CN116491415B - 优化温度提高cenh3介导的母本单倍体诱导效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种优化温度提高CENH3介导的母本单倍体诱导效率的方法。该方法通过低温培养或处理获得育性恢复的单倍体诱导系植株得到大量用于母本单倍体诱导的花粉，然后将育性恢复的单倍体诱导系作为父本给目标植物授粉，授粉后的母本植株转移至热处理培养室处理，杂交种子萌发后可得到高比例的母本单倍体植株。单倍体诱导系育性差和单倍体诱导效率低严重限制了单倍体技术在生产中的应用。本发明通过对单倍体诱导系冷处理轻易得获得大量可用于母本单倍体诱导的花粉，且通过诱导后热处理，显著提高单倍体诱导系杂交后代的母本单倍体比率，提高了母本单倍体的诱导效率。本发明会对CENH3介导的单倍体诱导生物技术在植物育种中的推广起到极大作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物育种领域，具体涉及一种优化温度提高CENH3介导的母本单倍体诱导效率的方法。
背景技术
传统育种过程往往需要自交6-8代才能获得纯合可用于农业生产的自交系，但双单倍体育种技术可以在两代内即可拿到100%纯合的材料，大大缩短了植物育种年限，显著提高育种效率。在过去半个多世纪，科学家和育种工作者获得植物单倍体主要有四种途径：配子体离体培养、辐射处理花粉、种间杂交以及单倍体诱导系。其中单倍体诱导系具有潜在的普适性和便利性，对于现代育种尤为重要。
CENH3是植物中的着丝粒特异性组蛋白H3变体，可替换着丝粒核小体组蛋白中的H3，在染色体分离和动粒复合体组装过程中发挥重要作用。2010年在研究CENH3在着丝粒部位作用的互补实验中，研究人员将CENH3的N末端尾替换为组蛋白3.3的N末端尾，并在N末端尾加上GFP绿色荧光蛋白。在杂合的cenh3-1突变体（纯合胚胎致死）中外源导入改造后的CENH3重组基因，并从中筛选出cenh3-1纯合但含有重组的CENH3的GFP-tailswap植株株系。该株系作为母本与不同生态型的拟南芥进行杂交，后代产生34％到45％的父本单倍体，该株系作为父本与不同生态型的拟南芥进行杂交，后代产生~5％的母本单倍体(Ravi andChan 2010) 。此外，拟南芥中含有CENH3点突变的突变体也具备单倍体诱导能力，不同的突变体与野生型杂交获得的单倍体诱导率从0.61％到44.1％不等(Kuppu et al 2015;Kuppu et al 2020) 。基于CENH3在真核生物中的保守性，在其他作物中编辑该基因从而得到单倍体诱导系的可行性也被广泛检验。但目前仅在玉米和小麦中有明确的关于改造自身CENH3 获得单倍体诱导系的报道。在玉米中采用拟南芥相同的替换策略实现3.6%的单倍体诱导效率(Kelliher et al 2016) ，玉米CENH3缺陷杂合突变体的 HIR 则达到 5.2% 左右的单倍体诱导效率(Wang et al 2021) 。六倍体小麦A、B、D三个亚基因组中， B和D亚基因组中的CENH3基因缺失，A亚基因组中CENH3基因移码突变，可以实现7%左右的单倍体诱导效率(Lv et al 2020) 。尽管在其他物种中可以实现CENH3改造获得诱导系，但单倍体诱导效率远低于拟南芥的单倍体诱导效率。
由上可知，现有的单倍体诱导方法存在以下缺点：
1.基于CENH3构建的单倍体诱导系GFP-tailswap，具有诱导效率高但育性差的弱点；
2.对CENH3进行点突变等操作，育性虽好但诱导效率较低；
3.虽然GFP-tailswap作为母本时诱导效率较高，但其诱导产生的父本单倍体依旧含有GFP-tailswap 的细胞质，对于生产使用过程中可能存在干扰。而GFP-tailswap作为父本诱导母本单倍体，诱导效率低；
4. CENH3介导的单倍体诱导系同时具有父本单倍体诱导能力及母本单倍体诱导能力，但母本单倍体诱导能力受到花粉数量少及诱导效率低两方面影响，限制了在实际操作过程中的应用。
综上研究表明，单倍体诱导率在不同的CENH3编辑系统中存在差异，且作物单倍体株系的单倍体诱导效率远低于拟南芥，极大地限制了该单倍体诱导技术在植物育种生产中的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种优化温度提高CENH3介导的母本单倍体诱导效率的方法；该方法通过冷热处理恢复CENH3介导的单倍体诱导系的育性及提高母本单倍体诱导效率；解决了以下问题：
1.解决GFP-tailswap单倍体诱导系育性差的问题，使GFP-tailswap诱导系能自交传代方便；
2.解决GFP-tailswap单倍体诱导系育性差的问题，使GFP-tailswap在作为父本时提供足够的花粉；
3.需解决GFP-tailswap在常温条件下诱导效率低下的问题；
