CN114711142A - 一种黄芪不定根组织培养用化学诱导剂及其在黄芪不定根培养中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属中药黄芪不定根化学诱导技术领域，为解决目前黄芪资源绿色、持续发展问题，提供一种黄芪不定根组织培养用化学诱导剂及其在黄芪不定根培养中的应用；由顺‑3‑己烯醛溶解于水中制备而成，顺‑3‑己烯醛溶解于水，制备得200mmol/L的母液，无菌滤膜过滤除菌后，4℃保存备用。有反馈抑制作用、以剂量依赖方式促进黄芪不定根生长和三萜、异黄酮活性成分合成积累，既遏制了黄芪不定根培养物的褐化，还促进根中黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、环黄芪苷Ⅱ、甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮及其葡萄糖苷等的合成积累。有望开发为一种绿色添加剂，应用于蒙古黄芪不定根组织培养体系，提高根培养物产量和活性物质含量。

Description

一种黄芪不定根组织培养用化学诱导剂及其在黄芪不定根培 养中的应用

技术领域

本发明属于中药黄芪不定根化学诱导技术领域，具体涉及一种黄芪不定根组织培养用化学诱导剂及其在黄芪不定根培养中的应用；所述顺-3-己烯醛可同时促进黄芪不定根生长和多种活性成分合成积累的化学诱导子。通过培养介质中添加低浓度的顺-3-己烯醛，促进了黄芪不定根组织培养物生物量的增加，以及培养物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和黄芪皂苷IV含量的增加。

背景技术

绿叶挥发物是植物在受到机械损伤、干旱、真菌感染等环境胁迫时或者正常状态下，磷脂酶水解细胞膜脂释放出的亚油酸、亚麻酸或结合态半乳糖脂等，在脂肪氧合酶、脂肪酸氢过氧化物裂解酶顺次作用下形成的一类小分子化合物，主要由C6醛、醇及其酯组成。国内外学者研究发现，除参与气味形成、表征干旱等胁迫状态外，绿叶挥发物在植物化学防御过程中发挥着重要作用。如反-2-己烯醛具有抑制黄曲霉孢子萌发、杀死农业害虫迟眼蕈蚊等作用^{[1, 2]}；乙酸顺-3-己烯酯具有增加玉米倍半萜释放量、毒杀草地夜娥幼虫、促进苯并恶唑嗪酮类化合物合成等作用^{[3, 4]}。顺-3-己烯醇预置具有降低白粉虱啃食番茄虫媒病毒感染、增加黄酮合成、改善植株生长等作用^[5]；乙酸顺-3-己烯酯预置（priming）具有保护或减轻非生物胁迫损伤等作用^[6]。中科院分子植物卓越创新中心与德国马普化学生态所合作，近期发表在《science》的研究成果揭示，顺-3-己烯醛参与植物特异性代谢产物CPH（caffeoylputrescine-green leaf volatile compound, m/z347.19）组装，以应对农业重大害虫小叶蝉^[7]。已有研究还揭示，绿叶挥发物防御作用与其构型有关，如反-2-己烯醛促进拟南芥植保素camalexin合成积累作用较顺-3-己烯醛强，大眼长蝽更倾向于捕食反-2/顺-3-己烯醛比率高、己烯醇及其乙酸酯氛围下的烟草天蛾幼虫，雌性叶蝉更倾向于在释放顺-3-己烯醇及其乙酸酯的茶树叶片产卵^[8-10]。此外，植物还可吸收外源绿叶挥发物，通过还原、酯化、糖基化修饰等方式转化之，进而发挥作用，如顺-3-己烯醇糖基化衍生物顺-3-己烯-巢菜糖苷具有毒杀斜纹夜娥的作用^{[11, 12]}。

中药黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus var. mongholicus或膜荚黄芪的干燥根，主要活性成分为多糖、三萜皂苷和异黄酮等。其中，黄芪皂苷Ⅳ和毛蕊异黄酮葡萄糖苷既是黄芪药材主要活性成分，也是黄芪的质控指标成分。

