CN102703332A - 一株产花生四烯酸油脂的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一株产花生四烯酸油脂的菌株及其应用。一株产花生四烯酸油脂的菌株，分类命名为高山被孢霉Mortierella alpina R807，已于2012年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012118。该菌株菌落颜色为乳白色，在PDA培养基上呈现褶状，不产孢子，可在含没食子酸辛酯的培养基上生长。该菌株的油脂组成脂肪酸分布中C18系列脂肪酸（硬脂酸C18：0，油酸C18：1，亚油酸C18：2及γ-亚麻酸C18：3）相对较少，花生四烯酸占总脂肪酸的含量保持在40％以上，产品质量能够满足食品工业对花生四烯酸含量的要求。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产花生四烯酸油脂的菌株及其应用。
背景技术
花生四烯酸(Arachidonic acid，简称ARA)，属于ω-6系列多不饱和脂肪酸，具有多种生理活性。ARA是前列腺素、环前列腺素和白三烯类等二十碳酸衍生物的直接前体。而且，ARA不仅能调节体内多种离子通道，维持细胞膜功能；同时也是构成神经组织的重要结构脂类，对于婴幼儿的脑发育和视力功能至关重要。目前，ARA已在保健食品、医药、化妆品等领域得到广泛应用。过去ARA的主要来源是动物肝脏、鱼油以及鸡蛋蛋黄等。但因为其品质不稳定，成本较高等缺点，研究人员逐渐将研究重点投向微生物发酵法，而获得性状优良的生产菌株是ARA油脂发酵生产的关键。
在早期的研究中，各国研究人员通过不同的诱变选育条件，选育出了ARA油脂含量较高的菌株。Eroshin等利用含乙酰水杨酸的培养基选择性地筛选了产ARA油脂的被孢霉，其中三株菌株ARA含量超过40％(Eroshin et al.World J Microbiol Biotechnol，1996，12(1)：91-96)。Chen等运用低温筛选的方法获得一株油脂中ARA含量达42.4％的菌株M.alpina Wuji-H4(Chen et al.J Am Oil Chem Soc，1997，74(5)：569-578)。姚建铭等利用离子束注入技术对M.alpina进行诱变，筛选得到一株ARA油脂高产菌，ARA占总脂肪酸含量为45.37％(姚建铭等.生物工程学报，2000，16(4)：478-481)。袁成凌等利用低能离子束对ARA产生菌M.alpina进行诱变选育，最终获得一株ARA油脂高产菌，ARA的含量占总脂防酸的52.36％，ARA产量达4.66g/L(袁成凌等.辐射研究与辐射工艺学报，2003，21(4)：237-242)。
要判断一株菌发酵产ARA的生产性能如何，只考察任何单一因素都是不准确的，必须综合考察菌体生物量、油脂含量、ARA占总脂肪酸含量以及ARA产量这几个因素。尽管这些突变株的ARA百分含量相对较高，但是因为菌株在发酵后生物量、油脂含量等指标不高，使得ARA油脂的发酵水平与产业化的需求还有距离。从总体生产性能考虑，这些菌株并不是优良的菌株。
除此之外，早期一些专利(CN 1696300B；CN 1255529C；CN 101153298B；CN 101113410B)已经对微生物发酵产花生四烯酸油脂的菌株或者发酵方法进行了申请保护，但是这些专利并未对生产的花生四烯酸混合油脂中的C18系列脂肪酸的含量进行限定，而在相关国家标准（《GB26401-2011食品安全国家标准》）以及各花生四烯酸油脂产业化公司的企业标准（《嘉必优花生四烯酸油脂产品规格书》）中均对花生四烯酸混合油脂中各组分脂肪酸含量具有明确的限定。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一株产花生四烯酸油脂的菌株。
本发明的另一目的是提供该菌株的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一株产花生四烯酸油脂的菌株，该菌株分类命名为：高山被孢霉R807（Mortierella alpinaR807），已于2012年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012118。该菌株菌落颜色为乳白色，在PDA培养基上呈现褶状，不产孢子。所述Mortierellaalpina R807菌株的脂肪酸分布图谱（图1）是典型的高山被孢霉的脂肪酸分布图谱。该菌株的油脂组成脂肪酸分布中C18系列脂肪酸相对较少，花生四烯酸占总脂肪酸的含量保持在40％以上。
