CN112020930A - 一种诱导水稻提高耐盐性的方法 - Google Patents

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Abstract

一种诱导水稻提高耐盐性的方法，属于水稻种植技术领域。步骤如下：步骤一.取水稻种子表面消毒，然后用3‑10 wt.‰NaCl溶液溶解5‑羟基‑L‑正缬氨酸，配制成浓度为20‑400 mg/L的5‑羟基‑L‑正缬氨酸溶液；步骤二.将水稻种子用步骤一制得的5‑羟基‑L‑正缬氨酸溶液20‑28℃温度下浸种16‑24 h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫环境下正常发芽生长即可。本发明利用外源5‑羟基‑L‑正缬氨酸浸种水稻种子和浇灌，能够提高诱导水稻种子在盐胁迫条件下提高其发芽率和生长速率的方法，并且能够有效诱导水稻提高耐盐性，可满足我国沿海滩涂对高产、优质、抗病、耐盐、直播水稻品种的迫切需求，具有很高的应用潜力和价值。

Description

一种诱导水稻提高耐盐性的方法
技术领域
本发明涉及水稻种植技术领域，具体涉及一种诱导水稻提高耐盐性的方法。
背景技术
土壤的盐渍化是限制作物生长发育，导致减产最严重的第二大非生物胁迫。据统计，全世界盐渍土面积约十亿公顷，中国盐渍土面积达一亿公顷。我国现有耕地中由于不当灌溉和施肥，导致至少有八百万公顷土壤中盐分积累，不同程度影响作物的生长。在人口数量不断增加、耕地面积日趋减少和淡水资源严重不足的严重压力下，积极利用大面积盐渍化土地，已成为全球备受关注的重大课题。
水稻是中等感盐作物，作为全球一半以上人口的主粮，其在种子萌发期、苗期、孕穗期是盐胁迫最为敏感期。盐胁迫导致水稻种子发芽率下降、抑制生长和结实率降低。前人为提高水稻耐盐性做了大量研究，据不完全统计，已有近千个水稻不同生育时期耐盐相关QTL被报道，但仅有KCL1和HST1基因被图位克隆，来自Pokkali的Saltol被精细定位，且仅有Saltol耐盐基因被成功用于水稻耐盐性分子改良，因此利用分子标记辅助选择结合传统育种提高水稻耐盐性存在育种周期长，难以应用的缺点。
水稻是盐渍土壤改良利用的先锋作物，在盐胁迫下体内发生了复杂的生理变化，为抵御盐害在细胞中积累大量的代谢产量，如叶片中脯氨酸含量会明显提高以调节受盐胁迫时的渗透平衡。现有技术中利用代谢组学对不同植物进行了逆境胁迫研究，为植物耐盐生理机制提供了新的技术和思路。但研究大都集中在植物受到逆境胁迫后，叶片或者根中代谢产物和代谢途径发生的改变，对水稻耐盐代谢组学的研究较少，特别是如何利用水稻自身代谢物诱导水稻提高耐盐性方面还鲜有报道。
公开号为CN106472137A中国专利申请文献公开了一种提高水稻苗期耐盐性的方法，属于水稻耐盐应用领域。该方法描述为：在水稻种子淡水浸种催芽前，先用1.8％NaCl盐溶液浸种1天，然后进行常规淡水浸种催芽，可极显著提高水稻苗期的耐盐性。该申请对解决沿海滩涂耐盐水稻品种不多、现有的耐盐品种产量不高、抗病性特别是抗稻瘟病性差、品质不好的问题提供很好途径。但该方法并非全程均是盐胁迫环境，且对发芽率提高效果甚微，难以解决盐胁迫环境（如沿海滩涂直播水稻）存在出苗率低、生长缓慢的问题。
发明内容
解决的技术问题：针对现有技术中存在上述技术问题，本发明提供一种诱导水稻提高耐盐性的方法，所述方法能够诱导水稻提高盐胁迫下的发芽率和生长速率。
技术方案：一种诱导水稻提高耐盐性的方法，步骤如下：
步骤一.取水稻种子表面消毒，然后用3-10 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基-L-正缬氨酸，配制成浓度为20-400 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液；
步骤二.将水稻种子用步骤一制得的5-羟基-L-正缬氨酸溶液20-28℃温度下浸种16-24 h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫环境下正常发芽生长即可。
作为优选，所述步骤一中水稻种子表面消毒具体过程如下：选取籽粒饱满、无霉菌斑点的成熟水稻种子，用70-75 wt.%乙醇溶液润洗2-3次，每次30-40 s，无菌水冲洗2-3次，再用5-10 wt.% NaClO溶液灭菌5-15 min，无菌水冲洗3-5次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水。
作为优选，所述盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl的混合溶液，其中5-羟基-L-正缬氨酸浓度为0-400 mg/L，NaCl浓度为3-10 wt.‰。
作为优选，所述步骤一中取水稻种子表面消毒，然后用5 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基-L-正缬氨酸，配制成浓度为200 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液。
