CN113179949B - 正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属中药黄芪促生技术领域，为了解决目前黄芪资源绿色、持续发展问题，提供正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，100 mmol/L正己醇水溶液无菌滤膜过滤除菌后，4℃保存即为正己醇诱导因子；按体积比0.5‰的添加量，添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，按质量体积比10%的接种量接种黄芪根培养物，25℃、100 rpm摇床培养1‑2周。正己醇具有促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成前体合成的作用。综合考虑不定根产量和活性成分合成积累的双重促进作用，诱导子正己醇有望开发为一种绿色添加剂，应用于蒙古黄芪不定根组织培养体系，提高根培养物产量和活性物质含量。

Description

正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累 中的用途

技术领域

本发明属于中药黄芪促生技术领域，具体涉及正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途。通过培养介质中添加低浓度正己醇，促进了黄芪不定根组织培养物生物量的增加，以及培养物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和黄芪皂苷IV的合成积累。

背景技术

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var.mongholicus (Bge.) 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，属常用补益类药材，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效。黄芪首载入1963年版《中华人民共和国药典》，之后收载于历版。已有研究表明，黄芪含有三萜皂苷、异黄酮、多糖、氨基酸等多种活性成分。迄今为止，研究者已从黄芪中分离鉴定得200多种化合物。其中，黄芪皂苷Ⅳ和毛蕊异黄酮葡萄糖苷不仅是黄芪药材中含有的主要活性成分，也是黄芪的质控指标成分。《中华人民共和国药典》（2020版）规定，黄芪药材中黄芪甲苷Ⅳ含量不得低于0.08%（0.08 mg/g，干重），毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不得低于0.02%（0.02 mg/g）。2019年11月，国家卫健委、国家市场监督管理总局联合发布《关于对党参等9种物质开展按照既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》，新增黄芪为药食同源中药材品种。2020年12月2日，欧盟委员会发布法规2020/1821号条例，批准黄芪提取物作为新型食品投放市场，名称为“黄芪提取物”。

黄芪药材，目前以仿野生栽培和平地移栽品为主，仿野生栽培黄芪的生长年限≥4年，平地移栽黄芪生长年限≥2年，生长周期较长；田间管理喷施化学合成农药防治病虫害、根施化学肥料促进生长，不仅容易造成黄芪药材农药残留、药材品质下降，同时也会引起土壤污染、板结和肥力下降等，不利于有限土地资源的循环利用。运用植物组织培养学方法，挖掘新的药用黄芪资源获得途径，是制备黄芪提取物、保障黄芪产业绿色发展、可持续利用的一种积极、经济、高效补给途径。

相比于药用黄芪田间栽培至少2年的生长周期，黄芪根培养物具有生长周期短、无农药和化肥污染、不占用土地资源等优点，是短期内获取大量药用黄芪、制备黄芪提取物的重要原料。与发根农杆菌诱导生成的毛状根培养物含有有毒的冠瘿碱、后期提取物制备成本高相比，不定根培养物更为安全、经济，具有很好的产业发展前景。兼具黄芪不定根生长和活性成分合成积累促进作用的诱导子将有助于黄芪不定根培养体系的产业化和成本节约。

正己醇是植物中的一种常见绿叶挥发物，存在于黄芪根部。现有针对烟草、拟南芥等植物的研究发现，正己醇具有介导植物化学防御应答的作用，但在药用植物非挥发性活性成分合成积累中的作用未见报道，相关的应用研究尚未涉及。

发明内容

本发明为了解决目前黄芪资源绿色、持续发展问题，提供了正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，正己醇提高了黄芪不定根产量和根中活性成分黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷的含量。

本发明由以下技术方案实现的：正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，所述正己醇处理方法为：100 mmol/L正己醇水溶液无菌滤膜过滤除菌后，4℃保存即为正己醇诱导因子；