所述的保藏号为CCTCC NO：M 2012118的高山被孢霉R807在发酵生产花生四烯酸油脂中的应用。
所述的高山被孢霉R807在葡萄糖发酵培养基中生长，发酵生产花生四烯酸油脂，所述葡萄糖发酵培养基配方为：葡萄糖60～90g/L，酵母膏9～12g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硝酸钠3～5g/L，七水合硫酸镁0.5～1.5g/L，pH 6.0。
所述的保藏号为CCTCC NO：M 2012118的高山被孢霉R807在发酵生产C18系列脂肪酸含量低，花生四烯酸含量大于40％的油脂中的应用。所述的C18系列脂肪酸为硬脂酸C18：0，油酸C18：1，亚油酸C18：2及γ-亚麻酸C18：3。
所述的高山被孢霉R807在葡萄糖发酵培养基中生长，发酵生产花生四烯酸油脂，所述葡萄糖发酵培养基配方为：葡萄糖60～90g/L，酵母膏9～12g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硝酸钠3～5g/L，七水合硫酸镁0.5～1.5g/L，pH 6.0。
有益效果：
本发明提供的保藏号为CCTCC NO：M 2012118的高山被孢霉R807作为发酵菌种，可以得到C18系列脂肪酸含量相对较低、花生四烯酸含量较高的高品质花生四烯酸油脂，花生四烯酸占总脂肪酸的含量保持在40％以上，产品质量能够满足食品工业对花生四烯酸含量的要求。
附图说明
图1高山被孢霉Mortierella alpina R807脂肪酸分布图谱。
生物样品保藏信息
高山被孢霉ME-AA01（Mortierella alpina ME-AA01），于2007年5月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M207067。
高山被孢霉R807（Mortierella alpina R807），于2012年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012118。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中所用培养基的溶剂未明确标示时均采用水作为溶剂。
以下实施例中pH调节方式：用1mol/L的盐酸和2mol/L的氢氧化钠调节pH。
以下实施例中接种量的百分比是指种子液与发酵培养基的体积之比。
以下实施例中培养基中残余葡萄糖含量测定仪器：SBA-40C生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）。
以下实施例中脂肪酸成分分析方法如下：
色谱条件：Thermo Finnigan TRACE DSQ型气相色谱-质谱联用仪，采用DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。起始柱温50℃，以20℃/min升温到250℃，保持2min。进样温度200℃，载气为氦气，载气流速1ml/min，不分流进样。总运行时间为12min。萃取头在进样口于200℃下脱附5min。
质谱检测条件：EI源70eV，离子源温度250℃，传输线温度250℃，扫描范围50～400aum。
实施例1：获得成熟的菌丝体
将高山被孢霉ME-AA01（Mortierella alpina ME-AA01）（CCTCC NO：M207067）接种在PDA培养基上。在25℃恒温培养箱中生长6-7天后，菌丝体的气生菌丝发达时，可用于制备种子液。上述PDA培养基配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，加水至1L，12l℃灭菌20min。(配制方法：马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL。)
实施例2：通过紫外-LiCl诱变得到本发明菌株
培养好的菌丝体高山被孢霉ME-AA01（CCTCC NO：M207067）经无菌水洗下，接于种子培养基中，25℃、120rpm培养三天。取20mL种子液6000rpm离心5min，弃上清，以20mLpH 7.4磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌球悬液。将菌球悬液接入已经灭菌处理过的铺有玻璃珠的250mL三角瓶中，25℃250rpm震荡处理20min。用同等体积的无菌水将其稀释处理，用灭过菌的纱布过滤，制成菌悬液作为待处理菌液。
