CN116445393B - 一种植物干细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

一种植物干细胞系及其建立方法和应用 Download PDF

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CN116445393B CN202310731023.9A CN202310731023A CN116445393B CN 116445393 B CN116445393 B CN 116445393B CN 202310731023 A CN202310731023 A CN 202310731023A CN 116445393 B CN116445393 B CN 116445393B
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Abstract

本发明涉及植物干细胞系及其建立方法和应用，其中，建立植物干细胞系的方法包括（a）、干细胞培育；（b）、干细胞筛选；（c）、干细胞继代培育：每代培育结束后、下次继代培育之前，都进行上述干细胞筛选步骤（b），以获得来自于一个克隆的植物干细胞团块；（d）、干细胞筛选；（e）、干细胞建系：每代培育结束后、下次继代培育之前，都进行上述干细胞筛选步骤（d），直至获得一个或多个植物干细胞系；（f）、干细胞系驯化获得性状稳定、分裂稳定、分裂快速的一个或多个植物干细胞系。

Description

一种植物干细胞系及其建立方法和应用
技术领域
本发明属于干细胞领域，具体涉及一种植物干细胞系及其建立方法和应用。
背景技术
由于如铁皮石斛等药用植物自然繁殖率低，而市场需求量大，因此，研究人员对药用植物的人工培养技术进行了大量研究。
如授权公告号为CN1275513C公开了铁皮石斛芽簇及其制备方法和用途，其通过对铁皮石斛或种子苗的茎尖或根尖进行无性系变异、诱变、再生和无激素增殖，获得生长速度比野生铁皮石斛快且有效成分与野生铁皮石斛相近且保持稳定的芽簇。
如授权公告号为CN104928229B和CN105238736B均涉及铁皮石斛干细胞的制备，其通过对去除根冠的铁皮石斛根尖进行清洗、消毒后利用固体培养基或筛选培养基分离其干细胞，再利用液体培养基对其进行传代培养，过滤后冻干制成铁皮石斛干细胞冻干粉。
上述专利在生产芽簇或者干细胞产品时，均需要重复整个制备过程，即需要自铁皮石斛的根尖或茎尖为起始物来进行生产。因此，该些方法存在生产周期长、生产流程复杂、耗时耗力等问题。
如申请公布号为CN101939415A公开了来自静止中心的植物干细胞及其分离方法，其通过采用含有植物生长激素的培养基来培养含有静止中心的植物根部组织一定时间，然后从培养组织中收集未分化的白色组织获得细胞系。其虽然公开了将来自静止中心的细胞系进行低温存储能够构建植物细胞系，但是其细胞系在液氮中保持至少10分钟后的细胞存活率也仅为大约超过85%。并且，本发明人研究发现，通过简单培养获得的细胞系，还存在因多次传代而退化的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物干细胞系及其建立方法和应用，该建立方法获得的植物干细胞系的均一性、稳定性好，能够长期培养。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种建立植物干细胞系的方法，包括如下步骤：
（a）、干细胞培育：将植物干细胞的多个碎屑间隔分布到固态植物干细胞培养基上，在黑暗条件下对植物干细胞进行培育，所述的多个碎屑之间的间隔分布距离足够大，使得培育长大后的植物干细胞团块不会互相接触；
（b）、干细胞筛选：选取培育中明显生长快、颜色一致、形态一致的植物干细胞团块，分切成多个碎屑；
（c）、干细胞继代培育：将分切后的植物干细胞碎屑再间隔分布到固态植物干细胞培养基上，在黑暗条件下对植物干细胞进行继代培育；每代培育结束后、下次继代培育之前，都进行上述干细胞筛选步骤（b），以获得来自于一个克隆的植物干细胞团块；
（d）、干细胞筛选：选取培育中明显生长快的植物干细胞团块；
（e）、干细胞建系：将选取的植物干细胞团块在固态植物干细胞培养基上，在黑暗条件下进行继代培育；每代培育结束后、下次继代培育之前，都进行上述干细胞筛选步骤（d），直至获得一个或多个植物干细胞系；
（f）、干细胞系驯化：将已建立的一个或多个植物干细胞系的碎屑再间隔分布到固态条件植物干细胞培养基上，在黑暗条件下对植物干细胞进行继代培育；每代培育结束后、下代培育之前，淘汰与前代相比褐化或颜色改变或分裂速度缓慢的团块，多代培育结束后，获得性状稳定、分裂稳定、分裂快速的一个或多个植物干细胞系。
