CN113711920B - 一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，步骤如下：将6‑BA喷施于植株花蕾上；用酒精与HgCl2消毒花蕾；释放小孢子，经过滤、离心得纯化小孢子；将小孢子用NLN培养基稀释、分装到培养皿，并添加植酸；最后，热激处理转至黑暗培养，待出现胚状体，振荡培养；将培子叶期胚状体转移到MS培养基上分化培养，培养条件为：4℃，14h蓝红复合光照射/天，培养14天；然后，在25℃、14h蓝红复合光照射/天条件下继续培养成苗。本发明优点为：通过外源喷施6‑BA于花蕾、小孢子培养过程中在培养基中添加植酸以及调整胚状体再生时光谱和环境温度，建立了一种提高不结球白菜小孢子一次成苗率的新方法。

Description

一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法。
背景技术
不结球白菜(Brassica campestris ssp.Chinensis Makino)属十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)芸薹种白菜亚种，俗称小白菜、青菜、油菜。不结球白菜原产中国，栽培历史悠久，是南方人民终年喜食的大众化主要蔬菜。
孢子是植物所产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞，能直接发育成新个体。小孢子是高等植物雄配子体减数分裂后四分体释放出的单核细胞。游离小孢子培养是指直接从花蕾或花药中获得小孢子群体进行培养的方法。由于小孢子培养较花药培养效率高，还可排除花药壁和绒毡层组织等体细胞的影响，因此受到育种学家的青睐。
理论上，小孢子在液体培养基中培养一段时间后，会经不同时期的胚状体，最终形成子叶形胚状体，此时便可转移到固体再生培养基上进行再生植株体的培养。然而，实际上，转移至固体再生培养基上的胚状体也并非一定能发育成正常的再生植株体，其原因主要有以下几方面：(1)大多数小孢子来源的胚胎可能会发生异常发育，包括在下胚轴上形成次生胚；(2)转移到固体培养基后的胚状体，其植株再生频率同样受很多因素影响，如培养基成分、水分、光质等；当培养条件不当时，植株再生困难，成苗率低。因此，若能在小孢子培养过程中，避免“胚胎发生异常发育”问题，同时找到植株再生过程中的最佳培育条件，将能有效提高胚状体再生频率，提高其一次成苗率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法；其通过“调整胚状体再生时温度”来避免胚状体异常发育的问题，通过“外源喷施6-BA于花蕾”、“小孢子培养过程中在培养基中添加植酸”以及“调整胚状体再生时光谱条件”来避免培养条件不当时植株再生困难、成苗率低的问题。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，包括如下步骤：
(1)花蕾的预处理
待不结球白菜植株现蕾后，将50～150mg/L浓度的6-BA喷施于花蕾上；6-BA喷施第二天，取花序备用；
(2)小孢子分离
选取花瓣长度/花药长度在0.5～1之间的花蕾，用70％酒精与0.1％HgCl2进行组合消毒，再用无菌水冲洗；接着，在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管进行离心；离心后，用B5培养基重悬沉淀后再次离心，所得沉淀即为所需的纯化小孢子；
(3)小孢子培养
将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为1×105～2×105个/mL-1；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.01％～0.5％浓度的植酸PA；最后，在33℃下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；
(4)胚状体萌发及成苗
将培养好的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，培养条件为：4℃，14h蓝红复合光照射/天，培养14天；然后，在25℃、14h蓝红复合光照射/天的条件下继续培养成苗。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，选择的花序具体为无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，选择对应花序后，将其置于自封袋中并喷清水，接着置于4℃冰箱中储存1～2天，备用。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，对花蕾进行组合消毒的具体方法为：先用70％酒精消毒30s，再用0.1％HgCl2震荡消毒6min；待组合消毒完成，再用无菌水冲洗2～3次，每次5min。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，待选取的花蕾完成消毒与清洗后，用玻璃棒在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用300目钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管中，并于1000r/min条件下离心3min；离心后，用B5培养基重悬沉淀，并将重悬液于1000r/min条件下再次离心3min，最终所得沉淀即为目标所需的纯化小孢子。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，当小孢子的细胞密度为1×105～2×105个/mL-1时，培养基呈淡黄色。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，转移到MS培养基上的子叶期胚状体的长度为2.5～3mm。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，蓝红复合光中，蓝光与红光的比例为1:1。