4.解决现有CENH3介导的单倍体诱导系育性不佳以及母本单倍体诱导率低等问题。
5.解决了CENH3介导的单倍体诱导系作为母本单倍体诱导系的限制的问题。
为实现上述目的，本发明所设计技术方案如下：
本发明提供了一种优化温度提高CENH3介导的母本单倍体诱导效率的方法，通过改变植物培养温度条件，从诱导系育性和花粉供体活力以及诱导后单倍体比率三个个方面优化CENH3介导的母本单倍体诱导效率的方法，所述方法首先通过降低诱导系生长环境温度恢复单倍体诱导系花粉育性，然后通过母本诱导后进行高温处理提高母本单倍体诱导后代单倍体比例，得到单倍体诱导系植株（利用温度对单倍体花粉活力和单倍体诱导后代单倍体比例的影响在时空上分离的特点）。
进一步地，所述CENH3介导的母本单倍体诱导系为GFP-tailswap植株株系，该GFP- tailswap的诱导方法如下：
将CENH3的N末端尾替换为组蛋白3.3的N末端尾，并在N末端尾加上GFP绿色荧光蛋白，在杂合的cenh3-1突变体（纯合胚胎致死）中外源导入改造后的CENH3重组基因，并从中筛选出cenh3-1纯合且含有重组的CENH3的GFP-tailswap植株株系。
本发明还提供了一种利用低温恢复单倍体诱导系育性和花粉活力的方法，所述方法通过将其他生长条件下获得的GFP-tailswap单倍体诱导系植株转换到低于20°C温度环境条件下生长来恢复单倍体诱导系的育性和花粉活力。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
将GFP-tailswap单倍体诱导系种子消毒处理，春化萌发后移栽至低于等于18 ℃，16小时光照/8小时黑暗条件下培养，得到育性恢复的单倍体诱导系。
再进一步地，所述方法包括以下步骤：
将GFP-tailswap单倍体诱导系种子消毒处理，春化萌发后移栽至低于14 ℃ - 18℃，16小时光照/8小时黑暗条件下培养，得到育性恢复的单倍体诱导系。
本发还提供了一种通过母本诱导进行高温处理提高母本单倍体诱导后代单倍体比例的方法，所述方法包括以下步骤：
A.首先去除目标植物大小合适花苞雄蕊，待雌蕊成熟后，将GFP-tailswap单倍体诱导系植株花粉涂抹于目标植物雌蕊柱头之上；
B.随后将授粉后目标植物在高温生长条件下培养至种子成熟后收获杂交种子；
C.使用流式细胞的方法鉴定收获的杂交种中产生的单倍体植株。
进一步地，所述步骤B中，温度为25 ℃ - 30 ℃。
本发还提供了一种提高CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导效率的方法，包括以下步骤：
1）植株培养
将GFP-tailswap单倍体诱导系种子消毒处理，4℃低温处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养7-10天，取生长良好的幼苗转移至栽培土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养至即将抽薹，得到单倍体诱导系植株；
2）冷处理
将单倍体诱导系植株转移至冷处理培养室，培养至育性恢复；
3）杂交
将步骤2）得到育性恢复的单倍体诱导系植株作为父本材料，Col-0野生型或gl1突变体作为母本材料，第一天用镊子去除母本植株大小合适花苞的雄蕊，第三天摘取冷处理后育性恢复的单倍体诱导系植株花朵，将花粉涂抹在去雄花朵柱头上进行授粉，每个花序授粉2-4个柱头；
4）热处理
将授粉后的母本植株转移至热处理培养室，继续培养至种子成熟后，收种获得F1代；
5）鉴别单倍体植株
将F1代种子进行消毒，4℃处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养得到植株，鉴定植株得到单倍体植株。
进一步地，所述步骤1）中，GFP-tailswap单倍体诱导系是在cenh3-1杂合植株中转入一个N端尾巴被H3.3的N端尾巴替换后接上GFP蛋白的重组CENH3，经过筛选cenh3-1纯合和重组的CENH3纯合植株，即获得GFP-tailswap株系。
再进一步地，所述步骤1）中，栽培土由营养土、基质和蛭石按质量比1:1:1混合而成。
再进一步地，所述步骤2）中，冷处理培养室的培养条件：温度为18℃，16小时光照/8小时黑暗。
再进一步地，所述步骤3）中，gl1突变体为Ler-0背景的GL1基因突变，造成显性的无毛状体表型，若F1为无毛状体植株，则判定为单倍体。
再进一步地，所述步骤4）中，热处理培养室的培养条件：温度为25℃，16小时光照/8小时黑暗。
再进一步地，所述步骤4）中，收种标准为：同一种母本植株的F1统一收种保存。
再进一步地，所述步骤5）中，若母本为Col-0野生型时，观察植株抽薹后的性状同时使用流式细胞仪检测植株倍性，确定得到单倍体植株；
或者，若母本为gl1突变体时，植株长出两片及两片以上真叶后可根据叶片表面是否具有毛状体辨别单倍体植株，并用流式细胞仪抽样检测植株倍型。