根据一些实施方式，所述的步骤（a）中的植物干细胞来自于植物的静止中心诱导的愈伤组织；获得所述的步骤（a）中的植物干细胞的具体步骤为：将植物的静止中心切碎形成碎屑，使植物静止中心组织暴露，破坏静止中心调控细胞对植物干细胞的抑制功能，加强逆分化，在黑暗条件下扩增培育愈伤组织，然后将愈伤组织切成碎屑，间隔分布于固态的愈伤组织诱导培养基中进行扩增，再对扩增后的愈伤组织继代培育；每代培育结束后、下代培育之前，都选取培育中颜色和形态基本保持一致的扩增后的愈伤组织，去除褐化部分后分成小块，再间隔分布于固态的愈伤组织诱导培养基中，所述的间隔分布距离足够大，使得培育长大后的愈伤组织团块不会互相接触，多代培育结束后，获得所述植物干细胞。通过对愈伤组织进行多轮筛选培育，能够从源头上使获得的植物干细胞得到纯化，性能优异，从而在利用该植物干细胞进行建系时，能够进一步保证建立的植物干细胞系的均一性稳定性更优。
进一步地，在对所述愈伤组织进行培育时，一代培育的时间为8~20天或者为愈伤组织长得超过培养容器总面积的60%。
进一步地，对所述愈伤组织进行2~5代的继代培育后，结束愈伤组织的继代培育。
根据一些实施方式，在所述的步骤（b）和（c）中，继代培育不少于5次。
进一步地，在所述的步骤（b）和（c）中，继代培育5~10次，例如，继代培育5次、6次、7次、8次、9次或10次。
根据一些实施方式，在所述的步骤（d）和（e）中，继代培育不少于5次。
进一步地，在所述的步骤（d）和（e）中，继代培育5~10次，例如，继代培育5次、6次、7次、8次、9次或10次。
通过控制继代培育的次数，在保证筛选出均一性稳定性好的干细胞系的同时，尽量缩短建立细胞系所花费的时间及精力，从而降低生产成本，提高经济效益。
根据一些实施方式，在进行步骤（e）的继代培育过程中，培养20~40天后，按1:4~6进行传代扩增。
根据一些实施方式，相邻两个所述碎屑之间的间隔分布距离为所述碎屑大小的三倍以上，例如3~8倍，具体参数根据细胞生长速度以及培育时间等进行调整，只需要保证培育长大后的植物干细胞团块不会相互接触即可。
本发明建立植物干细胞系的方法为通用方法，理论上可以针对所有植物来建立植物干细胞系。
根据一些实施方式，所述植物干细胞为裸子植物或被子植物的干细胞。
其中，裸子植物为植物界的种子植物（显花植物）的裸子植物门，它和被子植物门又称维管植物、高等植物（有胚植物）。
裸子植物门通常分为铁树纲、银杏纲、松柏纲（球果纲）、红豆杉纲（紫杉纲）及买麻藤纲（倪藤纲或盖子植物纲）5纲。全世界现存裸子植物种类分属于5纲，9目，12科，71属，约800种。
被子植物门分为单子叶植物纲和双子叶植物纲。
双子叶植物纲分为6个亚纲：木兰亚纲（Magnoliidae）、金缕梅亚纲（Hamamelidae）、石竹亚纲（Caryophyllidae）、五桠果亚纲（Dilleniidae）、蔷薇亚纲（Rosidae）和菊亚纲（Asteridae）。
单子叶植物纲分为5个亚纲：泽泻亚纲（Arismatidae）、鸭跖草亚纲（Commelinidae）、槟榔亚纲（Arecidae）、姜亚纲（Zingiberidae）和百合亚纲（Liliidae）。
进一步地，所述植物干细胞包括但不限于铁皮石斛、甜叶菊、藏红花、越南黄藤、人参、艾草、银杏或三七的干细胞。
根据一些实施方式，所述植物干细胞来自于铁皮石斛的嫩茎尖端、甜叶菊的嫩茎尖端、银杏的嫩根尖端、三七的嫩根尖端或越南黄藤的嫩根尖端。
本申请中的植物干细胞培养基采用本领域常用的植物干细胞培养基即可，条件植物干细胞培养基也采用本领域常用的培养基即可，具体地，条件植物干细胞培养基可以在植物干细胞培养基上缺少或增加一种或多种原料或者减少或增加一种或多种原料的用量。本申请中的愈伤组织诱导培养基采用本领域常用的愈伤组织诱导培养基即可。例如，植物为铁皮石斛时，可以采用如CN104928229B、CN105238736B、CN109601390B或CN101810140B等现有技术中的培养基。
本发明的第二方面提供一种如上所述的建立植物干细胞系的方法获得的植物干细胞系。
本发明的第三方面提供根据上述方法获得的植物干细胞系的应用，所述应用包括：所述植物干细胞系能够作为种源，通过培育所述植物干细胞系生产天然产物，所述植物干细胞系的裂解液、提取物或培养物作为药品、功能性食品或化妆品中的活性成分。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明通过采用固态的培养基对植物干细胞进行多轮筛选培育以及驯化培育，获得来自于一个克隆的植物干细胞系，相比于未经过多轮筛选培育或未经过驯化培育的干细胞系，通过本申请方法建立的植物干细胞系具有性状更为稳定、分裂更为稳定、分裂更为快速的优势，并且获得的植物干细胞系的均一性、稳定性更好，能够长期培养，甚至可以持续培养10年以上，从而为植物的培育提供了稳定的种源，为天然产物或活性成分的生产提供了稳定可靠的原料来源。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