相比于药用黄芪田间栽培至少2年的生长周期，黄芪根培养物具有生长周期短、无农药和化肥污染、不占用土地资源等优点，是短期内获取大量药用黄芪、制备黄芪提取物的重要原料。与发根农杆菌诱导生成的毛状根培养物含有有毒的冠瘿碱、后期提取物制备成本高相比，不定根培养物更为安全、经济，具有很好的产业发展前景。但是，黄芪不定根根培养中存在材料褐化、继代培养周期长等缺点。兼具黄芪不定根活性成分合成积累促进和培养物过氧化遏制作用的诱导子添加将有助于黄芪不定根培养体系的持续发展和产业化。

如上所述，顺-3-己烯醛防御作用与其构型有关，但已有研究主要在烟草、拟南芥、茶叶等植物中展开。顺-3-己烯醛反馈抑制其合成途径关键酶-脂肪氧合酶作用，及其在药用植物非挥发性活性成分合成积累中的应用国内外均未见报道。

发明内容

本发明为了解决目前黄芪资源绿色、持续发展问题，提供了一种黄芪不定根组织培养用化学诱导剂及其在黄芪不定根培养中的应用；该化学诱导剂具有反馈抑制作用、以剂量依赖方式促进黄芪不定根生长和三萜、异黄酮活性成分合成积累，既遏制了黄芪不定根培养物的褐化，还促进了根中黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、环黄芪苷Ⅱ、甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮及其葡萄糖苷等的合成积累。

本发明由以下技术方案实现的：一种黄芪不定根组织培养用化学诱导剂，所述化学诱导剂由顺-3-己烯醛溶解于水中制备而成，具体制备方法为：顺-3-己烯醛溶解于水，制备得200mmol/L的母液，无菌滤膜过滤除菌后，4℃保存备用。

所述反馈抑制兼化学诱导子顺-3-己烯醛通过商业购买的方式获得的分析纯试剂，母液配制用水为灭菌后的去离子水。

所述的黄芪不定根组织培养用化学诱导剂在黄芪不定根培养中的应用，所述化学诱导剂抑制黄芪不定根脂肪氧合酶合成积累，和促进根中活性成分甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮以及葡萄糖苷合成积累的方法，具体方法为：添加0.1%v:v的顺-3-己烯醛母液于含1mg/L吲哚丁酸、30 g/L蔗糖的1/2 MS液体培养液中；按照10%w:v的接种量，接种黄芪不定根培养物，25℃、100rpm条件下，摇床震荡培养120h。

所述的黄芪不定根组织培养用化学诱导剂在黄芪不定根培养中的应用，所述化学诱导剂抑制黄芪不定根脂肪氧合酶活性，和促进根中活性成分黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ以及环黄芪苷Ⅱ合成积累的方法，具体方法为：添加0.00625%v:v或0.025%v:v的顺-3-己烯醛母液于含1 mg/L吲哚丁酸、30 g/L蔗糖的1/2 MS液体培养液中；按照10%w:v的接种量，接种黄芪不定根培养物，25℃、100rpm条件下，摇床震荡培养168h。

本发明所述的化学诱导剂适用于蒙古黄芪不定根液体培养体系，在无菌震荡摇床培养条件下具有抑制根脂肪氧合酶和提高根中多种活性成分含量的作用。

本发明涉及的化学诱导子天然存在于药用植物蒙古黄芪根中，在道地黄芪即浑源黄芪中含量高，属挥发性有机化合物，应用于黄芪不定根培养体系，不存在二次污染问题；诱导子顺-3-己烯醛促进蒙古黄芪不定根中甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮及其葡萄糖苷合成积累与其抑制脂肪氧合酶信号途径、构型不稳定有关；促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成积累作用特征与脂肪氧合酶抑制剂—菲尼酮处理类似。因此，顺-3-己烯醛将为蒙古黄芪不定根液体培养提供了一种绿色、效应持久的环境友好型化学诱导剂。