再进一步地，所述流式细胞仪检测种子倍性的方法是取25 mg左右F1代种子培养出的植株的莲座叶，用ddH2O冲洗，置于冰上的培养皿中；加入400μL的Aru缓冲液，切割3min，用200μL Aru缓冲液洗涤培养皿中的细胞核并用30μm细胞过滤器过滤至收集管中；将20mg/mL RNase A 2.5μL和10mg/mL碘化丙啶(PI)溶液5μL加入收集管中，混合均匀，4℃避光放置30min；样品在Beckman CytoFLEX LX流式细胞仪上运行，使用Y585-PE-A过滤器检测PI发射光，每个样本统计大约10,000个细胞。
再进一步地，所述F1代种子培养出的植株的莲座叶是培养3周的植株莲座叶；
所述 Aru缓冲液包含9.65 mL MgSO4缓冲液，100μL 1M DTT, 250μL Triton X-100，其中，MgSO4缓冲液包含1.23g MgSO47H2O,1.85 g KCl,0.6 g HEPES，pH8.0。
本发明的有益效果：
1.本发明通过冷处理使CENH3介导的单倍体诱导系的正常可育花粉数量显著增多，同时通过热处理使CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导能力明显提高；
2.本发明使用单倍体诱导系冷处理恢复育性后作为父本杂交，随后进行热处理，可以提高单倍体诱导系杂交后代的母本单倍体率，且该促进能力不受限于单倍体诱导株系的类型，那么这一非生物技术手段将促进非模式植物，如水稻、玉米等作物进行单倍体诱导时的效率，会对CENH3介导的单倍体诱导生物技术在植物育种中的推广起到极大作用。
附图说明
图1为低温拯救GFP-tailswap的育性图；
图中，A为在18℃和22℃条件下生长的单倍体诱导系GFP-tailswap和Col角果伸长情况图，比例尺为1cm，
B为亚历山大染色法检测在18℃和22℃条件下生长的单倍体诱导系GFP-tailswap和Col的花粉活力图，紫红色染色表明花粉具有活力，比例尺为50μm。
图2为GFP-tailswap低温下相较高温产生更多正常的种子图；
图中，A为18℃和22℃条件下Col和GFP-tailswap的代表性图像，比例尺为1cm，
B为Col和GFP-tailswap植株在18℃和22℃条件下生长的角果长度的统计图，每种基因型至少分别统计3株单株的30个角果，条形图上方的星号表示显著差异，由方差分析后的Tukey检验确定，* * p<0.01，* * * p<0.001。
图3为gl1花粉在22℃和25℃授粉后不同的成熟种子的比例图；
收集不同
温度下gl1授粉的GFP-tailswap种子，在显微镜下分别计数黑且不可生存种子、皱纹种子(尺寸<1/2)、皱纹种子(尺寸>1/2)和饱满且可生存种子的比例。在每个温度条件下，从杂交种上收集到至少5个角果。
图4为单倍体表型及流式细胞鉴定结果图；
图中，A为单倍体子代、非整倍体子代和二倍体子代的植株表型图；
B为实施例1所提供的一种流式细胞仪检测的植株倍型图；横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞核倍型，2n为二倍体，1n为单倍体。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例
提高CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导效率的方法，包括以下步骤：
1.植株培养
将GFP-tailswap单倍体诱导系种子消毒处理，4℃低温处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养7-10天，取生长良好的幼苗转种土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养至即将抽薹；
2.冷处理
将单倍体诱导系植株转移至18℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室，培养至育性恢复，如图1所示；
3.杂交
将育性恢复的单倍体诱导系植株作为父本材料，Col-0野生型或gl1突变体作为母本材料，第一天用镊子去除母本植株大小合适花苞的雄蕊，第三天摘取冷处理后育性恢复的单倍体诱导系植株花朵，将花粉涂抹在去雄花朵柱头上进行授粉，每个花序授粉2-4个柱头；
4.热处理
将授粉后的母本植株转移至25℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室，继续培养至种子成熟后，收获F1代；
5.鉴别单倍体植株