作为优选，检验步骤二中处理后的水稻种子发芽率和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于20-28℃进行暗培养2-3d，2-3d之后进行光培养，光照强度为4000-10000 lx，光培养2-3d后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔PCR平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为25-28℃，光照强度3000-10000 lx，湿度为60~80%，光培养：暗培养为16 h：8 h，然后用与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液进行水培，每3天更换一次水培液，2周后测量幼苗株高、根长、鲜重。
作为优选，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5 cm视为发芽。
有益效果：1）本发明提出一种诱导水稻种子在盐胁迫条件下提高其发芽率和生长速率的方法，并且能够有效诱导水稻提高耐盐性。无盐胁迫下，盐稻8号种子发芽率约为100%，说明挑选的种子发芽率高且整齐一致；5‰盐胁迫下，发芽率急剧下降仅为66.67%，外源5-羟基-L-正缬氨酸20-400 mg/L浸种处理均极显著提高5‰盐胁迫下种子的发芽率，其中，浓度200 mg/L处理后发芽率高达90.33%左右。
2）本发明采用的5-羟基-L-正缬氨酸发明人前期研究发现的一种耐盐相关代谢物，目前对这一代谢物的研究报道极少，且未见其在植物耐盐应用方面的报道。本发明利用外源添加5-羟基-L-正缬氨酸诱导现有水稻品种（系）提高耐盐性，可满足我国沿海滩涂对高产、优质、抗病、耐盐、直播水稻品种的迫切需求。
附图说明
图1为含有200 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸浸种处理后的种子发芽率与未处理对照在5‰盐胁迫下生长6天对比图，图中a为未处理对照在5‰盐胁迫下生长6天的种子发芽图，b为200 mg/L 5-羟基-L-正缬氨酸溶液浸种处理后在5‰盐胁迫下生长6天的种子发芽图。
图2为含有200 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸与对照在5‰盐胁迫下生长2周对比图，图中a为未处理对照在5‰盐胁迫下生长6天的种子发芽图，b为200 mg/L 5-羟基-L-正缬氨酸溶液浸种处理后在5‰盐胁迫下生长6天的种子发芽图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
本说明书实施例中水稻（Oryza sativa L.）为盐稻8号。5-羟基-L-正缬氨酸（cas号为6152-89-2）由苏州爱玛特生物科技有限公司提供，含量>98%。NaCl为常规化学试剂。
实施例1
一种诱导水稻提高耐盐性的方法，步骤如下：
步骤一.取水稻种子表面消毒，然后用3 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基正缬氨酸，配制成浓度为20 mg/L的5-羟基正缬氨酸溶液，水稻种子表面消毒具体过程如下：选取籽粒饱满、无霉菌斑点的成熟水稻种子，用70 wt.%乙醇溶液润洗2次，每次30 s，无菌水冲洗2次，再用5 wt.% NaClO溶液灭菌5 min，无菌水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水；
步骤二.将水稻种子用步骤一制得的5-羟基正缬氨酸溶液20℃温度下浸种16 h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫环境下正常发芽生长即可。所述盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl的混合溶液，其中5-羟基-L-正缬氨酸浓度为0 mg/L，NaCl浓度为3 wt.‰。
检验步骤二中水稻种子发芽率和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于20℃进行暗培养2 d，2 d之后进行光培养，光照强度为4000lx，光培养2 d后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5 cm视为发芽；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔PCR平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为25℃，光照强度3000 lx，湿度为60~80%，光培养：暗培养为16 h：8 h，然后用与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液进行水培，每3天更换一次水培液，2周后测量幼苗株高、根长、鲜重。
实施例2
一种诱导水稻提高耐盐性的方法，步骤如下：
步骤一.取水稻种子表面消毒，然后用10 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基正缬氨酸，配制成浓度为400 mg/L的5-羟基正缬氨酸溶液，水稻种子表面消毒具体过程如下：选取籽粒饱满、无霉菌斑点的成熟水稻种子，用75 wt.%乙醇溶液润洗3次，每次40 s，无菌水冲洗3次，再用10 wt.% NaClO溶液灭菌15 min，无菌水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水；
