CN108094047B - 一种适合蝙蝠蛾幼虫感染母种菌株及北冬虫夏草栽培方法 - Google Patents
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Abstract
一种适合蝙蝠蛾幼虫感染母种菌株及北冬虫夏草栽培方法，该菌株为北冬虫夏草广A8号‑6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2017693；采用无创伤感染技术感染幼虫，感染5‑7天，幼虫身体体表长出菌丝，8‑10天经体表气孔肛门进入体内吸收营养；同时采用幼虫自食虫草菌法感染技术，大量血氧带着虫草孢子进入幼虫各个器官，20‑30天将幼虫全身长透，开始进入幼虫僵硬期，60‑80天后进入转色期，再进行光照诱导和定向培养，100‑150天进入出草期。经检测其子实体营养与药用成份与天然冬虫夏草不相上下，正品率达到85%，效益巨大。
Description
技术领域
本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种适合蝙蝠蛾幼虫感染母种菌株及虫草蝙蝠蛾幼虫为寄主人工栽培北冬虫夏草方法。
背景技术
冬虫夏草属子囊菌门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，是一营腐寄生菌，它是子囊菌中一个大属，全世界已知此属的有350多种，我国已知有58种，在我国已知的58种，由于它寄主不同，又有不同物名。
众所周知，世界上最珍稀昂贵菌类就是冬虫夏草，市场销价每公斤近40-60万元人民币以上，并每年还在以20-30%速度不断上涨，冬虫夏草的畅销在产区造成采挖过量，资源逐年减少，已到了频临灭绝境地，有专家预测再不给予保护，20年后将会进入灭绝阶段，随着人类生活不断提高，这种高档营养品、药品需求量将会是越来越大。因此，人们下在努力地探索其的生长规律，想方设法地通过人工栽培产品来替代这野生资源。
国内很多地方采用大米、小麦、玉米等为培养基像生产大宗食用菌一样待菌丝长透后出草就是大型食用菌子实体叫虫草花，由于没有昆虫寄主，外形根本不像虫草，也不是真正意义上的虫草，另外还有一些食用菌专家用蚕蛹，蚕幼虫试验性生产少量北虫草，采用创伤感染法感染幼虫或蚕蛹，大部分感染其它细菌，但易得败血病，幼虫僵化率很低，很难形成大规模生产，最多只是小试验而已。
北冬虫夏草是虫草属中一个模式种，与天然虫草极其相似的一个种，这个种极有可能成为野生冬虫夏草替代种。
上世纪80年代，申请人就认为北冬虫夏草天然虫草的替代种，特别是它的营养及药用成份基本相似，产生了尝试用人工饲养较多的家蚕幼虫来替代蝙蝠蛾幼虫来生产北冬虫夏草的技术构思，因此，从80年代初开始试验，先用创伤感染法感染家蚕幼虫，但这种感染法伤口上易感染败血病等，造成正品率低，大多数幼虫都死亡腐烂，失败告终。几年来经上百次试验，正品率只能在10-20%左右之间，而且幼虫满身长草，完全不像天然冬虫夏草，在停止不前时，突然想到是否是创伤接种口感染了其它细菌，造成失败。因此，试着不用创伤感染，而让它自然感染，果然，下批次不用创伤感染成品僵化率有所提高，进而想到再用一个什么载体进行二次感染，成品率不断提高，后又在僵虫转色期间采用光照定向法诱导出草，结果该批次幼虫尸体头部长出一根子座高大粗壮。到了2010年，随着申请人尝试的人工室内饲养蝙蝠蛾幼虫取得了成功，该栽培技术基本定型，到2015年，蝙蝠蛾幼虫栽培北冬虫夏草技术已基本成熟。