将待处理菌液与LiCl(1.5％)按照1∶1的体积混合注入无菌空白培养皿中，菌液厚度1mm，黑暗条件下进行紫外诱变。紫外灯20W，照射距离为30cm，照射时间为25min，诱变全程处于红灯下。取出培养皿，然后以10倍稀释法作一系列稀释至10-3。取0.1mL涂布于含有没食子酸辛酯的选择性固体培养基平板，暗箱培养2-3d。挑取若干在没食子酸辛酯选择性固体培养基上存活的单菌落，必须是生长速度较快且气生菌丝较发达的，即得到本发明菌株R807。
上述本发明菌株R807，菌落颜色为乳白色，在PDA培养基上呈现褶状，不产孢子，可在含没食子酸辛酯的培养基生长。该菌株可以在高糖发酵培养基中发酵生产ARA，其脂肪酸图谱是典型的高山被孢霉的图谱。本发明菌株定名为高山被孢霉R807（Mortierella alpina R807），已于2012年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012118。
上述选择性培养基配方为：添加没食子酸辛酯的PDA培养基。取0.1g没食子酸辛酯，用微量无水乙醇溶解后定容至10mL。用微孔过滤器除菌，加入到50℃左右的PDA培养基中，加入量为30mg/L。
上述种子培养基配方为：葡萄糖30～40g/L，酵母膏4～7g/L，磷酸二氢钾2～3g/L，硝酸钠1～3g/L，七水合硫酸镁0.5～1.5g/L，pH 6.0。
实施例3：制备上述Mortierella alpina R807菌株的菌球悬液
按实施例1方式将Mortierella alpina R807（CCTCC NO：M 2012118）培养至菌丝成熟阶段。菌丝体经无菌水洗下，接于种子培养基中，25℃、120rpm培养两天。再以5％的接种量转接于新鲜种子培养基，置于转速为120rpm的摇床上，25℃培养36h后，即制得Mortierella alpinaR807的菌球悬液。
实施例4：利用上述Mortierella alpina R807菌株，以发酵培养基获得含低产C18脂肪酸、高产ARA油脂的发酵菌体
将通过实施例3的方法所得的Mortierella alpina R807（CCTCC NO：M 2012118）菌球悬液以10％的接种量接入发酵培养基，置于转速为120rpm的摇床上，25℃培养156h。间隔12h取样并检测发酵结果。156h，发酵培养基中残余葡萄糖含量为0时，发酵终止。测发酵结束时各生产性能指标，如表1所示。对发酵获得的干菌体进行气相色谱分析，具体分析结果如表2所示，脂肪酸分布图谱如图1所示。
表1 Mortierella alpina R807的发酵生产性能
表2 Mortierella alpina R807菌体中总脂肪酸的组分分析
上述发酵培养基配方为：葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硝酸钠4g/L，七水合硫酸镁1g/L，pH 6.0。
Claims (6)
1.一株产花生四烯酸油脂的菌株，该菌株分类命名为：高山被孢霉Mortierella alpina R807，已于2012年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012118。
2.权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M 2012118的高山被孢霉R807在发酵生产花生四烯酸油脂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的高山被孢霉R807在葡萄糖发酵培养基中发酵生产花生四烯酸油脂，所述葡萄糖发酵培养基配方为：葡萄糖60～90g/L，酵母膏9～12g/L，磷酸二氢钾3～4g/L，硝酸钠3～5g/L，七水合硫酸镁0.5～1.5g/L，pH 6.0。
4.权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M 2012118的高山被孢霉R807在发酵生产花生四烯酸油脂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M 2012118的高山被孢霉R807在发酵生产花生四烯酸含量大于40％的油脂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的高山被孢霉R807在葡萄糖发酵培养基中生长，发酵生产花生四烯酸油脂，所述葡萄糖发酵培养基配方为：葡萄糖60～90g/L，酵母膏9～12g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硝酸钠3～5g/L，七水合硫酸镁0.5～1.5g/L，pH 6.0。
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