KR102140231B1

KR102140231B1 - 구상나무 추출물, 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법 및 그로부터 정제된 구상나무 이차대사물질

Info

Publication number: KR102140231B1
Application number: KR1020180062596A
Authority: KR
Inventors: 김진희
Original assignee: 국립생태원
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2020-07-31
Also published as: KR20190136630A

Abstract

본 발명은 구상나무 추출물, 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법 및 그로부터 분리정제된 구상나무 이차대사물질에 관한 것이다.
본 발명은 국내 자생의 아비에스 종의 구상나무(Abie Koreana)로부터 추출된 9종의 식물 이차대사물질을 유효성분으로 함유한 구상나무 추출물을 제공하고, 그로부터 분리 정제된 말톨(Maltol) 성분, 피시드(trans-Piceid) 성분 및 레스베라트롤(Resveratrol) 성분의 구상나무 이차대사물질은 구상나무의 생육환경 또는 고사환경을 진단할 수 있는 지표물질로서 활용될 수 있다.

Description

구상나무 추출물, 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법 및 그로부터 정제된 구상나무 이차대사물질{EXTRACTS OF ABIES KOREANA, PURIFICATION METHOD THEREOF AND SECONDARY METABOLITES ISOLATED BY EXTRACTS}

본 발명은 구상나무 추출물, 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법 및 그로부터 분리정제된 구상나무 이차대사물질에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 국내 자생 아비에스 종(Abies Species)의 구상나무(Abie Koreana)로부터 추출된 식물 이차대사물질을 유효성분으로 함유한 구상나무 추출물 및 그로부터 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법 및 그로부터 정제된 구상나무 이차대사물질에 관한 것이다.

탄수화물, 단백질 등의 일차대사물질과 달리 성장과 증식, 생명유지에 직접적으로 관여하지 않지만 식물 스스로 적응 및 생존에 유리한 조건을 만들기 위해 생성해내는 유기화합물을 통칭하여 식물 이차대사물질이라 한다.

식물이 이차대사물질을 만들어내는 주요 목적은 자기방어와 경쟁자 배척인 만큼 배타성을 갖고 있는 경우이므로, 일부 강한 독성을 가진 것이나 환각작용을 일으키는 성분들도 있으나, 이를 잘 활용하면 인체에 무척 유익한 작용을 하는 성분들이 많다.

식물 이차대사물질이 주목 받기 시작한 초기에는 항산화 효과로 널리 알려진 폴리페놀 정도가 언급되는 수준이었으나, 최근에는 폴리페놀에서도 특성에 따라 카테킨, 안토시아닌, 레스베라트롤, 퀘르세틴, 탄닌등 세분화되어 있으며 그 외에도 셀 수 없을 만큼 다양한 식물 이차대사산물이 각각의 목적에 맞게 활용되고 있다.

또한, 식물이 생산하는 알칼로이드(alkaloid), 스테로이드(steroid), 테르페노이드(terpenoid), 페놀릭(phenolics)와 같은 이차대사산물은 의약품, 염료, 색소, 향료, 농약, 호르몬, 식품 첨가제 등으로 이용되고 있다. 따라서, 유기 합성 기술의 발전에 의해 많은 화합물이 합성되었음에도 불구하고 식물은 여전히 신물질의 공급원으로서 각광 받고 있다.

그러나, 식물 이차대사산물들은 생합성 경로가 복잡하여 식물로부터 직접 추출하여 이용되고 있으나, 함량이 낮고, 계절, 장소, 기후, 재배조건, 식물체의 부위 등에 따라 생산성에 큰 차이를 나타내어 안정된 공급을 제공하지 못하고 있 다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 여러 가지 대안이 제시되어 있으며 그 중에서도 식물세포배양을 통한 안정된 대량생산체제에 관심이 모아지고 있으며, 이에 대한 연구가 최근 들어 활발해지고 있다[특허문헌 1].

