CN115316269A - 一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法 - Google Patents
一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115316269A CN115316269A CN202111103504.2A CN202111103504A CN115316269A CN 115316269 A CN115316269 A CN 115316269A CN 202111103504 A CN202111103504 A CN 202111103504A CN 115316269 A CN115316269 A CN 115316269A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- radish
- buds
- temperature
- microspores
- rate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 title claims abstract description 57
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 240000001970 Raphanus sativus var. sativus Species 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000005733 Raphanus sativus var niger Nutrition 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000011380 Raphanus sativus Nutrition 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 231100000732 tissue residue Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，专用于提高迟钝基因型萝卜游离小孢子胚胎发生率的方法，具体方法为：(1)活跃基因型萝卜花蕾个数：迟钝基因型萝卜花蕾个数＝1：2，将选取的花蕾置于4℃下预处理10～12h，接着置于6℃下预处理8～10h；(2)消毒后的花蕾加入pH5.8的B5提取液中进行提纯，获得提纯后的小孢子；(3)将提纯后的小孢子悬浮在pH5.8的1/2NLN‑13(添加0.30mg/L 6‑BA)培养基中，32.5℃下热激处理6～8h后，室温下静置暗培养，得到肉眼可见的胚状体；(4)将胚状体振荡培养，获得子叶型胚。本发明明显提高了迟钝基因型圆白萝卜小孢子胚胎发生率由0增加到5胚/蕾，本发明解决了现有技术存在的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，属于一种植物小孢子的培养方法，专用于提高迟钝基因型萝卜游离小孢子胚胎发生率的方法。
背景技术
萝卜(Raphanus sativus L)为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，栽培萝卜主要分为中国萝卜和四季萝卜两个亚种，中国萝卜为大型萝卜、四季萝卜为小型萝卜。中国萝卜是原产于我国的重要根菜类蔬菜作物，以膨大肉质直根为主要产品器官，是我国大众蔬菜之一、年种植面积达130万hm2，在蔬菜生产供应中占有重要地位。
国内萝卜新品种选育多采用常规育种技术，选择效率低，育种年限长，又因萝卜是异花授粉作物，多代自交易导致萝卜根变小、变劣等种性退化相关的问题发生，极大地制约了萝卜产业的发展。
单倍体具有单套染色体组，经染色体加倍成双单倍体后应用于优势育种，可显著加快品种选育进程。游离小孢子培养是作物产生单倍体的有效途径之一，是植物单倍体育种的重要手段。游离小孢子培养/花药培养技术可直接从花蕾或花药中获得新鲜的小孢子群体，在单细胞水平上获得基因型纯系植株，进而利用单倍体加倍技术获得性状稳定的双单倍体(DH)纯合体，大大缩短亲本基因型纯合时间，加快育种进程，提高品种育种效率。
萝卜虽属于十字花科，但它是该科最不容易进行游离孢子培养的材料，目前国内外报道较少，且在培养中普遍存在基因型偏性问题。如何提高一些迟钝基因型(成胚率≤1胚/蕾)的成胚率，是萝卜小孢子培养中急需解决的问题。
发明内容
本发明正是针对现有技术存在的不足，提供了一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，用以解决迟钝基因型萝卜小孢子胚胎发生率过低的技术问题，满足实际使用要求。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
本发明提供了一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，包括以下步骤：
(1)根据最低气温的相应高低选取适宜的花蕾并进行低温(变温)预处理18～22h；
单核靠边期小孢子占比最多的萝卜花蕾，其长度一般为2.5～3.5mm，但花蕾大小(长度、发育进展等)受温度影响较大；最低气温低于10℃时选长度为3.0～3.5mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)，最低气温高于10℃时选择长度为2.5～3.0mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)；
活跃基因型(成胚率≥5胚/蕾)萝卜花蕾个数：迟钝基因型萝卜花蕾个数＝1：2；
将选取的花蕾置于4℃下预处理10～12h，接着置于6℃下预处理8～10h。
(2)将步骤(1)的花蕾消毒后加入pH5.8的B5提取液中进行提纯，获得提纯后的小孢子；
(3)将步骤(2)提纯后的小孢子悬浮在pH5.8的1/2NLN-13(添加0.30mg/L 6-BA)培养基中32.5℃下热激处理6～8h后，室温下静置暗培养，得到肉眼可见的胚状体；
(4)将步骤(3)的胚状体振荡培养，获得子叶型胚。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例来说明本发明的内容。