作为本发明的优选方式之一，所述B5培养基、NLN培养基、MS培养基均为本领域常规培养基，其配方在此不再赘述。
本发明设计思路与原理：
一、关于“小孢子来源的胚胎可能发生异常发育”的问题：
经实验验证，较老的胚状体或在较高温度(25℃)培养的胚状体更容易发生次生胚胎发生，而在较低的温度下培养的胚状体更容易发育成正常植株。因此，在胚状体再生成苗时，可通过低温预处理的方式避免其发育异常，从而提高胚状体再生频率，提高成苗率。
二、关于“转移到固体培养基后的胚状体，其植株再生频率同样受很多因素影响”的问题：
6-BA是个高效能植物生长调节剂，在促进发芽、促进花芽分化和开花、提高坐果率、促进果实生长、提高果品品质等多方面表现良好。经实验验证，当体外喷施适当浓度的6-BA于花蕾上时，可以有效提高小孢子的活力，从而有利于后续的植株再生培养。
植酸(C6H18O24P6)是一种天然的抗氧化剂。研究发现，将适量的植酸添加到固体和液体培养基中，能显著降低多酚氧化酶活性，稳定培养基中pH值和mV值，并促进植物细胞生长，增强细胞抗褐化和水渍化能力，从而改善细胞状态。
光质对植物生长的影响主要体现在形态建成方面，红光促进植物茎和叶柄的伸长，蓝光影响植物的内源激素，并使自由态的IAA、GA1下降，ABA和乙烯含量增加。经实验验证，小孢子萌发前期，对小孢子进行适当的红蓝复合光处理后，其光合自养能力得到大大提高，植株健壮，形态建成最佳，且成苗率高。
因此，在胚状体再生培养过程中，可通过“外源喷施6-BA于花蕾”、“小孢子培养过程中在培养基中添加植酸”以及“调整胚状体再生时光谱与温度条件”来提高胚状体再生频率，提高成苗率。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明创造利用外源喷施6-BA于花蕾上获得高活力的小孢子，在小孢子培养过程中在培养基中添加植酸以提高小孢子抗氧化能力，再通过调整小孢子再生过程中光谱的红蓝比，以调控小孢子的激素水平、光合自养能力及形态建成，同步降低培养环境温度，使培养的胚胎更容易直接发育成正常植株，从而提高不结球白菜小孢子胚胎的一次成苗率；本发明解决了不结球白菜杂交育种年限长、育种效率低，且突变体种质资源在选育过程中存在不易获得及难以保存等一系列生产应用问题；
(2)本发明提供的方法具有操作简单，生产周期短，高效高等优点，所使用的方法避免了高危、高毒或易爆试剂的使用，具有显著的安全性。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，包括如下步骤：
(1)花蕾的预处理
待不结球白菜植株现蕾后，于盛花期，将50mg/L浓度的6-BA喷施于花蕾上；6-BA喷施第二天，选择的花序具体为无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序，将其置于自封袋中并喷清水，接着置于4℃冰箱中储存1天，备用；
(2)小孢子分离
选取花瓣长度/花药长度在0.5～1之间的花蕾，先用70％酒精消毒30s，用0.1％HgCl2震荡消毒6min，再用无菌水冲洗2次，每次5min；接着，用玻璃棒在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用300目钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管中，并于1000r/min条件下离心3min；离心后，用B5培养基重悬沉淀，并将重悬液于1000r/min条件下再次离心3min，最终所得沉淀即为目标所需的纯化小孢子；
(3)小孢子培养
将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为1×105个/mL-1左右(此时，培养基呈淡黄色)；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.01％浓度的植酸PA；最后，在33℃下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；
(4)胚状体萌发及成苗
将培养好的2.5mm长的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，培养条件为：4℃，14h蓝红复合光照射/天，培养14天；然后，在25℃、14h蓝红复合光照射/天的条件下继续培养成苗；其中，蓝红复合光中，蓝光与红光的比例为1:1。
实施例2
本实施例的一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，包括如下步骤：
(1)花蕾的预处理
待不结球白菜植株现蕾后，于盛花期，将100mg/L浓度的6-BA喷施于花蕾上；6-BA喷施第二天，选择的花序具体为无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序，将其置于自封袋中并喷清水，接着置于4℃冰箱中储存2天，备用；
(2)小孢子分离
选取花瓣长度/花药长度在0.5～1之间的花蕾，先用70％酒精消毒30s，用0.1％HgCl2震荡消毒6min，再用无菌水冲洗3次，每次5min；接着，用玻璃棒在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用300目钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管中，并于1000r/min条件下离心3min；离心后，用B5培养基重悬沉淀，并将重悬液于1000r/min条件下再次离心3min，最终所得沉淀即为目标所需的纯化小孢子；
(3)小孢子培养
将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为1.5×105个/mL-1左右(此时，培养基呈淡黄色)；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.1％浓度的植酸PA；最后，在33℃下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；