식물세포배양공학을 이용한 유용물질 생산기술은 일반 식물체를 노지에서 키우는 전통적인 농경법에 비하면 보다 좁은 면적이 요구되며 기내의 조건을 영양소와 호르몬, 물리적인 면에서 성장과 생산을 위한 최적의 생산조건을 유지, 조절해줄 수 있다. 또한 균류, 세균 및 바이러스 등의 모든 미생물과 해충에게서 격리 보호됨으로써 최근에 각광을 받고 있는 그린 테크놀로지의 장점을 극대화할 수 있고, 배양 조건이 균일하여 일정한 품질의 유용물질을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다. 특히 약용식물의 경우 생육이 늦어 생산성을 향상시키기가 용이하지 않으나, 배양세포의 생육속도는 최적화된 환경조건을 제공할 시 생산성을 큰 폭으로 신장시킬 수 있다.

일반적으로 아비에스 종(Abies Species)은 추위에 강하고 습한 환경을 선호하는 경향이 있으며, 오랫동안 레진과 같은 물질의 천연재료로 간주되어 오고, 상업적으로는 펄프 우드, 크리스마스 트리, 야생 동물 서식지, 목재, 향기 및 자연 의학을 포함한 자원으로서 중요도가 높아지고 있다. 이에, 인간 활동과 기후 변화의 결과로서 서식지 분화 및 생물의 다양성에 대한 관심이 커지고 있다.

식물은 4000 가지가 넘는 트리테르페노이드(triterpenoids)가 확인되면서 이차대사물질의 가장 큰 자원그룹으로 밝혀지고 있으며, 이미 10년 전 아비에스 종에서 277개의 화학성분이 보고된 바 있으며, 그 수는 여전히 증가하고 있다(비특허문헌 1).

아비에스 종(Abies Species) 중에서, 구상나무(Abies Koreana, Korean fir)는 소나무과의 여러해살이 상록 침엽 교목으로서, 한라산, 지리산, 덕유산, 무등산의 해발 500 내지 2,000m에 자생하며, 한국에서만 자라는 특산식물이다. 따라서, 한국 자생의 구상나무는 산지가 좁고 표본 크기가 작기 때문에 상대적으로 연구 보고가 드물었다.

현재까지 구상나무의 구성성분은 하기에 정리된 바와 같이, 테리테르페노이드 성분((24E)-3-Oxo-9b-lanosta-7,24-dien-26-ol, (22Z)-3-Oxo-9blanosta-7,22,24-trien-26,23-olide, (24E)-3,4-Seco-9b-lanosta-4(28), 7,24-triene-3,26-dioic acid 및 24-Methylidene-3,4-secocycloart-4(28)-en-3-oic acid)가 있으며, 더불어 리그난성분((þ)-pinoresinol, todolactol C, koreanol, 및 a-intermedianol)이고, 페놀릭 성분(Hexacosylferulate) 및 스테로이드 성분(b-Sitosterol 및 sitosterol glucoside)이 보고된 바 있다.

또한, 구상나무로부터 분리된 성분들의 생리활성은 항 박테리아성, 항균 및 항산화활성을 밝혀내면서, 이를 이용하여 다양한 분야에 적용할 수 있음은 당연히 이해될 것이다.

대한민국공개특허 제2015-0057333호에는 구상나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물이 리파아제 활성 억제효과를 확인함으로써, 혈중 지질 농도를 조절하여 과도한 혈중 지질로 인해 발생할 수 있는 비만과 고지혈증을 예방 또는 개선하기 위한 용도를 제안하고 있다(특허문헌 2).

그러나 상기 발명은 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 구상나무 추출물을 이용한 것으로서, 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이 개시되어 있다.

또한, 대한민국공개특허 제2014-0141593호에는 침엽수 목재 종으로부터 플라보노이드 디히드로퀘르세린(탁시폴린)을 단리하는 방법이 개시되어 있다. 구체적으로는, 아비에스 (Abies) 속의 전나무 목재를 소분하여 극성용매로 추출하여 추출물을 회수하고 정제하여 원하는 플라보노이드 물질인 디히드로퀘르세틴 (탁시폴린)을 분리하는 방법을 제시하고 있다(특허문헌 3).

이에, 본 발명자들은 구상나무로부터 추출되어 식물 이차대사물질을 유효성분으로 함유한 구상나무 추출물을 제조하고 상기 구상나무 추출물로부터 분리 정제하여 신규한 이차대사물질 성분을 분석함으로써, 본 발명을 완성하였다.

