CN107586756A - 一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，配方为：DCR，麦芽糖30~45g/L，ABA 5‑10 mg/L，PEG8000 100~125 g/L，AC 2 g/L，植物凝胶3 g/L。本发明的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，通过试验证实，在抗性黑松体胚发育成熟过程中，麦芽糖45 g/L、ABA 5‑10 mg/L、PEG8000 125 g/L、AC 2 g/L和植物凝胶3 g/L对体细胞胚成熟都具有促进作用。麦芽糖浓度为30‑45 g/L、ABA 10mg/L、PEG 100g/L组合时，产生子叶胚结构完整，数量最多，对提高抗性黑松体细胞胚的数量和质量具有重要意义，为抗性黑松抗松材线虫病的育种，选择优良家系的快速繁殖技术提供理论依据，为实现抗松材线虫病苗木的大量繁殖、生产提供可能。
Description
技术领域
本发明属于黑松体胚发生技术领域，具体涉及一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基。
背景技术
松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是松树上的一种毁灭性传染病，被许多国家列为检疫对象。我国1982年首次在南京中山陵发现，现已扩散到苏、皖、浙、赣等16个省(市)的246个县(区)。每年发生面积达10万公顷，直接经济损失25亿元(叶建仁，2010)。近年来其在我国的扩散趋势越来越明显，现已成为我国一种重要入侵病原生物(宁眺等，2004)。黑松是松材线虫病的高度感病树种，在我国山东、安徽、浙江、福建、江苏等省均有种植，全国总面积约159 300hm2。我国黑松林的健康发展受到松材线虫病的严重威胁。2004年，本团队从日本引进了一批珍贵的抗松材线虫病黑松种质资源，并建立了抗病黑松优良家系基因资源库(吴小芹等2009)。由于基因库中的母树种子产量有限，并且受到季节、环境等条件的限制，所以本实验室2008年开始了抗性黑松体细胞胚胎发生的研究，并先后成功诱导抗性黑松胚性细胞团，建立抗性黑松体胚发生体系(孙婷玉等，2014，2015)。目前该体系仍存在体胚发育不一致、产胚率低的问题，需要进一步优化。
体细胞胚胎发生是一个复杂的过程，大量研究表明，基本培养基的成分对松属树种的分化至关重要，其中培养基添加剂聚乙二醇(PEG)、活性炭(AC)、脱落酸(ABA)、糖种类及浓度对体细胞胚的成熟发育起着至关重要的作用。脱落酸(ABA)能促进体胚的成熟，抑制裂生多胚以及畸形胚的产生。采用活性炭(AC)对湿地松ESM进行成熟预处理，再将其转入成熟培养基中，获得了早期子叶胚(吴丽君，2009)。ABA与AC组合促进了马尾松子叶胚的形成(黄健秋，1995)。松属树种体胚的成熟还需要高渗透压的刺激作用，通常使用PEG作为渗透剂来提高培养基的渗透压，没有PEG调节培养基渗透压，几乎不可能获得子叶胚(Uddin,1993)。糖除了可以作为ESM的碳源外，也是重要的渗透剂，体细胞胚成熟阶段使用适当浓度的糖，不仅可以促进体胚的发生还能有效抑制畸形胚的出现，另外糖的种类对体胚的发育也十分重要，目前研究发现，麦芽糖对体胚的成熟的作用要大于其他种类的糖(Bozhkov,etal.2002)。因此要获得优良的成熟体细胞胚，只有在各种培养基组分都适合体细胞胚成熟的条件下才能实现。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，能有效提高抗性黑松体细胞胚的数量和质量。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，配方为：DCR，麦芽糖30～45g/L，ABA 5-10mg/L，PEG8000 100～125g/L，AC 2g/L，植物凝胶3g/L。
所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，所述的麦芽糖45g/L，PEG8000 125g/L。
所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，所述的ABA10mg/L，PEG100g/L。