黄芪药材，目前以仿野生栽培和平地移栽为主，仿野生栽培黄芪的生长年限≥4年，平地移栽黄芪生长年限≥2年，生长周期较长；田间管理喷施化学合成农药防治病虫害、根施化学肥料促进生长，不仅容易造成黄芪药材农药残留、药材品质下降，同时也会引起土壤污染、板结和肥力下降等，不利于有限土地资源的绿色发展。运用植物组织培养学方法，挖掘新的药用黄芪资源获得途径，是制备黄芪提取物、保障黄芪产业绿色发展、可持续利用的一种积极、经济、高效补给途径。

本发明涉及的化学诱导子通过如下途径筛选获得。首先分别添加1‰体积的50mmol/L正己醇、E-2-己烯醛、顺-3-己烯醛于1/2 MS培养液中，摇床振摇培养2周，动态取样。通过分析上述处理及对照样本中黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷含量和培养2周时的生物量，发现顺-3-己烯醛同时具有促进蒙古黄芪不定根生长、根中上述活性成分合成积累的作用。在此基础上，开展第二轮顺-3-己烯醛处理实验，相同条件下，培养6周，从转录和代谢调节层面，对顺-3-己烯醛促进作用机制进行了阐释。发现在培养6周时，顺-3-己烯醛处理组毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷共有的合成前体-芒柄花黄素合成量远高于对照；培养5周时，顺-3-己烯醛处理组参与毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成前体的IFS1.1（毛蕊异黄酮合成酶1.1）表达显著上调。提示在处理5-6周时，顺-3-己烯醛具有促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成前体合成的作用。综合考虑不定根产量和活性成分合成积累的双重促进作用，诱导子顺-3-己烯醛有望开发为一种绿色添加剂，应用于蒙古黄芪不定根组织培养体系，提高根培养物产量和活性物质含量。

附图说明

图1为黄芪苗及诱导生成的黄芪不定根及其液体培养物（A、B、C、D、E）；图中，A为黄芪组培苗及不定根诱导用顶芽（箭头标示）；B为诱导形成的不定根早期形态（箭头标示）；C为液体培养用不定根；D为继代培养用黄芪不定根培养物；E为用于顺-3-己烯醛等处理用黄芪不定根培养物；

图2为阳性对照菲尼酮体外抑制黄芪脂肪氧合酶剂量的优化；

图3为具有体外抑制黄芪脂肪氧合酶作用的绿叶挥发物筛选；图中，柱状图标准差上的不同字母代表绿叶挥发物间抑制率具有显著差异，Mock为溶剂对照，phenidone为阳性对照菲尼酮，Hexanal为正己醛，Hexanol为正己醇，Hexyl acetate为乙酸己酯，Cis-3-hexenal为顺-3-己烯醛，Cis-3-hexenol为顺-3-己烯醇，Leaf acetate为乙酸顺-3-己烯酯，Trans-2-hexenal为反-2-己烯醛，Trans-2-hexenol为反-2-己烯醇；

图4为顺-3-己烯醛处理浓度（A）及低温储存（B）对其体外抑制黄芪脂肪氧合酶的影响；图中，柱状图上不同字母代表不同浓度的顺-3-己烯醛抑制率具有显著差异，***表示低温储存3天后顺-3-己烯醛溶液抑制率显著低于同等浓度新鲜配制者；

图5为不同浓度顺-3-己烯醛体外抑制大豆（A）和绿豆（B）脂肪氧合酶作用表征；图中，柱状图标准差上的不同字母代表不同浓度抑制率的显著性差异，Mock为溶剂对照，phenidone为阳性对照菲尼酮；

图6为不同浓度顺-3-己烯醛处理不同时间的黄芪不定根培养物中脂肪氧合酶活性；图中，柱状图标准差上的不同字母代表组间相同时间点的显著性差异；

图7为不同浓度顺-3-己烯醛处理对黄芪不定根培养物中三萜皂苷合成积累的影响（A、B、C、D）；图中，A为黄芪皂苷Ⅰ，B为黄芪皂苷Ⅱ，C为黄芪皂苷Ⅲ，D为异黄芪皂苷Ⅰ，Control为正常对照，柱状图标准差上的不同字母代表组间相同时间点的显著性差异；

