CN110731271A - 一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法 - Google Patents

一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高菜心游离小孢子胚状体出胚数的培养方法，第一步选取处于单核靠边期的菜心花蕾，消毒后分离纯化出游离小孢子，将纯化后的小孢子悬浮于NLN液体培养基中，用血球计数板将小孢子密度调整为1×105～2×105个/mL，获得小孢子悬浮液。第二步将制备好的菜心小孢子加入大量元素减半且添加6‑BA(0.05mg/L)、NAA(0.10mg/L)、活性炭(100mg/L)的NLN‑13培养基中，然后将分装好的小孢子培养皿置于恒温培养箱中进行32℃热激处理24h，之后转入25℃恒温培养箱中继续暗培养，直至胚状体出现。采用该种培养方法对菜心小孢子的诱导出胚具有明显促进作用，可提高小孢子出胚数。本发明具有方法实用、步骤具体、重复性好等特点，可实现菜心游离小孢子培养在单倍体育种上的广泛应用。

Description

一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法
技术领域
本发明涉及菜心出胚数增加技术，具体涉及一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法。
背景技术
菜心(Brassica chinesis var.)，又名菜薹，为十字花科芸薹属一、二年生草本植物，由大白菜亚种和白菜亚种长期选择和栽培驯化而来，原产我国南部，是我国华南地区的特产。菜心生长周期短，在蔬菜周年供应尤其是淡季蔬菜供应上占有重要地位。选育出优质、丰产的新品种是菜心育种的重要目标之一。
菜心为异花授粉植物，杂种优势明显，但纯合非常困难，利用一代杂种培育优良的自交系亲本一般需6-8代(年)，要对所选单株进行连续多代剥蕾自交纯化，相当费工费时，且长期自交会出现自交衰退现象。应用游离小孢子培养技术获得单倍体进而加倍成后代完全纯合的双单倍体植株(DH植株)，可在较短时间内使材料得以纯化，从而大幅度缩短育种年限，而游离小孢子培养体系的开发是关键所在。小孢子培养是直接从花蕾或花药中获得游离小孢子进行培养，通过诱导胚状体，再生出完整的单倍体植株，最后经过自发或诱发染色体加倍，成为正常可育、纯合的二倍体植株的过程。尽管目前小孢子培养技术已经取得了较大进展，但在实际应用中，由于该技术涉及到的影响较多，每个因素的变化都可能使得小孢子培养出现重复性差，出胚数低等问题，许多因素的最佳条件有待于进一步研究。虽然已有研究者建立了大白菜、芥菜、辣椒等作物的游离小孢子培养体系，但不同种间游离小孢子胚诱导各有其自身的规律，并不能完全套用，为了解决上述技术问题，特提出一种新的技术方案。
发明内容
本发明提出菜心出胚数增加技术，特别说明了一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，通过游离小孢子制备及研究不同培养基类型、不同热激处理时间、培养基中添加不同浓度激素和活性炭对菜心小孢子胚状体诱导的影响，旨在找出菜心游离小孢子胚状体诱导发生的最佳培养条件，以提高出胚数，为建立菜心游离小孢子胚状体培养技术和利用现有资源快速创造所需要的新育种材料奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、试验材料，以20份菜心为试验材料，分别进行编号1～20，以珍珠岩为基质进行穴盘育苗，当幼苗长至三叶一心时，选取生长一致的健壮幼苗移栽到田间，常规栽培管理直至抽薹开花，于晴天上午采摘处于单核靠边期的花蕾进行游离小孢子培养，取样时主花序上的花蕾优先，其次为第一、第二分枝上的花蕾；
步骤二、小孢子游离，在无菌台上，将挑选好的花蕾放入烧杯中，用70％的酒精进行表面灭菌30s后，再用0.1％HgCl2灭菌10～12min，接着用无菌水冲洗3次，每次冲洗5min，置于无菌圆底试管中加入少量的B5提取液，用玻璃棒将花蕾轻轻研碎，使小孢子游离到提取液中。再通过50μm孔径尼龙网除去花蕾组织碎片，收集滤液于10mL离心管中，滤液经900r/min离心3min，弃上清，再用B5提取液重新悬浮小孢子后再离心，如此重复3次，最后将所得小孢子沉淀用NLN液体培养基悬浮，用血球计数板将小孢子密度调整为1×105～2×105个/mL，分装至75mm培养皿中，用Parafilm封口；