所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，所述的麦芽糖45g/L，ABA10mg/L，PEG8000 125g/L。
所述的抗松材线虫病黑松得胚性细胞系为#1337，培养基为DCR+麦芽糖45g/L+ABA10mg/L+PEG 125g/L。
所述的抗松材线虫病黑松得胚性细胞系为#1537或#1637，培养基为DCR+麦芽糖30g/L+ABA 10mg/L+PEG 125g/L。
所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基在高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生中的应用。
所述的应用：胚性细胞在固体增殖培养基上继代生长10天，取1g胚性胚柄细胞团于30mL培养液中，培养采用100mL的三角瓶，置于90rpm摇床上，25℃，暗培养，每星期继代增殖一次至胚性细胞全部均匀分散于培养液；将继代4次的胚性细胞充分摇匀，取2mL胚性细胞喷洒在无菌滤纸，平铺在固体成熟培养基上。
有益效果：与现有技术相比，本发明的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，通过试验证实，在抗性黑松体胚发育成熟过程中，麦芽糖45g/L、ABA 5-10mg/L、PEG8000 125g/L、AC 2g/L和植物凝胶3g/L对体细胞胚成熟都具有促进作用。麦芽糖浓度为30-45g/L、ABA 10mg/L、PEG 100g/L组合时，产生子叶胚结构完整，数量最多，对提高抗性黑松体细胞胚的数量和质量具有重要意义，为抗性黑松抗松材线虫病的育种，选择优良家系的快速繁殖技术提供理论依据，为实现抗松材线虫病苗木的大量繁殖、生产提供可能。
附图说明
图1是ABA浓度对抗性黑松体胚发育成熟的影响结果图；
图2是PEG浓度对抗性黑松体胚发育成熟的影响结果图；
图3是AC浓度对抗性黑松体胚发育成熟的影响结果图；图中，A：AC 1g/L，B：AC 2g/L，C：AC 3g/L；
图4是成熟培养基中抗病黑松体细胞胚成熟结果图；A：胚性细胞团固体增殖，B、C：胚性细胞悬浮培养扩大增殖，D：抗病黑松成熟体细胞胚。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的方法，具体过程如下：
以抗性黑松胚性细胞#1337，#1537，#1637作为成熟培养的试验材料，将增殖阶段生长优良，显微观察后处于后期原胚阶段的胚性胚柄细胞团转至成熟培养基中。培养方法：将诱导的细胞系，取1g胚性胚柄细胞团于30mL培养液中，培养采用100mL的三角瓶，置于90rpm摇床上，25℃，暗培养，每星期继代增殖一次至胚性细胞全部均匀散落于培养液。将继代4次的胚性细胞充分摇匀，取2mL胚性悬浮细胞喷洒在固体成熟培养基上。成熟阶段采用培养温度(25±1)℃，暗培养。
出胚率(个/皿)＝每个皮氏培养皿体细胞胚个数，数据采用Excel处理，用SPSS软件进行方差分析和差异显著性检验。
1)将诱导的抗性黑松#1337的胚性细胞系作为成熟培养的试验材料，转接到基本培养基为DCR，麦芽糖分别为30，45，60g/L，肌醇1g/L，谷氨酰胺1.5g/L，ABA 20mg/L，琼脂8g/L的成熟培养基上，每个处理5皿，重复3次，三个月统计出胚情况。
结果表明(表1)，抗性黑松体细胞胚的成熟培养基中，添加30g/L麦芽糖时，成熟培养基上获得体细胞胚数量少，体胚瘦弱，颜色白，基部呈半透明聚拢状态；添加45g/L麦芽糖，成熟体细胞胚数量最多，体胚发育正常，形成结构完整的子叶胚；麦芽糖60g/L时，成熟体胚，数量减少，长度较短，子叶明显可见，但胚轴短。部分培养皿里出现无胚轴发育的畸形体细胞胚，可见麦芽糖是影响体胚发育成熟的重要因素。
表1麦芽糖浓度对抗性黑松体胚发育情况
2)将抗性黑松#1337转接在以DCR为基本培养基，ABA浓度分别为0，5，10，20，30，50mg/L的处理，添加麦芽糖30g/L，肌醇1g/L，谷氨酰胺1.5g/L，琼脂8g/L的成熟培养基上，每个处理5皿，重复3次。三个月后观察出胚情况。