1、获得铁皮石斛愈伤组织：将铁皮石斛嫩茎尖端用升汞消毒，尖端组织切碎，使植物静止中心组织暴露，破坏静止中心调控细胞对植物干细胞的抑制功能，加强逆分化，在愈伤组织诱导培养基（MS基础培养基+1.0mg/L NAA+0.8mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值5.8）中进行固体培养基培育，以获得植物愈伤组织，愈伤组织为植物因外界不利条件受到伤害时，受害部位的一种在伤口表面新生的组织。愈伤组织中包含了植物干细胞。
2、扩增愈伤组织：将铁皮石斛愈伤组织转移到愈伤组织诱导培养基中，在无可见光条件下进行多次扩增，步骤为：将愈伤组织置于固体的愈伤组织诱导培养基上培养，待愈伤组织形成后，选取颜色、形态都保持基本一致的愈伤组织，去除褐化的部分，将愈伤组织分成小块，间隔的平铺在培养基上进行继代扩增，每20天为一代或者愈伤组织长得超过总面积的60%时继代，进行5次继代扩增，继代过程中继续去除褐化部分，保留培养较好的组织。培养温度条件为25℃，得到大量愈伤组织。
3、植物干细胞分离：在扩增过程中选取5次扩增后在颜色、形态都保持一致的愈伤组织，选择以上9个均一的团块，一个团块的愈伤组织切成1毫米左右的碎屑，转移到固态的植物干细胞培养基（MS基础培养基+1.0mg/L 6-BA +25g/L蔗糖+10g/L土豆汁+15g/L香蕉汁+7.0g/L琼脂，pH值5.8）中进行培养。在无可见光条件下进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便愈伤组织长大后不会互相接触，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。培养过程中及时去除褐化的团块。培养温度条件为优选25℃，生长20天。以下表1是观察到的克隆情况。
4、植物干细胞筛选与继代培育：分离选取步骤3中明显生长快（1.5倍增速及以上），颜色形态一致的团块，一个团块切成1毫米左右的碎屑，放入新的固态植物干细胞培养基中再次进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便长大后团块不会互相接触。在无可见光条件下进行培育和继代，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。按上述过程干细胞团块的碎屑经过本步骤5次稀薄分布培育，每代培育结束后、下次继代培育之前，都选取培育中明显生长快、颜色一致、形态一致的植物干细胞团块，分切成多个碎屑用于下一代培养，5次培养结束共分离扩增出12个干细胞组织团块。温度条件为25℃。观察本步骤培养的第一代至第五代的干细胞小团块生长及选择情况依次见表2至表6。
5、植物干细胞筛选与建系：选取步骤4中的多个生长迅速，颜色形态稳定的干细胞团，再进行5次稳定性培养，即不再稀薄分布培养，而是扩大培养每个克隆，培育20天后按1:5继代，将培养过程中不稳定的克隆删除，以建立多个干细胞系。温度条件为25℃。表7为6~10代干细胞克隆培育生长状况及选择。
按照以上筛选方法，筛选到3株成长快、表型稳定的克隆。对以上克隆进行线粒体活力测定。选用尚宝生物公司生产的线粒体呼吸链复合物II试剂盒(琥珀酸-辅酶Q还原酶)，货号BA1395，测定意义：
线粒体复合体又称琥珀酸-辅酶Q还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基FAD还原为FADH，后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q，是呼吸电子传递链的支路。
测定原理：复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成：
提取液：规格为液体80mL×2瓶，4℃保存；
试剂一：规格为液体40mL×1瓶，4℃保存；
试剂二；规格为粉剂×1支，-20℃保存；
试剂三：规格为粉剂×1支，-20℃保存；
试剂四：规格为液体2.5mLx1瓶，4℃保存；
溶液的配制：
1.试剂二：溶于1mL丙酮，可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮100倍稀释后使用。
2.试剂三：临用前加入2mL丙酮溶解备用。