现有技术出现了《原生态冬虫夏草高产及育种的方法》，CN201210058897.4公开了： 1.制备孢子悬浮液， 2.菌种培养基：多性蛋白胨10克、葡萄糖30克、酵母膏1克、硫酸镁0.55克、磷酸二氢钾1克、琼脂20克、生长素5毫升、水1000毫升。3.每天晚上8点或阴天把孢子悬浮液和培养基喷洒在活虫体上每天2次，共喷洒3天，增强蝙蝠蛾幼虫接受冬虫夏草的菌种机率，且提高成活率5倍，胞子侵入虫体后萌发，虫钻入土中，冬季形成菌核，夏季菌核前端生出子座穿出土壤形成小草，产出优质高产的冬虫夏草，给全世界人民带来原生态冬虫夏草名贵中药材更大的资源。其中也涉及蝙蝠蛾幼虫接受冬虫夏草的菌种的问题，可见，蝙蝠蛾幼虫栽培北冬虫夏草是一种趋势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合蝙蝠蛾幼虫感染母种菌株及虫草蝙蝠蛾幼虫为寄主人工栽培北冬虫夏草方法。
本发明的适合蝙蝠蛾幼虫感染母种菌株，该菌株为北冬虫夏草（Cordycepsmilitaris）广A8号-6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏时间：2017年11月13日，保藏编号CCTCC NO：M2017693；该菌株从天然野生北虫草采用子座分离法分离到第一代母种编上号，然后再将每支母种做成液体栽培种，找到一支适合蝙蝠蛾幼虫感染，经小试中试实验，发现6号适合蝙蝠蛾幼虫感染。
本发明的虫草蝙蝠蛾幼虫为寄主人工栽培北冬虫夏草方法，采用无创伤感染技术进行北冬虫夏草菌感染幼虫，感染5-7天，幼虫身体体表长出菌丝，8-10天经体表气孔肛门进入体内吸收营养；同时采用幼虫自食虫草菌法感染技术，伴随幼虫吃进虫草菌，幼虫吃进的带有虫草菌的营养载体也在肚内大量繁殖；随着幼虫的活动，大量血氧带着虫草孢子进入幼虫各个器官20-30天将幼虫全身长透，开始进入幼虫僵硬期，60-80天后进入转色期，再进行光照诱导和定向培养，100-150天进入出草期。
所述无创伤感染技术，即幼虫体无伤口，自然感染，技术方法为：将经过逐条消毒过幼虫，放入净化接种台，用紫外线消毒灭菌5-10分钟，用毛笔沾上液体种，搽幼虫体多遍，尤其是幼虫气孔和肛门处，再放入已长菌丝的液体种培养载体上，自行再沾上载体上菌丝，完成一次无创伤感染。
在完成无创伤一次感染后，根据感染情况，再进行二次或多次无创伤感染，每次无创伤感染后放入新的培养载体上，以利于幼虫自食虫草菌感染。
幼虫自食虫草菌法感染技术为，幼虫在接种感染前多天不给食，让幼虫处于饥饿状态，幼虫放入已长菌丝的液体种培养载体上，幼虫因饥饿会大量啃食培养载体，连同北虫草菌一起吞进肚内，进入肚内后，加上幼虫活动又带进大量血氧连同虫草菌进入幼虫体内各器官快速生长；幼虫感染后，幼虫体菌丝开始萌发，调好培养室温度10-12℃，湿度60-75%，早晚通风5-10分钟增加室内氧气，有利于菌丝生长定植，5-7天幼虫全身开始萌发菌丝，12-15天后幼虫表面长成雪白菌丝，20天后菌丝通过气孔进入体内，25-35天幼虫开始僵化，幼虫开始僵化时，保持温度12-14℃、相对空气湿度68-72%，黑暗培养。
采用光照诱导和定向培养方法为：光照诱导：增加光照，光照度约150-200勒克斯光，温度调到13-15℃，早中晚一天三次通风；定向培养：将已僵化幼虫头与头排好，头在外，尾深埋土中埋好，晚上开日光灯照射4-6小时；保持光照300-400勒克斯光，温度调到14-16℃，相对空气湿度80-90%，一天三次通风，增加氧气，有利于子实体正常生长。