具体应用方法为：按照体积比为0.5‰的添加量，添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，再按照质量体积比为10%的接种量接种黄芪根培养物，25℃、100 rpm摇床培养1-6周。

本发明提供了所述正己醇诱导因子在诱导黄芪不定根生长中的用途。

进一步的，所述正己醇在黄芪不定根组织培养体系中的用途，添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，接种黄芪根培养物，摇床培养2周。

本发明还提供了所述正己醇在诱导黄芪多活性成分合成积累中的用途，所述多活性成分为毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷，添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，接种黄芪根培养物，摇床培养2周。

所述正己醇在诱导黄芪多活性成分合成积累中的用途，所述多活性成分为黄芪皂苷Ⅳ，添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，接种黄芪根培养物，摇床培养1周。

所述黄芪不定根液体培养基为：含1 mg/L吲哚丁酸、30 g/L蔗糖的1/2 MS液体培养液。

所述黄芪为蒙古黄芪。

本发明所述正己醇通过商业购买的方式获得分析纯试剂，母液配制用水为灭菌后的去离子水。

本发明所述的正己醇诱导因子适用于蒙古黄芪不定根组织培养体系，在无菌震荡摇床培养条件提高不定根产量和多种活性成分含量的作用。

本发明所述正己醇天然存在于药用植物黄芪根中，在道地黄芪即浑源黄芪中含量高，属挥发性有机化合物，与水互溶性佳，应用于黄芪不定根培养体系，不存在二次污染问题；正己醇诱导因子促进蒙古黄芪不定根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成积累，与抑制其合成前体物质的合成、促进合成前体即毛蕊异黄酮和芒柄花黄素的糖基化及随后的酰基化修饰有关。

在黄芪不定根培养5-6周时，正己醇具有促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成前体-芒柄花黄素合成的作用。因此，正己醇将为蒙古黄芪不定根培养体系提供了一种绿色、效应持久的环境友好型化学诱导剂。

本发明所确定的化学诱导因子-正己醇，除存在于黄芪外，还存在于其他多种中药材中，如柴胡挥发油中，正己醇所占比例高达6.216%[1]；兴安白芷挥发油中，正己醇所占比例为0.33%[2]；鸦胆子挥发油中，正己醇所占比例为3.13%[3]；牛蒡子挥发油中，正己醇所占比例为0.52%[4]。化学诱导因子正己醇很可能在上述药用植物组织培养物中发挥有益作用。

本发明涉及的化学诱导因子，通过如下途径筛选获得。首先添加1‰体积的50mmol/L正己醇、E-2-己烯醛、正己醛于1/2 MS培养液中，摇床振摇培养2周，动态取样。通过分析上述处理及对照样本中黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷含量和培养2周时的生物量，发现正己醇同时具有促进蒙古黄芪不定根生长、根中上述活性成分合成积累的作用。在此基础上，开展第二轮正己醇处理实验，相同条件下，培养6周，从转录和代谢调节层面，对正己醇促进作用机制进行了阐释。发现在培养6周时，正己醇处理组毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷共有的合成前体-芒柄花黄素合成量远高于对照；培养5周时，正己醇处理组参与毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成前体合成的IFS1.1（毛蕊异黄酮合成酶1.1）表达显著上调。提示在处理5-6周时，正己醇具有促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成前体合成的作用。综合考虑不定根产量和活性成分合成积累的双重促进作用，诱导子正己醇有望开发为一种绿色添加剂，应用于蒙古黄芪不定根组织培养体系，提高根培养物产量和活性物质含量。

附图说明

图1为黄芪苗及诱导生成的黄芪不定根及其液体培养物（A、B、C、D、E）；图中，A为黄芪组培苗及不定根诱导用顶芽（箭头标示）；B为诱导形成的不定根早期形态（箭头标示）；C为液体培养用不定根；D为继代培养用黄芪不定根培养物；E为用于正己醇等处理用黄芪不定根培养物；