图8为不同浓度顺-3-己烯醛处理对黄芪不定根培养物中异黄酮合成积累的影响（A、B、C）；图中，A为毛蕊异黄酮葡萄糖苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside, CG），B为芒柄花苷（ononin），C为毛蕊异黄酮（calycosin），Control为正常对照，柱状图标准差上的不同字母代表组间相同时间点的显著性差异。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。

实施例１：蒙古黄芪不定根诱导与继代培养

以实验室长期扩繁（> 5年）、处于生长旺盛期的蒙古黄芪组培苗为出发材料，如附图1中A所示，选取长势良好的顶芽，长度为１～２厘米，无菌剪切后，转移至含0.7%琼脂、30g/L蔗糖、1 mg/L萘乙酸的MS固体培养基中，25℃、16小时（光）/8小时（暗）条件下培养8周，诱导长出的不定根早期形态学特征见附图1中的B，用于液体培养的不定根形态学特征见附图1中的C。

随后，无菌剪切、无菌水洗涤不定根后，转移培养至含30 g/L蔗糖、1 mg/L吲哚丁酸的30 mL1/2 MS液体培养基（100 mL三角瓶）中，25℃、100 rpm的条件下摇床培养4周，为不定根种子培养物，如附图1中D所示；分为两份，转接根种子培养物于含100 mL相同培养基的250 mL三角瓶中，相同条件下摇床培养4周，用于不定根继代培养；继续均分为两份，再转接于含200 mL相同培养基的500 mL三角瓶中，相同条件下摇床培养4周，获得诱导处理用蒙古黄芪不定根培养物，如附图1中E所示。因为黄芪不定根由黄芪组培苗顶芽诱导分化形成，属无菌培养物，基于组织研磨法的细菌培养（27℃7天，无菌落形成）也证实不定根培养物为无菌材料。

实施例2：脂肪氧合酶提取、活性测定和菲尼酮体外孵育剂量的优化

随机称取1.00g长势良好的黄芪不定根，液氮研磨成粉，按照1:10 (w:v)的物料比加入pH9.0、0.05 mol/L硼酸缓冲液，充分混匀、冰水浴浸提2 h，4℃、8000 rpm离心10 min，转移上清至新的离心管中，所得上清液即为脂肪氧合酶粗提液，4℃保存备用。在低温条件下，量取30 μL脂肪氧合酶粗提液至新的离心管中，再加入1000 μL已预热至25℃的pH9.0、0.435 mmol/L亚油酸溶液，充分混匀后25℃孵育10 min，之后加入970 μL无水乙醇终止反应；同时，以先加无水乙醇、后加底物溶液的反应体系作为空白对照，测定OD₂₃₅，获得根培养物脂肪氧合酶活性数据。

选取同一批次脂肪氧合酶粗提液，吸取120 μL至新的离心管中，按照30:1体积比分别加入0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、1.0 mmol/L、10 mmol/L菲尼酮溶液和甲醇（溶剂对照），充分混匀，25℃孵育10 min，按照上面方法测定OD_235。利用获得的OD₂₃₅，进行抑制率的计算，有关公式如下：抑制率=[（OD_{235，正常对照}－OD_{235，菲尼酮}）/OD_{235，正常对照}]×100%。

结果见附图2，从该图可以看出，当菲尼酮浓度分别为0.01、0.1、1.0、10.0 mM时，抑制率分别为19.52%、36.65%、100%、100%，故选取抑制率为100%的最小浓度即1.0 mM，进行后续实验。