국제공개특허 제2005-012507호 (2005.10.02 공개) 대한민국공개특허 제2015-0057333호 (2015.05.28 공개) 대한민국공개특허 제2014-0141593호 (2014.12.10 공개)

Yang, X. W.; Li, S. M.; Shen, Y. H.; Zhang, W. D. Phytochemical and biological studies of Abies species. Chem. Biodivers. 2008, 5 (1), 56-81.

본 발명의 목적은 구상나무(Abies Koreana)로부터 추출된 구상나무 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 구상나무 추출물로부터 이차대사물질의 분리정제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로부터 분리정제된 구상나무 이차대사물질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내 자생 아비에스 종(Abies Species)의 구상나무(Abies Koreana)로부터 추출된 식물 이차대사물질을 유효성분으로 함유한 구상나무 추출물을 제공한다.

상기 구상나무 추출물은 구상나무(Abies Koreana) 잎으로부터 추출된 것이 바람직하다.

본 발명은 a) 지역별 채취한 구상나무(Abies Koreana) 잎을 세척 및 건조하여 세절하는 시료 준비 단계;

(b) 상기 준비된 시료를 지역별로 구분된 시험관에 충진하는 단계

(c) 순차적 용매순환 방식으로 추출하여 지역별 구상나무 추출액을 수득하는 단계 및

(d) 지역별 구상나무 추출액으로부터 이차대사물질을 회수하는 단계로 이루어진, 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법을 제공한다.

상기 순차적 용매순환 방식은 비극성 용매에서부터 극성 용매순으로 단일 유기용매가 순차적으로 투입되어 추출된 것이고, 바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매가 순차 투입되는 것이다.

더욱 바람직하게는 헥산을 이용한 추출 후, 에틸아세테이트, 메탄올 순서로 투입되는 것이다.

나아가 본 발명은 상기 분리정제방법로부터 수득된 구상나무 이차대사물질을 제공한다.

구체적으로는, 분리정제된 구상나무 이차대사물질로는 말톨(Maltol) 성분, 트랜스-피시드(trans-Piceid) 성분 및 레스베라트롤(Resveratrol) 성분이다.

본 발명에 따라, 구상나무(Abies Koreana)로부터 추출된 식물 이차대사물질을 유효성분으로 함유한 구상나무 추출물을 제공하고, 상기 구상나무 추출물로부터 이차대사물질의 분리기법을 개발하여, 그로부터 분리 정제된 구상나무 이차대사물질을 제공할 수 있다.

본 발명은 구상나무 잎으로부터 추출된 추출물로부터, 평균기온, 강수량, 풍속 등의 비생물학적인 환경요인에 의해 구상나무 이차대사물질의 발현량 차이를 확인함으로써, 시기별 및 지역별 구상나무 이차대사물질의 발현여부에 따라 구상나무의 생육환경 또는 고사환경을 진단할 수 있는 지표물질로서 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 분리정제방법으로부터 수득된 구상나무 이차대사물질의 질량분석결과이고,
도 2는 본 발명의 분리정제방법으로부터 수득된 말톨(Maltol) 성분의 ¹H-NMR 분석결과이고,
도 3은 도 2의 말톨 성분의 ¹³C-NMR 분석결과이고,
도 4는 본 발명의 분리정제방법으로부터 수득된 트랜스-피시드(trans-Piceid) 성분의 ¹H-NMR 분석결과이고,
도 5는 도 4의 트랜스-피시드 성분의 ¹³C-NMR 분석결과이고,
도 6은 본 발명의 분리정제방법으로부터 수득된 레스베라트롤(Resveratrol) 성분의 ¹H-NMR 분석결과이고,
도 7은 도 6의 레스베라트롤 성분의 ¹³C-NMR 분석결과이고,
도 8은 본 발명의 분리정제방법에 따라, 분리정제된 말톨 성분의 시기별 및 지역별 발현량을 도시한 결과이고,
도 9는 본 발명의 분리정제방법에 따라, 분리정제된 트랜스-피시드 성분의 시기별 및 지역별 발현량을 도시한 결과이고,
도 10은 본 발명의 분리정제방법에 따라, 분리정제된 레스베라트롤 성분의 시기별 및 지역별 발현량을 도시한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 국내 자생 아비에스 종(Abies Species)의 구상나무(Abies Koreana)로부터 추출된 식물 이차대사물질을 유효성분으로 함유한 구상나무 추출물을 제공한다.

이때, 구상나무 추출물은 구상나무(Abies Koreana) 잎을 사용하여 시료채취의 용이성을 제공한다.

본 발명의 구상나무 추출물에는 9종의 이차대사물질을 함유하되, 구체적으로는 탁시폴린(Taxifolin), 켐페롤-3-글로코사이드(Keampferol-3-glucoside), 파라-쿠마릭애씨드(p-coumaric acid), 4-하이드록시벤조익애씨드(4-Hydroxybenzoic acid), 프로토카테츄익애씨드(Protocatechuic acid), 디하이드로아비에트산(Dehydroabietic acid), 말톨(Maltol), 피시드(trans-Piceid), 레스베라트롤(Resveratrol)을 함유한다.

또한, 본 발명은 (a) 지역별 채취한 구상나무(Abies Koreana) 잎을 세척 및 건조하여 세절하는 시료 준비 단계;

본 발명의 분리정제방법에 있어서, (a) 단계에서 지역은 아고산(subalpine) 생태계 분석을 위하여, 본 발명의 실시예에서는 한라산국립공원 내 영실(노루샘터, 고도 1500∼1650m), 윗세오름(어리목, 고도 1650∼1700m)), 진달래밭(성판악, 고도 1500∼1650m))의 3곳과, 또한, 지리산국립공원 내 세석(거림, 고도 1500∼1600m), 반야봉(임걸령, 고도 1400∼1500m)의 2곳을 지정하여 채취하여 실시하나, 구상나무 국내 자생지라면 가능할 것이다.

채취시기는 봄(4월), 여름(7월), 가을(10월)로 구분하며, 시료 채취로 인해 식물 전체의 훼손을 막고 채취 용이성으로 인해 구상나무의 잎을 채취하여 실시한다.

(b) 단계에서 세절된 시료를 시험관에 충진하고, 속실렛(Soxhlet) 추출을 위한 원통형 여과지(thimble filter) 에 시료를 충진한다.

(c) 단계는 순차적 용매순환 방식으로 추출하는 것으로서, 상기 원통형 여과지(thimble filter)에 충진된 시료전체가 증발되는 용매와 접촉하고 다시 용매가 냉각하는 과정을 장시간 반복하면서, 용매의 극성도와 용해도 차이에 의해 분리되도록 한다.

이때, 순차적 용매순환 방식은 비극성 용매에서부터 극성 용매순으로 단일 유기용매가 순차적으로 투입되어 추출되는 것이다.

바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매가 순차 투입되는 것이다.

특히, 헥산은 지방질/지방산(lipid/fatty acids)과 같은 물질분리에 유용하므로, 정유물질을 많이 함유하는 침엽수의 잎에서 헥산을 사용하여 지방질을 추출한 후 에틸아세테이트, 메탄올 순서로 투입함으로써, 물질을 용이하게 추출 및 분리할 수 있다.

더욱 바람직하게는 헥산을 통하여 지방질/지방산(lipid/fatty acids)의 추출 후, 에틸아세테이트, 메탄올 순서로 투입되어 추출하는 것이다.

이후, (d) 단계는 지역별 채취된 구상나무 추출액으로부터 이차대사물질을 용매증발 건조하여 회수하는 단계이다.

구체적으로는, 본 발명에서 구상나무 추출물로부터 분리 및 분광학적 분석으로 검증한 결과, 구상나무 이차대사물질은 하기 화학식 1로 표시되는 말톨(Maltol) 성분, 화학식 2로 표시되는 피시드(trans-Piceid) 성분 및 화학식 3으로 표시되는 레스베라트롤(Resveratrol) 성분이다.

화학식 1

화학식 2

화학식 3

상기 말톨 성분은 작물의 성장과 토양 미생물의 성장을 저해하는 타감물질로 작용하며, 항균효과 및 성체 곡물바구미(Sitophilus granarius)에 대해 유인제로서 작용한다고 알려져 있다.

또한, 상기 피시드(trans-Piceid)와 레스베라트롤 성분은 다양한 균들에 항미생물활성과 가문비나무를 균사체로 감염시키면 스틸벤 합성 전사가 증가되며 균의 성장을 심각하게 저해하고, 또한 상기 레스베라트롤을 포함한 페놀성 화합물은 유충의 섭식작용을 저지하는 타감효과가 공지되어 있다.