步骤三、分析关键因素对菜心游离小孢子胚诱导的影响；
步骤四、小孢子培养，将分装好的小孢子培养皿置于恒温培养箱中进行热激诱导，之后转入25℃恒温培养箱中继续暗培养，至胚状体出现，培养25天后统计小孢子出胚数；
所述的20份菜心为试验材料为，1、汉珍一号菜心，来源湖北；2、尖叶70天，来源广东；3、尖叶菜心，来源辽宁；4、澳洲改良80天油青甜菜心，来源广东；5、油青尖叶甜菜心，来源广东；6、甜菜心，来源广东；7、油青甜菜心，来源广东；8、全能特级80天油青甜菜心王，来源辽宁；9、玉冠一号广府青菜心，来源广东；10、油青菜心，来源辽宁；11、广澳油菜心，来源湖南；12、航育49-1菜心，来源甘肃；13、雪莹白菜苔，来源湖北；14、广润杂交菜心，来源广东；15、广府青菜心，来源广东；16、航天香脆菜心，来源广东；17、珍美45天尖叶油青菜心，来源甘肃；18、初恋小青菜一代杂交菜心，来源甘肃；19、四-九月菜心，来源香港；20、油绿粗薹菜心，来源广东。
所述的关键因素对菜心游离小孢子胚诱导的影响，包括以下步骤：步骤一、不同基本培养基对菜心小孢子胚状体诱导的影响：以20种基因型的菜心为试材，将获得的游离小孢子培养于蔗糖浓度为13％和1/2大量元素减少一半的NLN培养基，蔗糖浓度为13％的培养基上，研究不同培养基诱导产生胚状体的能力，得到菜心小孢子培养最佳培养基类型；
步骤二、不同激素种类及浓度对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以不同出胚数的菜心品种为材料，在培养基中加不同浓度的细胞分裂素(6-BA)和生长素(NAA)，未添加激素的培养基为对照，观察不同激素种类及浓度对菜心胚状体诱导的影响，获得菜心小孢子培养最佳激素配比；
步骤三、添加不同浓度活性炭对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以不加活性炭的培养基为对照，将胚产量不同的基因型为对象，研究添加不同浓度的活性炭对胚状体诱导率的影响，获得菜心游离小孢子培养最佳活性炭浓度；
步骤四、不同热激时间对胚胎发生的影响：以出胚数存在差异的菜心为研究对象，设置32℃热激处理6h、12h、24h、48h四个处理，以无高温预处理的新鲜小孢子培养为对照，研究不同热激时间对菜心游离小孢子胚诱导的影响；
步骤五、常规培养与改良方法培养对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以常规培养为对照，综合试验步骤一至步骤四的试验结果，组合成改良培养方法。以20个菜心品种为试验材料，研究这两种培养方法对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响，花蕾采集、小孢子游离、暗培养等其他条件均保持一致。
所述的激素浓度及配比为0.00mg/L 6-BA+0.00mg/L NAA、0.05mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA、0.05mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA、0.05mg/L 6-BA+0.20mg/L NAA、0.10mg/L6-BA+0.05mg/L NAA、0.10mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA、0.10mg/L 6-BA+0.20mg/L NAA、0.15mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA、0.15mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA或0.15mg/L 6-BA+0.20mg/LNAA。
所述的活性炭的浓度为50、100、150、200或400mg/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：首次对菜心游离小孢子胚状体诱导影响因素进行系统研究，明确制约菜心小孢子胚状体发生的关键因素，通过建立一种的完善、高效、适用的胚状体诱导培养体系，提高菜心小孢子胚状体出胚数，缩短育种周期。