实施例
1、实验材料：
1)拟取花蕾的萝卜种株：秋季分别选取满身红萝卜(活跃基因型萝卜品种)和圆白萝卜(迟钝基因型萝卜品种)的种根种植于江苏省农业科学院六合基地蔬菜留种大棚内，田间管理同常规。
2)B5培养基。
3)1/2NLN-13的制备：
在每100ml液体NLN中加入13g蔗糖，获得NLN-13，将NLN-13与水按体积比1：1混合稀释，获得大量元素减半的1/2NLN-13。
2、具体步骤：
1)3月上旬至4月中旬，从满身红萝卜和圆白萝卜种株上采集花蕾进行游离小孢子培养；
单核靠边期小孢子占比最多的萝卜花蕾，其长度一般为2.5～3.5mm，但花蕾大小(长度、发育进展等)受温度影响较大；最低气温低于10℃时选长度为3.0～3.5mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)，最低气温高于10℃时选择长度为2.5～3.0mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)；
满身红萝卜花蕾个数：圆白萝卜花蕾个数＝1：2；
将选取的花蕾置于4℃下预处理10～12h，接着置于6℃下预处理8～10h；
2)小孢子分离：将上述花蕾以24～30个为一组，经流水冲洗沥干水分备用，在无菌工作台上将选取的花蕾置于灭菌的烧杯中，经75％酒精消毒20s，用2％的次氯酸钠表面消毒15min，无菌水冲洗3遍，转至破碎仪中，2000rpm，30s，加入少量经高温灭菌的B5提取液，挤出小孢子；含小孢子的悬浮液用400目尼龙网过滤，除去较大的组织残渣，收集悬浮液于离心管，1000rpm离心3min，弃去上清液，再加入4mlB5提取液离心，重复3次，弃去上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子；
3)游离小孢子培养：纯化后的小孢子用1/2NLN-13(添加0.30mg/L 6-BA)培养液稀释，保持花粉密度为1.0×105蕾/ml，以每皿3ml小孢子悬浮液分装入直径为30mm的无菌玻璃培养皿中，用封口膜封口；在32.5℃恒温培养箱中热激处理6～8h后，再转至25℃下静置暗培养；
4)待出现肉眼看见的胚状体后，将胚状体转入转速为55rpm的摇床上震荡培养21～28d，得到子叶型胚，统计胚胎发生率。
利用该方法，满身红萝卜和圆白萝卜小孢子胚胎平均发生率可达13胚/蕾和5胚/蕾，本项技术把迟钝基因型圆白萝卜小孢子胚胎发生率由0提高到5胚/蕾。
Claims (4)
1.一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于：如何提高迟钝基因型萝卜游离小孢子胚胎发生率的问题；具体方法为：
1)根据最低气温的相应高低选取适宜的花蕾并进行低温(变温)预处理18～22h；单核靠边期小孢子占比最多的萝卜花蕾，其长度一般为2.5～3.5mm，但花蕾大小(长度、发育进展等)受温度影响较大；最低气温低于10℃时选长度为3.0～3.5mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)，最低气温高于10℃时选择长度为2.5～3.0mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)；活跃基因型(成胚率≥5胚/蕾)萝卜花蕾个数：迟钝基因型萝卜花蕾个数＝1：2；将选取的花蕾置于4℃下预处理10～12h，接着置于6℃下预处理8～10h；
2)将步骤1)的花蕾消毒后加入pH5.8的B5提取液中进行提纯，获得提纯后的小孢子；
3)将步骤2)提纯后的小孢子悬浮在pH5.8的1/2NLN-13(添加0.30mg/L6-BA)培养基中，32.5℃下热激处理6～8h后，室温下静置暗培养，得到肉眼可见的胚状体；
4)将步骤3)胚状体振荡培养，获得子叶型胚。
2.根据权利要求1所述的一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于：所述步骤1)活跃基因型(成胚率≥5胚/蕾)萝卜花蕾个数：迟钝基因型(成胚率≤1胚/蕾)萝卜花蕾个数＝1：2；成胚率≥5胚/蕾的萝卜品种定义为活跃基因型萝卜品种，成胚率≤1胚/蕾的萝卜品种定义为迟钝基因型萝卜品种。
3.根据权利要求1所述的一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于：所述步骤1)将选取的花蕾置于4℃下预处理10～12h，接着置于6℃下预处理8～10h，同时低温+变温预处理花蕾，增加小孢子的活力。
4.根据权利要求1所述的一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于：所述步骤3)将步骤2)提纯后的小孢子悬浮在pH5.8的1/2NLN-13(添加0.30mg/L 6-BA)培养基中，32.5℃下热激处理6～8h后，室温下静置暗培养，得到肉眼可见的胚状体；添加0.30mg/L 6-BA明显增加了出胚率；32.5℃下热激处理6～8h是最佳热激温度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111103504.2A CN115316269A (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111103504.2A CN115316269A (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115316269A true CN115316269A (zh) | 2022-11-11 |
Family
ID=83912450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111103504.2A Pending CN115316269A (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115316269A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1543780A (zh) * | 2003-11-21 | 2004-11-10 | 北京市农林科学院 | 一种萝卜游离小孢子的培养方法 |