3.工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三按1：1混合，现用现配。
样本的前处理：
组织或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
（1）、准确称取0.1g组织，加入1mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆；
（2）、将匀浆转速600g 4℃离心10min；
（3）、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心15min；
（4）、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做）；
（5）、步骤（4）中的沉淀即为线粒体，加入400μL提取液，超声波破碎(冰浴，功率20%或200W，超声3s间隔10秒，重复30次)，用于复合体Ⅱ酶活性测定及蛋白浓度测定。
测定步骤:
（1）、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。
（2）、将试剂一25℃预热15min。
（3）、在微量玻璃比色皿中分别加入：样本10μL，试剂一150μL，工作液20μL，试剂四20μL。将上述试剂分别加入比色皿后，迅速吹打混匀，记录第10秒的吸光度A1，尽量在25℃环境中，准确反应2min之后迅速取出，记录2min时的吸光度A2，计算ΔA等于A1-A2。
复合体II活力单位的计算：使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
按样本鲜重计算：单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmo1 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（V样×Cpr））÷T=476.2×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
表7中3个克隆的线粒体活性结果见下表8。
6、干细胞系驯化及优选：对步骤5分离出的3个干细胞系进行驯化，方法如下：对步骤5分离出的3个干细胞系，在黑暗条件下继续进行稀薄分布，每个细胞系选取5个克隆，在固态条件植物干细胞培养基（MS培养基+0.05mg/L 6-BA +10g/L蔗糖+10g/L土豆汁+5g/L香蕉汁+7.0g/L琼脂，pH值5.8）中，进行扩增速度与稳定性驯化，培养过程中如与前代相比，出现褐化或颜色改变、分裂速度缓慢等，即被淘汰。最终选取出适应驯化、性状与分裂均稳定快速的干细胞系，作为种源保存或使用。温度条件为25℃。按照上述方法测试线粒体活力，不同代数干细胞系的平均线粒体活力测试结果如表9。
以上数字表明每个细胞系的单一克隆的均一性非常稳定，均可作为细胞系长期保存。
效果测试：
1、干细胞系保存：
1）将植物干细胞系置于液氮中保存。液氮长期保存后，复苏细胞系，测定其复苏效率见表10。
2）将液氮中冻存复苏后的植物干细胞系置于实施例1步骤3中的固态的植物干细胞培养基上进行连续扩增，并用于之后的生产。自2013年4月建系至2023年5月，铁皮石斛干细胞系显示出稳定的性状：其分裂速度、表观特征均稳定。将3个植物干细胞系诱导成芽簇后，检测芽簇的诱导率，检测值浮动在3%以内，见表11。
2、植物干细胞系持续分裂稳定性观察：
将2013年4月建立的铁皮石斛干细胞系6-12-7-8-8-1进行长期扩增及诱导，并对倍增周期进行记录如表12。可见，本申请的方法建立的铁皮石斛干细胞系在持续培养10年时，不会出现退化，仍能保持较快的分裂速度且表观特征均稳定。
实施例2
1、获得甜叶菊愈伤组织：将甜叶菊嫩茎尖端用升汞消毒，尖端组织切碎，使植物静止中心组织暴露，破坏静止中心调控细胞对植物干细胞的抑制功能，加强逆分化，在愈伤组织诱导培养基（1/2MS基础培养基+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值6.5）中进行固体培养基培育，以获得植物愈伤组织。
2、扩增愈伤组织：将甜叶菊愈伤组织转移到愈伤组织诱导培养基中，在无可见光条件下进行多次扩增，步骤为：将愈伤组织置于固体的愈伤组织诱导培养基上培养，待愈伤组织形成后，选取颜色、形态都保持基本一致的愈伤组织，去除褐化的部分，将愈伤组织分成小块，间隔平铺在培养基上进行继代扩增，愈伤组织超过总面积的60%时继代，继代过程中继续去除褐化部分，保留培养较好的组织。培养温度条件为28℃，得到大量质地坚硬的愈伤组织。