实施例3：具脂肪氧合酶活性抑制作用的绿叶挥发物体外筛选

选取同一批次的脂肪氧合酶粗提液，吸取120 μL至新的离心管中，按照30:1体积比加入50 mM的如下绿叶挥发物溶液：正己醛、正己醇、乙酸己酯、顺-3-己烯醛、顺-3-己烯醇、反-2-己烯醛、反-2-己烯醇、乙酸顺-3-己烯酯，同时设置正常对照、溶剂对照（添加同等体积比例的甲醇）和阳性对照（实施例2筛选获得），充分混匀，25℃孵育10 min，按照实施例2方法测定OD₂₃₅，计算抑制率；每个处理重复数：3。

结果见附图3，从该图可以看出，所检测的绿叶挥发物中，顺-3-己烯醛抑制率最高，与阳性对照菲尼酮处于同一水平；而其它挥发物抑制率明显低于顺-3-己烯醛和阳性对照，与溶剂对照处于同一水平，提示这些绿叶挥发物体外不具有明显抑制黄芪脂肪氧合酶的作用。

实施例4：顺-3-己烯醛抑制黄芪不定根脂肪氧合酶粗提液作用表征及低温储存对其抑制作用的影响

按照实施例1制备三批次的黄芪不定根脂肪氧合酶粗提液，吸取120 μL至新的离心管中，按照1:30（v:v）的比例加入0.1 mmol/L、1mmol/L、10 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L顺-3-己烯醛，同时设置正常对照和溶剂对照，生物学重复：3；重复混匀后，充分混匀，25℃孵育10 min，按照实施例2方法测定OD₂₃₅，计算抑制率。结果见附图4A，从该图可以看出，顺-3-己烯醛体外抑制作用与其浓度有关，浓度在0.1~1 mM之间，抑制作用最弱，抑制率与溶剂对照处于同一数量级（<5%）；浓度为10 mM时，抑制率为47.85±2.28%；浓度为25 mM时，抑制率为72.72±1.36%；浓度为50 mM时，抑制率为90.91±0.48%；浓度为100、200 mM时，抑制率均大于99%，脂肪氧合酶活性完全抑制，抑制率与1mM菲尼酮相当。

反-2-己烯醛为顺-3-己烯醛异构化产物，构型稳定，但实施例3结果表明反-2构型不具有抑制脂肪氧合酶的作用，提示顺-3-己烯醛体外抑制黄芪脂肪氧合酶是构型特异性的；鉴于顺-3构型不稳定，容易异构化为无抑制作用的反-2构型，以新鲜配制相同浓度顺-3-己烯醛溶液为对照，我们进一步考察了低温储存条件下即4℃保存3天，10、25、50 mM顺-3-己烯醛溶液对三批次黄芪脂肪氧合酶粗提液的抑制作用，结果见附图4B。从该图可以看出，低温储存3天的10 mM顺-3-己烯醛抑制率明显低于新鲜配制品，提示低温储存条件下，部分顺-3-己烯醛异构化或转化，导致其抑制作用降低；从该图也可以看出，低温储存3天对25、50 mM顺-3-己烯醛抑制作用无显著影响，提示该储存条件对顺-3-己烯醛异构化或转化程度很弱。换言之，顺-3-己烯醛异构化与其浓度有关，浓度高，异构化程度小。

实施例5：顺-3-己烯醛体外抑制其他植物来源脂肪氧合酶作用研究

脂肪氧合酶为绿叶挥发物合成途径关键酶，顺-3-己烯醛具有体外抑制黄芪脂肪氧合酶的作用提示着其的反馈抑制；该反馈抑制仅存在于黄芪，还是普遍存在于植物界；为了明确该抑制作用的存在范围，利用实施例2脂肪氧合酶提取与活性测定方法，我们调查了顺-3-己烯醛对代表植物脂肪氧合酶的抑制作用：（1）含反-2-己烯醛的药用植物柴胡、桔梗和党参，选用材料为鲜根；（2）模式植物拟南芥和烟草，选用材料为植物全株；（3）豆科植物大豆和绿豆，选用材料为豆芽。结果发现，大豆和绿豆芽脂肪氧合酶活性较高，其他材料中脂肪氧合酶活性很低，故后续以大豆芽和绿豆芽为材料，提取脂肪氧合酶，对顺-3-己烯醛抑制作用进行研究，结果见附图5A、5B。