(4)胚状体萌发及成苗
将培养好的2.6mm长的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，培养条件为：4℃，14h蓝红复合光照射/天，培养14天；然后，在25℃、14h蓝红复合光照射/天的条件下继续培养成苗；其中，蓝红复合光中，蓝光与红光的比例为1:1。
实施例3
本实施例的一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，包括如下步骤：
(1)花蕾的预处理
待不结球白菜植株现蕾后，于盛花期，将100mg/L浓度的6-BA喷施于花蕾上；6-BA喷施第二天，选择的花序具体为无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序，将其置于自封袋中并喷清水，接着置于4℃冰箱中储存1天，备用；
(2)小孢子分离
选取花瓣长度/花药长度在0.5～1之间的花蕾，先用70％酒精消毒30s，用0.1％HgCl2震荡消毒6min，再用无菌水冲洗2次，每次5min；接着，用玻璃棒在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用300目钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管中，并于1000r/min条件下离心3min；离心后，用B5培养基重悬沉淀，并将重悬液于1000r/min条件下再次离心3min，最终所得沉淀即为目标所需的纯化小孢子；
(3)小孢子培养
将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为1.5×105个/mL-1左右(此时，培养基呈淡黄色)；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.15％浓度的植酸PA；最后，在33℃下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；
(4)胚状体萌发及成苗
将培养好的2.8mm长的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，培养条件为：4℃，14h蓝红复合光照射/天，培养14天；然后，在25℃、14h蓝红复合光照射/天的条件下继续培养成苗；其中，蓝红复合光中，蓝光与红光的比例为1:1。
实施例4
本实施例的一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，包括如下步骤：
(1)花蕾的预处理
待不结球白菜植株现蕾后，于盛花期，将150mg/L浓度的6-BA喷施于花蕾上；6-BA喷施第二天，选择的花序具体为无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序，将其置于自封袋中并喷清水，接着置于4℃冰箱中储存2天，备用；
(2)小孢子分离
选取花瓣长度/花药长度在0.5～1之间的花蕾，先用70％酒精消毒30s，用0.1％HgCl2震荡消毒6min，再用无菌水冲洗3次，每次5min；接着，用玻璃棒在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用300目钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管中，并于1000r/min条件下离心3min；离心后，用B5培养基重悬沉淀，并将重悬液于1000r/min条件下再次离心3min，最终所得沉淀即为目标所需的纯化小孢子；
(3)小孢子培养
将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为2×105个/mL-1左右(此时，培养基呈淡黄色)；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.5％浓度的植酸PA；最后，在33℃下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；
(4)胚状体萌发及成苗
将培养好的3mm长的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，培养条件为：4℃，14h蓝红复合光照射/天，培养14天；然后，在25℃、14h蓝红复合光照射/天的条件下继续培养成苗；其中，蓝红复合光中，蓝光与红光的比例为1:1。
实施例5
本实施例用以验证不同浓度6-BA对不结球白菜出胚率的影响：
方法：花蕾的预处理过程中，待不结球白菜植株现蕾后，于盛花期配制好浓度依次为0、50、100、150和200mg/L的6-BA，并分别喷施于花蕾上，进而研究不同不同浓度6-BA对不结球白菜出胚率的影响(其他步骤相同，且参照实施例3)。
实施结果：结果如表1所示。
表1不同浓度6-BA对不结球白菜QC出胚率的影响
6-BA浓度(mg/L) 平均出胚率(胚/蕾)
0 0.78
50 0.92
100 1.56
150 1.08
200 0.74
由表1可知，与正常生长的不结球白菜相比，用6-BA溶液处理花蕾后的出胚率有不同程度的变化。其中效果最好的是喷施100mg/L的花蕾，出胚率提升了100％；其次是150mg/L和50mg/L的花蕾，出胚率分别提升了17.95％和38.46％；喷施200mg/L的花蕾的出胚率受到了抑制，比不施加6-BA溶液的出胚率下降了5.13％。
实施例6
本实施例用以验证不同浓度植酸PA对不结球白菜出胚率的影响：
方法：小孢子培养过程中，将密度稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并分别添加浓度为0、0.01％、0.1％、0.15％、0.5％和1％的植酸PA，进而研究不同浓度植酸PA对不结球白菜出胚率的影响(其他步骤相同，且参照实施例3)。