특히, 상기 효과와 더불어, 본 발명의 방법에 따라 구상나무 추출물로부터 분리 정제된 구상나무 이차대사물질로서, 말톨(Maltol) 성분, 피시드(trans-Piceid) 성분 및 레스베라트롤(Resveratrol) 성분은 구상나무 채취의 시기별 및 지역별로 상기 이차대사물질의 발현량이 결정되므로, 구상나무의 생육환경 또는 고사환경을 진단할 수 있는 지표물질로서 활용될 수 있다.

이하, 제조예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 제조예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 제조예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

한라산국립공원에서 영실(노루샘터, 고도 1500∼1650m), 윗세오름(고도 1650∼1700m), 진달래밭(고도 1500∼1650m) 지역에서 2017년 봄(4월), 여름(7월), 가을(10월)에 구상나무의 잎을 채취하였다.

또한, 지리산 국립공원에서 세석(고도 1500∼1600m), 반야봉(고도 1400∼1500m) 지역에서 2017년 봄(4월), 여름(7월), 가을(10월)에 구상나무의 잎을 채취하였다.

각 지역에서 수집된 5종의 구상나무 잎을 자연 건조하고 세절하여 각각 세절된 시료를 원통형 여과지(thimble filter)를 포함한 속실렛 반응기에 충진하고 헥산을 투입하여 헥산 추출물을 수득하고, 이후 에틸아세테이트 투입하여 에틸아세테이트 추출물을 수득하고, 이후 메탄올을 순차 투입한 후 메탄올추출물을 수득하여, 지역별 채집된 시료로부터 구상나무 추출물을 수득하였다.

<실험예 1> 이차대사물질의 성분분석

상기 실시예 1에서 수득된 구상나무 추출물의 성분분석을 위하여, HPLC(Dionex U-3000 UHPLC)를 이용하여 성분 분석하였다.

이때, 공지의 전나무속(Abies spp.)에 분포하는 이차대사물질 분석 데이터로부터 표준물질을 선정하였다. 이때, 표준물질로는 플라보노이드 성분으로서 탁시폴린(Taxifolin), 켐페롤-3-글로코사이드(Keampferol-3-glucoside)의 2종, 페롤릭 성분으로서 파라-쿠마릭애씨드(p-coumaric acid), 4-하이드록시벤조익애씨드(4-Hydroxybenzoic acid), 프로토카테츄익애씨드(Protocatechuic acid)의 3종, 스테로이드 성분으로서, 디하이드로아비에트산(Dehydroabietic acid)의 1종을 선정하였다.

HPLC 분석조건:

컬럼: YMC-Triart C18, 5㎛, 250 × 4.6 mm

LC gradient: 100% A Buffer 2분/ 0∼100% B Buffer 33분/ 100% B Buffer 8 분

유속: 1 ㎖/분

파장: 210nm, 254nm, 280nm, 340nm

온도: 35℃

주입량: 시료 (10㎕)

LC 버퍼용액: ① A Buffer: H₂O, B Buffer: MeOH

② A Buffer: H₂O+0.04%(Trifluoroacetic acid, TFA), B Buffer: MeOH+0.04% TFA

상기 HPLC 성분분석 결과, 상기 선정된 표준물질의 6종의 이차대사물질을 확인하였고, 6종 이외에 3종의 분석대상물질을 발견하고, 이를 질량분석 및 핵자기공명 분석을 수행하였다.

도 1 내지 도 7의 분석결과로부터, 화학식 1로 표시되는 말톨(Maltol) 성분으로 분리정제하였다[ESIMS m/z 168.3 [M+ACN+H]⁺, UV λ_max(nm): 213.84, 275.83; ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD-d₄), δ = 7.95 (1H, d, J = 5.4 Hz, H-6), 6.39 (1H, d, J = 5.4 Hz, H-5), 2.36 (3H, s, -CH₃), ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD-d4) δ = 175.4 (C-4), 156.3 (C6), 152.3 (C-2), 144.6 (C-3), 114.5 (C-5), 14.3 (-CH₃)].