附图说明
图1为本发明对不同激素含量对菜心小孢子胚胎发生的影响；
图2为本发明对添加活性炭对菜心小孢子胚胎发生的影响；
图3为本发明对不同热激时间对菜心小孢子胚胎发生的影响；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此
实施例一、基本培养基对菜心小孢子胚状体诱导的影响
由下表可知，不同培养基对菜心小孢子胚状体诱导的影响不同，本研究发现采用大量元素减半的基本培养基(1/2NLN-13)有利于菜心小孢子胚诱导，出胚数较NLN-13明显增多。此外，基因型不同对小孢子出胚的影响也非常大，供试的20份材料中，有8份诱导出胚，诱导率达40.00％，其中四-九月菜心出胚数最高，其次为尖叶70天，其他材料难诱导出胚。
Figure BDA0002298529210000051
Figure BDA0002298529210000061
其中，NLN-13为蔗糖浓度为13％；1/2NLN-13为大量元素减少一半的NLN培养基，蔗糖浓度为13％。
实施例二、不同激素含量对菜心小孢子胚胎发生的影响；
参照图1可知，激素种类和浓度的配比与菜心小孢子胚状体诱导密切相关。当6-BA含量为0.05mg/L时，随着NAA含量的增大，胚状体的数目也随之增多，但6-BA浓度为0.1mg/L和0.15mg/L时，NAA浓度过高则会抑制胚状体的产生。总的来说，0.05mg/L 6-BA+0.10mg/LNAA是菜心小孢子培养最适胚状体诱导培养基激素组合。
实施例三、添加活性炭对菜心小孢子胚胎发生的影响；
参照图2可知，添加少量活性炭有利于菜心小孢子胚状体的诱导，当活性炭浓度为100mg/L时，各供试材料的小孢子胚状体产量均显著高于其他处理，随着活性炭浓度的增大，胚状体数量随之下降。
实施例四、不同热激时间对菜心小孢子胚胎发生的影响；
以未32℃热激处理(0h)为对照，分别处理24、48、72h，比较不同热激处理时间6h、12h、24h、48h对菜心小孢子胚状体发生的影响，试验结果如图3所示。对于品种2、品种10、品种17和品种19四份材料来说，处理24h时胚状体产量均达到最高，显著高于对照。热激处理时间过短出胚效果不明显，如6h或12h，但热激时间也不宜过长。本次试验中热激处理24h对于菜心游离小孢子胚状体诱导培养最为适合。
实施例五、常规方法培养与改良方法培养对菜心游离小孢子胚胎发生的影响；
改良方法是使用大量元素减半的NLN-13培养基，且在培养基中添加6-BA(0.05mg/L)、NAA(0.10mg/L)、活性炭(100mg/L)，将分装好后的小孢子培养皿置于恒温培养箱中进行32℃热激处理24h，其他处理条件与常规方法保持一致。由下表可知，不同培养方法对小孢子出胚有较大影响。供试的20份材料中，采用常规培养有8份材料诱导出胚，改良方法培养有13份材料诱导出胚，且各出胚材料的出胚数均比常规培养时要多。由此可见，培养方法的不同对菜心小孢子胚胎发生能力影响也不同。因此，采用本发明中改良方法培养，可大大提高菜心游离小孢子胚状体出胚数。
Figure BDA0002298529210000081
在本发明的描述中，需要理解的是，指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤一、试验材料，以20份菜心为试验材料，分别进行编号1～20，以珍珠岩为基质进行穴盘育苗，当幼苗长至三叶一心时，选取生长一致的健壮幼苗移栽到田间，常规栽培管理直至抽薹开花，于晴天上午采摘处于单核靠边期的花蕾进行游离小孢子培养，取样时主花序上的花蕾优先，其次为第一、第二分枝上的花蕾；
步骤二、小孢子游离，在无菌台上，将挑选好的花蕾放入烧杯中，用70％的酒精进行表面灭菌30s后，再用0.1％HgCl2灭菌10～12min，接着用无菌水冲洗3次，每次冲洗5min，置于无菌圆底试管中加入少量的B5提取液，用玻璃棒将花蕾轻轻研碎，使小孢子游离到提取液中。再通过50μm孔径尼龙网除去花蕾组织碎片，收集滤液于10mL离心管中，滤液经900r/min离心3min，弃上清，再用B5提取液重新悬浮小孢子后再离心，如此重复3次，最后将所得小孢子沉淀用NLN液体培养基悬浮，用血球计数板将小孢子密度调整为1×105～2×105个/mL，分装至75mm培养皿中，用Parafilm封口；
