CN108739367B - 一种诱导紫云英四倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导紫云英四倍体的方法。该方法包括采用组合诱变剂在二倍体紫云英子叶柄夹角为30°～50°，第一片真叶未出时用对生长点进行点滴处理，处理后，光密度减少至180μmol·m^‑2·s^‑1，光照时数控制在10h·d^‑1，昼温18℃，夜温15℃，相对湿度75％～90％；所述的组合诱变剂由0.1‑0.2％秋水仙素+50‑100mg·L^‑1氟乐灵+20μl·L^‑1吐温T‑20组成；组合诱变剂处理次数为2‑4次。本发明以特定浓度的秋水仙素和氟乐灵混合使用，四倍体诱变率达到了13.7％，提高了四倍体诱导率，同时降低了秋水仙素浓度，减少了对环境的污染。

Description

一种诱导紫云英四倍体的方法

技术领域

本发明属于分子育种领域，涉及一种诱导紫云英四倍体的方法。

背景技术

紫云英是豆科黄芪属一年生或越年生草本，是我国南方地区冬季稻田主要的绿肥作物，翻耕沤田后具有减少化肥使用量、增加土壤养分、提高水稻产量，改善稻米品质等作用。利用冬季休耕田种植紫云英绿肥，并进行合理的养分管理，在维持水稻高产的同时提高了氮肥利用率，对于实现水稻优质、高产具有十分重要的意义，是一项有效的养田、肥田措施。十八届五中全会提出探索实行耕地轮作休耕制度试点，拟定了《耕地轮作休耕制度试点方案》，倡导耕地轮作休耕，冬季种植紫云英符合国家休耕政策，同时也是响应农业部《到2020年化肥使用量零增长行动方案》、《国家土壤有机质提升项目》等文件的有效措施。目前我国二倍体紫云英品种鲜草产量低，养分含量低，不能满足生产上的需要，多倍体植物表现为器官的巨大性，抗逆性、丰产性和有效成分增加。因此，通过人工诱变培育四倍体紫云英新品种，具有重要意义。

自然界中植物染色体的多倍性现象很普遍。多倍体化是物种形成的主要途径之一，也是推动植物进化的重要适应生长环境的机制。秋水仙素作为一种高效的多倍体诱导剂被广泛的使用，但研究表明，用秋水仙素处理的M₀代植株死亡率高、生长缓慢，生育期延迟、结实率低，需不断继代选育；又因细胞分裂速度不同步，导致个别叶片出现缺刻、扭曲生长等现象，容易产生嵌合体；另秋水仙素是一种有剧毒的化学试剂，致癌性强，且能引起骨髓毒性反应、肝功能异常、蛋白尿现象，对操作人员威胁大，且容易污染水源。秋水仙素对植物微管蛋白的亲和性远远低于对动物微管蛋白的亲和性，因此在诱导植物细胞染色体加倍时需要较高的浓度，而高浓度的秋水仙素会对被处理的植物材料产生较大的毒害，虽诱导率高，但植物成活率低，而氟乐灵对植物微管蛋白有很强的结合力，在低浓度条件下具有较高的抑制微管聚合能力，虽诱导率低，但氟乐灵诱导浓度低、对植物毒害作用小、安全性高。随着植物组培技术的迅速发展，离体组织培养诱导植物多倍体技术已经成熟，但操作过程十分复杂，且获得成熟植株所需的周期较长，耗费大量人力财力。近年来，科学研究者们开始尝试使用秋水仙素、除草剂类诱变剂、有机溶剂等混合液作为诱变剂，处理种子或者茎尖生长点，且取得了良好的诱变效果。而以秋水仙素+氟乐灵+吐温T-20混合液作为诱变剂的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导紫云英四倍体的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种诱导紫云英四倍体的方法，采用组合诱变剂在二倍体紫云英子叶柄夹角为30°～50°，第一片真叶未出时用对生长点进行点滴处理，处理后，光密度减少至180μmol·m^-2·s^-1，光照时数控制在10h·d^-1，昼温18℃，夜温15℃，相对湿度75％～90％；其中，所述的组合诱变剂由0.1-0.2％秋水仙素+50-100mg·L^-1氟乐灵+20μl·L^-1吐温T-20组成；组合诱变剂处理次数为2-4次。