| US20090100538A1 (en) * | 2005-05-24 | 2009-04-16 | Ferrie Alison M R | Methods for producing microspore derived doubled haploid apiaceae |
| CN104186309A (zh) * | 2014-07-30 | 2014-12-10 | 镇江瑞繁农艺有限公司 | 一种提高胭脂萝卜胚胎发生率的方法 |
| CN110731271A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-01-31 | 海南省农业科学院蔬菜研究所 | 一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法 |
-
2021
- 2021-09-23 CN CN202111103504.2A patent/CN115316269A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1543780A (zh) * | 2003-11-21 | 2004-11-10 | 北京市农林科学院 | 一种萝卜游离小孢子的培养方法 |
| US20090100538A1 (en) * | 2005-05-24 | 2009-04-16 | Ferrie Alison M R | Methods for producing microspore derived doubled haploid apiaceae |
| CN104186309A (zh) * | 2014-07-30 | 2014-12-10 | 镇江瑞繁农艺有限公司 | 一种提高胭脂萝卜胚胎发生率的方法 |
| CN110731271A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-01-31 | 海南省农业科学院蔬菜研究所 | 一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 张丽;郑鹏婧;: "春白萝卜游离小孢子培养的研究" * |
| 李晓梅;冉茂林;杨峰;: "萝卜游离小孢子成胚诱导影响因素研究进展" * |
| 陈琳;雍晓平;冉茂林;: "萝卜根形对游离小孢子培养成胚率的影响" * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1067511C (zh) | 引入育性恢复基因并由此制备芸苔属植物f1杂种的方法 | |
| CN102228007B (zh) | 一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法 | |
| CN102047843B (zh) | 一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法 | |
| CN104429952B (zh) | 一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法 | |
| CN100496225C (zh) | 棉花叶柄组织培养与高分化率材料选育方法 | |
| CN112931198A (zh) | 一种菠萝抗寒种质的制备方法 | |
| CN102144560B (zh) | 一种获得芸薹属a基因组蔬菜新种质的方法及应用方法 | |
| Wang et al. | Initiation and development of microspore embryogenesis in recalcitrant purple flowering stalk (Brassica campestris ssp. chinensis var. purpurea Hort.) genotypes | |
| CN103651111A (zh) | 榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法 | |
| CN103299896A (zh) | 一种广适性耐抽苔春白菜游离小孢子的培养方法 | |
| Vardi et al. | Isolation and culture of Citrus protoplasts | |
| CN103053423B (zh) | 以花椰菜小孢子胚为外植体建立再生体系的方法 | |
| CN1666600A (zh) | 利用子叶柄作为外植体的棉花组织培养方法 | |
| CN1869202A (zh) | 一种不结球白菜游离小孢子培养技术 | |
| CN112931197B (zh) | 一种菠萝组织培养苗的制备方法 | |
| CN1799332A (zh) | 制备植物单倍体胚和单倍体植株的方法 | |
| CN102181424B (zh) | 原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法 | |
| CN115316269A (zh) | 一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法 | |
| CN112106663B (zh) | 一种杨梅实生无性系的建立方法 | |
| CN103782902A (zh) | 一种借助60Co-γ射线诱变和小孢子培养创制大白菜突变体的方法 | |
| CN1778169A (zh) | 一种牡丹胚状体诱导方法 | |
| CN103798125A (zh) | 一种获得十字花科蔬菜新种质的方法及其应用方法 | |
| CN114027181A (zh) | 一种萝卜小孢子培养方法 | |
| CN1237868C (zh) | 菹草胚培养方法 | |
| CN101946713B (zh) | 甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20221111 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |