CN103202234B

CN103202234B - 铁皮石斛的快速繁殖方法

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Publication number: CN103202234B
Application number: CN201310156723.6A
Authority: CN
Inventors: 王喆之; 牛俊峰; 吕鼎豪; 肖娅萍; 任倩俐; 王璐
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2033-04-28
Also published as: CN103202234A

Abstract

一种铁皮石斛的快速繁殖方法，在转接培养过程中以添加萘乙酸、香蕉汁和多效唑的MS培养基为转接培养基，培养一个月铁皮石斛组培苗生物积累量可达到249.9%，且畸形苗少，同时在大田移栽时，以发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的混合物为大田移栽基质，实验结果证明，移栽135天后，铁皮石斛移栽苗成活率为94.8%、高度增加29.74%、直径增加31.64%、新生芽增加12.5%、生物积累量增加34.17%。本发明方法原料易得，操作简单，能快速提高铁皮石斛在组培瓶内的生物积累量和移栽成活率，可广泛用于铁皮石斛的工厂化快速繁殖和大规模的大田栽培。

Description

铁皮石斛的快速繁殖方法

技术领域

本发明属于药用植物人工种植技术领域，具体涉及兰科植物铁皮石斛的快速繁殖方法。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），为兰科石斛属多年生草本植物，主要分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西等地，为一种珍稀的中药材。因其具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效,位列“中华九大仙草之首”,并被录入2010版药典。其主要药用成分为铁皮石斛多糖、生物碱、氨基酸和其他微量成分。现代药理学表明，铁皮石斛具抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、增强人体免疫力、抑制肿瘤和降低血糖等作用及扩张血管的作用。其特殊的药理药效作用，使这一植物的野生资源受到了人为的大规模、掠夺式开采，因而使铁皮石斛的野生资源紧缺，甚至濒临灭绝。

铁皮石斛种子没有胚乳，在自然条件下发芽率低，生长缓慢，人工自花传粉成功率较低，且对生长环境要求苛刻（天然状态下主要生长于悬崖峭壁），其已无法满足日益增长的市场需求。而组织培养是目前铁皮石斛种苗生产的重要途径,也是挽救这一濒危物种的有效途径。发明人所在的研究小组对于铁皮石斛外植体诱导愈伤，愈伤组织继代及诱导其长成生根苗的技术已十分成熟。一般从生根苗到出瓶苗需要转接培养基一次，此阶段是铁皮石斛在组培瓶内生长的最快时期，同时也是产生畸形苗，出现组培瓶开花的主要时期，因此寻求一组影响铁皮石斛生根苗生长的关键激素和添加物是十分必要的。

关于组培苗移栽的基质筛选也是目前国内一些科研工作者和种植者研究的重点，民间有用树皮作为移栽基质的传统做法，但关于铁皮石斛基质的研究，有不同的基质配方和比例。目前，国内大多数以MS培养基为基本培养基，添加不同激素及不同添加物，但是在培养过程中经常遇见产生畸形苗，甚至出现组培苗开花现象，并且存在组培苗生长慢、生物积累率低的现象。目前有关组培苗的大田移栽基质均采用树皮、木屑、苔藓等按照一定比例混合，基质不同移栽成活率也尽相同，但至今没有一种既满足铁皮石斛的生长发育，又能有效利用当地的材料作为移栽材料的基质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服铁皮石斛种植转接培养和大田移栽过程中存在的缺点，提供一种成本低，组培苗生长快、移栽成活率高的铁皮石斛快速繁殖育苗的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、配制铁皮石斛转接培养基

向MS培养基中添加萘乙酸、香蕉汁、多效唑，用蒸馏水定容，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，配制成铁皮石斛转接培养基，铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.1～0.9mg/L、香蕉浓度为50～150g/L、多效唑浓度为0.1～2.0mg/L。

2、铁皮石斛组培苗的转接培养

选取组培室中株高为1～3cm、长出2～3片真叶且根系发育完整的铁皮石斛组培苗，在超净工作台上将组培苗转接至步骤1配制的铁皮石斛转接培养基上，置于温度为25±2℃、光照强度2000～3000Lx、光照12h/12h的组织培养室培养。

3、炼苗

将步骤2中转接培养后株高为5～6cm、根长为1～1.5cm的铁皮石斛幼苗做炼苗处理。

4、配制铁皮石斛大田移栽基质

将直径为3～5cm的木块与直径为3～5cm的石块按照体积比为2:1混匀后铺在苗床上，铺的厚度为5～8cm，木块与石块的混合物上面铺一层厚度为5～10cm的发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的体积比为1:0.5～1:0.5～2的基质，在基质上方铺一层厚度为0.5～2cm的鲜苔藓，配制成铁皮石斛大田移栽基质。

5、移栽

将炼苗处理后的铁皮石斛幼苗按3～4株一穴移栽到步骤4配制的铁皮石斛大田移栽基质中。

本发明的配制铁皮石斛转接培养基步骤1中，向MS培养基中添加萘乙酸、香蕉汁、多效唑，用蒸馏水定容，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，配制成铁皮石斛转接培养基，铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度最佳为0.5mg/L、香蕉浓度最佳为75g/L、多效唑浓度最佳为0.9mg/L。

本发明的配制铁皮石斛大田移栽基质步骤4中，将直径为3～5cm的木块与直径为3～5cm的石块按照体积比为2:1混匀后铺在苗床上，铺的厚度为5～8cm，最佳在木块与石块的混合物上面铺一层厚度为5～10cm的发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的体积比为1:0.5:0.5的基质，在基质上方铺一层厚度为0.5～2cm的鲜苔藓，配制成铁皮石斛大田移栽基质。

本发明以添加萘乙酸、香蕉汁和多效唑的MS培养基为铁皮石斛转接培养的培养基，培养1个月铁皮石斛组培苗生物积累量可达249.9%，畸形苗少，同时以发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的混合物为基质配制大田移栽基质，实验结果证明，移栽135天后，铁皮石斛移栽苗成活率为94.8%、高度增加29.74%、直径增加31.64%、新生芽增加12.5%、生物积累量增加34.17%。本发明方法原料易得，操作简单，能快速提高铁皮石斛在组培瓶内的生物积累量和移栽成活率，可广泛用于铁皮石斛的工厂化快速繁殖和大规模的大田栽培。

附图说明

图1是萘乙酸浓度对铁皮石斛组培苗生物积累量的影响。

图2是香蕉汁浓度对铁皮石斛组培苗生物积累量的影响。

图3是多效唑浓度对铁皮石斛组培苗生物积累量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

1、配制铁皮石斛转接培养基

向培养基中加入萘乙酸、香蕉汁、多效唑，用蒸馏水定容至1L，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，配制成铁皮石斛转接培养基，铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.5mg/L、香蕉浓度为75g/L、多效唑浓度为0.9mg/L。

上述的香蕉汁是将75g香蕉在榨汁机中加100mL水打匀制得。

2、铁皮石斛组培苗的转接培养

选取组培室中株高为2cm、长出2～3片真叶且根系发育完整的铁皮石斛组培苗，在超净工作台上将组培苗转接至盛有铁皮石斛转接培养基的组培瓶内，置于温度为25±2℃、光照强度3000Lx、光照12h/12h的组织培养室培养。

3、炼苗

将步骤2中转接培养后株高为5cm、根长为1～1.5cm的铁皮石斛幼苗在温室条件下放置2周做炼苗处理。

4、配制铁皮石斛大田移栽基质

选取腐朽的树木用铡草机打成直径3～5cm的木块，与直径为3cm的石块按照体积比为2:1混匀后铺在苗床上，铺的厚度为5cm，木块与石块的混合物上面再铺一层厚度为5cm的发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的体积比为1:0.5:0.5的基质，在基质上方铺一层厚度为0.5cm的鲜苔藓，配制成铁皮石斛大田移栽基质。

5、移栽

将炼苗处理后的铁皮石斛苗根部的培养基用自来水洗净，倒置放在塑料网筐中，室温放置，待其根部稍微发白变软后按3～4株铁皮石斛幼苗一穴移栽到步骤4配制的铁皮石斛大田移栽基质中，为防止根部损坏，其根部1/4露出基质。

实施例2

1、配制铁皮石斛转接培养基

向培养基中加入萘乙酸、香蕉汁、多效唑，用蒸馏水定容至1L，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，配制成铁皮石斛转接培养基，铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.1mg/L、香蕉浓度为50g/L、多效唑浓度为0.1mg/L。

上述的香蕉汁是将50g香蕉在榨汁机中加100mL水打匀制得。

2、铁皮石斛组培苗的转接培养

选取组培室中株高为1cm、长出2～3片真叶且根系发育完整的铁皮石斛组培苗，在超净工作台上将组培苗转接至盛有铁皮石斛转接培养基的组培瓶内，置于温度为25±2℃、光照强度2000Lx、光照12h/12h的组织培养室培养。

3、炼苗

将步骤2中转接培养后株高为6cm、根长为1～1.5cm的铁皮石斛幼苗在温室条件下放置2周做炼苗处理。

4、配制铁皮石斛大田移栽基质

选取腐朽的树木用铡草机打成直径3～5cm的木块，与直径为3～5cm的石块按照体积比为2:1混匀后铺在苗床上，铺的厚度为8cm，木块与石块的混合物上面再铺一层厚度为10cm的发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的体积比为1:1:2的基质，在基质上方铺一层厚度为2cm的鲜苔藓，配制成铁皮石斛大田移栽基质。

5、移栽

将炼苗处理后的铁皮石斛苗根部的培养基用自来水洗净，倒置放在塑料网筐中，室温放置，待其根部稍微发白变软后按3～4株铁皮石斛幼苗一穴移栽到步骤4配制的铁皮石斛大田移栽基质中，为防止根部损坏，其根部1/3露出基质。

实施例3

1、配制铁皮石斛转接培养基

向培养基中加入萘乙酸、香蕉汁、多效唑，用蒸馏水定容至1L，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，配制成铁皮石斛转接培养基，铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.9mg/L、香蕉浓度为150g/L、多效唑浓度为2.0mg/L。

上述的香蕉汁是将150g香蕉在榨汁机中加200mL水打匀。

2、铁皮石斛组培苗的转接培养

选取组培室中株高为3cm、长出2～3片真叶且根系发育完整的铁皮石斛组培苗，在超净工作台上将组培苗转接至盛有铁皮石斛转接培养基的组培瓶内，置于温度为25±2℃、光照强度2500Lx、光照12h/12h的组织培养室培养。

3、炼苗

4、配制铁皮石斛大田移栽基质

选取腐朽的树木用铡草机打成直径3～5cm的木块，与直径为3～5cm的石块按照体积比为2:1混匀后铺在苗床上，铺的厚度为6cm，木块与石块的混合物上面再铺一层厚度为8cm的发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的体积比为1:1:1的基质，在基质上方铺一层厚度为1cm的鲜苔藓，配制成铁皮石斛大田移栽基质。

5、移栽

将炼苗处理后的铁皮石斛苗根部的培养基用自来水洗净，倒置放在塑料网筐中，室温放置，待其根部稍微发白变软后按3～4株铁皮石斛幼苗一穴移栽到步骤4配制的铁皮石斛大田移栽基质中，为防止根部损坏，其根部1/5露出基质。