作为本发明所述的诱导紫云英四倍体方法的优选，所述的组合诱变剂组成为0.15％秋水仙素+100mg·L^-1氟乐灵+20μl·L^-1吐温T-20。

作为本发明所述的诱导紫云英四倍体方法的优选，组合诱变剂处理次数为2次，7:00～8:00、14:30～15:30各处理1次，每次用量为20μL。

作为本发明所述的诱导紫云英四倍体方法的优选，组合诱变剂处理前，二倍体紫云英生产环境的光密度控制在240μmol·m^-2·s^-1，光照时数10h·d^-1，昼温25℃，夜温18℃，相对湿度70％～85％。

作为本发明所述的诱导紫云英四倍体方法的优选，组合诱变剂处理2天后，恢复处理前光照、温湿度水平；在幼苗3片复叶时，将幼苗移入大棚中。

作为本发明所述的诱导紫云英四倍体方法的优选，所述的二倍体紫云英品种包括但不限于“紫地丰”、“湘紫2号”、“宁波大桥”、“余江大叶”、“信紫1号”等。

有益效果：

本发明研究结果表明：将秋水仙素和氟乐灵两种诱变剂混合使用，诱导率高，死亡率低，比其单独使用时效果好，说明两者存在协同作用，原因可能在于氟乐灵与植物微管蛋白结合力强，抑制微管聚合；秋水仙素能促使已形成的微管解聚，又能促使DNA的复制和有关蛋白质合成，两者不同程度阻碍微管形成的双层效应引起的结果，以往关于秋水仙素诱导豆科四倍体活体，一般采用0.2％秋水仙素，且诱变率大都在10％以下，本发明以特定浓度的秋水仙素和氟乐灵混合使用，四倍体诱变率达到了13.7％，提高了四倍体诱导率，同时降低了秋水仙素浓度，减少了对环境的污染。四倍体诱导率的提高可能与诱变剂中添加吐温T-20有关，吐温T-20是一种非离子型表明活性剂，具有乳化、增溶、扩散、稳定等作用，在诱变剂中添加吐温T-20能扩大诱变剂与生长点的接触面积，提高了药剂通过分生组织的穿透力，且能使分生组织更加活跃，因此，在一定程度上提高了诱变剂的诱变效果。

附图说明

图1二倍体(A)和四倍体(B)幼苗照片

图2二倍体单株(左)、四倍体单株(右)照片

图3四倍体叶片(左)、二倍体叶片(右)照片

图4四倍体(左)、二倍体(右)花器官解剖图

图5四倍体续育

图6二倍体(左)、四倍体(右)荚果及种子

图7二倍体(左)、四倍体(右)种子

图8二倍体气孔

图9四倍体气孔

图10二倍体(A)和四倍体(B)气孔密度

图11二倍体(A)和四倍体(B)粉粒

图12二倍体(A)和四倍体(B)根尖染色体

具体实施方式

实施例1

1.1材料

“紫地丰”紫云英品种为南京理想农业科技有限公司选育的二倍体(2n＝2x＝16)紫云英品种；秋水仙素和氟乐灵为上海源叶生物科技有限公司产品，秋水仙素纯度98％，白色粉末；氟乐灵纯度97％，粉红色固体；吐温T-20为广州市中万新材料有限公司产品。

2016年9月19日将种子播种于装有育苗基质(淮安柴米河农业科技发展有限公司)穴盘(50孔)中，放入人工气候室培养，光密度控制在240μmol·m^-2·s^-1，光照时数10h·d^-1，昼温25℃，夜温18℃，相对湿度70％～85％，定时通风换气^[42]。

