CN102047843B - 一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法 - Google Patents
一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其步骤如下：(1)选取小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的供体植株的花蕾，4℃预处理1-3天；(2)剥去花萼后，先用酒精浸泡，再用次氯酸钠振荡消毒，然后用无菌水清洗；(3)将花药剥离，以每60mm直径培养皿12-18枚花药的密度接种于N4-3固液双层培养基上；(4)花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下继续黑暗培养；(5)培养4-7周时间，待大量胚状体发生时，将子叶型胚状体转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗。经过本发明培育方法，胚状体发生率突破了基因型的限制，甜辣椒的培养效率得到了大幅度提高，同时DH株比率也得到了提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种单倍体育种技术。
背景技术
通过单倍体培养，丰富的分离、变异和重组在当代就能显示，并可以通过染色体加倍以纯合的形式永久稳定下来。与常规育种技术相比较，单倍体育种技术具有以下优势：首先，可显著加快纯合速度，应用单倍体育种可缩短作物育种周期5-6个世代；其次，加倍单倍体的隐性基因不受显性基因遮盖而能正常表达，可显著提高基因型的选择效率和选择的准确性，有利于多基因重组和隐性基因的选择。此外，单倍体培养在遗传分析、基因工程、分子生物学及物种进化等领域，都有重要的应用和研究价值。
甜辣椒(即Capsicum annuum L.，包括甜椒和辣椒等不同基因型)单倍体的发生主要通过雄核发育途径，即可通过花药培养和游离小孢子培养得到其单倍体。20世纪70年代，我国在国际上最早开展了甜辣椒花药培养研究。其后，国内外的多位科研工作者在甜辣椒花药培养和游离小孢子培养上投入了大量精力。目前，甜辣椒花药培养获得了一定发展，但真实培养效率不能令人满意，尚存在基因型反应率低、有效胚状体发生率低、培养周期长、内生菌污染严重等问题。因此，要获得一定群体规模的加倍单倍体须耗费大量资源和工作量，培养时间也大大拉长，不能满足育种实践需要。
游离小孢子培养不受母体组织影响，且成熟游离培养体系的一次培养产胚量大，同时游离小孢子还具备分散性单细胞特点，是理想的遗传转化受体材料。但甜辣椒游离小孢子培养难度大，国内外曾有过辣椒基因型材料的成功报道，但关于甜椒基因型材料尚无成功报道，经本实验室数次重复，发现报道方法受基因型限制大，甜椒材料基本上无法获得理想的胚状体发生率及再生株获得率。
此外，在普通的甜辣椒单倍体培育实验中，单倍体植株的加倍也一直是一个难点。经过自然加倍或人工加倍得到的双单倍体(Doubled Haploid，DH)植株对于育种、分子生物学、遗传学研究等具有重要意义。而甜辣椒小孢子培养或花药培养得到的再生株中，自然加倍的DH株所占比例仅为30％左右。其余为单倍体、混倍体、非整倍体等，其中单倍体所占比例最大，约为55％左右(培养基、培养条件和基因型的不同可导致差异)。现有技术中常用的田间秋水仙碱加倍法的加倍效果也并不理想。因此，大量的单倍体植株被浪费，限制了甜辣椒单倍体培育技术的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够解决上述问题，可以较为高效地获得甜辣椒双单倍体植株的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其步骤如下：
(1)选择长势良好、无病虫害的植株作为供体植株，通过镜检选取小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的花蕾，4℃低温预处理花蕾1-3天；
(2)选取合适大小的花蕾——不同基因型的处在上述发育时期的花蕾大小可有不同，大致上，合适的花蕾处在花瓣与花萼呈平齐状态至花瓣稍长于花萼的状态之间，更一般地，可选择花瓣不短于花萼的花蕾；
将花蕾剥去花萼后，先用75％(v/v)的酒精浸泡30s，再用8-10％(v/v)的次氯酸钠振荡消毒10-20min，然后用无菌水清洗3次，每次3-5min；
(3)在工作台上将花药完好无损地剥离，以每60mm直径培养皿接种12-18枚花药的密度接种于N4-3固液双层培养基上，所述N4-3固液双层培养基的配方为：
固体层：NTH培养基+3-6％蔗糖+0.5％活性炭+0.8％琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和琼脂粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；
液体层：NTH培养基+3-6％蔗糖+IAA 0.5-1.5mg/L+6-BA 0.1-0.6mg/L+戊炔草胺0.1-0.5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比；
所述固体层经121℃高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌；
(4)花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下继续黑暗培养；
(5)培养4-7周时间，即可看到大量胚状体发生，将子叶型胚状体转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗。
如上所述的获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其中，所述NTH培养基的配方为：
硝酸铵：825mg/L，硝酸钾：950mg/L，二水氯化钙：166mg/L，七水硫酸镁：185mg/L，磷酸二氢钾：680mg/L，硼酸：6.20mg/L，四水硫酸锰：25mg/L，七水硫酸锌：10mg/L，二水钼酸钠：0.25mg/L，无水硫酸铜：0.025mg/L，六水氯化钴：0.03mg/L，肌醇：100mg/L，烟酸：5mg/L，盐酸吡哆醇：0.5mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，叶酸：5mg/L，生物素：0.5mg/L。
一种用于培育甜辣椒双单倍体植株的培养基，为固液双层培养基，其配方为：
固体层：NTH培养基+3-6％蔗糖+0.5％活性炭+0.8％琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和琼脂粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；
液体层：NTH培养基+3-6％蔗糖+IAA 0.5-1.5mg/L+6-BA 0.1-0.6mg/L+戊炔草胺0.1-0.5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比；
所述固体层经121℃高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌。
如上所述的用于培育甜辣椒双单倍体植株的培养基，其中，所述NTH培养基的配方为：
硝酸铵：825mg/L，硝酸钾：950mg/L，二水氯化钙：166mg/L，七水硫酸镁：185mg/L，磷酸二氢钾：680mg/L，硼酸：6.20mg/L，四水硫酸锰：25mg/L，七水硫酸锌：10mg/L，二水钼酸钠：0.25mg/L，无水硫酸铜：0.025mg/L，六水氯化钴：0.03mg/L，肌醇：100mg/L，烟酸：5mg/L，盐酸吡哆醇：0.5mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，叶酸：5mg/L，生物素：0.5mg/L。
本发明的有益效果为：
应用本发明的培育方法，甜辣椒胚状体的发生突破了基因型的限制，特别是甜椒基因型的培养效率得到了大幅度提高。同时，甜椒和辣椒的再生株中DH株比率均得到了明显提高。
本发明培育方法及培养基中的组分戊炔草胺是一种生产上常用的选择性除草剂，其作为一种抗微管物质，可有效抑制纺锤丝的形成，使植物染色体复制而不分开，从而使染色体加倍。与秋水仙碱相比，戊炔草胺的染色体加倍效果相当，应用浓度低，并具有无毒的特性。
附图说明
图1为采用本发明培育方法的胚状体发生情况示意照片。
图2为采用本发明培育方法的胚状体成苗情况示意照片。
具体实施方式
实施例1
本发明的甜辣椒双单倍体培育方法的具体步骤如下：
(1)选择长势良好、无病虫害植株作为供体植株，严格按镜检结果选取小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的花蕾，4℃低温预处理花蕾1-3天；
(2)取合适大小的花蕾，剥去花萼后，用75％(v/v)的酒精浸泡30s，再用8-10％(v/v)的次氯酸钠振荡消毒10-20min，最后用无菌水清洗3次，每次3-5min；
(3)在工作台上将花药完好无损的剥离，以每60mm直径培养皿12-18枚花药的密度接种于N4-3固液双层培养基上，N4-3培养基的配方为：
固体层：NTH培养基+3-6％蔗糖+0.5％活性炭+0.8％琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和琼脂粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；
液体层：NTH培养基+3-6％蔗糖+IAA 0.5-1.5mg/L+6-BA 0.1-0.6mg/L+戊炔草胺0.1-0.5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比；
所述固体层经121℃高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌；
(4)花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下继续黑暗培养；
(5)培养4-7周时间，即可看到大量胚状体发生，将子叶型胚状体转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗；待再生株长至3-4片真叶，切取叶片，通过流式细胞仪或保卫细胞叶绿体计数法鉴定植株倍性。
二倍体植株的准确鉴定以田间植株的坐果与结籽情况为准，小孢子途径得到的DH株以后代不发生性状分离为判断标准。
其中，所述NTH培养基的配方如下所示：
示例性的经本发明培育方法得到的甜辣椒的胚状体发生状况如图1所示，可见到接种在培养基上的黄色的花药及数目众多的发生的胚状体。示例性的经本发明培育方法得到的甜辣椒胚状体的成苗状况如图2所示，可见胚状体的成苗状况良好。
对比例1
对照培育方法的具体步骤如下：
(1)镜检选取小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的花蕾，4℃低温预处理花蕾1-3天；
(2)取合适大小的花蕾，剥去花萼后，75％(v/v)的酒精浸泡花药30s，8-10％(v/v)的次氯酸钠振荡消毒10-20min，最后用无菌水清洗3次，每次3-5min；
(3)将花药以每60mm直径培养皿12-18枚花药的密度接种于Nitsch固液双层培养基上，Nitsch培养基的配方为：
固体层：Nitsch基本培养基+麦芽糖2-5％(w/w)+活性炭0.5％(w/w)+琼脂粉0.8％(w/w)，121℃高压灭菌；液体层：Nitsch+麦芽糖2-5％(w/w)+IAA0.5-1.5mg/L+ZT(玉米素)0.1-0.5mg/L，抽滤灭菌；
(4)花药先于9℃黑暗培养5-10天，接着转至25-30℃条件下黑暗培养；
(5)培养直至出胚，继而培育壮苗，进行植株倍性鉴定。
其中，所述Nitsch培养基配方如下所示：
实施例及对比例培养效果的检验
分别采用上述本发明的培育方法及对照培育方法对供试的共计6个基因型进行统计，其中3个为甜椒基因型(基因型编号分别为06-51×-223、SY07-119×-129、07-122×-107)，3个为辣椒基因型(基因型编号分别为08-Y3、07-75×-54、06-109×-113)。
采用本发明的单倍体培育方法的培育结果如表1所示。6个基因型合计平均产胚率为9.91个胚/花蕾，单皿统计产胚率最高可达55.00个胚/花蕾(表中未示出)，各基因型合计再生株平均自然加倍率为58.29％。其中3个甜椒基因型的平均产胚率为6.21个胚/花蕾，再生株平均自然加倍率为55.22％；3个辣椒基因型的平均产胚率为14.66个胚/花蕾，再生株平均自然加倍率为59.76％。
采用对照培育方法的培育结果如表2所示，6个基因型合计平均产胚率为4.33个胚/花蕾，再生株平均自然加倍率为29.74％。其中3个甜椒基因型的平均产胚率仅为0.03个胚/花蕾，显著低于本发明培育方法，再生株平均自然加倍率为40.00％；3个辣椒基因型的平均产胚率为9.88个胚/花蕾，再生株平均自然加倍率为30.06％。
由表1可见，和对照培育方法相比，本发明的双单倍体培育方法显著提高了辣椒胚状体发生率，特别是甜辣椒基因型的的胚状体发生率。同时，本发明的培育方法还将辣椒再生株中DH株的比率提高了近一倍。
表1本发明培育方法对不同基因型辣椒的培养效率
表2对照培育方法对不同基因型辣椒的培养效率
Claims (4)
1.一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）选取小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的甜辣椒供体植株的花蕾，4℃低温预处理花蕾1-3天；
（2）取花瓣不短于花萼的花蕾，剥去花萼后，先用体积百分比75%的酒精浸泡30s，再用体积百分比8-10%的次氯酸钠振荡消毒10-20min，然后用无菌水清洗3次，每次3-5min；
（3）将花药完整地剥离，以每60mm直径培养皿接种12-18枚花药的密度接种于N4-3固液双层培养基上，其中，所述N4-3固液双层培养基的配方为：
固体层：NTH培养基+3-6%蔗糖+0.5%活性炭+0.8%琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和琼脂粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；
液体层：NTH培养基+3-6%蔗糖+IAA 0.5-1.5mg/L+6-BA 0.1-0.6mg/L+戊炔草胺0.1-0.5 mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比；
所述固体层经121℃高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌；
（4）花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下继续黑暗培养；
（5）培养4-7周时间，待胚状体发生时，将子叶型胚状体转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗。
2.如权利要求1所述的获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其特征在于，所述NTH培养基的配方为：
硝酸铵：825mg/L，硝酸钾：950mg/L，二水氯化钙：166mg/L，七水硫酸镁：185mg/L，磷酸二氢钾：680mg/L，硼酸：6.20mg/L，四水硫酸锰：25mg/L，七水硫酸锌：10mg/L，二水钼酸钠：0.25mg/L，无水硫酸铜：0.025mg/L，六水氯化钴：0.03mg/L，肌醇：100mg/L，烟酸：5mg/L，盐酸吡哆醇：0.5mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，叶酸：5mg/L，生物素：0.5mg/L。
3.一种用于培育甜辣椒双单倍体植株的培养基，其特征在于，为固液双层培养基，其配方为：
固体层：NTH培养基+3-6％蔗糖+0.5％活性炭+0.8％琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和琼脂粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；
液体层：NTH培养基+3-6％蔗糖+IAA 0.5-1.5mg/L+6-BA 0.1-0.6mg/L+戊炔草 胺0.1-0.5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比；
所述固体层经121℃高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌。
4.如权利要求3所述的用于培育甜辣椒双单倍体植株的培养基，其特征在于，所述NTH培养基的配方为：
硝酸铵：825mg/L，硝酸钾：950mg/L，二水氯化钙：166mg/L，七水硫酸镁：185mg/L，磷酸二氢钾：680mg/L，硼酸：6.20mg/L，四水硫酸锰：25mg/L，七水硫酸锌：10mg/L，二水钼酸钠：0.25mg/L，无水硫酸铜：0.025mg/L，六水氯化钴：0.03mg/L，肌醇：100mg/L，烟酸：5mg/L，盐酸吡哆醇：0.5mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，叶酸：5mg/L，生物素：0.5mg/L。
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