图2为正己醇（hexanol）、E-2-己烯醛（E-2-hexenal）、正己醛（hexanal）处理对黄芪不定根培养物中黄芪皂苷Ⅳ和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的影响；图中，A为培养1周时的黄芪皂苷Ⅳ含量；B为正己醇和E-2-己烯醛处理组黄芪皂苷Ⅳ动态积累；C为培养1周时的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量；D为溶剂对照（50%乙醇）、正己醇和正己醛处理组毛蕊异黄酮葡萄糖苷动态积累；Normal control：正常对照；Vehicle control: 溶剂对照；A、C柱状图标准差上的不同字母代表组间显著性差异；B、D柱状图标准差上的不同字母代表同一组内不同培养时间点间的显著性差异；

图3为正己醇（hexanol）、E-2-己烯醛（E-2-hexenal）、正己醛（hexanal）处理对黄芪不定根培养物中芒柄花苷动态积累的影响；图中，柱状图标准差上的不同字母代表组内不同时间点间的显著性差异；

图4为正己醇（hexanol）、E-2-己烯醛（E-2-hexenal）、正己醛（hexanal）处理对培养2周的黄芪不定根培养物生长的影响；图中，柱状图标准差上的不同字母代表组间生长率的显著性差异；

图5为基因表达分布图；图中，C7和C14分别为培养7天、14天的正常对照；V7和V14分别为50%乙醇处理后7天、14天的溶剂对照；E7和E14分别为处理后7天、14天的E-2-己烯醛处理；H7和H14分别为处理后7天、14天的正己醇处理；图中，FPKM为基因对应转录本的相对丰富度，代表基因的相对表达水平；

图6为正己醇和E-2-己烯醛诱导引起的差异表达基因的GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，代谢途径）富集分析；图中，E为E-2-己烯醛处理，H为正己醇处理，V为50%乙醇即溶剂对照，字母后面的数字7和14代表根培养天数；

图7为毛蕊异黄酮葡萄糖苷生物合成途径及潜在参与合成的酶基因在正己醇处理（hexanol）和对照（control）组中的表达；图中，柱状图标准偏差上面的*表示相同时间点对照组与正己醇处理组间显著性差异表达；4CL：4-香豆酸：辅酶Ａ连接酶；IFS1.1：异黄酮合成酶1.1；IFS1.2：异黄酮合成酶1.2；UCGT1：毛蕊异黄酮葡萄糖基转移酶1；UCGT2：毛蕊异黄酮葡萄糖基转移酶2；CGMT：毛蕊异黄酮葡萄糖酰基转移酶。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例１：蒙古黄芪不定根诱导与继代培养

以实验室长期扩繁（> 5年）、处于生长旺盛期的蒙古黄芪组培苗为出发材料，如图1中A所示，选取长势良好的顶芽，长度为１～２厘米，无菌剪切后，转移至含0.7%琼脂、30 g/L蔗糖、1 mg/L萘乙酸的MS固体培养基中，25℃、16小时（光）/8小时（暗）条件下培养8周，诱导长出的不定根早期形态学特征见图1中的B，用于液体培养的不定根形态学特征见图1中的C。

随后，无菌剪切、无菌水洗涤不定根后，转移培养至含30 g/L蔗糖、1 mg/L吲哚丁酸的30 mL 1/2 MS液体培养基（100 mL三角瓶）中，25℃、100 rpm的条件下摇床培养4周，为不定根种子培养物，如如图1中D所示；分为两份，转接根种子培养物于含100 mL相同培养基的250 mL三角瓶中，相同条件下摇床培养4周，用于不定根继代培养；继续均分为两份，再转接于含200 mL相同培养基的500 mL三角瓶中，相同条件下摇床培养4周，获得诱导处理用蒙古黄芪不定根培养物，如图1中E所示。因为黄芪不定根由黄芪组培苗顶芽诱导分化形成，属无菌培养物，基于组织研磨法的细菌培养（27℃培养7天，无菌落形成）也证实不定根培养物为无菌材料。

实施例2：正己醇、E-2-己烯醛、正己醛处理与样品收集

利用50%乙醇溶液配制处理用正己醇、E-2-己烯醛、正己醛母液，浓度均为50mmol/L，过滤除菌后4℃保存备用。处理具体方法为：按照1‰的体积比，添加上述母液于含1mg/L吲哚丁酸、30 g/L蔗糖的1/2 MS液体培养液中；按照10%（w:v）的接种量，接种黄芪不定根培养物，称量接种前、接种后培养瓶+培养液的质量，分别记为W₀₁、W₀₂（g），采用扣除法即W₀₂－W₀₁，计算得接种量（即起始生物量FW₀），25℃、100 rpm条件下，摇床震荡培养14天。同时，分别以正常培养物和添加1‰的50%乙醇的培养物作为正常对照和溶剂对照。

分别在处理后1、3、5、7、14天取样，每组每个取样点生物学重复数为3。采样时，首先转移根培养物至新鲜滤纸上，吸干培养液后，分成2份，一份转移至螺帽管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱，用于转录组文库构建；另一份置于60℃烘箱，烘干至恒重，用于化学分析。第14天的样品，吸干培养液后先称重（即生物量鲜重W₁₄），再分成2份进行后续样品处理。

实施例3：正己醇、E-2-己烯醛、正己醛处理对黄芪根培养物中黄芪皂苷Ⅳ和毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成积累的影响

利用前期建立的方法制备供试品溶液，色谱纯甲醇稀释100倍后，0.45 μm滤膜过滤，UHPLC-MS法测定黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量。

具体的色谱-质谱信息：Thermo Fischer Scientific Ultimate 3000 HPLC 色谱- Thermo Fischer Scientific Orbitrap Q Exactive Plus mass spectrometer质谱仪，选择性离子模式（target selected-ion-monitoring mode，SIM）定量检测，进样量：1 μL；分离用色谱柱：Syncronis C18 column (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm; ThermoFischer)。

色谱条件：流速为0.2 mL/min，柱温为30℃, and the gradie，流动相为0.1%甲酸（A）–乙腈（B），梯度洗脱条件：0~3 min, 100%A→80%A；3~8 min, 80%A→5%A; 8~11 min,5%A; 11~12min, 5%A→80%A; 12~20 min, 80%A。

质谱定性鉴别和定量分析用离子信息见表1。

表1：质谱定性鉴别和定量分析用离子信息

含量数据以“平均值±标准偏差”形式表示。SPSS软件进行差异显著性分析，阈值：P < 0.05。处理后7天时不定根中的黄芪皂苷Ⅳ含量分析结果如图2中A所示，结果表明，正己醇和E-2-己烯醛处理显著提高了根中黄芪皂苷Ⅳ的含量，分别比正常对照增加了81.67%、81.41%，对应的浓度分别为1.60±0.28 mg/g（干重）、1.60±0.14 mg/g。正己醇和E-2-己烯醛处理后培养不同时间的根培养物中黄芪皂苷Ⅳ含量分析结果如图2中B所示。结果表明，E-2-己烯醛处理1天时的根样品中的含量较高，为1.29±0.08 mg/g，正己醇处理组其他时间点样本中含量未见显著增加。概言之，E-2-己烯醛通过快速、迟缓两种方式促进黄芪皂苷Ⅳ的合成积累，正己醇通过迟缓诱导的方式促进黄芪皂苷Ⅳ的合成积累。

上述处理对取样时间点为7天时根培养物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成积累的影响见附图2中C。结果表明，正己醛和正己醇处理组含量显著高于正常对照，增幅分别为56.07%（0.57±0.08 mg/g）和65.18%（0.60±0.02 mg/g）。此外，50%乙醇处理即溶剂对照组含量（0.58±0.06 mg/g）亦显著高于正常对照，但与上述处理组间无显著差异。

50%乙醇（溶剂）、正己醛、正己醇处理对根培养物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷动态积累影响见附图2中D。从该图可以看出，除处理后7天培养物外，正己醛和正己醇处理还分别导致培养后3天、14天样本中含量显著增加，且增加幅度与培养后7天样本中增幅相近。总体而言，正己醛和正己醇促进根培养物中毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成积累作用明显有别于50%乙醇（溶剂对照）；就正己醛和正己醇诱导作用而言，正己醇诱导作用虽迟缓、但持续时间较长。

考虑到芒柄花苷是黄芪药材中的另一种重要的异黄酮类活性成分，与毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有共同的合成前体-芒柄花黄素，正己醛、E-2-己烯醛和正己醇处理对该活性成分合成积累如何影响，我们对不同时间点收集的上述处理及对照组根培养物中芒柄花苷含量进行了测定及数据分析。差异显著性分析针对不同时间点的所有处理及对照组进行，结果见附图3。从该图可以看出，上述处理14天时，正己醇处理组芒柄花苷含量显著高于其他组，达到最高，且除7天时间点外，随培养时间的延长，正己醇组中芒柄花苷含量持续增加。此外，上述处理14天时的根产量（鲜重）分析表明，正己醇处理还具有促进根生长的作用，以初始接种量为基准，生长率高达1.25±0.34，而E-2-己烯醛和正己醛处理组仅为0.77±0.09、0.25±0.11，正常对照和溶剂对照分别为0.46±0.09、0.35±0.20，提示正己醇促进根生长效应最佳。概言之，正己醇处理2周，兼具芒柄花苷合成积累促进、根产量提高等作用，且对两参数的促进效应均为最佳。

实施例4：与正己醇和E-2-己烯醛诱导有关的差异表达基因分析

综合考虑对活性成分合成积累及根生长的影响，正己醇效应最佳，E-2-己烯醛次之，正己醛最弱。基于此，我们选取处理后7天、14天的正己醇和E-2-己烯醛组根样品（100mg），利用RNAiso Plus试剂盒，根据试剂盒说明书进行总RNA提取与质量分析。

除上述处理外，样品还包括处理后7天、14天的正常对照和溶剂对照。质控合格的总RNA，干冰中保存快递至华大基因，进行mRNA富集与环状单股DNA文库构建（合同号：F19FTSNCKF1295）。BGISEQ-500测序平台进行高通量测序，获得原始reads。利用SOAPnuke（v1.4.0）、trimmomatic（v0.36）去除低质量reads；随后利用Trinity软件将获得的高质量reads组装为基因。利用BUSCO算法进行组装后基因质量评价，利用hmmscan（v3.0，http://hmmer.org）、Blast（v2.2.23，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、Blast2GO（https://www.blast2go.com）在线分析工具进行基因注释。利用软件Bowtie2将高质量reads比对至基因转录本，再利用RSEM（Random Swap Expectation Maximization）算法（v1.2.8）进行比对后转录本丰度计算，获得基因表达数据 [以FPKM（Fragments PerKilobase of exon model per Million mapped fragments）值表示]。利用PossionDis法进行差异表达基因分析，阈值设定为：Fold change≥2.00、False Discovery Rate（FDR）≤0.001。利用R软件中的pheatmap和phyper算法进行差异表达基因的GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集，阈值设定为Q≤0.5。

目前，测序获得的原始reads已提交至NCBI，登录号：PRJNA688411。不同FPKM阈值的基因表达分布图见附图4。就表达水平FPKM≤1的基因而言，14天时的正常对照、溶剂对照和E-2-己烯醛处理组基因数量较7天时的高，而正己醇处理组基因表达分布相反，14天时FPKM≤1的基因数量较低。就表达水平1＜FPKM＞10的基因而言，14天时的正常对照、溶剂对照和E-2-己烯醛处理组基因数量较7天时的低，而正己醇处理组相反，14天时的基因数量较高。该结果提示，正己醇诱导基因表达分布明显不同于E-2-己烯醛，随着培养时间的延长，1＜FPKM＞10的基因数量增加，所占比例增大。