1.2处理方法

在子叶柄夹角为30°～50°，第一片真叶未出时用微量注射器对生长点进行点滴处理，7:00～8:00、14:30～15:30各处理1次，一天两次，每次用量为20μL。秋水仙素设置三个浓度水平：0.1％、0.15％、0.2％；氟乐灵设置两个浓度水平：50mg·L^-1、100mg·L^-1；每组合添加20μl·L^-1吐温T-20，处理次数设置2次、4次两个水平，以点滴蒸馏水作为对照(CK)。

处理后，光密度减少至180μmol·m^-2·s^-1，光照时数控制在10h·d^-1，昼温18℃，夜温15℃，相对湿度75％～90％，2天后，恢复处理前水平。在幼苗3片复叶时(见图1、图2)，将幼苗移入大棚中。

由表1可知，不同浓度秋水仙素、氟乐灵或两者组合处理均能诱导获得四倍体植株，但诱导效果不同。单独使用秋水仙素时，随着秋水仙素浓度(0.1％～0.2％)的增加，四倍体诱导率有所提高，但死亡率也逐渐的增加，在处理4次，秋水仙素浓度为0.2％时，诱导率为8.2％，而死亡率达到了5.0％；单独使用氟乐灵时，当处理4次，氟乐灵浓度为100mg·L^-1时，死亡率为0.3％，表明氟乐灵对植株毒害作用小或无毒害作用，但变异率明显较单独使用秋水仙素时低，最高诱导率仅为3.6％，诱导效果较秋水仙素差。

当秋水仙素和氟乐灵混合使用时，变异率、四倍体诱导率较单独使用时均有所提高。在相同氟乐灵浓度下，随着秋水仙素浓度的增加，变异率逐渐增加，而四倍体诱导率先增加后降低，不同秋水仙素浓度处理，四倍体诱导率差异显著。当处理2次，秋水仙素浓度为0.15％、氟乐灵浓度为100mg·L^-1时，四倍体诱导率最高，达到了13.7％；在相同秋水仙素浓度下，随着氟乐灵浓度的增加，变异率、四倍体诱导率有所增加，但并不显著。相同的诱变剂浓度，点滴次数不同，四倍体诱导率无显著差异。实验结果表明：以0.15％秋水仙素+100mg·L^-1氟乐灵+20μl·L^-1吐温T-20诱导紫云英四倍体效果最佳。

表1不同诱变剂组合诱导效果

注：同一列中不同小写字母、大写字母分别表示在α＝0.05、α＝0.01水平下差异显著，下表同。

1.3形态学和解剖学鉴定

叶片(第一花序下的羽状复叶)、花器官、荚果、种子等形态学指标和气孔大小、气孔密度、保卫细胞内叶绿素含量、花粉粒形状、大小等解剖学指标参照韩业飞(韩业飞，张蜀宁，张宇，等.优质、矮紧型白梗同源四倍体不结球白菜的诱导及选育[J].南京农业大学学报，2014，37(2)：15-20)方法。

四倍体“紫地丰”植株表现出“巨大性”(见表2、图2～4、图6～7)：四倍体株高、单株重、小叶长、小叶宽、小叶厚、花序长、花序宽、种子长、种子宽、荚果长、荚果宽较二倍体分别增加26.02％、19.40％、25.00％、48.18％、50.00％、21.03％、18.22％、18.32％、23.53％、23.83％、30.58％，差异极显著；四倍体龙骨瓣长、龙骨瓣宽、翼瓣长比二倍体分别增加7.44％、6.12％、5.69％，差异显著；单荚果种子数四倍体较二倍体减少48.78％，差异极显著。

四倍体气孔长、气孔宽、花粉粒长、花粉粒宽、叶绿体个数较二倍体分别增加43.42％、18.53％、32.59％、52.27％、50.28％，差异极显著；四倍体气孔密度较二倍体减少32.55％，差异极显著(见图8～11)。