实施结果：结果如表2所示。
表2不同浓度植酸对不结球白菜出胚率的影响
PA浓度(％) 平均出胚率(胚/蕾)
0 0.639
0.01 0.774
0.1 1.495
0.15 1.137
0.5 0.789
1 0.487
由表2可知，与不添加PA的培养基相比，在培养基中分别添加0.01％、0.1％、0.15％和0.5％的PA，出胚率提高21％、134％、78％和23％，添加1％浓度的PA出胚率受到抑制，下降了24％。
实施例7
本实施例用以验证不同光谱和低温处理对胚状体再生的影响：
方法：胚状体萌发及成苗过程中，将培养好的子叶期胚状体转移到MS培养基上，并分别置于四种不同光质下进行分化培养14天(14h光照/天)，并且，每种光质再分别设置两个温度组“4℃处理组，25℃对照组”；然后，在25℃，14h光照条件(同上述光质)下培养成苗，4周后统计不结球白菜小孢子直接成苗情况，进而研究不同光谱和低温处理对胚状体再生的影响(其他步骤相同，且参照实施例3)。
不同光质分别指红光、蓝光、蓝红复合光(1:1)与荧光灯对应处理下的光质，其主要技术参数见表3。
实施结果：结果如表4所示。
表3不同光谱分布的主要技术参数
Figure BDA0003280440910000121
表4不同光谱和低温处理对胚状体再生的影响
Figure BDA0003280440910000122
由表4可知，将生长良好的子叶型胚状体，转移到MS培养基上，置于四种不同的光质下进行分化培养，其直接成苗率有不同程度的变化。其中效果最好的是蓝红复合光处理，直接成苗率比白色荧光灯对照下提升了3.91％；单一的蓝光和红光对直接成苗率有不同程度的抑制，分别比对照降低了14.34％和45.11％。
同时，在胚状体再生成苗时，低温预处理也会对直接成苗率产生影响。将红光处理的小孢子置于4℃低温14天，直接成苗率比25℃下提升了33.73％；蓝光处理下低温后直接成苗率提升了20.18％；蓝红复合光下经历低温后直接成苗率提升了21.83％；白色荧光灯下低温后直接成苗率提升了14.86％；低温处理可以提升胚状体一次成苗率。
综合而言，在所有组合中，蓝红复合光照射并进行4℃低温处理的组合对胚状体一次成苗效果最好，比荧光灯照射并置于25℃常温下组合的一次成苗率提高26.60％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）花蕾的预处理
待不结球白菜植株现蕾后，将50~150mg/L浓度的6-BA喷施于花蕾上；6-BA喷施第二天，取花序备用；
（2）小孢子分离
选取花瓣长度与花药长度之比在0.5~1之间的花蕾，用70%酒精与0.1% HgCl2进行组合消毒，再用无菌水冲洗；接着，在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管进行离心；离心后，用B5培养基重悬沉淀后再次离心，所得沉淀即为所需的纯化小孢子；
（3）小孢子培养
将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为1×105~2×105个/mL；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.01%~0.5%浓度的植酸PA；最后，在33℃下热激处理24 h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；
（4）胚状体萌发及成苗
将培养好的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，培养条件为：4℃，14h蓝红复合光照射/天，培养14天；然后，在25℃、14h蓝红复合光照射/天的条件下继续培养成苗；其中，蓝红复合光中，蓝光与红光的比例为1:1。
2.根据权利要求1所述的提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，选择的花序具体为无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序。
3.根据权利要求1所述的提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，选择对应花序后，将其置于自封袋中并喷清水，接着置于4℃冰箱中储存1~2天，备用。
4.根据权利要求1所述的提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，对花蕾进行组合消毒的具体方法为：先用70%酒精消毒30s，再用0.1%HgCl2震荡消毒6min；待组合消毒完成，再用无菌水冲洗2~3次，每次5min。
5.根据权利要求1所述的提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，待选取的花蕾完成消毒与清洗后，用玻璃棒在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用300目钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管中，并于1000r/min条件下离心3min；离心后，用B5培养基重悬沉淀，并将重悬液于1000r/min条件下再次离心3min，最终所得沉淀即为目标所需的纯化小孢子。
6.根据权利要求1所述的提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，当小孢子的细胞密度为1×105~2×105个/mL时，培养基呈淡黄色。
7.根据权利要求1所述的提高不结球白菜小孢子胚状体一次成苗率的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，转移到MS培养基上的子叶期胚状体的长度为2.5~3mm。
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