3、植物干细胞分离：在扩增过程中选取5次扩增后在颜色、形态都保持一致的愈伤组织，选择以上9个均一的团块，一个团块的愈伤组织切成1毫米左右的碎屑，转移到固态的植物干细胞培养基（1/2MS培养基+0.15mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+20g/L土豆汁+7.0g/L琼脂，pH值6.5）中进行培养。在无可见光条件下进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便愈伤组织长大后不会互相接触，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。培养过程中及时去除褐化的团块。培养温度条件为28℃，生长30天。以下表13是观察到的克隆情况。
4、植物干细胞筛选与继代培育：分离选取步骤3中明显生长快（1.5倍增速及以上），颜色形态一致的团块，一个团块切成1毫米左右的碎屑，放入新的固态植物干细胞培养基中再次进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便长大后团块不会互相接触。在无可见光条件下进行培育和继代，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。按上述过程干细胞团块的碎屑经过本步骤5次稀薄分布培育，每代培育结束后、下次继代培育之前，都选取培育中明显生长快、颜色一致、形态一致的植物干细胞团块，分切成多个碎屑用于下一代培养，5次培养结束共分离扩增出12个干细胞组织团块。温度条件为28℃。观察本步骤培养的第一代至第五代的干细胞小团块生长及选择情况依次见表14至表18。
5、植物干细胞筛选与建系：选取步骤4中的多个生长迅速，颜色形态稳定的干细胞团，再进行5次稳定性培养，即不再稀薄分布培养，而是扩大培养每个克隆，培育30天后按1:5继代，将培养过程中不稳定的克隆删除，以建立多个干细胞系。温度条件为28℃。表19为6~10代干细胞克隆培育生长状况及选择。
按照以上筛选方法，筛选到4株成长快、表性稳定的克隆。对以上克隆按照实施例1中记载的方法进行线粒体活力测定，测试结果见表20。
6、干细胞系驯化及优选：对步骤5分离出的4个干细胞系进行驯化，方法如下：对步骤5分离出的4个干细胞系，在黑暗条件下继续进行稀薄分布，每个细胞系选取5个克隆，在固态条件植物干细胞培养基（1/2MS或MS培养基+0.05mg/L 6-BA+10g/L蔗糖+10g/L土豆汁+5g/L香蕉汁+7.0g/L琼脂，pH值5.0）中，进行扩增速度与稳定性驯化，培养过程中如与前代相比，出现褐化或颜色改变、分裂速度缓慢等，即被淘汰。最终选取出适应驯化、性状与分裂均稳定快速的干细胞系，作为种源保存或使用。温度条件为25℃。按照实施例1中记载的方法进行线粒体活力测定，不同代数干细胞系的平均线粒体活力测试结果如表21。
以上数字表明每个细胞系的单一克隆的均一性非常稳定，均可作为细胞系长期保存。
实施例3
1、获得银杏愈伤组织：将银杏嫩根尖端用升汞消毒，尖端组织切碎，使植物静止中心组织暴露，破坏静止中心调控细胞对植物干细胞的抑制功能，加强逆分化，在愈伤组织诱导培养基（DCR培养基+1.2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+7.0g/L琼脂，pH值6.0）中进行固体培养基培育，获得植物愈伤组织。
2、扩增愈伤组织：将银杏愈伤组织转移到愈伤组织诱导培养基中，在无可见光条件下进行多次扩增，步骤为：将愈伤组织置于固体的愈伤组织诱导培养基上培养，待愈伤组织形成后，选取颜色、形态都保持基本一致的愈伤组织，去除褐化的部分，将愈伤组织分成小块，间隔的平铺在培养基上进行继代扩增，每20天为一代或者愈伤组织长得超过总面积的60%时继代，进行5次继代扩增。继代过程中继续去除褐化部分，培养较好的组织培养温度条件为25℃，得到大量愈伤组织。
3、植物干细胞分离：在扩增过程中选取5次扩增后在颜色、形态都保持一致的愈伤组织，选择以上9个均一的团块，一个团块的愈伤组织切成1毫米左右的碎屑，转移到固态的植物干细胞培养基（DCR培养基+1.2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+10g/L土豆汁+0.1g/L活性炭+7.0g/L琼脂，pH值6.0）中进行培养。在无可见光条件下进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便愈伤组织长大后不会互相接触，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。培养过程中及时去除褐化的团块。培养温度条件为优选25℃，生长40天。以下表22是观察到的克隆情况。