步骤二.将水稻种子用步骤一制得的5-羟基正缬氨酸溶液28℃温度下浸种24 h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫环境下正常发芽生长即可。所述盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl的混合溶液，其中5-羟基-L-正缬氨酸浓度为400 mg/L， NaCl浓度为10 wt.‰。
检验步骤二中水稻种子发芽率和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于28℃进行暗培养3d，3d之后进行光培养，光照强度为10000lx，光培养3d后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5 cm视为发芽；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔PCR平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为28℃，光照强度10000 lx，湿度为60~80%，光培养：暗培养为16 h：8 h，然后用与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液进行水培，每3天更换一次水培液，2周后测量幼苗株高、根长、鲜重。
实施例3
一种诱导水稻提高耐盐性的方法，步骤如下：
步骤一.取水稻种子表面消毒，水稻种子表面消毒具体过程如下：选取籽粒饱满、无霉菌斑点的成熟水稻种子，用70 wt.%乙醇溶液润洗2次，每次30 s，无菌水冲洗2次，再用5wt.% NaClO溶液（加1-2滴吐温20）灭菌5 min，无菌水冲洗3-5次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水，然后用5 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基-L-正缬氨酸，配制成浓度为200 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液；
步骤二.将水稻种子用步骤一制得的5-羟基-L-正缬氨酸溶液25℃温度下浸种24 h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫环境下正常发芽生长即可。所述盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液。
检验步骤二中处理后的水稻种子发芽率和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒（19cm×14cm×12cm）中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于25℃进行暗培养3 d，3 d之后进行光培养，光照强度为4000 lx，光培养3 d后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5 cm视为发芽；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔PCR平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为25℃，光照强度4000 lx，湿度为60~80%，光培养/暗培养为16 h/8 h，然后用与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液进行水培，每3天更换一次水培液，2周后测量幼苗株高、根长、鲜重。
实施例4
同实施例3，区别在于，步骤一中用5 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基-L-正缬氨酸，配制成浓度为20 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液。
实施例5
同实施例3，区别在于，步骤一中用5 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基-L-正缬氨酸，配制成浓度为50 mg/L的5-羟基5-羟基-L-正缬氨酸溶液。
实施例6
同实施例3，区别在于，步骤一中用5 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基-L-正缬氨酸，配制成浓度为400 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液。
对比例1
同实施例3，区别在于，步骤一中将浓度为200 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液换成同等体积的无菌水。
对比例2
同实施例3，区别在于，步骤一中将浓度为200 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液换成同等体积的5 wt.‰NaCl溶液。