不同组别培养时间特异性表达基因数据统计结果见表2。从表中数据可以看出，正己醇处理组14天对应的特异表达基因数量增加了，从7,313条增加至9,579条，而正常对照和溶剂对照组降低，E-2-己烯醛组两时间点特异表达基因数量几近相等。该分析进一步说明正己醇诱导基因表达模式有别于E-2-己烯醛。

表2：培养时间特异性表达基因数据统计结果

分别以7天、14天的溶剂对照为参照，获得与正己醇和E-2-己烯醛诱导有关的差异表达基因，并进行GO和KEGG富集，结果见附图5。除术语“transcription regulatoractivity”、“multicellular organismal process”外，7天的E-2-己烯醛处理组GO富集得各条术语中的差异表达基因数量最多。除途径“metabolism of terpenoids andpolyketides”、“membrane transport”、“signal transduction”、“environmentaladaptation”外，7天的E-2-己烯醛处理组KEGG富集获得pathway的差异表达基因数量亦最多。正己醇诱导获得的差异表达基因富集结果明显有别于E-2-己烯醛，除GO术语“biological regulation”、“multicellular organismal process”外，14天时富集为“biological process”的差异表达基因数量与7天时的数量接近或更低；而14天时富集为“molecular function”的差异表达基因数量较7天时的高。此外，正己醇诱导产生的差异表达基因中，14天时富集至代谢途径“metabolism of terpenoids and polyketides”的数量最高。因此，差异表达基因谱为正己醇诱导次生代谢作用迟缓、但更为有效且作用持久提供了转录水平上的实验支撑。

实施例5：正己醇促进黄芪不定根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成积累作用机制研究

采用实施例1相同方法，培养获得蒙古黄芪不定根，进行第二轮的正己醇诱导处理。同时以正常培养物为对照，培养6周，培养条件同实施例1，而接种量降低为5%。分别在培养的1、2、3、4、5、6周时，收集样本，称重后分成2份，分别用于基因表达、毛蕊异黄酮和芒柄花黄素含量测定。每组每个时间点的生物学重复数为3。

利用实施例4方法，进行总RNA提取。以1 μg总RNA为模板，利用PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis kit合成cDNA，灭菌后高纯水稀释5倍，用于qPCR。利用TBGreen Premix Ex TaqTM Ⅱ kit (Tli RNaseH Plus)，在CFX96TM Real-Time System &C1000 Touch Thermal Cycler仪进行基因表达分析。qPCR反应体系组成如表3。

表3：qPCR反应体系组成

扩增反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s→52~58℃ 30 s→72℃ 30 s 循环40次；95℃ 10 s，65℃ 5s后升温至95℃（升温速率：0.5℃/s）。除生物学重复外，每个样品进行4次技术重复。与毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成有关的基因及其引物信息见表4，其中COR413-PM1为内参对照。

表4：与毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成有关的基因及其引物信息

基于Ct值，进行基因表达定量，利用2^-△△CT 法进行基因表达分析，并以培养起始时根培养物中的基因表达作为标准。采用实施例2方法进行数据分析，结果见附图6。与对照相比，正己醇处理明显下调了如下时间点基因的表达：（1）培养3、5周时4CL（4-香豆酰：辅酶A连接酶），（2）培养3、5、6周时IFS1.2（异黄酮合成酶1.2），（2）所有取样点样本中UCGT1（毛蕊异黄酮葡萄糖基转移酶1）。此外，正己醇处理显著上调了2周时样本中的UCGT2（毛蕊异黄酮葡萄糖基转移酶2）和CGMT（毛蕊异黄酮葡萄糖苷丙二酰基转移酶）的表达，增幅分别是对照组的43.65%和5.43倍，该结果与培养2周时显著增加的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量结果一致。基因表达分析结果还表明，正己醇处理组5周时样本中IFS1.1（异黄酮合成酶1.1）表达水平显著上调。

采用实施例3方法制备供试品溶液，采用实施例3色谱质谱条件UHPLC-MS法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷合成前体-毛蕊异黄酮、芒柄花黄素的含量，定量用离子信息见表1。其中，芒柄花黄素含量是以培养1周时的对照组芒柄花黄素色谱峰面积平均值为标准，计算得相对含量。采用实施例3方法进行数据分析，结果见表5、图7。与对照相比，正己醇处理组1周时根培养物中毛蕊异黄酮和芒柄花黄素含量显著降低，处理组2周时培养物中芒柄花黄素含量亦显著降低。该结果与下调的参与毛蕊异黄酮葡萄糖苷骨架化合物合成的4CL、IFS1.2表达一致。提示正己醇通过下调毛蕊异黄酮葡萄糖苷骨架化合物芒柄花黄素和毛蕊异黄酮的合成、上调毛蕊异黄酮糖基化和及其糖苷酰基化修饰的方式促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷的合成与积累。

表5 正己醇处理对黄芪不定根中芒柄花黄素和毛蕊异黄酮合成积累及根生长的影响

此外，分析结果还表明正己醇处理组培养6周的根中芒柄花黄素含量远高于对照组，增幅达45.93倍。该结果与5周时正己醇处理组中显著上调的IFS1.1表达一致，提示正己醇在培养5-6周时亦发挥着促进作用。因此，该部分工作从基因表达和代谢物水平揭示了正己醇促进蒙古黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷合成积累的作用机制，同时也提示正己醇在处理5-6周发挥着促进其合成前体-芒柄花黄素合成的作用。该结果也进一步肯定了正己醇迟缓、但作用持久的促进作用特征。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献：

[1] 王朋. 柴胡挥发油提取与富集工艺研究[D]. 山东中医药大学,2016.

[2] 赵爱红,杨鑫宝,杨秀伟,陶海燕,于俊林,王文全.兴安白芷的挥发油成分分析[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(05): 763-768.

[3] 汪洪武,刘艳清,严子军,韦寿莲,叶金青.不同方法提取鸦胆子挥发油化学成分的GC-MS分析[J].精细化工,2011,28(07):668-670，697.

[4] 刘新湘. 解表类中药挥发油化学成分的GC/MS研究[D].中南大学,2007。

Claims (6)

1.正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，其特征在于：所述正己醇处理方法为：100 mmol/L正己醇水溶液无菌滤膜过滤除菌后，4℃保存即为正己醇诱导因子；

具体应用方法为：按照体积比为0.5‰的添加量，添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，再按照质量体积比为10%的接种量接种黄芪根培养物，25℃、100 rpm摇床培养1-6周。

2.根据权利要求1所述的正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，其特征在于：添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，接种黄芪根培养物，摇床培养2周。

3.根据权利要求1所述的正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，其特征在于：所述多活性成分为毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷，添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，接种黄芪根培养物，摇床培养2周。

4.根据权利要求1所述的正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，其特征在于：所述多活性成分为黄芪皂苷Ⅳ，添加正己醇诱导因子于黄芪不定根液体培养基中，接种黄芪根培养物，摇床培养1周。

5.根据权利要求1所述正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，其特征在于：所述黄芪不定根液体培养基为：含1 mg/L吲哚丁酸、30 g/L蔗糖的1/2MS液体培养液。

6.根据权利要求1所述正己醇在诱导黄芪不定根生长以及黄芪多活性成分合成积累中的用途，其特征在于：所述黄芪为蒙古黄芪。

Images