从图附5A可以看出，顺-3-己烯醛浓度为25、50、100 mM时，抑制率>99%，抑制作用与阳性对照菲尼酮接近；浓度为1、10mM时，抑制率分别为59.72±3.95%、86.80±2.56%；与实施例4结果相比，顺-3-己烯醛体外抑制大豆脂肪氧合酶强于体外抑制黄芪脂肪氧合酶作用。与黄芪和大豆脂肪氧合酶相比，绿豆脂肪氧合酶活性更高，相同条件下重新筛选获得的阳性对照菲尼酮浓度为10 mM，是前两种植物的10倍。从附图5B可以看出，顺-3-己烯醛浓度增加至250、500 mM时，抑制率分别为74.42±11.84%、73.54±5.96%，抑制率仍显著低于阳性对照，提示顺-3-己烯醛具有反馈抑制绿豆脂肪氧合酶的作用，但作用较弱。综上所述，顺-3-己烯醛反馈抑制作用明显存在于包括蒙古黄芪、大豆、绿豆的豆科植物中。

实施例6：不同浓度顺-3-己烯醛处理对黄芪不定根脂肪氧合酶和三萜、黄酮/异黄酮合成积累的影响

为了进一步验证顺-3-己烯醛反馈抑制作用及其诱导作用，利用黄芪不定根培养物，我们进一步对其在体抑制作用进行了验证。首先利用无菌水配制12.5 mmol/L、50mmol/L、200 mmol/L顺-3-己烯醛，过滤除菌且现用现配。处理具体方法为：按照1‰的体积比，添加上述母液于含1 mg/L吲哚丁酸、30 g/L蔗糖的1/2 MS液体培养液中；按照13%（w:v）的接种量，接种黄芪不定根培养物，25℃、100 rpm条件下，摇床震荡培养168小时；同时设置正常培养物对照。分别在处理后4、8、12、24、48、72、120、168 h取样，每组每个取样点生物学重复数为3。采样时，首先转移根培养物至新鲜滤纸上，吸干培养液后，分成2份，一份转移至螺帽管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱，用于脂肪氧合酶活性测定；另一份置于60℃烘箱，烘干至恒重，用于化学分析。第168 h的样品，拍照后再进行如上处理。

采用实施例2方法进行脂肪氧合酶粗提液的制备和活性测定；同时测定粗提物的OD₂₈₀，以牛血清白蛋白为标准蛋白，绘制工作曲线，计算获得脂肪氧合酶粗提液蛋白含量数据。脂肪氧合酶酶活力单位定义为：以亚油酸为底物，在pH9.0、25℃、2mL反应体系中，每分钟每微克脂肪氧合酶粗提物OD₂₃₅增加0.001为一个活力单位。

利用课题组新建立的方法制备供试品溶液，具体方法如下：研钵研磨根培养物为粉末，按照1:30（g:v）的物料比加入70%乙醇，超声提取1h，8,000 g离心收集上层清液；重复提取一次，合并提取液，氮吹仪浓缩至干，色谱纯甲醇溶解并定容至2ml，0.22μm滤膜过滤，UHPLC法测定黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量。具体色谱、质谱条件为：Thermo Fischer Scientific Ultimate3000 HPLC 色谱- Thermo Fischer Scientific Orbitrap Q Exactive Plus massspectrometer质谱仪，选择性离子模式（target selected-ion-monitoring mode，SIM）定量检测，进样量：2 μL；分离用色谱柱：Syncronis C18 column (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm; Thermo Fischer)。色谱条件：流速为0.2 mL/min，柱温：40℃, 流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（A），梯度洗脱条件：0~2 min, 20%A；2~4 min, 20%A→40%A; 4~7 min, 40%A→45%A; 7~10 min, 45%A；10~14 min, 45%A→80%A; 14~16 min, 80%A→95%A；16~18.5 min, 95%A;18.5~19 min, 95%A→20%A；19~22 min, 20%A。质谱定性鉴别和定量分析用离子信息见表1。

