CN111388542A

CN111388542A - 一种从白芍非药用部位提取单萜苷类有效成分的方法

Info

Publication number: CN111388542A
Application number: CN202010213437.9A
Authority: CN
Inventors: 龚慕辛; 马喆; 谢凯莉
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2020-07-10

Abstract

本发明涉及中药有效成分的提取，具体公开了一种从白芍非药用部位提取单萜苷类有效成分的方法。所述方法包括如下步骤：将白芍非药用部位进行干燥处理并粉碎，得到颗粒样品；采用水或醇‑水混合溶剂对所述颗粒样品进行提取，获得粗提取液；利用大孔树脂对由所述粗提取液制备的上样液进行吸附，再利用乙醇‑水混合溶媒作为洗脱剂，按0％、50％乙醇梯度洗脱，收集50％乙醇洗脱部位洗脱液，浓缩，干燥，获得精制提取物。本发明所述方法不仅有效富集了多种单萜苷组分，还减少了潜在毒性成分，扩大并丰富了中药资源的有效综合利用。

Description

一种从白芍非药用部位提取单萜苷类有效成分的方法

技术领域

本发明涉及中药有效成分的提取，具体地说，涉及从白芍非药用部位提取单萜苷类有效成分的方法。

背景技术

白芍的有效成分为白芍单萜苷类，主要包括氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷，每种成分均具有多种药理作用和用途，目前主要提取自白芍主根。

以白芍等牡丹科植物为原料进行单萜苷类成分提取或制备的相关技术多集中在芍药苷和芍药内酯苷两个主要成分上，且重点是得到一些单体成分，工艺较为复杂，所得单体成分无论是药用还是食用并不能代表中药白芍的综合作用。

白芍的根茎(根状地下茎)和侧根凸头，合称芍头，属于非药用部位，白芍主根上附着的细根(以下简称细根)因不能达到药用要求，在采收时常作为下脚料被弃去。然而，其中仍然含有氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷等有效成分，只是还同时存在一些潜在毒性成分如苯甲酸等，故而至今尚未见到针对这些非药用部位进行有效成分提取的研究报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种从白芍非药用部位提取有效成分的方法，旨在从芍头和白芍细根中提取单萜苷类有效成分，并降低提取物中潜在毒性成分的含量，为中药资源的安全合理应用做出贡献。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种从白芍非药用部位提取有效成分的方法，包括如下步骤：

(1)将白芍非药用部位进行干燥处理并粉碎，得到颗粒样品；

(2)采用水或醇-水混合溶剂对所述颗粒样品进行提取，合并提取液，过滤，浓缩，获得粗提取液；

(3)采用层析柱，以大孔树脂为填料，先利用大孔树脂对由所述粗提取液制备的上样液进行吸附，再利用乙醇-水混合溶媒作为洗脱剂，按0％、50％乙醇梯度洗脱，收集50％乙醇洗脱部位洗脱液，浓缩，干燥，获得精制提取物。

本发明所述的有效成分包括氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷。

进一步地，步骤(1)中，所述白芍非药用部位选自白芍根茎、侧根凸头和细根中的一种或多种，经粉碎后过5～10目筛，得到颗粒样品。

进一步地，步骤(2)中，采用6～14倍体积的40％～70％乙醇回流提取，优选采用12倍体积的50％乙醇或70％乙醇回流提取。

进一步地，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～2.5小时，优选提取次数为2次，每次提取时间为1.5～2小时。

更为优选地，采用6～14倍体积的50％乙醇或70％乙醇回流提取2次，每次提取时间为1.2～2小时。

提取后，将提取液合并，并将合并提取液过滤，浓缩，得到不含醇的粗提取液。

进一步地，步骤(3)中，所述上样液由所述粗提取液经稀释或未经稀释后获得，所述上样液的浓度为0.25～1g干燥原料/mL(即每1mL上样液相当于0.25～1g干燥原料)，由于上样液的浓度越小纯化效果越好，但过小的浓度会导致纯化速度的降低，优选0.25～0.5g干燥原料/mL(即每1mL上样液相当于0.25～0.5g干燥原料)。

在实际应用中，可在步骤(2)中将粗提取液浓缩为浓度为0.25～0.5g干燥原料/mL的药液，无需稀释即可直接作为步骤(3)的上样液。

更进一步地，步骤(3)中，所述大孔树脂为苯乙烯系弱极性和非极性树脂，优选D-101、AB-8大孔树脂。

所述层析柱的柱径高比为1:10～1:1，优选1:4。应当理解的是，在该优选比例的基础上，略微上下浮动如1:3.5、1:3.8或1:4.2等并不会与此处的优选比例形成显著差异，故本领域技术人员在该优选比例的基础上所作的小幅度调整也同样属于本发明所述的优选比例。

