CN113508731B - 一种amf菌剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明AMF菌剂为由幼套球囊霉(Glomus etunicatum)孢子制成的菌剂，通过本发明限定的方法获得的菌剂和接种方法栽培的三七，无论是物理方面的生长，还是化学方面的包括皂苷等活性成分的积累，均获得了良好的效果，值得推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然真菌的应用，尤其涉及AMF菌剂的制备及在促进三七生长和皂苷积累中的应用。
背景技术
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)，又名田七、参三七，为五加科人参属多年生草本植物，是我国传统的名贵中草药，也是云南省最具特色的道地药材，具有止血、散瘀、消肿、定痛等显著临床功效。皂苷是三七中最主要的活性物质，主要包括属于20(S)-原人参二醇(20(S)-protopanaxadio)型的人参皂苷Rb1和20(S)-原人参三醇型的人参皂苷Rg1和三七皂苷R1，均为达玛烷型四环三萜皂苷。
丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是功能相对明确、研究最多、最早的一大类古老内生真菌，在80％以上的陆生植物中均有定殖，主要包括球囊菌门(Glomeromycota)中的多孢囊霉目(Diversisporales)、原囊霉目(Archaeosporales)、球囊霉目(Glomerales)和类球囊霉目(Paraglomerales)。AMF不能被纯培养，其孢子需借助植物根系进行繁殖和扩培。AMF在增强药用植物营养吸收、促进生长、提高胁迫耐性及增加次级代谢产物合成方面发挥着重要作用。研究显示，将AMF根内球囊霉(Rhizophagusintraradices)、不规则根内球囊霉(R.irregularis)、光壁无梗囊霉(Acaulosporalaevis)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、细根内球囊霉(R.clarus)、摩西球囊霉(G.mosseae)、集球囊霉(G.fasciculatum)、巨孢囊霉(Gigaspora sp.)、管柄囊霉(Funneliformis mosseae)孢子制成单一或混合接种菌剂，接种在青蒿(Artemisiaannua)、藏红花(Crocus sativus)、嘉兰(Gloriosa superba)、薄荷(Mentha crispa)、山药(Dioscorea)、当归(Angelica archangelica)、贯叶连翘(Hypericum perforatum)根部，发现青蒿素、藏红花苦甙、藏红花素Ⅱ、嘉兰秋水仙素、薄荷精油、山药多酚、香豆素、单倍萜、总黄酮、总酚、金丝桃素和伪金丝桃素等活性物质含量增加1至10余倍。
由于三七对生长环境要求高，且易受到根腐病、病害等连作障碍的影响，其产量和质量极不稳定，通过提高三七须根AMF定殖率，增强AMF的诱导刺激，从而促进三七的生长和皂苷的积累。
发明内容
本发明提供了一种具有高侵染水平的在三七须根接种AMF的方法及在促进三七和皂苷积累中的应用，利用本发明所提供的菌剂及接种方法，可以用于促进三七等药用植物的生长和活性物质的积累。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种AMF菌剂(促进三七生长的含有AMF孢子的玉米根际土壤)的制作和三七须根接种方法，所述AMF菌剂为由幼套球囊霉(Glomus etunicatum)孢子制成的菌剂。
具体的，本发明提供了一种AMF菌剂和/或用于促进三七生长的根际土壤的制备方法，包括以下步骤：
(1)在半开放式花盆种植模式中采用玉米根系完成AMF孢子的扩繁，栽培基质采用混合土壤基质，所述的混合土壤基质为淤泥土、胶泥土、蛭石和石英砂；
(2)栽培结束后，采用湿筛法挑取AMF孢子，镜检孢子形态，确认其为幼套球囊霉，且计算平均孢子含量，要求根际土壤中AMF孢子的数量达到30～40/g，即得含有AMF孢子的玉米根际土壤。
进一步的，所述的混合土壤基质中淤泥土:胶泥土:蛭石:石英砂质量比＝4:3:2:1。
进一步的，在使用前采用2段式间隔式湿热灭菌方式对混合土壤基质进行灭菌。
进一步的，所述的采用玉米根系完成AMF孢子的扩繁包括将经表面消毒的玉米种子栽种于混合土壤基质中，栽培处理3个月的步骤。
本发明进一步提供了三七须根高浸染率接种方法，具体方法如下：
(1)将土壤转栽至三七栽培基质中，所述的三七栽培基质为营养土、深层黄土和蛭石；
(2)将所制备的含有AMF孢子的玉米根际土壤放置在三七须根部位；
(3)待三七生长稳定后，在其周围播撒三叶草种子；
(4)观察三七须根AMF定殖率，定殖率大于40％以上的幼苗即为菌根化幼苗。
进一步的，所述的土壤用无菌水洗净，喷洒0.01％的苯菌灵抑制三七根部其他原有真菌的生长繁殖。
进一步的，所述的三七栽培基质为营养土:深层黄土:蛭石质量比＝5:4:1。
进一步的，所述的含有AMF孢子的玉米根际土壤为30g。
进一步的，所述的三叶草的种植密度要求待三叶草长大后可以完全遮蔽土壤。
进一步的，栽培周期为30天。
进一步的，所述的定殖率采用碱解离——酸性品红染色法，40倍镜条件下测得。
本发明还提供了提高三七株高、总鲜重、地下部分鲜重的方法，采用上述的接种方法培三七。
本发明还提供了提高三七根部皂苷含量积累的方法，采用上述的接种方法栽培三七。
本发明还提供了AMF菌剂的应用，其用于促进三七生长和皂苷积累中的应用。
本发明进一步提供了所述的接种方法在促进三七生长和皂苷积累中的应用。
附图说明
图1丛枝菌根真菌(AMF)侵染三七新生须根情况及典型形态结构
注：a，三七新生须根AMF泡囊群；b，c，d，AMF典型形态结构。A，arbuscules，丛枝；H，hypha，菌丝；V，vesicles，泡囊
图2：接种幼套球囊霉对三七生长的影响
图3：接种幼套球囊霉对三七生物量的影响
注：*表示AMF处理组与对照组之间差异显著，P<0.05；**表示AMF处理组与对照组之间差异显著，P<0.01
图4：接种幼套球囊霉对三七皂苷含量积累的影响
注：*表示AMF处理组与对照组之间差异显著，P<0.05
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。下述实施例中所使用的各原材料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
实施例1
一种AMF菌剂的制备及其在促进三七生长和皂苷积累中的应用方法，方法如下：
实验材料 三七幼苗为采自云南省文山州文山县云南文山苗乡三七实业有限公司规范化种植基地的一年生三七幼苗(前期实验调查显示，超过93％的一年生三七幼苗无AMF定殖)，要求生长一致、无病害、长势良好。三七苗鉴定由云南中医药大学赵荣华教授完成。所用AMF为幼套球囊霉(Glomus etunicatum)，实验室自有，其存在形式为保存于土壤基质中的孢子。其孢子形态已经显微镜镜检确认，所侵染的玉米根系经PCR扩增后确证所用AMF为幼套球囊霉。
2、AMF孢子扩繁 由于AMF不能被纯培养，需将从根际土壤中收集的AMF孢子在玉米活体系中进行扩繁。本发明所用菌土为实验室固有保存菌土。
2.1幼套球囊霉孢子的挑取和形态鉴定方法：将根际土样阴干，准确称取50g于500mL烧杯中；加水至300～350mL，浸泡过夜；磁力搅拌10-20min，得土壤溶液；过20、100、140、200目分样筛，用自来水反复冲洗干净，最后将残留物冲洗到200mL的烧杯中，静置5min，倒入500mL梨形分液漏斗，静置15min；打开底部活塞，排水，剩约40mL，从上口倒入铺有滤纸片的布氏漏斗中，抽滤、冲洗三次；转移至直径9cm培养皿中；解剖镜下观察，根据形态，用解剖针将完整的、健康的孢子、孢子果挑取到洁净湿润滤纸上。幼套球囊霉孢子形态为：孢子圆形或近圆形，淡黄色或黄色，有2层孢壁，未成熟后垣孢子的外壁有完整的连孢菌丝，成熟后脱落。
2.2AMF孢子扩繁方法：扩繁体系为活玉米根系；在半开放式花盆种植模式中完成；栽培基质采用混合土壤基质，具体为，淤泥土:胶泥土:蛭石:石英砂＝4:3:2:1(质量比)，混匀；采用2段式间隔式湿热灭菌方式，装于花盆中，将经表面消毒的玉米种子栽种于基质中，栽培处理3个月。要求根际土壤中AMF孢子的数量达到30～40/g。
2.3幼套球囊霉分子鉴定方法以AMF侵染后的新鲜玉米根系为材料，采取CTAB法提取玉米根系和内生真菌总DAN，作为扩增模板，以真菌扩增通用引物作为反应引物(3NDF：5’-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3’；V4_euk_R2：5’-ACGGTATCT(AG)ATC(AG)TCTTCG-3’)，采用2×Pfu PCR MasterMix酶进行PCR扩增，反应体系为：PCR扩增程序为预变性：94℃、4min；变性94℃、30s，退火：53℃、40s，延伸：72℃、1min，35个循环；后延伸：72℃、7min；4℃保存。PCR酶为2×Pfu PCR MasterMix。之后将扩增产物送生物测序公司进行测序分析，测序结果与NCBI DQ273793聚为一枝，证实染玉米根系的AMF为幼套球囊霉。
3、组别设计本发明共设1个处理组和对照组；处理组为用幼套球囊霉孢子接种的三七，并在周围播撒三叶草种子，对照组是以灭活幼套球囊霉孢子处理的三七，每个处理设10个重复，每个重复含4-5株三七幼苗，即处理组和对照组分别含40-50棵三七。
4、接种前预处理首先准备三七栽培基质，配方为：营养土:深层黄土:蛭石＝5:4:1(质量比)，混合均匀后，采用2段式间隔式湿热灭菌方式进行灭菌处理，待完全恢复室温后，转移至用75％酒精消毒后的花盆中，每盆700g，保证装填至花盆1/2～2/3处，加无菌水完全浸透，放置2晚，备用；之后将三七根部土壤小心处理干净后，用去离子水洗净，喷洒0.01％的苯菌灵来抑制三七根部其他真菌的生长繁殖，之后迅速移至栽培基质中；接种菌剂需提前放入栽培基质中；栽培条件为：白天用遮阳网避光(避免强光照射)，温度28℃，晚上温度22℃，相对湿度85％～95％。间隔4d浇施1次1/4Hoagland营养液，Hoagland营养液配方如下：0.6mmol/L NH4NO3，1.0mmol/L KNO3，0.2mmol/L(NH4)H2PO4，1.2mmol/L Ca(NO3)2，0.12mmol/L MgSO4，1.12×10-2mmol/L Fe-EDTA(II)，1.1×10-3mmol/L MnCl2，0.6×10- 2mmol/LH3BO4，1.0×10-4mmol/L ZnSO4，4×10-5mmol/L CuSO4，2.5×10-5mmol/L(NH4)6Mo7O24，pH值调整至6.5。
5、接种及管理按上述设计，将AMF接种菌剂提前放置在处理后的栽培基质中，约在根系到达以外部位的1-2cm处，每棵三七根系周围放置30g接种菌剂(约含900～1200个AMF孢子)。接种后三七培养条件如上。每两个月取根样1次，采用碱解离-酸性品红染色法检测AMF在三七根内定殖情况，每个处理随机选取10-20段、1-2cm的须根制成片子，采用十字交叉法在光学显微镜下观察、拍照，统计AMF定殖率，具体如下：1)制片将洗净的根样置于试管中，加10％KOH溶液，于水浴中煮至根样半透明且有小气泡，反复清洗后移至平板中，加乳酸甘油中和10min；放置在载玻片上，滴加适量0.01％酸性品红乳酸甘油溶液，在酒精灯下加热至冒白烟，重复三至五次，倾去多余的品红溶液，斜置载玻片，缓慢滴加乳酸甘油溶液脱色至无红色液体流出。剪取6条合适大小根样置载玻片上整齐排列，滴加少量乳酸甘油溶液，制片。2)定殖率统计将成片置于生物显微镜下观察AMF典型结构，统计包含典型结构的视野数；AMF典型结构包括丛枝、泡囊、菌丝、菌丝圈。
6、三七生物量的测定：株高的测定：用直尺直接测量三七芦头至顶部的长度，单位：cm；三七总鲜重及根鲜重的测定：将三七洗净，用滤纸把表面的水吸干后置于电子天平上称重(精确至0.01g)。
7、三七皂苷含量的测定：
7.1色谱条件
按照《中国药典》2010版，采用高效液相色谱法测定三七的皂苷含量。色谱柱：Agilent Zorbar SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-水；按表2进行梯度洗脱；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长：203nm；进样量：10μL。
表1梯度洗脱程序
7.2对照品溶液与供试品的制备
三七根样的处理：按照试验组别的设计，对栽培的三七进行收样，将三七根用超纯水水清洗干净，50℃恒温鼓风干燥120h后，用高速粉碎机打粉，待用。
精密称取三七总皂苷对照品0.0381g，置于25mL容量瓶内，用70％的甲醇定容至刻度，得到三七总皂苷对照品溶液浓度1.524mg/mL。精密称取三七样品0.6g于25mL容量瓶，加适量70％甲醇并置于超声仪上超声提取45min，放冷，定容至刻度，摇匀，静置后用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品。
7.3线性关系考察
精密吸取三七总皂苷对照品液4、6、8、10、12μL，根据上述色谱条件测定各峰面积，以进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，得出三种皂苷的回归方程。三七皂苷R1：y＝269.22x+2.1747，R2＝0.9985，线性范围：0.49×10-3～1.48×10-3；人参皂苷Rg1：y＝339.57x+2.8578，R2＝1，线性范围：1.76×10-3～5.28×10-3；人参皂苷Rb1：y＝272.39x+13.19，R2＝1，线性范围：1.85×10-3～5.56×10-3。
7.4精密度考察
精密称取三七样品0.6g，按上述方法制备供试品，连续进6次样，每次10μL，记录各皂苷的含量，计算各皂苷含量的相对标准偏差RSD值，其中，三七皂苷R1的RSD值为1.38％，人参皂苷Rg1的RSD值为0.70％，人参皂苷Rb1的RSD值为0.25％，表明该方法精密性良好。
7.5稳定性考察
精密称取三七样品0.6g，按上述方法制备供试品，分别在0、4、8、12、16、24h按3.9.1的色谱条件进行测定，每次进样10μL，记录各皂苷的含量，计算各皂苷含量的相对标准偏差RSD值，其中三七皂苷R1的RSD值为2.10％，人参皂苷Rg1的RSD值为2.20％，人参皂苷Rb1的RSD值为0.76％，表明该方法稳定性良好。
7.6重复性考察
称取三七样品6份，按上述方法制备供试品、进样，记录各皂苷的含量，其中三七皂苷R1的RSD值为1.18％，人参皂苷Rg1的RSD值为1.93％，人参皂苷Rb1的RSD值为2.09％，表明该方法重复性良好。
7.7加样回收率考察
按照按上述方法制备供试品，用移液枪移取上述制备好的样品0.6mL，再移取三七总皂苷对照品液0.6mL混合均匀后进高效液相色谱仪，其色谱条件同上，对照品浓度为1.672mg/mL(其中R1：7.4％；Rg1：26.3％；Rb1：27.7％)，记录各皂苷的峰面积，计算回收率以及相对标准偏差RSD值。结果显示，三七皂苷R1的平均回收率为97.70％，RSD值为0.51％，人参皂苷Rg1的平均回收率为108.14％，RSD值为0.27％，人参皂苷Rb1的平均回收率为103.60％，RSD值为0.20％。
8、数据分析采
方差分析用软件SPSS 21.0；数据图采用软件Sigmaplot 11.0完成。
结果与分析
由图可知，接种AMF幼套球囊霉可以显著促进三七的生长，与对照组相比，在总鲜重、鲜根重方面均呈极显著差异，在株高方面呈显著差异。AMF对总鲜重、鲜根重和株高的生长贡献率可以达到58.92％、136.02％和44.20％，从中可知，接种AMF对三七新鲜根重的促生效果尤为显著。