将F1代种子进行消毒，4℃处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养，如果使用野生型作为母本，植株抽薹后可分辨单倍体植株，并使用流式细胞仪检测植株倍性，确定单倍体植株；如果使用gl1突变体作为母本，植株长出两片及两片以上真叶后可根据叶片表面是否具有毛状体辨别单倍体植株，并用流式细胞仪抽样检测植株倍型。
如图4所示，将培养皿置于冰上，加入400ul Aru缓冲液(9.65 mL MgSO4缓冲液(1.23g MgSO47H2O,1.85 g KCl,0.6 g HEPES，PH8.0)，100μL 1M DTT, 250μL Triton X-100)，取25 mg左右用ddH2O冲洗的莲座叶放入培养皿中，切割3 min释放细胞核。将所有混合物转移到30μm细胞过滤器中，用200μL Aru缓冲液洗涤培养皿中的细胞核，收集到细胞过滤器中，将细胞核过滤至收集管中。将20mg/mL RNase A 2.5μL和10mg/mL碘化丙啶(PI)溶液5μL加入5ml收集管中，混合均匀，4℃避光放置30min。样品在Beckman CytoFLEX LX流式细胞仪上运行，使用Y585-PE-A过滤器检测PI发射光，每个样本统计大约10,000个细胞。
实施例2
本实施例与实施例1的方法基本相同，不同之处在于：
母本材料为gl1突变体。
对照例1
1.单倍体诱导系GFP-tailswap植株培养
将GFP-tailswap单倍体诱导系种子消毒处理，4℃低温处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养7-10天，取生长良好的幼苗转种土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养至开花状态
2.杂交
将育性恢复的单倍体诱导系植株作为父本材料，Col-0野生型或gl1突变体作为母本材料，第一天用镊子去除母本植株大小合适花苞的雄蕊，第三天摘取冷处理后育性恢复的单倍体诱导系植株花朵，将花粉涂抹在去雄花朵柱头上进行授粉，每个花序授粉2-4个柱头；
3.热处理
将授粉后的母本植株转移至25℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室，继续培养至种子成熟后，收获F1代；
4.鉴别单倍体植株
将F1代种子进行消毒，4℃处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养，如果使用野生型作为母本，植株抽薹后可分辨单倍体植株，并使用流式细胞仪检测植株倍性，确定单倍体植株；如果使用gl1突变体作为母本，植株长出两片及两片以上真叶后可根据叶片表面是否具有毛状体辨别单倍体植株，并用流式细胞仪抽样检测植株倍型。
对照例2
1.植株培养
将GFP-tailswap单倍体诱导系种子消毒处理，4℃低温处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养7-10天，取生长良好的幼苗转种土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养至即将抽薹；
2.冷处理
将单倍体诱导系植株转移至18℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室，培养至育性恢复；
3.杂交
将育性恢复的单倍体诱导系植株作为父本材料，Col-0野生型或gl1突变体作为母本材料，第一天用镊子去除母本植株大小合适花苞的雄蕊，第三天摘取冷处理后育性恢复的单倍体诱导系植株花朵，将花粉涂抹在去雄花朵柱头上进行授粉，每个花序授粉2-4个柱头；
4.热处理
将授粉后的母本植株转移至22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室，继续培养至种子成熟后，收获F1代；
5.鉴别单倍体植株
将F1代种子进行消毒，4℃处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养，如果使用野生型作为母本，植株抽薹后可分辨单倍体植株，并使用流式细胞仪检测植株倍性，确定单倍体植株；如果使用gl1突变体作为母本，植株长出两片及两片以上真叶后可根据叶片表面是否具有毛状体辨别单倍体植株，并用流式细胞仪抽样检测植株倍型（如图4）。
如图1~3所示：对照例1未经过冷处理，GFP-tailswap单倍体诱导系植株育性并未恢复，未产生大量有活性的花粉，实验例1冷处理提高了拟南芥单倍体诱导株系GFP- tailswap的育性，同时，实验例热处理提高了拟南芥单倍体诱导系GFP-tailswap的母本单倍体诱导效率，F1代饱满且可生存的种子数目减少3。
如表1所示：通过杂交后代倍性鉴定，在对照例2中，GFP-tailswap的母本单倍体诱导效率为1.4％，而实施例1在冷热处理后，GFP-tailswap诱导株系的母本单倍体诱导效率提高至24.8％。
