CN112876528A - 一种获得人参皂苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化合物的提取分离，具体涉及一种获得人参皂苷的方法。所述方法包括如下步骤：培养人参不定根，对人参不定根进行酸碱胁迫处理，然后提取人参皂苷。该方法具有操作简便、皂苷得率高的优点。

Description

一种获得人参皂苷的方法

技术领域

本发明涉及化合物的提取分离，具体涉及一种获得人参皂苷的方法。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是五加科(Araliacede)人参属(Panax)多年生药用植物。人参的应用历史悠久，在地球上已经存在了数百万年，是沿用至今的一种非常珍贵的中草药。人参中最主要且有效的药用成分是人参皂苷(Ginsenoside)，又名皂甙，人参皂苷是次生代谢产物，包括总皂苷和40多种单体皂苷，人参皂苷主要在人参根中，但也存在于茎、叶、花、果实、芽胞和芦头等组织器官中。人参皂苷含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核，依糖苷基架构的不同而被分为两组：达玛烷型和齐墩果烷型。达玛烷类型包括两类：人参二醇型-A型，苷元为20(S)-原人参二醇，如人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2及糖苷基PD；人参三醇型-B型，苷元为20(S)-原人参三醇，如人参皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1及糖苷基PT。齐墩果烷型：齐墩果酸型-C型，苷元为齐墩果酸。人参皂苷有多种药理活性，包括增强免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗血脂、增强记忆力和延缓衰老等功效，可用于糖尿病、癌症、心脑血管病等疾病的预防及治疗。由于人参皂苷的药用和保健价值较高，而成为广泛的研究和利用目标。

发明内容

为促进人参皂苷的研究和利用，本发明提供一种获得人参皂苷的方法，具有操作简便、皂苷得率高的优点。本发明请求保护的技术方案如下：

一种获得人参皂苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：培养人参不定根，对人参不定根进行酸碱胁迫处理，然后提取人参皂苷。

优选地，所述培养人参不定根是指：将人参不定根接种至B5培养基中，20～24℃，200～240r/min避光培养。

优选地，所述人参不定根的培养时间为25天。

优选地，所述人参不定根的接种量为每250mL培养基中接种1g人参不定根。

优选地，所述酸碱胁迫处理是指将人参不定根的培养基的pH调至3.5、4.5、7.0或8.0。

优选地，使用无菌的盐酸或氢氧化钠溶液调节培养基的pH。

优选地，所述酸碱胁迫处理的时间为5天。

优选地，所述提取人参皂苷包括：

步骤1：取经过酸碱胁迫处理的人参不定根，37℃干燥后研磨成人参干粉；

步骤2：将人参干粉包裹在滤纸中，将滤纸袋浸入甲醇溶液中，放置过夜，然后超声提取30分钟；将超声提取液连同滤纸袋一起转移至索氏提取器中，加入甲醇溶液，并在90℃水浴中提取30h；然后将溶液转移到旋转蒸发仪上蒸发至干，并用蒸馏水重新溶解；

步骤3：向步骤2获得的溶液中加入乙酸乙酯，充分混合，静置以分离各层，用分液漏斗收集下层溶液，重复3次；

步骤4：向步骤3获得的溶液中加入水饱和正丁醇，混合均匀，然后静置分离各层，用分液漏斗收集上层溶液，重复3次；

步骤5：使用旋转蒸发仪蒸发步骤4收集的溶液，直到不再有液体流动为止，得到人参皂苷。

优选地，步骤2和步骤5中，使用旋转蒸发仪在85℃的温度下，120～200r/min的转速下蒸发溶液。

本发明所述的人参皂苷包括但不限于Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、PPT和/或PPD。

附图说明

图1.人参不定根的鲜重、干重和总皂苷含量；其中，A为人参不定根的鲜重对比图；B为人参不定根的干重对比图；C为人参不定根中的总皂苷含量对比图；横坐标中的CK代表空白对照组，3.5、4.5、7.0、8.0分别代表pH3.5，pH4.5、pH7.0、pH8.0的酸碱处理组；皂苷含量(mg/g)表示从1克人参不定根干粉中提取的皂苷量(mg)。