进一步地，所述粗提取液的最大上样量为2～3BV；上样速度为0.5～2mL/min，优选1mL/min。

当大孔树脂采用D-101时，最大上样量优选为3BV；当大孔树脂采用AB-8时，最大上样量优选为2BV。

进一步地，所述洗脱剂先后分别为2倍体积的水和4倍体积的50％乙醇。

洗脱速度为0.5～2mL/min，优选0.75～1mL/min。

需要说明的是，本发明提及到的乙醇百分含量均指体积百分含量，例如50％乙醇指体积分数为50％的乙醇水溶液；涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

基于前述方法及各步骤的优选方案，本发明综合提取步骤和春花步骤中的多个工艺条件与参数，提供一种优选的提取纯化方法，以获得有效成分提取率尽可能高、潜在毒性成分含量尽可能低的提取物。

该方法具体包括如下步骤：

(1)将白芍非药用部位进行干燥处理并粉碎，过5～10目筛得到颗粒样品；

(2)采用10～12倍体积的50％乙醇或70％乙醇回流提取2次，每次提取时间为1.5～2小时，合并提取液，经过滤、浓缩后获得浓度为0.25～0.5g干燥原料/mL的粗提取液；

(3)采用柱径高比为1:4的层析柱，以D-101、AB-8大孔树脂为填料，以0.5mL/min的上样速度上样所述粗提取液2～3BV，再先后利用2倍体积的水和4倍体积的50％乙醇以0.75～1mL/min的洗脱速度对大孔树脂层析柱进行洗脱，收集50％乙醇洗脱部位洗脱液，浓缩，干燥，获得精制提取物。

第二方面，由于本发明针对白芍非药用部位进行提取，而获得了一种具有多种有效成分且潜在毒性成分含量较低的提取物，弥补了现有技术对白芍非药用部位利用不足，或难以利用的缺陷，本发明提供一种白芍非药用部位提取物，由本发明所提供的前述方法制备而成，所述白芍提取物中含有氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷中的一种或多种(一般为多种)，且苯甲酸和没食子酸的含量不大于1.6％和0.05％。

本发明的有益效果在于：

本发明通过对单萜苷类有效成分的提取和纯化工艺研究，可选用含有有效成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷和潜在毒性成分苯甲酸以及没食子酸的白芍根茎、侧根凸头、细根中的任意一种部位，采用优选的提取工艺和大孔树脂梯度洗脱工艺，不仅有效富集了多种单萜苷组分，还减少了潜在毒性成分，扩大并丰富了中药资源的有效综合利用。

通过本发明提取和纯化方法对白芍非药用部位进行有效成分的提取和纯化，单萜苷类成分的总转移率>70％，而非单萜苷类成分没食子酸的转移率为0.4％，苯甲酸转移率<50％，有效部位单萜苷总含量>60％。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的白芍采集于白芍主产区安徽亳州井泉药业白芍种植基地，芍头经首都医科大学中医药学院罗容副教授鉴定为毛茛科植物芍药(Paeonialactiflora Pall.)的干燥根茎及侧根凸头。

本发明具体实施方式中使用的仪器与设备如下：

高效液相色谱仪(美国安捷伦1260，紫外检测器)；Kromasil 100-5C₁₈(250mm×4.6mm,5μm)；1000mL数字电热套(巩义予华仪器有限责任公司)；SXKW-10000mL智能电热套(北京林茂科技有限公司)；MSA124S-1CE-DU电子天平(德国Sartorius)；KQ 5200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FW 100粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；J1811252旋转蒸发仪(北京西冲科技发展有限公司)。

本发明具体实施方式中使用的材料与试剂如下：

没食子酸对照品(纯度≥98％，CAS 149-91-7，ID：BD09A038)、氧化芍药苷对照品(纯度≥98％，CAS：39011-91-1，ID：A08A0177)、芍药苷对照品(纯度≥98％，CAS：23180-57-6，Lot：AF71101-01)、没食子酰芍药苷对照品(纯度≥98％，CAS：122965-41-7，Lot：AF71101-05)、苯甲酰芍药苷对照品(纯度≥98％，CAS：38642-49-8，Lot：AF71101-02)购自成都普思生物科技股份有限公司；芍药内酯苷对照品(纯度≥98％，CAS：39011-90-0，ID：S-011-180908)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；苯甲酸对照品(纯度≥98％，CAS：65-85-0，Lot：Z18S7H21155)购自上海源叶生物科技有限公司。

D101型大孔树脂(批号：120613)购自天津市海光化工有限公司；AB-8型大孔吸附树脂(批号：140611)购自天津市海光化工有限公司；HP-20型、HPD-500型、NKA-9型和S-8型大孔吸附树脂、型大孔树脂均购自安北京虹湖联合化工产品有限公司，批号分别为20190518、M0058-500、524D011、313A011；乙腈、甲醇为色谱纯(Thermo Fisher Chemical)；磷酸为分析纯，购自北京化工厂；95％药用乙醇购自宏发化工有限公司；纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

对比例1

本对比例针对本发明所述方法的步骤(1)对白芍非药用部位是否进行粉碎处理的效果进行的对比。

晒干方法：将白芍主根从芍头着生处切下做药用，再切下优质的种芽留种，得到芍头。用剥刀刮去芍头上的残留的茎叶和粗皮等,洗净，横切成厚度为0.3cm左右的片，贮放在干燥阴凉通风的室内，防止有残留的种芽发芽，先摊开先曝晒1～2天，再逐渐堆厚曝晒，不断上下翻动，使表皮慢慢收缩。中午太阳过猛，用竹席等物盖好芍头片，下午3～4时后再摊开晒。晒3～5天后，把芍头在室内堆放2～3天，促使水分外渗“发汗”，然后继续晒3～5天，这样反复堆晒3～4次，晒干。细根同法晒干。

按照均匀取样法取两份原料，一份不粉碎，另一份粉碎，经过粉碎处理的实验组在粉碎后过10目筛。

将两份样品按照以下方法测定其中没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酸和苯甲酰芍药苷的含量。

含量测定方法的建立：

(1)对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷等7种对照品适量，用甲醇定容，得到含没食子酸103μg·mL^-1、氧化芍药苷48.5μg·mL^-1、芍药内酯苷368μg·mL^-1、芍药苷1122.8μg·mL^-1、没食子酰芍药苷44.4μg·mL^-1、苯甲酸41.6μg·mL^-1、苯甲酰芍药苷54μg·mL^-1的混标溶液，依次稀释得到系列混标溶液。

(2)供试品溶液的制备

精密称取上述样品25g，置于500mL圆底烧瓶中，采用10倍体积的50％乙醇回流提取2次，每次提取时间为1.5小时，合并提取液，两层滤纸抽滤，60℃水浴下减压浓缩至无醇味，加70％乙醇转移并定容，得到每1mL相当于0.01g晒干原料的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。进样10μL分析。

(3)色谱条件

色谱柱为Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(A)∶0.1％磷酸水溶液(B)，洗脱梯度：0～10min，5％～13％A；10～25min，13％～15％A；25～40min，15％～18％A；40～45min，18％～20％A；45～50min，20％～50％A；50～55min，50％～50％A；55～60min，50％～100％A；60～65min，100％～100％A。流速1.0mL·min^-1，检测波长：0～10min，275nm；10～18min，258nm；18～47min，230nm；47～50min，280nm；50～65min，230nm，柱温为25℃，进样量为10μL。理论塔板数按芍药苷计算不低于2000。

(4)标准曲线及线性范围

按上述色谱条件测定，以各成分色谱峰面积作为纵坐标(X)，以对照品中各成分的质量浓度作为横坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得回归方程。

(5)精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液10μL，连续进样6次，按上述色谱条件测定，并计算相对标准偏差RSD值(％)，结果各成分峰面积的RSD均小于2.0％，表明仪器精密度良好。

(6)重复性试验

精密称取同一芍头样品6份，分别按上述方法制备供试品溶液，并按色谱条件测定，计算相对标准偏差RSD值(％)，结果各成分含量的RSD均小于3％，表明该方法重复性良好。

(7)稳定性试验

取同一供试品溶液，分别按上述色谱条件于0，2，4，6，8，12，24，36，48h进样，计算相对标准偏差RSD值(％)，结果各成分48h内峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液在48h内稳定。

(8)加样回收率试验

精密称定1.25g样品粉末6份，分别精密加入与样品中各成分含量相等的对照品，按上述色谱条件测定，计算得出7种成分的平均回收率，均符合要求。

经测定，两份不同处理的样品检测结果如表1所示。综合评分P为各成分转移率Q与权重系数(非单萜苷类成分权重系数为负)乘积之和，即P＝-7.5％*Q_没食子酸+5％*Q_{氧化芍药苷}+20％*Q_{芍药内酯苷}+50％*Q_芍药苷+5％*Q_{没食子酰芍药苷}-7.5％*Q_苯甲酸+5％*Q_{苯甲酰芍药苷}。

表1粉碎对各成分提取效果的影响

由表1可以看出，晒干粉碎后的样品各成分峰面积明显高于未粉碎样品与未晒干样品，利于后续工艺对有效成分的提取，因此选择对白芍非药用部位晒干粉碎后提取。

对比例2

本对比例针对本发明所述方法的步骤(2)对获得粗提取液的提取方式和提取溶剂进行对比筛选。

取粉碎过10目筛后的原料，按照均匀取样法取三份，分别置于圆底烧瓶中：

第一份采用12倍量70％乙醇(每次加入12倍量)，加热回流提取2次，每次1h，将上述醇提液过滤，合并滤液，浓缩后加溶剂定容并稀释得到每mL相当于0.01g晒干原料的溶液，过0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液；

第二份采用12倍量70％乙醇(每次加入12倍量)，在25℃下超声提取2次，每次1h，将上述醇提液过滤，合并滤液，浓缩后加溶剂定容并稀释得到每mL相当于0.01g晒干原料的溶液，过0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液；

第三份采用12倍量的水煎煮1h(每次加入12倍量)，共煎煮2次，合并提取液，浓缩后加水定容并稀释得到每mL相当于0.01g晒干原料的溶液，过0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液。

将上述续滤液分别按对比例1所述的色谱条件进行测定，结果见表2。

表2不同提取方法对各成分提取效果的影响

由表2可以看出，采用乙醇回流提取时，单萜苷类成分提取率远高于水回流提取及乙醇超声提取，因此提取方法选用乙醇回流提取法。

对比例3

本对比例针对本发明所述方法的步骤(2)对获得粗提取液的提取次数进行对比筛选。

取粉碎过10目筛后的原料，按照均匀取样法取三份，采用12倍量70％乙醇(每次加入12倍量)，分别加热回流提取1次、2次、3次，每次提取时间为1.5h。

将所得醇提液过滤，合并或不合并后浓缩后加溶剂定容并稀释得到每mL相当于0.01g晒干原料的溶液，过0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液。

将上述续滤液分别按对比例1所述的色谱条件进行测定，结果见表3。

表3提取次数对各成分提取效果的影响

由表3可以看出，提取2次时有效成分含量最高，因此，提取次数选择提取2次为宜。

对比例4

本对比例针对本发明所述方法的步骤(2)对获得粗提取液的提取时间进行对比筛选。

取粉碎过10目筛后的原料，按照均匀取样法取四份，采用10倍量70％乙醇(每次加入10倍量)，加热回流提取2次，每次提取时间分别为1h，1.5h，2h，2.5h。

将上述续滤液分别按对比例1所述的色谱条件进行测定，结果见表4。

表4提取时间对各成分提取效果的影响

由表4可以看出，提取时间为1h/次和2.5h/次的提取效果均不如1.5h/次和2h/次，而提取时间为1.5h和2h的提取效果相近，因此优选提取时间为1.5h/次～2h/次。

对比例5

本对比例针对本发明所述方法的步骤(2)对获得粗提取液的提取溶剂用量进行对比筛选。

取粉碎过10目筛后的原料，按照均匀取样法取四份，以70％乙醇作为提取溶剂，分别采用6倍量，10倍量，14倍量，20倍量提取溶剂加热回流提取2次，每次提取时间为1.5h。

将上述续滤液分别按对比例1所述的色谱条件进行测定，结果见表5。

表5料液比对各成分提取效果的影响

由表5可以看出，提取溶剂用量过大，提取效果反而下降，提取溶剂过小时，无法没过原料，不易提取，因此优选提取溶剂的体积10倍～14倍。

对比例6

本对比例针对本发明所述方法的步骤(2)对获得粗提取液的提取溶剂乙醇的浓度进行对比筛选。

取粉碎过10目筛后的原料，按照均匀取样法取四份，分别采用10倍量40％，50％，60％，70％和80％体积分数的乙醇作为提取溶剂，加热回流提取2次，每次提取时间为1.5h。

将上述续滤液分别按对比例1所述的色谱条件进行测定，结果见表6。

表6乙醇浓度对各成分提取效果的影响

由表6可以看出，40％、60％、80％乙醇对有效成分的提取效果不如50％乙醇以及70％乙醇，50％乙醇对有效成分的提取效果优于70％乙醇，优选采用50％乙醇作为提取溶剂。

对比例7

本对比例采用多种不同条件的粗提方法，并以7种成分的含量Y作为指标，采用Hassan法对各正向成分(除没食子酸、苯甲酸外的其他5种成分)以及负向成分(没食子酸和苯甲酸)的提取率进行归一化处理得到归一值d_min和d_max，公式如下：

(1)

(2)

(3)

公式中Y为原料中各成分含量(mg/g)，c为供试品溶液中各成分的浓度(mg/mL)，n为稀释倍数，V为样品溶液体积(mL)，m为粉碎后的原料质量(g)。

根据各成分在芍头原料中含量大小进行赋权，各成分权重系数k依次为：k_没食子酸＝7.5％，k_{氧化芍药苷}＝5％，k_{芍药内酯苷}＝20％，k_芍药苷＝50％，k_{没食子酰芍药苷}＝5％，k_苯甲酸＝7.5％，k_{苯甲酰芍药苷}＝5％。将各成分归一值与相应权重系数乘积相加得到总评归一值OD。

(4)OD＝7.5％*d_没食子酸+5％*d_{氧化芍药苷}+20％*d_{芍药内酯苷}+50％*d_芍药苷+5％*d_{没食子酰芍药苷}+7.5％*d_苯甲酸+5％*d_{苯甲酰芍药苷}。

比较多种不同粗提方法及有效成分和潜在毒性成分的测定结果，为节约篇幅，摘选部分组别及测定结果如下：

(1)取粉碎过10目筛后的原料，加12倍量50％乙醇提取2次，每次80min。测定提取物中各成分含量，按照下式计算得到总评归一OD值，为2.56，提取物中含单萜苷类含量为12.89％，含苯甲酸0.30％，没食子酸0.53％。

(2)取粉碎过10目筛后的原料，加8倍量36％乙醇提取2次，每次130min，测定提取物中各成分含量，得到OD值为1.13。提取物中含单萜苷类含量为11.73％，含苯甲酸0.30％，没食子酸0.67％。

(3)取粉碎过10目筛后的原料，加10倍量30％乙醇提取2次，每次100min，测定提取物中各成分含量，得到OD值为1.11。提取物中含单萜苷类含量为10.64％，含苯甲酸0.28％，没食子酸0.65％。

对比例8

本对比例针对本发明所述方法的步骤(3)对大孔树脂材料进行对比筛选。

取粉碎过10目筛后的原料，加12倍量50％乙醇提取2次，每次80min，测定提取物中各成分含量，提取液浓缩后加水定容至0.25g干燥原料/mL浓度作为上样液备用。

将预处理好的六种型号(D-101、AB-8、HP-20、HPD-500、NKA-9、S-8)树脂用滤纸快速吸干表面水分，分别称取2.0g，置于具塞锥形瓶中，加入5mL去离子水使其湿润，再精密加入10mL上样液(0.25g干燥原料/mL)，每隔8h超声5min，24h后抽滤，并以100mL去离子水洗涤树脂，洗涤液与抽滤液合并后定容至250mL作为吸附后液，按2.1.3项下色谱条件测定。向树脂中加入50％乙醇溶液80mL，每隔8h超声振动5min，24h后抽滤，抽滤液定容至250mL即为解吸液，按对比例1所述的色谱条件测定。总评归一值OD为各成分吸附率、解吸率与前述相应成分权重系数乘积之和。

静态吸附率＝1-C₁V₁/C₀V₀

静态解吸率＝C₂V₂/(C₀V₀-C₁V₁)

C₀为原溶液中各成分质量浓度，C₁为吸附后液中各成分质量浓度，C₂为解吸液中各成分质量浓度，V₀为原溶液体积，V₁为吸附后液体积，V₂为解吸液体积。

结果见表7，说明6种树脂中综合评分最高的是非极性大孔树脂D-101，其次是大孔树脂AB-8、HP-20、HPD-500和NKA-9，故淘汰S-8型大孔树脂，采用其他5种树脂进行动态吸附考察。