为了确定本发明的最佳工艺条件，发明人进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下：

1、铁皮石斛转接培养基单因素试验

（1）萘乙酸浓度对铁皮石斛组培苗生物积累量的影响

向MS培养基中添加萘乙酸，用蒸馏水定容至1L，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，分别配制成萘乙酸浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L的铁皮石斛转接培养基。按照实施例1的方法进行转接培养实验，每个浓度做12个重复。转接培养30天时，以每瓶为基本单位，称量组培瓶内铁皮石斛的质量，以单位时间内铁皮石斛组培苗生物积累量为指标，单位时间选择30天，按照下述公式计算生物积累量：

生物积累量=（测量值-初始值）/初始值×100%

计算结果见图1。

由图1可见，随着铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度的增加，转接培养30天的铁皮石斛组培苗生物积累量先增加后降低，其中铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.5mg/L时，转接培养30天的铁皮石斛组培苗生物积累量可达到76.0%。

（2）香蕉汁浓度对铁皮石斛组培苗生物积累量的影响

向MS培养基中添加萘乙酸、香蕉汁，用蒸馏水定容至1L，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，配制成萘乙酸浓度为0.5mg/L、香蕉浓度分别为50、75、100、125、150g/L的铁皮石斛转接培养基。按照实施例1的方法进行转接培养实验，每个浓度做12个重复。转接培养30天时，以每瓶为基本单位，称量组培瓶内铁皮石斛的质量，按照试验（1）的方法计算生物积累量，计算结果见图2。

由图2可见，随着铁皮石斛转接培养基中香蕉汁浓度的增加，转接培养30天的铁皮石斛组培苗生物积累量先增加后降低，铁皮石斛转接培养基中香蕉的浓度为50g/L时，铁皮石斛组培苗转接培养30天的生物积累量可达到98.9%，铁皮石斛转接培养基中香蕉的浓度为100g/L时，铁皮石斛组培苗转接培养30天的生物积累量为81.4%。

（3）多效唑浓度对铁皮石斛组培苗生物积累量的影响

向MS培养基中添加萘乙酸、香蕉汁、多效唑，用蒸馏水定容至1L，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，配制成萘乙酸浓度为0.5mg/L、香蕉浓度为75g/L、多效唑浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L的铁皮石斛转接培养基。按照实施例1的方法进行转接培养实验，每个浓度做12个重复。转接培养30天时，以每瓶为基本单位，称量组培瓶内铁皮石斛的质量，按照试验（1）的方法计算生物积累量，计算结果见图3。

由图3可见，随着铁皮石斛转接培养基中多效唑浓度的增加，转接培养30天的铁皮石斛组培苗生物积累量先增加后降低，铁皮石斛转接培养基中多效唑的浓度为1.0mg/L时，铁皮石斛组培苗转接培养30天的生物积累量可达到75.8%。

由上述单因素试验可以看出，影响铁皮石斛组培苗生物积累量的排序为：香蕉汁浓度＞萘乙酸浓度＞多效唑浓度。

2、铁皮石斛转接培养基响应面试验

采用Box-Behnken响应面分析方法，按照表1的3因素3水平设17个试验点，其中1～12号是析因试验,13～17号是中心试验。17个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复5次，铁皮石斛组培苗转接培养过程与实施例1相同，培养30天后统计生物积累量的变化，结果见表2。

表1试验因素和水平

表2Box-Behnken试验设计及结果

对表2的试验结果进行响应面二次回归模型拟合，得到铁皮石斛组培苗生物积累量对以上三因素的二次多项回归方程

Y=2.64+0.029A+0.16B-0.15C-0.10AB-0.015AC+0.39BC-0.19A²-0.59B²-0.29C²

对回归方程进行方差分析显著性检验，结果见表3。

表3方差分析

注：P≦0.05，差异显著。

由表3可见，失拟差不显著（P=0.2394＞0.05）,模型的P值为0.0046，表明模型极显著，因素交互项BC和B²对试验的影响显著。同时软件方程的决定系数R₂=0.9182，表明该模型拟合程度良好，该模型是合适的。从回归方程可以看出，香蕉汁浓度和多效唑浓度间交互作用对铁皮石斛生物积累量影响最为显著。结合上述二次回归模型的结果，铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.51mg/L、香蕉浓度为76.48g/L、多效唑浓度为0.89mg/L时，铁皮石斛生物积累量最大，为266.5%。综合实际条件，本发明选择铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.5mg/L、香蕉浓度为75g/L、多效唑浓度为0.9mg/L。