步骤三、分析关键因素对菜心游离小孢子胚诱导的影响；
步骤四、小孢子培养，将分装好的小孢子培养皿置于恒温培养箱中进行热激诱导，之后转入25℃恒温培养箱中继续暗培养，至胚状体出现，培养25天后统计小孢子出胚数。
2.根据权利要求1所述的提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，其特征在于：所述的20份菜心为试验材料为，1、汉珍一号菜心，来源湖北；2、尖叶70天，来源广东；3、尖叶菜心，来源辽宁；4、澳洲改良80天油青甜菜心，来源广东；5、油青尖叶甜菜心，来源广东；6、甜菜心，来源广东；7、油青甜菜心，来源广东；8、全能特级80天油青甜菜心王，来源辽宁；9、玉冠一号广府青菜心，来源广东；10、油青菜心，来源辽宁；11、广澳油菜心，来源湖南；12、航育49-1菜心，来源甘肃；13、雪莹白菜苔，来源湖北；14、广润杂交菜心，来源广东；15、广府青菜心，来源广东；16、航天香脆菜心，来源广东；17、珍美45天尖叶油青菜心，来源甘肃；18、初恋小青菜一代杂交菜心，来源甘肃；19、四-九月菜心，来源香港；20、油绿粗薹菜心，来源广东。
3.根据权利要求1所述的提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，其特征在于：所述的关键因素对菜心游离小孢子胚诱导的影响，包括以下步骤：
步骤一、不同基本培养基对菜心小孢子胚状体诱导的影响：以20种基因型的菜心为试材，将获得的游离小孢子培养于蔗糖浓度为13％和1/2大量元素减少一半的NLN培养基，蔗糖浓度为13％的培养基上，研究不同培养基诱导产生胚状体的能力，得到菜心小孢子培养最佳培养基类型；
步骤二、不同激素种类及浓度对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以不同出胚数的菜心品种为材料，在培养基中加不同浓度的细胞分裂素(6-BA)和生长素(NAA)，未添加激素的培养基为对照，观察不同激素种类及浓度对菜心胚状体诱导的影响，获得菜心小孢子培养最佳激素配比；
步骤三、添加不同浓度活性炭对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以不加活性炭的培养基为对照，将胚产量不同的基因型为对象，研究添加不同浓度的活性炭对胚状体诱导率的影响，获得菜心游离小孢子培养最佳活性炭浓度；
步骤四、不同热激时间对胚胎发生的影响：以出胚数存在差异的菜心为研究对象，设置32℃热激处理6h、12h、24h、48h四个处理，以无高温预处理的新鲜小孢子培养为对照，研究不同热激时间对菜心游离小孢子胚诱导的影响；
步骤五、常规培养与改良方法培养对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以常规培养为对照，综合试验步骤一至步骤四的试验结果，组合成改良培养方法。以20个菜心品种为试验材料，研究这两种培养方法对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响，花蕾采集、小孢子游离、暗培养等其他条件均保持一致。
4.根据权利要求3所述的提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，其特征在于：所述的激素浓度及配比为0.00mg/L 6-BA+0.00mg/LNAA、0.05mg/L6-BA+0.05mg/LNAA、0.05mg/L 6-BA+0.10mg/LNAA、0.05mg/L 6-BA+0.20mg/LNAA、0.10mg/L 6-BA+0.05mg/LNAA、0.10mg/L6-BA+0.10mg/LNAA、0.10mg/L 6-BA+0.20mg/LNAA、0.15mg/L 6-BA+0.05mg/LNAA、0.15mg/L6-BA+0.10mg/LNAA或0.15mg/L 6-BA+0.20mg/LNAA。
5.根据权利要求3所述的提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，其特征在于：所述的活性炭的浓度为0、50、100、150、200或400mg/L。
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