结果发现成熟培养基中不添加ABA，胚性细胞不能形成体细胞胚。ABA浓度为5mg/L～20mg/L能显著促进抗性黑松胚性细胞形成体细胞胚。ABA浓度为20mg/L，成熟培养基中观察到子叶胚数量最多。当ABA浓度30mg/L，成熟培养基中体细胞胚数量开始减少。当ABA浓度50mg/L，成熟培养基中子叶胚数量较ABA 20mg/L显著降低。由图1可见，抗性黑松体细胞胚发育成熟阶段，ABA浓度5mg/L～20mg/L之间对体胚发生的促进作用均为显著促进。ABA20mg/L与30mg/L，ABA 30mg/L与50mg/L两两比较均为不显著。由此可见，体胚发育成熟ABA浓度适宜保持在10mg/L～20mg/L。
3)将抗性黑松#1337转接在以DCR为基本培养基，添加麦芽糖30g/L，ABA20mg/L，肌醇1g/L，谷氨酰胺1.5g/L，琼脂8g/L的成熟培养基上，聚乙二醇(PEG8000)浓度分别为0，50，75，100，125，150，每个处理5皿，重复3次。三个月后观察出胚情况。
结果发现聚乙二醇(PEG8000)对抗性黑松体胚发生的影响显著。在不添加PEG8000的成熟培养基上，没有获得子叶胚。PEG浓度50g/L～125g/L，胚性细胞产生体细胞胚数量随着PEG浓度的增加而显著增加，PEG浓度为125g/L，成熟培养基上获得体细胞胚数量最多。继续增加PEG浓度至150g/L，体胚数量明显减少(图2)。可见，PEG浓度为125g/L为体胚发育成熟的最佳浓度。
4)将抗性黑松#1337胚性细胞转接在以DCR为基本培养基，成熟培养基为麦芽糖30g/L，肌醇1g/L，ABA20mg/L，谷氨酰胺1.5g/L，100g/L PEG8000，琼脂8g/L，每个处理5皿，重复3次。三个月后观察体胚发育情况。
结果显示，在抗性黑松体细胞胚的成熟培养基中，当AC浓度为1g/L时，抗性黑松ESM在成熟培养基中能明显增殖，但胚性细胞向成熟发育阶段转化的少，形成体细胞胚数量较少；当AC浓度为2g/L时，活性炭在培养基中均匀分散，在培养早期ESM在成熟培养基中也能增殖，其后胚性细胞向成熟发育阶段转化的较多，形成体细胞胚数量较多，且结构完整、发育正常；当AC浓度为3g/L时，成熟培养基颜色明显加深，较少ESM在成熟培养基上增殖，胚性细胞向成熟阶段转化的少，形成体细胞胚数量少，且形成的体细胞胚大多数发育到柱状胚阶段后不在继续发育，出现明显的体胚发育停滞阶段(图3)。由此可见，在抗性黑松体胚发育成熟阶段，较适宜的活性炭(AC)的浓度为2g/L。
5)采用琼脂和植物凝胶两种凝固剂，分别以相应的浓度添加到培养基中，外加麦芽糖30g/L，肌醇1g/L，谷氨酰胺1.5g/L，ABA 20mg/L，PEG 130g/L，每个处理5皿，重复3次。三个月后观察体胚发育情况。
结果发现：添加琼脂，成熟培养基都不能凝固，胚性细胞无法生长，也无子叶胚形成。当琼脂浓度增加至10g/L时，成熟培养基底部凝固，但表面不凝固。当琼脂浓度增加至12g/L时，培养基仍不能完全凝固。胚性细胞在添加琼脂的成熟培养基上衰亡，均无子叶胚形成。更换培养基凝固剂为植物凝胶，浓度2g/L时，培养基凝固，表面偏软，胚性细胞产生子叶胚。当植物凝胶浓度增为3g/L时，成熟培养上获得的子叶胚多，结构发育完整。当植物凝胶浓度为3.5g/L，成熟培养基凝固、表面偏硬。胚性细胞在成熟培养基上生长一个星期，可见细胞表面颜色变白、干燥，三个月后体胚发育至子叶胚前期停滞，不能正常发育(表2)。因此，在抗性黑松体胚发育成熟阶段宜选用植物凝胶浓度为3g/L。
表2不同浓度琼脂与植物凝胶对抗性黑松体胚形成影响
实施例2
依据实施例1的结果，选择麦芽糖、ABA、PEG三个浓度，采用L9(34)的正交试验设计进行试验(表3)。将ESM转接至设计的培养基中，每个处理5皿，重复3次，三个月后观察体胚发育情况。所有培养基在灭菌前pH值调至5.8，高压灭菌(121℃，20min)。
表3因素与水平
将抗性黑松#1337，#1537及#1637胚性细胞转接在不同激素组合对的成熟培养基上，培养三个月，观察和统计体胚发育成熟状况(表4)。
表4麦芽糖、ABA、PEG对抗性黑松体胚发育成熟影响
注：“+++”表示子叶胚有完整的胚根、胚轴和子叶，体胚质量佳，发育完全；“++”表示子叶胚下胚轴较短，上胚轴和子叶发育完整；“+”表示子叶胚瘦弱，但子叶发育完整。
结果发现抗性黑松不同胚性细胞系在9种不同培养基中体胚的数量和形态存在一定差异。组合不一，效果也不一。3个胚性细胞系中#1537产生子叶胚数量最多，#1637次之，#1337产生子叶胚数量最少。这说明抗性黑松胚性细胞产生子叶胚存在明显的遗传差异。在9种成熟培养基组合中，胚性细胞产生子叶胚最多的成熟培养基组合，为麦芽糖45g/L，ABA10mg/L，PEG8000 125g/L。成熟培养基中抗病黑松体细胞胚成熟结果，如图4所示，图中，A：胚性细胞团固体增殖，B、C：胚性细胞悬浮培养扩大增殖，D：抗病黑松成熟体细胞胚。