所述液体种是在菌种营养基上接入母种后培养而得到：
菌种营养基包括以下重量份的原料：土豆200±20份、葡萄糖20±2份、麦麸30±3份、腐殖土20±2份、硫酸镁1.5±0.15份、磷酸二氢钾3±0.3份、蛋白胨2±0.2份、牛肉膏1±0.1份、水1000份。上述菌种营养基的制备：先将土豆用水煮25分钟后过滤，将其它原料加入土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为菌种培养基，用高压1.5公斤压力灭菌1小时后，冷却到20-24℃接入母种，三天静止培养后，摇动培养菌丝72-96小时后得到液体种。
所述液体种培养载体包括以下重量份的原料：红萝卜180-220份、葡萄糖20-25份、蛋白胨2-2.5份、土豆50-60份、琼脂20-23份、水1000份。液体种培养载体的制备：将红萝卜和土豆用水煮25分钟后过滤，再其它原料加入红萝卜和土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为培养基，再倒入生产所需容器中，高压灭菌1.5公斤压力下灭菌40-50分钟，冷却后接入液体种，得到液体种培养载体。
本发明采用无创伤感染法进行接种栽培试验，待幼虫僵化转色时再采用“光照定向”诱导出草，生产的北冬虫夏草除子座桔黄偏红外（不是自然的黑色），其它与天然野生冬虫夏草完全相似，解决了用蝙蝠蛾幼虫菌核与虫体不结实的历史性难题问题。本发明经检测其子实体营养成份与药用成份与天然冬虫夏草不相上下，基本相似，十分接近，正品率达到85%，经济与社会效益巨大。
具体实施方式
实施例：
1、蝙蝠蛾幼虫挑选及消毒
先将操作所需器械容器用75%酒精消毒，再放入零下低温冷却到2-4℃待用，然后将幼虫逐条用75%酒精消毒灭菌。
2、载体生产，营养载体配比：
液体种培养载体包括以下重量份的原料：红萝卜180-220份、葡萄糖20-25份、蛋白胨2-2.5份、土豆50-60份、琼脂20-23份、水1000份；先将红萝卜和土豆用水煮25分钟后过滤，再将其它原料加入红萝卜和土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为培养基，再倒入生产所需容器中，高压灭菌1.5公斤压力下灭菌40-50分钟，冷却后接入液体种，得到液体种培养载体。
3、菌种生产的具体做法与配比如下：液体种是在菌种营养基上接入母种后培养而得到的：母种菌株为北冬虫夏草（Cordyceps militaris）广A8号-6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2017693；
菌种营养基包括以下重量份的原料：土豆200±20份、葡萄糖20±2份、麦麸30±3份、腐殖土20±2份、硫酸镁1.5±0.15份、磷酸二氢钾3±0.3份、蛋白胨2±0.2份、牛肉膏1±0.1份、水1000份；先将土豆用水煮25分钟后过滤，再将其它原料加入土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为培养基，再装入三角瓶中用高压1.5公斤压力灭菌1小时后，再冷却到20-24℃接入母种，三天静止培养后，开始用摇床摇动培养菌丝72-96小时后得到液体种，液体种再接入虫体。