为了检验响应面模型的合适性和有效性，发明人进行了一组验证试验，试验结果见表4。

表4最优配方试验结果

由表4可见，实际值与理论值相差较小，RSD%为1.381%，说明理论值与实际值具有良好的拟合性，所建模型合理，从而说明回归方程能更合理说明各影响因素对铁皮石斛组培苗生物积累量的影响。

综合上述试验结果以及实际条件，本发明最佳选择铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.5mg/L、香蕉浓度为75g/L、多效唑浓度为0.9mg/L。

3、铁皮石斛大田移栽基质的筛选

选取表5中四种不同配比的物质作为铁皮石斛移栽基质，发明人于2012年6月11日对铁皮石斛进行移栽实验，具体移栽方法与实施例1相同。移栽后对铁皮石斛移栽苗的高度、苗的直径、新生芽及生物量（重量）进行统计，并在10月25日，对移栽135天的移栽苗的各项指标进行统计，结果见表6。

表5基质配方

表6不同基质统计结果

由表6可见，以发酵过的块状树皮与腐殖质、珍珠岩的体积比为1:0.5:0.5的混合物、发酵过的块状树皮与苔藓的体积比为3:1的混合物、未发酵的粉状树皮与苔藓的体积比为3:1的混合物分别配制成铁皮石斛移栽基质，铁皮石斛移栽苗的成活率较低，且移栽苗的生长发育较慢，而以发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的体积比为1:0.5:0.5的混合物配制成铁皮石斛移栽基质，铁皮石斛移栽苗的成活率为94.8%，移栽135天后，移栽苗的高度增加29.74%、直径增加31.64%，新生芽增加12.5%，其生物积累量增加34.17%。因此，本发明选择以发酵过的树皮粉与腐殖质、珍珠岩的混合物配制成铁皮石斛移栽基质。

Claims

1.一种铁皮石斛的快速繁殖方法，其特征在于它由下述步骤组成：

（1）配制铁皮石斛转接培养基

向MS培养基中添加萘乙酸、香蕉汁、多效唑，用蒸馏水定容，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟，配制成铁皮石斛转接培养基，铁皮石斛转接培养基中萘乙酸浓度为0.5mg/L、香蕉浓度为75g/L、多效唑浓度为0.9mg/L；

上述的香蕉汁是将75g香蕉在榨汁机中加100mL水打匀制得；

（2）铁皮石斛组培苗的转接培养

选取组培室中株高为1～3cm、长出2～3片真叶且根系发育完整的铁皮石斛组培苗，在超净工作台上将组培苗转接至步骤（1）配制的铁皮石斛转接培养基上，置于温度为25±2℃、光照强度2000～3000Lx、光照12h/12h的组织培养室培养；

（3）炼苗

将步骤（2）中转接培养后株高为5～6cm、根长为1～1.5cm的铁皮石斛幼苗做炼苗处理；

（4）配制铁皮石斛大田移栽基质

将直径为3～5cm的木块与直径为3～5cm的石块按照体积比为2:1混匀后铺在苗床上，铺的厚度为5～8cm，木块与石块的混合物上面铺一层厚度为5～10cm的发酵过的树皮粉、腐殖质、珍珠岩的体积比为1:0.5:0.5的基质，在基质上方铺一层厚度为0.5～2cm的鲜苔藓，配制成铁皮石斛大田移栽基质；

（5）移栽

将炼苗处理后的铁皮石斛幼苗按3～4株一穴移栽到步骤（4）配制的铁皮石斛大田移栽基质中。