4、植物干细胞筛选与继代培育：分离选取步骤3中明显生长快（1.5倍增速及以上），颜色形态一致的团块，一个团块的愈伤组织切成1毫米左右的碎屑，放入新的固态植物干细胞培养基中再次进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便长大后团块不会互相接触。在无可见光条件下进行培育和继代，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。按上述过程干细胞团块的碎屑经过本步骤5次稀薄分布培育，每代培育结束后、下次继代培育之前，都选取培育中明显生长快、颜色一致、形态一致的植物干细胞团块，分切成多个碎屑用于下一代培养，5次培养结束共分离扩增出12个干细胞组织团块。温度条件为25℃。观察本步骤培养的第一代至第五代的干细胞小团块生长及选择情况依次见表23至表27。
5、植物干细胞筛选与建系：选取步骤4中的多个生长迅速，颜色形态稳定的干细胞团，再进行5次稳定性培养，即不再稀薄分布培养，而是扩大培养每个克隆，培育40天后按1:5继代，将培养过程中不稳定的克隆删除，以建立多个干细胞系。温度条件为25℃。表28为6~10代干细胞克隆培育生长状况及选择。
按照以上筛选方法，筛选到4株成长快、表型稳定的克隆。对以上克隆按照实施例1中记载的方法进行线粒体活力测定，测试结果见表29。
6、干细胞系驯化及优选：对步骤5分离出的4个干细胞系进行驯化，方法如下：对步骤5分离出的4个干细胞系，在黑暗条件下继续进行稀薄分布，每个细胞系选取5个克隆，在固态条件植物干细胞培养基（DCR培养基+1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+10g/L蔗糖+5g/L土豆汁+0.1 g/L活性炭+7.0g/L琼脂，pH值6.0）中，进行扩增速度与稳定性驯化，培养过程中如与前代相比，出现褐化或颜色改变、分裂速度缓慢等，即被淘汰。最终选取出适应驯化、性状与分裂均稳定快速的干细胞系，作为种源保存或使用。温度条件为25℃。按照实施例1中记载的方法进行线粒体活力测定，不同代数干细胞系的平均线粒体活力测试结果如表30。
以上数字表明每个细胞系的单一克隆的均一性非常稳定，均可作为细胞系长期保存。
实施例4
1、获得三七愈伤组织：将三七嫩根尖端用升汞消毒，尖端组织切碎，使植物静止中心组织暴露，破坏静止中心调控细胞对植物干细胞的抑制功能，加强逆分化，在愈伤组织诱导培养基（MS培养基+1.0 mg/L KT +0.5 mg/L 2,4-D +0.3 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+7.0g/L琼脂， pH值6.8）中进行固体培养基培育，获得植物愈伤组织。
2、扩增愈伤组织：将三七愈伤组织转移到愈伤组织诱导培养基中，在无可见光条件下进行多次扩增，步骤为：将愈伤组织置于固体的愈伤组织诱导培养基上培养，待愈伤组织形成后，选取颜色、形态都保持基本一致的愈伤组织，去除褐化的部分，将愈伤组织分成小块，间隔的平铺在培养基上进行继代扩增，每20天为一代或者愈伤组织长得超过总面积的60%时继代，进行5次继代扩增。继代过程中继续去除褐化部分，培育较好的组织培养温度条件为22℃，得到大量愈伤组织。
3、植物干细胞分离：在扩增过程中选取5次扩增后在颜色、形态都保持一致的愈伤组织，选择以上9个均一的团块，一个团块的愈伤组织切成1毫米左右的碎屑，转移到固态的植物干细胞培养基（MS培养基+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+20g/L土豆汁+25克香蕉汁+7.0g/L琼脂，pH值6.8）中进行培养。在无可见光条件下进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便愈伤组织长大后不会互相接触，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。培养过程中及时去除褐化的团块。培养温度条件为优选22℃，生长30天。以下表31是观察到的克隆情况。
4、植物干细胞筛选与继代培育：分离选取步骤3中明显生长快（1.5倍增速及以上），颜色形态一致的团块，一个团块的愈伤组织切成1毫米左右的碎屑，放入新的固态植物干细胞培养基中再次进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便长大后团块不会互相接触。在无可见光条件下进行培育和继代，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。按上述过程干细胞团块的碎屑经过本步骤5次稀薄分布培养，每代培育结束后、下次继代培育之前，都选取培育中明显生长快、颜色一致、形态一致的植物干细胞团块，分切成多个碎屑用于下一代培养，5次培养结束共分离扩增出12个干细胞组织团块。温度条件为22℃。观察本步骤培养的第一代至第五代的干细胞小团块生长及选择情况依次见表32至表36。