由图可知，接种AMF在增加三七皂苷含量积累方面效果显著，与对照组相比均差异显著，其对三七根部总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量积累贡献率分别为18.21％、29.56％、19.55％和14.13％。
结论与讨论
在三七根部接种AMF幼套球囊霉(Glomus etunicatum)，并保持高水平定殖率，可以显著促进三七的生长和三七皂苷的积累。
AMF、DSE是植物根系中最主要的两大类共生内生真菌，在提高宿主抗逆性、促进植物生长、增强代谢产物积累等方面发挥着重要作用。众多研究显示，人参、青蒿、藏红花、重楼、滇黄精、山药、当归等药用植物活性物质含量与AMF种类和定殖密度密切相关，并可响应AMF的诱导而增加积累。发明人所在的团队前期调查了云南省文山州4个样地的三七根AMF定殖情况，结果显示，4个样地均有着较高的AMF定殖率，平均定殖率范围为25.18～32.07％；相关性分析显示，三七皂苷R1与AMF及典型结构定殖率之间具有较高的相关性，呈显著相关；其次为人参皂苷Rb1、总皂苷；而人参皂苷Rg1与AMF及其典型结构定殖率之间的相关性较低。此外，对文山和马关两个样地的三年生三七根内生真菌进行多样性分析，发现三七根内生真菌物种相对丰富，OTU数量分别为205和198，相同OTU数为147，且都含有球囊菌门真菌，即AMF真菌所属门。但目前关于三七等药用植物生长和功效成分积累响应AMF诱导的调控机制仍不清楚，需进一步研究。
最后，在文章撰写时发现，虽然现有技术有采用真菌技术栽培三七的报道，例如CN201110366829(下称参考文献)，但是其与本申请存在明显区别：
在方法层面：1)材料：参考文献中用的是种子萌发。我们所用的是幼苗。这就决定了在今后的应用当中，我们的方案主要针对三七种植，参考文献更偏重三七育苗。
2)参考文献所用菌种为摩西球囊霉，我们采用的则是幼套球囊霉。
3)在提高AMF定殖率上，我们有针对性的使用了根系较为发达的三叶草进行混合种植。
4)为了确认定殖的AMF为所添加的菌种，我们进行了形态学分子生物学的鉴定。
5)因为材料的差异，与参考文献相比，在接种方法方面存在着较大的差异。
在效果层面：
我们的实验结果显示，接种幼套球囊霉对三七根部总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量积累贡献率分别为18.21％、29.56％、19.55％和14.13％；对总鲜重、鲜根重和株高的生长贡献率可以达到58.92％、136.02％和44.20％。这个结果均显著高于参考文献的实验效果。
综上，本发明AMF菌剂为由幼套球囊霉(Glomus etunicatum)孢子制成的菌剂，通过本发明限定的方法获得的菌剂和接种方法栽培的三七，无论是物理方面的生长，还是化学方面的包括皂苷等活性成分的积累，均获得了良好的效果，值得推广使用。
Claims (3)
1.一种AMF菌剂在促进三七生长和皂苷积累中的应用方法，方法如下：
1）实验材料：三七幼苗为采自云南文山苗乡三七实业有限公司规范化种植基地的一年生三七幼苗，所用AMF为幼套球囊霉，要求存在形式为保存于土壤基质中的孢子；其孢子形态已经显微镜镜检确认，所侵染的玉米根系经PCR扩增后确证所用AMF为幼套球囊霉；
2）AMF孢子扩繁：由于AMF不能被纯培养，需将从根际土壤中收集的AMF孢子在玉米活体系中进行扩繁；
2.1）幼套球囊霉孢子的挑取和形态鉴定方法：将根际土样阴干，准确称取50g于500mL烧杯中；加水至300～350mL，浸泡过夜；磁力搅拌10-20min，得土壤溶液；过20、100、140、200目分样筛，用自来水反复冲洗干净，最后将残留物冲洗到200mL的烧杯中，静置5min，倒入500mL梨形分液漏斗，静置15min；打开底部活塞，排水，剩约40mL，从上口倒入铺有滤纸片的布氏漏斗中，抽滤、冲洗三次；转移至直径9cm培养皿中；解剖镜下观察，根据形态，用解剖针将完整的、健康的孢子、孢子果挑取到洁净湿润滤纸上；幼套球囊霉孢子形态为：孢子圆形或近圆形，淡黄色或黄色，有2层孢壁，未成熟后垣孢子的外壁有完整的连孢菌丝，成熟后脱落；