图2.人参皂苷标准品的高效液相色谱图。

图3.酸碱处理组(pH3.5)的人参皂苷样品的高效液相色谱图。

图4.酸碱处理组(pH4.5)的人参皂苷样品的高效液相色谱图。

图5.酸碱处理组(pH7.0)的人参皂苷样品的高效液相色谱图。

图6.酸碱处理组(pH8.0)的人参皂苷样品的高效液相色谱图。

图7.空白对照组(CK)的人参皂苷样品的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

实验材料：

以下实验中所使用的人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为大马牙人参，由吉林农业大学人参基因资源研究与利用实验室提供。该品种为已知的人参品种，在非专利文献“王景，张甜甜，李萌等.利用SNP分子标记对人参品种大马牙的特异鉴定研究，中药材.2015年11期”中有记载。

实验药品：

B5培养基配方：

培养基PH：5.5～6.5

母液Ⅰ(10×)：

母液Ⅱ(100×)：

母液Ⅲ(100×)：

水饱和正丁醇：将正丁醇和蒸馏水按照1:1的体积比混合，振摇，混匀，放置过夜。得到的混合液分层，上层为水饱和正丁醇溶液。

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得；使用的实验方法和条件均为本领域常规的实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

实施例1、人参皂苷的提取分离

试验材料：大马牙人参的不定根，由吉林农业大学人参基因资源研究与利用实验室提供。

1.1人参不定根的酸碱胁迫处理

将实验室诱导培养的人参不定根单根无性系接种至B5培养基中，生长25天的人参不定根接种于30瓶新鲜的B5培养基中，每瓶接种量为1.0g/250mL(每250mL培养基接种1g人参不定根)，20～24℃，200～240r/min，避光培养。将接种了人参不定根的培养瓶分为5组，每组6瓶(6个生物学重复，选取长势、生长量均一的材料)，其中4组作为酸碱处理组(pH组)，1组作为空白对照组(CK组)。将所有人参不定根置于20～24℃，200～240r/min，避光条件下进行培养。

接种25天后，使用过滤除菌的0.01M HCL和0.01M NaOH分别调节4个酸碱处理组的培养基pH至3.5、4.5、7.0和8.0，空白对照组加入ddH₂O。各组的溶液添加如表1所示，表中pH3.5组、pH4.5组、pH7.0组、pH8.0组为酸碱处理组，CK组为空白对照组。

表1

在20～24℃，200～240r/min，避光培养条件下酸碱处理5天后，从培养瓶中取出不定根，称量每瓶人参不定根的鲜重后，烘干，称量干重，然后提取人参皂苷。

1.2人参皂苷的分离提取

按照如下步骤提取人参不定根中的人参皂苷：

(1)将经过酸碱胁迫处理的人参不定根和空白对照组的人参不定根分别在37℃的烤箱中干燥72小时，取出并称重。取干重1克的材料，用研钵研磨成人参干粉，用于提取人参皂苷。

(2)将获得的人参干粉包裹在滤纸中，确保纸袋不容易松动。将包裹着人参干粉的滤纸袋浸入装在50mL锥形瓶中的20mL甲醇溶液中，并用保鲜膜密封瓶口，以防止甲醇挥发。放置过夜(8～10小时)后，将其超声(220HZ)提取30分钟。之后，将滤纸袋和溶液一并转移至索氏提取器中，向其中加入80mL甲醇溶液，并在90℃水浴中提取30h。然后将溶液转移到旋转蒸发仪上，于85℃，120～200r/min蒸发至干，并用20mL蒸馏水重新溶解以备用。

(3)向上一步获得的溶液中加入20mL乙酸乙酯，充分混合，静置以分离各层，用分液漏斗收集下层溶液，重复3次。

(4)向上一步获得的溶液中加入20mL水饱和正丁醇，混合均匀，然后静置分离各层，用分液漏斗收集上层溶液，重复3次。

(5)使用旋转蒸发仪在85℃，120～200r/min下蒸发上一步收集的溶液，直到不再有液体流动为止，得到人参皂苷。然后用10mL色谱甲醇重新溶解人参皂苷并通过0.22μm有机相滤膜过滤，密封备用。