5、植物干细胞筛选与建系：选取步骤4中的多个生长迅速，颜色形态稳定的干细胞团，再进行5次稳定性培养，即不再稀薄分布培养，而是扩大培养每个克隆，培育30天后按1:5继代，将培养过程中不稳定的克隆删除，以建立多个干细胞系。温度条件为22℃。表37为6~10代干细胞克隆培育生长状况及选择。
按照以上筛选方法，筛选到3株成长快、表型稳定的克隆。对以上克隆按照实施例1中记载的方法进行线粒体活力测定，测试结果见表38。
6、干细胞系驯化及优选：对步骤5分离出的3个干细胞系进行驯化，方法如下：对步骤5分离出的3个干细胞系，在黑暗条件下继续进行稀薄分布，每个细胞系选取5个克隆，在固态条件植物干细胞培养基（MS培养基+0.8 mg/L KT+0.5 mg/L 2,4-D +0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10g/L蔗糖+10g/L土豆汁+7.0g/L琼脂，pH值5.8）中，进行扩增速度与稳定性驯化，培养过程中如与前代相比出现褐化或颜色改变、分裂速度缓慢等，即被淘汰。最终选取出适应驯化、性状与分裂均稳定快速的干细胞系，作为种源保存或使用。温度条件为22℃。按照实施例1中记载的方法进行线粒体活力测定，不同代数干细胞系的平均线粒体活力测试结果如表39。
以上数字表明每个细胞系的单一克隆的均一性非常稳定，均可作为细胞系长期保存。
实施例5
1、获得越南黄藤愈伤组织：将越南黄藤嫩根尖端用升汞消毒，用消毒后的手术刀将尖端组织切碎，使植物静止中心组织暴露，植物干细胞不受调控细胞调节而与愈伤组织一起生长。在愈伤组织诱导培养基（MS基础培养基+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值5.8）中进行固体培养基培育，获得植物愈伤组织。
2、扩增愈伤组织：将越南黄藤愈伤组织转移到愈伤组织诱导培养基中，在无可见光条件下进行多次扩增，步骤为：将愈伤组织置于固体的愈伤组织诱导培养基上培养，待愈伤组织形成后，选取颜色、形态都保持基本一致的愈伤组织，去除褐化的部分，将愈伤组织分成小块，间隔的平铺在培养基上进行继代扩增，每20天为一代或者愈伤组织长得超过总面积的60%时继代，进行5次继代扩增。继代过程中继续去除褐化部分，培养较好的组织培养温度条件为25℃，得到大量愈伤组织。
3、植物干细胞分离：在扩增过程中选取5次扩增后在颜色、形态都保持一致的愈伤组织，选择以上9个均一的团块，一个团块的愈伤组织切成1毫米左右的碎屑，转移到固态的植物干细胞培养基（MS基础培养基+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+10g/L椰汁+7.0g/L琼脂，pH值5.8）中进行培养。在无可见光条件下进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便愈伤组织长大后不会互相接触，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。培养过程中及时去除褐化的团块。培养温度条件为优选25℃，生长30天。以下表40是观察到的克隆情况。
4、植物干细胞筛选与继代培育：分离选取步骤3中明显生长快（1.5倍增速及以上），颜色形态一致的团块，一个团块的愈伤组织切成1毫米左右的碎屑，放入新的固态植物干细胞培养基中再次进行稀薄分布，即每个碎屑之间的间距5倍于碎屑直径，让干细胞碎屑之间保持明显的距离，以便长大后团块不会互相接触。在无可见光条件下进行培育和继代，保证分离出来自一个克隆的植物干细胞。按上述过程干细胞团块的碎屑经过本步骤5次稀薄分步培养，每代培育结束后、下次继代培育之前，都选取培育中明显生长快、颜色一致、形态一致的植物干细胞团块，分切成多个碎屑用于下一代培养，5次培养结束共分离扩增出12个干细胞组织团块。温度条件为25℃。观察本步骤培养的第一代至第五代的干细胞小团块生长及选择情况依次见表41至表45。
5、植物干细胞筛选与建系：选取步骤4中的多个生长迅速，颜色形态稳定的干细胞团，再进行5次稳定性培养，即不再稀薄分布培养，而是扩大培养每个克隆，培育30天后按1:5继代，将培养过程中不稳定的克隆删除，以建立多个干细胞系。温度条件为25℃。表46为6~10代干细胞克隆培育生长状况及选择。