取同样规格的层析柱(直径1.5cm，长30cm)，分别装入上述5种树脂各10mL，取原料提取液0.25g干燥原料/mL各20mL，分别以1mL/min的流速上样，先用50mL去离子水洗脱，再依次用10％、30％、50％、70％、95％的乙醇各30mL洗脱，洗脱流速为1mL/min，分别收集各部分洗脱液，加去离子水定容至250mL，其他各部分洗脱液用同浓度乙醇液定容至100mL，按上述色谱条件测定。比较5种型号大孔树脂洗脱率并进行综合评分。总评归一值OD分别为总洗脱率与相应成分权重系数乘积之和，各成分动态吸附率与相应成分权重系数乘积之和。

动态吸附率＝(C₀V₀-C₂V₂-C₃V₃)/C₀V₀

各浓度醇溶液洗脱率＝C_nV_n/C₀V₀

总洗脱率为除水外各浓度醇溶液洗脱率之和。

C₂为上样吸附后流出液中各成分质量浓度，C₃为水洗脱液中各成分质量浓度，C_n为各浓度乙醇洗脱液中各成分质量浓度，V₂为上样吸附后流出液体积，V₃为水洗脱液体积，V_n为各浓度乙醇洗脱液体积。

结果见表7。由表7可知，D-101、AB-8大孔树脂纯化效果较好，综合考虑动、静态吸附结果，选择D-101、AB-8两种树脂进行进一步考察。同时发现用D-101、AB-8两种树脂时，乙醇浓度大于50％后，氧化芍药苷、芍药苷、芍药内酯苷、没食子酰芍药苷等多种成分总洗脱率基本不变，因此后续实验选用50％乙醇进行洗脱。

表7不同类型大孔树脂对7种成分静态吸附率、解析率的影响

对比例9

本对比例针对本发明所述方法的步骤(3)对上样液的最大上样量进行对比筛选。

取同样规格的层析柱(直径1.5cm，长30cm)2根，分别装入D-101、AB-8大孔树脂各10mL，取原料粗提取液0.25g干燥原料/mL，以1mL/min的流速通过树脂柱，分段收集残留液并定容至25mL作为吸附后液，前50mL每10mL收集一次，以后每5mL收集一次，按对比例1所述的色谱条件测定。按下式计算泄漏率。

泄漏率＝C₂V₂/C₀V₀

经实验发现，使用D-101树脂时，上样至第4份时，芍药内酯苷和芍药苷的累计泄漏率超过5％，说明芍药内酯苷和芍药苷已经开始明显泄露，因此最大上样量为3BV。而使用AB-8树脂时，上样至第3份时，芍药内酯苷和芍药苷的累计泄漏率超过5％，说明芍药内酯苷和芍药苷已经明显开始泄露，因此最大上样量为2BV。

由此可知，D-101大孔树脂的最大上样量更大，其吸附效果优于AB-8大孔树脂，因此，选择D-101大孔树脂对粗提取液进行纯化。

对比例10

本对比例针对本发明所述方法的步骤(3)对洗脱剂的用量进行对比筛选。

量取预处理好的D-101大孔树脂10mL，装于直径为1.6cm的玻璃层析柱中，将干燥原料浓度为0.25g/mL的原料粗提取液30mL通过树脂柱进行动态吸附，上样速度为1mL/min，分别利用10mL、20mL、30mL、40mL和50mL的水和40mL、60mL、70mL和80mL的50％乙醇洗脱，洗脱速度为1mL/min，每10mL收集一次洗脱液，定容至100mL，按对比例1所述的色谱条件测定。结果如表8所示。

表8洗脱溶剂用量考察

对比发现，选用20mL水除杂，40mL 50％乙醇进行洗脱，即2BV水、4BV 50％乙醇进行洗脱，可尽量保存芍药苷、芍药内酯苷等有效成分。

对比例11

本对比例针对本发明所述方法的步骤(3)对层析柱的柱径高比进行对比筛选。

量取预处理好的D-101大孔树脂各10mL，分别装于玻璃层析柱中，此时树脂径高比分别为1:10、1:4、1:1，分别以1mL/min的速度上样0.25g/mL的原料提取液30mL，进行动态吸附，再用水20mL，50％乙醇40mL进行洗脱，洗脱速度为1mL/min，收集洗脱液，定容后按对比例1所述的色谱条件测定。吸附率、洗脱率及总评归一值计算公式同前。结果见表9。

表9大孔树脂柱径高比对吸附率和洗脱率的影响

由表9可知，柱径高比为1:4时，纯化效果最好，其吸附率和洗脱率均高于柱径高比为1:10和1:1。

对比例12

本对比例针对本发明所述方法的步骤(3)对上样液浓度进行对比筛选。

量取预处理好的D-101大孔树脂各10mL，分别装于3根直径均为1.6cm的玻璃层析柱中，将提取液浓缩后定容至不同体积，以得到干燥原料浓度分别为0.25g/mL、0.5g/mL、1g/mL的原料提取液，以1mL/min的速度上样，上样体积分别为30mL、15mL、7.5mL，进行动态吸附，再用水20mL，50％乙醇40mL进行洗脱，洗脱速度为1mL/min，收集洗脱液，定容后按对比例1所述的色谱条件测定。吸附率、洗脱率及及总评归一值计算公式同前，结果见表10。

表10上样液浓度对吸附率和洗脱率的影响

由表10可知，在一定范围内，上样浓度越小时纯化效果越好，但浓度过小会导致纯化速度降低，因此后续实验选择0.25g/mL～0.5g/mL。

对比例13

本对比例针对本发明所述方法的步骤(3)对上样速度进行对比筛选。

量取预处理好的D-101大孔树脂各10mL，分别装于3根直径均为1.6cm的玻璃层析柱中，采用30mL干燥原料浓度为0.25g/mL原料提取液上样，上样速度分别为0.5mL/min、1mL/min、2mL/min，进行动态吸附，再用水20mL，50％乙醇40mL进行洗脱，洗脱速度为1mL/min，收集洗脱液，定容后按对比例1所述的色谱条件测定。吸附率、洗脱率及总评归一值计算公式同前，结果见表11。

表11上样速度对吸附率和洗脱率的影响

由表11可知，在一定范围内，上样速度越小时纯化效果越好，但上样速度过慢过会导致纯化效率降低，因此，确定0.5mL/min为上样速度。

对比例14

本对比例针对本发明所述方法的步骤(3)对洗脱速度进行对比筛选。

量取预处理好的D-101大孔树脂各10mL，分别装于4根直径均为1.6cm的玻璃层析柱中，采用30mL干燥原料浓度分别为0.25g/mL原料提取液上样，上样速度为1mL/min，进行动态吸附，再用水20mL，50％乙醇40mL进行洗脱，洗脱速度分别为0.5mL/min、0.75mL/min、1mL/min、2mL/min，收集洗脱液，定容后按对比例1所述的色谱条件测定。吸附率、洗脱率及及总评归一值计算公式同前，结果见表12。

表12洗脱速度对吸附率和洗脱率的影响

由表12可知，在所选择的洗脱速度中，洗脱速度为1mL/min及0.75mL/min时纯化效果较好。

对比例15

本对比例采用不同上样条件、洗脱条件和树脂柱径高比，综合比较多因素变量对纯化效果的影响。

为节约篇幅，摘选部分组别及测定结果如下：

(1)上样浓度为0.5g/mL，上样速度为1mL/min，洗脱速度为1mL/min，径高比为1:4时，纯化效果最好。各单萜苷成分总转移率依次为芍药内酯苷112％(部分由芍药苷转化而来)、苯甲酰芍药苷79％、芍药苷60％、没食子酰芍药30％、氧化芍药苷22％，而苯甲酸总转移率为49％，没食子酸为1.4％。纯化后有效部位含单萜苷60.48％，含苯甲酸1.60％，没食子酸0.05％。

(2)上样浓度为0.25g/mL，上样速度为0.5mL/min，洗脱速度为0.75mL/min，径高比为1:10时，有效部位含单萜苷36.62％，含苯甲酸0.97％，没食子酸0.06％。