화학식 1

또한, 화학식 2로 표시되는 피시드(trans-Piceid) 성분으로 분리 정제하였다[ESIMS m/z 391.4 [M+H]⁺, UV λ_max(nm) : 216.85, 318.62; ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD-d₄) , δ = 7.36 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2′, 6′), 7.02 (1H, d. J = 16.2 Hz, H-8), 6.84 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7), 6.77 (1H, t, J = 1.2 Hz, H-2), 6.76 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3′, 5′), 6.62 (1H, t, J = 1.2 Hz, H-6), 6.45 (1H, t, J = 1.8 Hz, H-4), 4.90 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1″), 3.94 (1H, dd, J = 1.8, 12.0 Hz, H-6a″), 3.72 (1H, dd, J = 6.0, 12.0 Hz, H-6b″), 3.46 (3H, m, H-2″, 5″, 3″), 3.39 (1H, m, H-4″), ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD-d₄) δ = 160.5 (C-3), 159.9 (C-5), 158.9 (C-4′), 141.5 (C-1), 130.3 (C-1′), 130.0 (C-8), 128.9 (C-2′, 6′), 126.7 (C-7), 116.7 (C-3′, 5′), 108.5 (C-6), 107.0 (C-2), 104.2 (C-4), 102.5 (C-1″), 78.3 (C-5″), 78.1 (C-3″), 75.0 (C-2″), 71.6 (C-4″), 62.7 (C-6″)].

화학식 2

또한, 화학식 3으로 표시되는 레스베라트롤(Resveratrol) 성분으로 분리 정제하였다[ESIMS m/z 229.3 [M+H]⁺, UV λ_max(nm) : 217.35, 309.38; ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD-d₄), δ = 7.34 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.94 (1H, d, J = 16.8 Hz, H-8), 6.78 (1H, d, J = 16.8 Hz, H-7), 6.76 (2H, d, J = 9.0 Hz, 3′, 5′), 6.44 (2H, d, J = 1.8 Hz, H-2, 6), 6.16 (1H, d, J = 0.6 Hz, H-4)

¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD-d₄) δ = 159.8 (C-3), 159.7 (C-5), 158.7 (C-4′), 141.4 (C-1), 130.4 (C-1′), 129.5 (C-8), 128.9 (C-2′, 6′), 127.0 (C-7), 116.7 (C-3′, 5′), 105.8 (C-2, 6), 102.8 (C-4)].

화학식 3

<실험예 2> 이차대사물질의 발현량 정량분석

상기 실험예 1에서 확인된 구상나무추출물로부터 분리정제된 9종의 이차대사물질의 성분별 발현량을 수치화하여 검정그래프를 작성하였다. 이때, 9종의 이차대사물질은 탁시폴린, 켐페롤-3-글로코사이드, 파라-쿠마릭애씨드, 4-하이드록시벤조익애씨드, 프로토카테츄익애씨드, 디하이드로아비에트산, 말톨, 트랜스-피시드, 레스베라트롤이었다.

특히 분리 정제된, 말톨, 트랜스-피시드 및 레스베라트롤에 대하여, 시기별 및 지역별에 따른 발현량을 수치화하여 도 8 내지 도 10에 도시하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 2017년 4월, 7월 및 10월에 한라산국립공원의 영실 지역에서 채취한 시료에서는 시기에 따라 말톨 성분의 증가 경향을 보였고, 윗세오름에서 채취한 경우는 시기별 큰 영향을 받지 않고 발현량이 유지되었다. 그러나, 진달래밭에서 채취한 경우, 4월보다 7월에 감소하고, 급기야 10월에는 말톨 성분의 발현량이 관찰되지 않았다.

또한, 2017년 4월, 7월에 지리산 국립공원의 세석 지역에서 채취한 시료로부터 분리정제된 말톨 성분은 4월 및 7월에 높은 발현량을 보인 반면, 반야봉 지역의 경우는 말톨 성분이 4월에 발현된 수준대비 70%정도 감소한 결과를 확인하였다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 2017년 4월 및 7월에 한라산국립공원의 영실, 윗세오름 및 진달래밭에서 채취한 구상나무 추출물로부터 분리 정제된 트랜스-피시드 성분은 한라산국립공원의 영실, 윗세오름 및 진달래밭에 높은 발현량을 보였으나, 10월 채취한 시료에서는 영실, 윗세오름에서는 성분이 크게 증가한 반면, 진달래밭에서는 트랜스-피시드 성분이 발현되지 않았다.