按照以上筛选方法，筛选到3株成长快、表型稳定的克隆。对以上克隆按照实施例1的方法进行线粒体活力测定，测试结果见表47。
6、干细胞系驯化及优选：对步骤5分离出的3个干细胞系进行驯化，方法如下：对步骤5分离出的3个干细胞系，在黑暗条件下继续进行稀薄分步，每个细胞系选取5个克隆，在固态条件植物干细胞培养基（MS基础培养基+1.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+10g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值5.8）中，进行扩增速度与稳定性驯化，压力培养基培养过程中如与前代相比，出现褐化或颜色改变、分裂速度缓慢等，即被淘汰。最终选取出适应驯化、性状与分裂均稳定快速的干细胞系，作为种源保存或使用。温度条件为22℃。按照实施例1的方法测试线粒体活力，不同代数干细胞系的平均线粒体活力测试结果如表48。
以上数字表明每个细胞系的单一克隆的均一性非常稳定，均可作为细胞系长期保存。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种建立植物干细胞系的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（a）、干细胞培育：将植物干细胞的多个碎屑间隔分布到固态植物干细胞培养基上，在黑暗条件下对植物干细胞进行培育，所述的多个碎屑之间的间隔分布距离足够大，使得培育长大后的植物干细胞团块不会互相接触；
（b）、干细胞筛选：选取培育中明显生长快、颜色一致、形态一致的植物干细胞团块，分切成多个碎屑；
（c）、干细胞继代培育：将分切后的植物干细胞碎屑再间隔分布到固态植物干细胞培养基上，在黑暗条件下对植物干细胞进行继代培育；每代培育结束后、下次继代培育之前，都进行上述干细胞筛选步骤（b），以获得来自于一个克隆的植物干细胞团块；
（d）、干细胞筛选：选取培育中明显生长快的植物干细胞团块；
（e）、干细胞建系：将选取的植物干细胞团块在固态植物干细胞培养基上，在黑暗条件下进行继代培育；每代培育结束后、下次继代培育之前，都进行上述干细胞筛选步骤（d），直至获得一个或多个植物干细胞系；
（f）、干细胞系驯化：将已建立的一个或多个植物干细胞系的碎屑再间隔分布到固态条件植物干细胞培养基上，在黑暗条件下对植物干细胞进行继代培育；每代培育结束后、下代培育之前，淘汰与前代相比褐化或颜色改变或分裂速度缓慢的团块，多代培育结束后，获得性状稳定、分裂稳定、分裂快速的一个或多个植物干细胞系；
所述植物干细胞来自于铁皮石斛的嫩茎尖端、甜叶菊的嫩茎尖端、银杏的嫩根尖端、三七的嫩根尖端或越南黄藤的嫩根尖端并且经过愈伤组织诱导途径获得。
2.根据权利要求1所述的建立植物干细胞系的方法，其特征在于：所述建立植物干细胞系的方法还包括步骤（a）之前的如下步骤：将植物的静止中心切碎形成碎屑，在黑暗条件下扩增培育愈伤组织，然后将愈伤组织切成碎屑，间隔分布于固态的愈伤组织诱导培养基中进行扩增，再对扩增后的愈伤组织继代培育；每代培育结束后、下代培育之前，都选取培育中颜色和形态基本保持一致的扩增后的愈伤组织，去除褐化部分后分成小块，再间隔分布于固态的愈伤组织诱导培养基中，所述的间隔分布距离足够大，使得培育长大后的愈伤组织团块不会互相接触，多代培育结束后，获得所述植物干细胞；获得的所述植物干细胞再进行所述步骤（a）的培育。
3.根据权利要求2所述的建立植物干细胞系的方法，其特征在于：在对所述愈伤组织进行培育时，一代培育的时间为8~20天或者为愈伤组织生长超过培养容器总面积的60%。
4.根据权利要求2所述的建立植物干细胞系的方法，其特征在于：对所述愈伤组织进行2~5代的继代培育后，结束愈伤组织的继代培育。
5.根据权利要求1所述的建立植物干细胞系的方法，其特征在于：在所述的步骤（b）和（c）中，继代培育不少于5次。
6.根据权利要求1所述的建立植物干细胞系的方法，其特征在于：在所述的步骤（d）和（e）中，继代培育不少于5次。
7.根据权利要求1所述的建立植物干细胞系的方法，其特征在于：在进行步骤（e）的继代培育过程中，培育20~40天后，按1:4~6进行传代扩增。
8.根据权利要求1或2所述的建立植物干细胞系的方法，其特征在于：相邻两个所述碎屑之间的间隔分布距离为所述碎屑大小的三倍以上。
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日本晴水稻悬浮细胞系的建立和保存;尹德东;胡宝忠;;东北农业大学学报(第06期);全文 *

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