表1对照例2与实验例1冷热处理单倍体诱导株GFP-tailswap的单倍体诱导效率
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种优化温度提高CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导效率的方法，通过改变植物培养温度条件，从诱导系育性和花粉供体活力以及诱导后单倍体比率三个方面优化CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导效率，其特征在于：所述方法首先通过降低诱导系生长环境温度为18℃的条件下恢复单倍体诱导系花粉育性，然后通过母本诱导后进行温度为25℃的高温处理提高母本单倍体诱导后代单倍体比例，得到单倍体植株，所述CENH3介导的单倍体诱导系为GFP-tailswap植株株系。
2.根据权利要求1所述优化温度提高CENH3介导的母本单倍体诱导效率的方法，其特征在于：该GFP-tailswap植株株系的诱导方法如下：
将CENH3的N末端尾替换为组蛋白3.3的N末端尾，并在N末端尾加上GFP绿色荧光蛋白，在杂合的cenh3-1突变体中外源导入改造后的CENH3重组基因，并从中筛选出cenh3-1纯合且含有重组的CENH3的GFP-tailswap植株株系。
3.一种利用低温恢复单倍体诱导系育性和花粉活力的方法，其特征在于：
将GFP-tailswap单倍体诱导系种子消毒处理，春化萌发后移栽至温度为18 ℃，16小时光照/8小时黑暗条件下培养，得到育性恢复的单倍体诱导系。
4.一种通过母本诱导进行高温处理提高母本单倍体诱导后代单倍体比例的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
A.首先去除目标植物大小合适花苞雄蕊，待雌蕊成熟后，将权利要求1中所述单倍体诱导系植株花粉涂抹于目标植物雌蕊柱头之上；
B.随后将授粉后目标植物在温度为25 ℃的高温生长条件下培养至种子成熟后收获杂交种子；
C.使用流式细胞的方法鉴定收获的杂交种中产生的单倍体植株。
5.一种提高CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导效率的方法，包括以下步骤：
1）植株培养
将GFP-tailswap单倍体诱导系种子消毒处理，4℃低温处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养7-10天，取生长良好的幼苗转移至栽培土上，在22℃，16小时光照/8小时黑暗植物培养室进行培养至即将抽薹，得到单倍体诱导系植株；
2）冷处理
将单倍体诱导系植株转移至冷处理培养室，培养至育性恢复；其中，冷处理培养室的培养条件：温度为18℃，16小时光照/8小时黑暗；
3）杂交
将步骤2）得到育性恢复的单倍体诱导系植株作为父本材料，Col-0野生型或gl1突变体作为母本材料，第一天用镊子去除母本植株大小合适花苞的雄蕊，第三天摘取冷处理后育性恢复的单倍体诱导系植株花朵，将花粉涂抹在去雄花朵柱头上进行授粉，每个花序授粉2-4个柱头；
4）热处理
将授粉后的母本植株转移至热处理培养室，继续培养至种子成熟后，收种获得F1代；其中，培养条件：温度为25℃，16小时光照/8小时黑暗；
5）鉴别单倍体植株
将F1代种子进行消毒，4℃处理两天后，播撒至22℃，16小时光照/8小时黑暗培养室的栽培土中培养得到植株，鉴定植株得到单倍体植株。
6.根据权利要求5所述提高CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导效率的方法，其特征在于：所述步骤1）中，GFP-tailswap单倍体诱导系的诱导方法如下：
将CENH3的N末端尾替换为组蛋白3.3的N末端尾，并在N末端尾加上GFP绿色荧光蛋白，在杂合的cenh3-1突变体中外源导入改造后的CENH3重组基因，并从中筛选出cenh3-1纯合且含有重组的CENH3的GFP-tailswap植株株系。
7.根据权利要求5所述提高CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导效率的方法，其特征在于：所述步骤3）中，gl1突变体为Ler-0背景的GL1基因突变，造成显性的无毛状体表型，若F1为无毛状体植株，则判定为单倍体。
8.根据权利要求5所述提高CENH3介导的单倍体诱导系的母本单倍体诱导效率的方法，其特征在于：所述步骤5）中，若母本为Col-0野生型时，观察植株抽薹后的性状同时使用流式细胞仪检测植株倍性，确定得到单倍体植株；
或者，若母本为gl1突变体时，植株长出两片以上真叶后根据叶片表面是否具有毛状体辨别单倍体植株，并用流式细胞仪抽样检测植株倍型。
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