또한, 2017년 4월 및 7월에 지리산 국립공원에서 채취한 구상나무 추출물로부터 분리 정제된 트랜스-피시드 성분은 4월 및 7월 반야봉에서 채취한 시료에서는 모두 발현량이 극히 낮은 반면, 세석에서는 높은 발현량과 더불어 4월 및 7월 시기에 따라 증가 경향을 보였다.

또한, 도 10의 결과를 통해, 2017년 4월에 한라산국립공원의 영실, 윗세오름 및 진달래밭에서 채취한 구상나무 추출물로부터 분리 정제된 레스베라트롤 성분은 7월 및 10월 시기에 채취한 시료보다, 레스베라트롤 성분의 발현량이 낮아지는 결과를 보이고, 특히 10월에 진달래밭에서 채취한 경우에는 레스베라트롤 성분이 전혀 발현되지 않았다.

반면에, 2017년 4월 및 7월에 지리산 국립공원에서 채취한 구상나무 추출물로부터 분리 정제된 레스베라트롤 성분은 반야봉에서는 성분의 발현량이 시기에 따라 급격히 낮아지고, 다만 세석에서는 레스베라트롤 성분이 4월보다 7월에 발현량 향상결과를 보였다.

이상으로부터, 본 발명의 구상나무 추출물로부터 분리 정제된 이차대사물질인 말톨, 트랜스-피시드 및 레스베라트롤 성분은 평균기온, 강수량, 풍속 등의 비생물학적인 환경요인에 의해 발현량의 차이를 보인다는 결과를 확인하였다. 특히, 식물생육에 대한 실태 조사결과, 한라산국립공원의 진달래밭과 지리산국립공원의 반야봉에서는 구상나무가 고사된 결과와, 상기 지역에서 구상나무 이차대사물질인 말톨, 트랜스-피시드 및 레스베라트롤 성분이 발현되지 않는 결과와 일치하므로, 본 발명에서 분리정제된 구상나무 이차대사물질은 시기별 및 지역별 구상나무 이차대사물질의 발현여부에 따라 구상나무의 생육환경 또는 고사환경을 진단할 수 있는 지표물질로서 활용될 수 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

국내 자생 아비에스 종(Abies Species)의 구상나무(Abies Koreana)로부터 추출된 식물 이차대사물질을 유효성분으로 함유한 구상나무 추출물로서,
상기 추출물은 하기 화학식 1로 표시되는 말톨(Maltol) 성분, 화학식 2로 표시되는 피시드(trans-Piceid) 성분 및 화학식 3으로 표시되는 레스베라트롤(Resveratrol) 성분으로 분리정제된, 구상나무 이차대사물질.

화학식 1

화학식 2

화학식 3
제1항에 있어서, 상기 구상나무(Abies Koreana) 잎으로부터 추출된 것을 특징으로 하는 구상나무 추출물.
(a) 지역별 채취한 구상나무(Abies Koreana) 잎을 세척 및 건조하여 세절하는 시료 준비 단계;
(b) 상기 준비된 시료를 지역별로 구분된 시험관에 충진하는 단계
(c) 순차적 용매순환 방식으로 추출하여 지역별 구상나무 추출액을 수득하는 단계 및
(d) 지역별 구상나무 추출액으로부터 이차대사물질을 회수하는 단계로 이루어진, 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법으로,
상기 추출액은 하기 화학식 1로 표시되는 말톨(Maltol) 성분, 화학식 2로 표시되는 피시드(trans-Piceid) 성분 및 화학식 3으로 표시되는 레스베라트롤(Resveratrol) 성분으로 분리정제되는, 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법.

화학식 1

화학식 2

화학식 3
제3항에 있어서, 상기 순차적 용매순환 방식이 비극성 용매에서부터 극성 용매순으로 단일 유기용매가 순차적으로 투입되어 추출된 것을 특징으로 하는 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법.
제4항에 있어서, 상기 유기용매가 헥산 추출 이후, 에틸아세테이트 및 메탄올 순서로 순차적 투입된 것을 특징으로 하는 구상나무 이차대사물질의 분리정제방법.
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