实施例1

本实施例旨在说明一种从白芍非药用部位提取有效成分的方法，具体步骤如下：

(1)将白芍非药用部位进行晒干并粉碎，过10目筛得到颗粒样品；

(2)采用12倍体积的50％乙醇，加热回流提取2次，每次提取时间为80min，合并提取液，经过滤、浓缩后获得浓度为0.25～0.5g干燥原料/mL的粗提取液；

(3)采用柱径高比为1:4的层析柱，以D-101大孔树脂为填料，以0.5mL/min的上样速度上样所述粗提取液3BV，再先后利用2倍体积的水和4倍体积的50％乙醇以0.75mL/min的洗脱速度对大孔树脂层析柱进行洗脱，收集50％乙醇洗脱部位洗脱液，浓缩，干燥，获得精制提取物。精密称取干燥至恒重的精制提取物30mg，以70％的乙醇溶解定容到10mL，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。按照上述色谱条件进样10μL进行含量测定，则各成分含量依次为：芍药苷39.2％，芍药内酯苷17.8％，苯甲酰芍药苷为1.75％，没食子酰芍药苷1.41％，氧化芍药苷0.35％，没食子酸0.05％，苯甲酸1.4％，有效部位中单萜苷总含量为60.51％。由于实验用原料中上述五种单萜苷的总含量为58.10mg/g，没食子酸的含量为8.11mg/g，苯甲酸的含量为2.34mg/g，本工艺纯化物得率为7.3％，故单萜苷类的转移率为76％，没食子酸的转移率为0.45％，苯甲酸的转移率为43.7％。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，将步骤(2)中12倍体积的50％乙醇替换为10倍体积的70％乙醇。精密称取干燥至恒重的精制提取物，按照上述方法进行含量测定，则各成分含量依次为：芍药苷38.9％，芍药内酯苷17.6％，苯甲酰芍药苷为1.85％，没食子酰芍药苷1.45％，氧化芍药苷0.34％，没食子酸0.045％，苯甲酸1.5％，有效部位中单萜苷总含量为60.14％。本工艺纯化物得率为7.2％，故单萜苷类的转移率为75.5％，没食子酸的转移率为0.40％，苯甲酸的转移率为46.2％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，步骤(3)中，利用2倍体积的水和4倍体积的50％乙醇以1mL/min的洗脱速度对大孔树脂层析柱进行洗脱。精密称取干燥至恒重的精制提取物，按照上述方法进行含量测定，则各成分含量依次为：芍药苷38.64％，芍药内酯苷17.5％，苯甲酰芍药苷为1.85％，没食子酰芍药苷1.93％，氧化芍药苷0.33％，没食子酸0.033％，苯甲酸1.1％，有效部位中单萜苷总含量为60.25％。本工艺纯化物得率为7.2％，故单萜苷类的转移率为74.7％，没食子酸的转移率为0.29％，苯甲酸的转移率为33.8％。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，步骤(1)中，将白芍非药用部位进行晒干并粉碎，过5目筛得到颗粒样品。精密称取干燥至恒重的精制提取物，按照上述方法进行含量测定，则各成分含量依次为：芍药苷38.7％，芍药内酯苷17.8％，苯甲酰芍药苷为1.47％，没食子酰芍药苷1.86％，氧化芍药苷0.29％，没食子酸0.04％，苯甲酸1.2％，有效部位中单萜苷总含量为60.12％。本工艺纯化物得率为7.1％，故单萜苷类的转移率为73.5％，没食子酸的转移率为0.35％，苯甲酸的转移率为36.4％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种从白芍非药用部位提取单萜苷类有效成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将白芍非药用部位进行干燥处理并粉碎，得到颗粒样品；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述白芍非药用部位粉碎后过5～10目筛，得到颗粒样品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述白芍非药用部位选自根茎、侧根凸头和细根中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用6～14倍体积的40％～70％乙醇回流提取，优选采用12倍体积的50％乙醇或70％乙醇回流提取；

和/或，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～2.5小时，优选提取次数为2次，每次提取时间为1.5～2小时。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述上样液由所述粗提取液经稀释或未经稀释后获得，所述上样液的浓度为0.25～1g干燥原料/mL，优选0.25～0.5g干燥原料/mL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述大孔树脂为苯乙烯系弱极性和非极性树脂，优选D-101、AB-8大孔树脂；

和/或，所述层析柱的柱径高比为1:10～1:1，优选1:4。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述粗提取液的最大上样量为2～3BV；

和/或，上样速度为0.5～2mL/min，优选0.5mL/min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述洗脱剂的洗脱速度为0.5～2mL/min，优选0.75～1mL/min；

和/或，所述洗脱剂的用量先后分别为2倍体积的水和4倍体积的50％乙醇。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)采用6～14倍体积的50％乙醇或70％乙醇回流提取2次，每次提取时间为1.2～2小时，合并提取液，经过滤、浓缩后获得浓度为0.25～0.5g干燥原料/mL的粗提取液；

(3)采用柱径高比为1:4的层析柱，以D-101、AB-8大孔树脂为填料，以1mL/min的上样速度上样所述粗提取液2～3BV，再先后利用2倍体积的水和4倍体积的50％乙醇以0.75～1mL/min的洗脱速度对大孔树脂层析柱进行洗脱，收集50％乙醇洗脱部位洗脱液，浓缩，干燥，获得精制提取物。

10.一种白芍提取物，其特征在于，所述白芍提取物由权利要求1～9任一项所述的方法制备而成，所述白芍提取物中含有氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷中的一种或多种，且苯甲酸和没食子酸的含量不大于1.6％和0.05％。