实施例3-6及对比例1和对比例2处理后的水稻种子发芽率和幼苗生长状况见下表
不同浓度5-羟基-L-正缬氨酸对5‰盐胁迫下种子发芽率和幼苗生长的影响
发芽率(%) 株高(cm) 根长(cm) 鲜重(mg)
对比例1 100±0.00 10.92±0.06 6.15±1.23 13.43±1.22
对比例2 66.67±2.04 4.32±0.07 1.31±0.05 5.24±0.71
实施例4 74.33±1.08 4.72±0.06 1.64±0.04 5.81±0.52
实施例5 84.67±1.47 5.13±0.07 2.01±0.05 6.33±0.42
实施例3 90.33±1.78 5.54±0.08 2.42±0.05 6.85±0.51
实施例6 80.33±1.47 4.97±0.09 1.91±0.03 6.12±0.37
从表中以及图1和图2中可以看出，无盐胁迫下，盐稻8号种子发芽率约为100%，说明挑选的种子发芽率高且整齐一致；5‰盐胁迫下，发芽率急剧下降仅为66.67%，外源5-羟基-L-正缬氨酸20-400 mg/L浸种处理均极显著提高5‰盐胁迫下种子的发芽率，其中，浓度200mg/L处理后发芽率高达90.33%左右（种子发芽图参见图1b）。与NaCl单独处理相比，20-400mg/L 5-羟基-L-正缬氨酸处理均使幼苗在盐胁迫下的生物量增加，其中以200 mg/L处理时，效果最高（幼苗生长2周后照片见图2b）。因此选用200 mg/L 5-羟基-L-正缬氨酸为最佳浓度。
本说明书实施例中由于实验室条件限制，所以盐胁迫环境设定为浇灌水盐胁迫溶液为5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl的混合溶液，其中5-羟基-L-正缬氨酸浓度为0-400 mg/L，NaCl浓度为3-10 wt.‰。实际种植时，将处理后的水稻种子种植在盐渍土/或者盐胁迫环境均可。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种诱导水稻提高耐盐性的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一.取水稻种子表面消毒，然后用3-10 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基-L-正缬氨酸，配制成浓度为20-400 mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液；
步骤二.将水稻种子用步骤一制得的5-羟基-L-正缬氨酸溶液20-28℃温度下浸种16-24 h后得到处理后水稻种子，使其在盐胁迫环境下正常发芽生长即可。
2.根据权利要求1所述的一种诱导水稻提高耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤一中水稻种子表面消毒具体过程如下：选取籽粒饱满、无霉菌斑点的成熟水稻种子，用70-75wt.%乙醇溶液润洗2-3次，每次30-40 s，无菌水冲洗2-3次，再用5-10 wt.% NaClO溶液灭菌5-15 min，无菌水冲洗3-5次，最后用无菌滤纸吸干种子表面附着水。
3.根据权利要求1所述的一种诱导水稻提高耐盐性的方法，其特征在于，所述盐胁迫环境为浇灌水盐胁迫溶液为5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl的混合溶液，其中5-羟基-L-正缬氨酸浓度为0-400 mg/L， NaCl浓度为3-10 wt.‰。
4.根据权利要求1所述的一种诱导水稻提高耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤一中取水稻种子表面消毒，然后用5 wt.‰NaCl溶液溶解5-羟基-L-正缬氨酸，配制成浓度为200mg/L的5-羟基-L-正缬氨酸溶液。
5.根据权利要求1所述的一种诱导水稻提高耐盐性的方法，其特征在于，检验步骤二中水稻种子发芽率和生长速率的方法，步骤如下：将步骤二处理后的水稻种子置于发芽盒中进行发芽试验，发芽盒内垫两层无菌滤纸，每个发芽盒内放置100粒种子，加入与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液使滤纸保持湿润，并盖上发芽盒的盖子，将发芽盒置于20-28℃进行暗培养2-3d，2-3d之后进行光培养，光照强度为4000-10000 lx，光培养2-3d后统计发芽率，并挑选生长一致的30株幼苗进行幼苗生长试验，试验设3次重复；将发芽后的幼苗转入截去底部的96孔PCR平板中，每孔放置一苗，于人工气候培养箱中培养，培养条件为25-28℃，光照强度3000-10000 lx，湿度为60~80%，光培养：暗培养为16 h：8 h，然后用与步骤一同等浓度的5-羟基-L-正缬氨酸和NaCl混合溶液进行水培，每3天更换一次水培液，2周后测量幼苗株高、根长、鲜重。
6.根据权利要求5所述的一种诱导水稻提高耐盐性的方法，其特征在于，统计发芽率时，根长和苗高二者之和大于0.5 cm视为发芽。
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