表5正交设计方差分析
对3个胚性细胞系在适宜的成熟培养基中获得的子叶胚数量进行方差分析(表5)可知，PEG8000或PEG8000与ABA和麦芽糖两因素的交互作用均对胚性细胞#1337产生子叶胚，有极显著影响。而麦芽糖及麦芽糖与ABA的交互作用对胚性细胞系#1337产生子叶胚有显著影响。麦芽糖、ABA和PEG8000以及三因素之间的交互作用对胚性细胞系#1537及#1637产生子叶胚均有极显著影响。
对抗性黑松各无性系产生子叶胚数量进行极差分析(表6)，结果发现：在不同的组合中，不同无性系生产体细胞胚数量呈现出不同的变化趋势：胚性细胞系#1337，麦芽糖在P2水平(45g/L)获得子叶胚数量最多，而ABA和PEG在P1(分别为10mg/L和125g/L)水平获得子叶胚数量最多。说明，胚性细胞系#1337最佳的组合为麦芽糖45g/L+ABA 10mg/L+PEG125g/L；胚性细胞系#1537和#1637，麦芽糖、ABA和PEG都在P1(分别为30g/L，10mg/L和125g/L)水平获得子叶胚数量最多。说明，#1537和#1637最佳的组合为麦芽糖30g/L+ABA10mg/L+PEG 125g/L；在3个无性系中PEG的极差最大，对抗性黑松体细胞胚发育成熟的影响最大。
表6不同无性系在麦芽糖、ABA和PEG作用下产生子叶胚数量的极差分析
Claims (8)
1.一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，其特征在于：所述的培养基配方为：DCR，麦芽糖30~45g/L，ABA 5-10 mg/L，PEG8000 100~125 g/L，AC 2 g/L，植物凝胶3g/L。
2.根据权利要求1所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，其特征在于：所述的麦芽糖45 g/L，PEG8000 125 g/L。
3.根据权利要求1所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，其特征在于：所述的ABA 10mg/L，PEG 100g/L。
4.根据权利要求1所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，其特征在于：所述的麦芽糖45 g/L，ABA 10 mg/L，PEG8000 125 g/L。
5.根据权利要求1所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，其特征在于：所述的抗松材线虫病黑松得胚性细胞系为#1337，培养基为DCR+麦芽糖45g/L + ABA 10mg/L + PEG 125 g/L。
6.根据权利要求1所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基，其特征在于：所述的抗松材线虫病黑松得胚性细胞系为#1537或#1637，培养基为DCR+麦芽糖30g/L +ABA 10 mg/L + PEG 125 g/L。
7.权利要求1-6任一项所述的高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基在高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：胚性细胞在固体增殖培养基上继代生长10天，取1g胚性胚柄细胞团于30mL培养液中，培养采用100mL的三角瓶，置于90rpm摇床上，25℃，暗培养，每星期继代增殖一次至胚性细胞全部均匀分散于培养液；将继代4次的胚性细胞充分摇匀，取2mL胚性细胞喷洒在无菌滤纸，平铺在固体成熟培养基上。
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| Title |
|---|
| 梁芬: "抗松材线虫病黑松体细胞胚胎发生及植株再生体系研究,第D049-212页", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库电子期刊.农业科技辑》 * |
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