获得了各酸碱处理组(pH3.5、pH4.5、pH7.0、pH8.0)以及空白对照组(CK)的人参皂苷样品。

1.3人参皂苷的高效液相色谱检测

人参皂苷标准溶液的制备：精确称取各人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1的标准品，并加入适量的甲醇使其溶解，得到的标准溶液通过0.22μm滤膜过滤备用。分别配制每种人参皂苷单体的单标溶液，以及含有这些人参皂苷单体的混标溶液，标准溶液中人参皂苷单体的浓度如表2所示。通过高效液相色谱检测单标溶液，可以得到每种人参皂苷单体的保留时间(min)。

表2

利用高效液相色谱检测混标溶液以及上述1.2中提取分离的各酸碱处理组和空白对照组的人参皂苷样品。本实验所用仪器为Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)。色谱条件：Waters C18色谱柱(4.6mm×250mm，内径5μm)，柱温35℃，进样量：10.00μL，流动相：溶剂A为水，溶剂B为乙腈，进行洗脱，条件如表3所示，流速为l.000mL/min，检测波长为203nm。

表3高效液相色谱流动相梯度条件

人参皂苷标准品和提取的人参皂苷样品的高效液相色谱图如图2-7所示。将各样品中人参皂苷单体的峰面积代入公式：[(S样/S标)×C标×V样]/1g，计算样品中人参皂苷单体的含量(mg/g，表示从1克人参干粉中提取出来的人参皂苷单体的量)。其中，“S样”表示样品中人参皂苷单体的峰面积，“S标”表示混标溶液中人参皂苷单体的峰面积，“C标”表示混标溶液中人参皂苷单体的浓度(mg/μL)，“V样”表示样品在高效液相色谱检测中的进样量(10μL)。总皂苷含量等于各人参皂苷单体含量的总和。

本实验对酸碱处理组和空白对照组的人参不定根进行了鲜重、干重和总皂苷含量的测定，结果如表4和图1所示，与未经处理的人参不定根相比，经酸碱胁迫处理的人参不定根的总皂苷含量显著升高，鲜重和干重变化并不明显。通过这些结果证明，在人参不定根培养系统中进行酸碱胁迫处理促进了人参皂苷的合成。

表4.人参不定根的鲜重、干重和总皂苷含量对比

组别	鲜重(g)	干重(g)	总皂苷含量(mg/g)
				pH3.5组	9.13	0.95	10.60
pH4.5组	10.70	1.00	10.70
				pH7.0组	10.43	1.09	12.06
pH8.0组	10.33	0.96	13.25
				CK组	10.40	1.00	2.82

注：总皂苷含量(mg/g)表示从1克人参干粉中提取出来的人参皂苷总量(mg)。

Claims (10)

1.一种获得人参皂苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：培养人参不定根，对人参不定根进行酸碱胁迫处理，然后提取人参皂苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养人参不定根是指：将人参不定根接种至B5培养基中，20～24℃，200～240r/min避光培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述人参不定根的培养时间为25天。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述人参不定根的接种量为每250mL培养基中接种1g人参不定根。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸碱胁迫处理是指将人参不定根的培养基的pH调至3.5、4.5、7.0或8.0。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用无菌的盐酸或氢氧化钠溶液调节培养基的pH。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酸碱胁迫处理的时间为5天。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述提取人参皂苷包括：

步骤1：取经过酸碱胁迫处理的人参不定根，37℃干燥后研磨成人参干粉；

步骤2：将人参干粉包裹在滤纸中，将滤纸袋浸入甲醇溶液中，放置过夜，然后超声提取30分钟；将超声提取液连同滤纸袋一起转移至索氏提取器中，加入甲醇溶液，并在90℃水浴中提取30h；然后将溶液转移到旋转蒸发仪上蒸发至干，并用蒸馏水重新溶解；

步骤3：向步骤2获得的溶液中加入乙酸乙酯，充分混合，静置以分离各层，用分液漏斗收集下层溶液，重复3次；

步骤4：向步骤3获得的溶液中加入水饱和正丁醇，混合均匀，然后静置分离各层，用分液漏斗收集上层溶液，重复3次；

步骤5：使用旋转蒸发仪蒸发步骤4收集的溶液，直到不再有液体流动为止，得到人参皂苷。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2和步骤5中，使用旋转蒸发仪在85℃的温度下，120～200r/min的转速下蒸发溶液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人参皂苷包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、PPT和/或PPD。

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