2.2）AMF孢子扩繁方法：扩繁体系为活玉米根系；在半开放式花盆种植模式中完成；栽培基质采用混合土壤基质，具体为，按质量比计，淤泥土:胶泥土:蛭石:石英砂＝4:3:2:1，混匀；采用2段式间隔式湿热灭菌方式，装于花盆中，将经表面消毒的玉米种子栽种于基质中，栽培处理3个月；要求根际土壤中AMF孢子的数量达到30～40/g；
2.3）幼套球囊霉分子鉴定方法以AMF侵染后的新鲜玉米根系为材料，采取CTAB法提取玉米根系和内生真菌总DNA，作为扩增模板，以真菌扩增通用引物作为反应引物3NDF：5’-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3’；V4_euk_R2：5’-ACGGTATCT(AG)ATC(AG)TCTTCG-3’，采用2×PfuPCR MasterMix酶进行PCR扩增，反应体系为：PCR扩增程序为预变性：94℃、4min；变性94℃、30s，退火：53℃、40s，延伸：72℃、1min，35个循环；后延伸：72℃、7min；4℃保存；PCR酶为2×Pfu PCR MasterMix；之后将扩增产物送生物测序公司进行测序分析，测序结果与NCBIDQ273793聚为一枝，证实侵染玉米根系的AMF为幼套球囊霉；
3）组别设计：共设1个处理组；处理组为用幼套球囊霉孢子接种的三七，并在周围播撒三叶草种子，每个处理设10个重复，每个重复含4-5株三七幼苗，即处理组含40-50棵三七；
4）接种前预处理：首先准备三七栽培基质，配方为：按质量比计，营养土:深层黄土:蛭石＝5:4:1，混合均匀后，采用2段式间隔式湿热灭菌方式进行灭菌处理，待完全恢复室温后，转移至用75％酒精消毒后的花盆中，每盆700g，保证装填至花盆1/2～2/3处，加无菌水完全浸透，放置2晚，备用；之后将三七根部土壤小心处理干净后，用去离子水洗净，喷洒0.01％的苯菌灵来抑制三七根部其他真菌的生长繁殖，之后迅速移至栽培基质中；接种菌剂需提前放入栽培基质中；栽培条件为：白天用遮阳网避光，温度28℃，晚上温度22℃，相对湿度85％～95％；间隔4d浇施1次1/4Hoagland营养液，Hoagland营养液配方如下：0.6mmol/L NH4NO3，1.0mmol/L KNO3，0.2mmol/L(NH4)H2PO4，1.2mmol/L Ca(NO3)2，0.12mmol/L MgSO4，1.12×10-2mmol/L Fe-EDTA(II)，1.1×10-3mmol/L MnCl2，0.6×10-2mmol/LH3BO4，1.0×10- 4mmol/L ZnSO4，4×10-5mmol/L CuSO4，2.5×10-5mmol/L(NH4)6Mo7O24，pH值调整至6.5；
5）接种及管理：按上述设计，将AMF接种菌剂提前放置在处理后的栽培基质中，在根系到达以外部位的1-2cm处，每棵三七根系周围放置30g接种菌剂；接种后三七培养条件如上；每两个月取根样1次，采用碱解离-酸性品红染色法检测AMF在三七根内定殖情况，每个处理随机选取10-20段、1-2cm的须根制成片子，采用十字交叉法在光学显微镜下观察、拍照。
2.权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述方法还能够提高三七株高、总鲜重、地下部分鲜重。
3.权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述方法能够提高三七根部皂苷含量积累。
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|---|
| 丛枝菌根侵染强度与二年生三七生物量和药效成分含量的相关性研究;曾燕等;中国现代中药(第12期);第1253-1257页 * |
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