表2二、四倍体紫云英形态解剖学比较

1.4根尖染色体计数倍性鉴定

根尖染色体倍性鉴定参照郑金双(郑金双，张蜀宁，孙成振，等.不结球白菜根尖体细胞染色体制片及其二倍体和四倍体有丝分裂过程观察[J].南京农业大学学报，2011，20(4)：58-63)方法。

根尖分生组织有丝分裂中期染色体鉴定结果表明(见图12)：四倍体植株的染色体为数目为2n＝4x＝32条，对照二倍体染色体数目2n＝2x＝16条。

1.5养分含量测定方法

在盛花期时对M₁代植株测定其全氮、全磷、全钾含量。植物样品于105℃烘箱中杀青2h，然后于60℃条件下烘干至恒重。植物样品采用H₂SO₄-H₂O₂法消煮后，植株全氮含量采用连续流动分析仪测定(王巧兰.氮磷钾营养对水稻植株体氮素损失的影响[D].华中农业大学，2010)，全磷含量采用钒钼黄比色法测定(李小峰，李秋华，秦好丽，等.2013.百花湖消落带常见植物氮磷钾营养元素含量分布特征研究[J].环境科学学报，33(4)：1089-1097)，全钾含量采用火焰光度计法测定(李晓艳，孙立，吴良欢.不同吸硅型植物各器官硅素及氮、磷、钾素分布特征[J].土壤通报，2014，45(01)：193-198)，干物质含量百分比使用常规方法测定。

结果表明(见表3)：四倍体植株中全N、全P、全K含量分别较二倍体植株增加28.08％、20.00％、16.36％，差异极显著，干物质含量较二倍体植株增加30.73％，差异极显著。

表3二倍体、四倍体植株养分含量比较

1.6四倍体培育

经鉴定的M0代植株，2017年春3月下旬抽薹开花，单株人工授粉；5月上旬收获种子。2017年9月20日，播种M1代种子，共13个株系，进行营养器官和生殖器官鉴定，获得3个优良株系。四倍体“紫地丰”品种株型高大、茎秆粗壮、叶片深绿色、茎秆浅绿色、花深紫红色，株高54.76cm，单株重79.4g，植株养分含量高，盛花期时植株全氮含量3.74％，全磷含量0.42％，全钾含量3.19％。

Claims (6)

1.一种诱导紫云英四倍体的方法，其特征在于采用组合诱变剂在二倍体紫云英子叶柄夹角为30°～50°，第一片真叶未出时对生长点进行点滴处理，处理后，光密度减少至180μmol·m^-2·s^-1，光照时数控制在10h·d^-1，昼温18℃，夜温15℃，相对湿度75％～90％；其中，所述的组合诱变剂由0.1-0.2％秋水仙素+50-100mg·L^-1氟乐灵+20μl·L^-1吐温T-20组成；组合诱变剂处理次数为2-4次。

2.根据权利要求1所述的诱导紫云英四倍体的方法，其特征在于所述的组合诱变剂组成为0.15％秋水仙素+100mg·L^-1氟乐灵+20μl·L^-1吐温T-20。

3.根据权利要求1所述的诱导紫云英四倍体的方法，其特征在于组合诱变剂处理次数为2次，7:00～8:00、14:30～15:30各处理1次，每次用量为20μL。

4.根据权利要求1所述的诱导紫云英四倍体的方法，其特征在于组合诱变剂处理前，二倍体紫云英生产环境的光密度控制在240μmol·m^-2·s^-1，光照时数10h·d^-1，昼温25℃，夜温18℃，相对湿度70％～85％。

5.根据权利要求1所述的诱导紫云英四倍体的方法，其特征在于组合诱变剂处理2天后，恢复处理前光照、温湿度水平；在幼苗3片复叶时，将幼苗移入大棚中。

6.根据权利要求1所述的诱导紫云英四倍体的方法，其特征在于所述的二倍体紫云英品种选自包括“紫地丰”、“湘紫2号”、“宁波大桥”、“余江大叶”、“信紫1号”在内的任意一种二倍体紫云英。

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