表1：质谱定性鉴别和定量分析用离子信息表

不同浓度顺-3-己烯醛处理组黄芪不定根培养物脂肪氧合酶活力分析结果见附图6。从该图可以看出，顺-3-己烯醛处理4、48、72 h时，200 μM处理组酶活力单位显著低于12.5 μM处理组；处理后8~24 h及120 h，所有的顺-3-己烯醛处理组脂肪氧合酶活力均低于对照组；处理后168 h，顺-3-己烯醛处理组与对照组脂肪氧合酶活力无显著差异。简言之，除体外抑制作用外，顺-3-己烯醛具有在体抑制黄芪根培养物脂肪氧合酶的作用，抑制作用与剂量、作用时间有关；就目前实验长度而言，最佳的处理时间为120 h。

不同浓度顺-3-己烯醛处理组根培养物中黄芪皂苷含量分析结果见附图7。从图7A可以看出，处理4、168 h，所有的处理组黄芪皂苷I含量均显著高于对照组，且12.5 μM处理组含量最高；黄芪皂苷Ｉ含量明显增加也存在于如下组别：12.5、50 μM分别处理8、48 h根培养物中。从图7Ｂ、7C及7D可以看出，顺-3-己烯醛对黄芪不定根培养物中黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、异黄酮皂苷Ⅰ合成积累影响类似，12.5、50 μM诱导促进作用佳，特别是12.5 μM处理组。

不同浓度顺-3-己烯醛处理组根培养物中异黄酮含量分析结果见附图8。从附图8A、8B可以看出，200 μM顺-3-己烯醛处理4~24 h，根培养物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量最高，显著高于对照和低浓度处理组；随时间延长，该处理对二者的促进效应减弱。从附图8C可以看出，200 μM顺-3-己烯醛促进毛蕊异黄酮合成积累作用最佳。其次为12.5 μM顺-3-己烯醛处理组，中间剂量处理效应最差。

汇总不同浓度顺-3-己烯醛处理组黄芪皂苷和异黄酮含量数据，最低浓度即12.5μM顺-3-己烯醛处理组促进合成积累的组分数量最多，而最高浓度即200 μM顺-3-己烯醛处理组促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷合成积累作用最强。

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最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种黄芪不定根组织培养用化学诱导剂，其特征在于：所述化学诱导剂由顺-3-己烯醛溶解于水中制备而成，具体制备方法为：顺-3-己烯醛溶解于水，制备得200mmol/L的母液，无菌滤膜过滤除菌后，4℃保存备用。

2.权利要求1所述的黄芪不定根组织培养用化学诱导剂在黄芪不定根培养中的应用，其特征在于：所述化学诱导剂抑制黄芪不定根脂肪氧合酶合成积累，和促进根中活性成分甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮以及葡萄糖苷合成积累的方法，具体方法为：添加0.1% v:v的顺-3-己烯醛母液于含1 mg/L吲哚丁酸、30 g/L蔗糖的1/2 MS液体培养液中；按照10%w:v的接种量，接种黄芪不定根培养物，25℃、100rpm条件下，摇床震荡培养120h。

3.权利要求1所述的黄芪不定根组织培养用化学诱导剂在黄芪不定根培养中的应用，其特征在于：所述化学诱导剂抑制黄芪不定根脂肪氧合酶活性，和促进根中活性成分黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ以及环黄芪苷Ⅱ合成积累的方法，具体方法为：添加0.00625%v:v或0.025% v:v的顺-3-己烯醛母液于含1 mg/L吲哚丁酸、30 g/L蔗糖的1/2 MS液体培养液中；按照10%w:v的接种量，接种黄芪不定根培养物，25℃、100rpm条件下，摇床震荡培养168h。

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