4、无创伤一次感染：无创伤感染技术，即幼虫体无伤口，自然感染：将经过逐条消毒过幼虫，放入净化接种台，用紫外线再消毒灭菌5-10分钟，用毛笔沾上液体种，搽幼虫体多遍，尤其是幼虫气孔和肛门处，再放入已长菌丝的液体种培养载体上，自行再沾上载体上菌丝，完成一次无创伤感染幼虫自食虫草菌法感染：幼虫在接种感染前多天不给食，让幼虫处于饥饿状态，幼虫放入已长菌丝的液体种培养载体上，幼虫因饥饿会大量啃食培养载体，连同北虫草菌一起吞进肚内，进入肚内后，加上幼虫活动又带进大量血氧连同虫草菌进入幼虫体内各器官快速生长；调好培养室温度10-12℃，湿度60%左右；5-7天内幼虫全身开始萌发菌丝，12-15天后幼虫表面长成雪白菌丝，20天后菌丝已通过汽孔进入体内；30天左右幼虫开始僵化。
5、放入载体二次感染法：在完成无创伤一次感染后，根据感染情况，进行二次无创伤感染，二次无创伤感染后放入新的培养载体上，以利于幼虫自食虫草菌法感染；第二次感染主要是幼虫体刚沾上液体种，全身湿湿的，容易沾上载体上长出的菌丝，这又增加了再次感染机会，可减少虫体不感染结果，又增加了营养，又保证了幼虫在几十天培养内不失水的把握，也更易出草。
6、菌丝定植管理：菌种接种感染后，幼虫体菌丝开始萌发，这时应调好温度10-12℃，相对湿度60-75%，早晚通风5-10分钟增加室内氧气，有利于菌丝生长定植。
7、幼虫僵化管理：幼虫经二次感染后它全身长菌白，菌丝也有部分通过汽孔进入体内吸收幼虫营养，全身上下内外已长菌丝也已开始僵化，这时也要调高一点温度，保持12-14℃、相对空气湿度68-72%），黑暗培养。
8、菌核形成管理：
菌丝在幼虫体内吸收营养，造成幼虫死亡关键时候，温度稍低一点，可调到8-10℃为好，多通风增加氧气进入，有利于菌核形成。
9、光照诱导管理：这时可适当增加光照，光照度约150-200勒克斯光，温度调到13-15℃，早中晚一天三次通风，如光照不够装日光灯照亮。
10、定向出草管理：将已僵化幼虫头与头排好，头在外，尾深埋土中埋好，晚上开日光灯照射4-6小时，保持光照300-400勒克斯光，温度调到14-16℃，相对空气湿度80-90%，一天三次通风，增加氧气，有利于子实体正常生长。
11、出草管理：这时可适应增加温度，一般18-20℃，相对空气湿度90-95%，一天四次通风，光照要较好， 400勒克斯以上，土壤湿度含水量60-65%。
Claims (5)
1.一种适合蝙蝠蛾幼虫感染母种菌株的北冬虫夏草栽培方法，其特征在于：该菌株为北冬虫夏草 Cordyceps militaris 广A8号-6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2017693；
该菌株从天然野生北虫草采用子座分离法分离到第一代母种编上号，然后再将每支母种做成液体栽培种，找到其中一支适合蝙蝠蛾幼虫感染菌株；
具体步骤为：将经过逐条消毒过幼虫，放入净化接种台，用紫外线再消毒灭菌5-10分钟，用毛笔沾上液体种，搽幼虫体多遍，尤其是幼虫气孔和肛门处，再放入已长菌丝的液体种培养载体上，完成无创伤感染，调好培养室温度10-12℃，湿度60-75%，早晚通风5-10分钟增加室内氧气，感染5-7天，幼虫身体体表长出菌丝，同时采用幼虫自食虫草菌法感染，伴随幼虫吃进上述菌株，幼虫吃进的带有虫草菌的营养载体也在肚内大量繁殖，大量血氧带着虫草孢子进入幼虫各个器官， 20-30天将幼虫全身长透，开始进入幼虫僵硬期，僵硬期保持温度12-14℃、相对空气湿度68-72%，黑暗培养；60-80天后进入转色期，再进行光照诱导和定向培养，100-150天进入出草期。
2.根据权利要求1所述的北冬虫夏草栽培方法，其特征在于：在完成无创伤一次感染后，进行二次或多次无创伤感染；每次无创伤感染后放入新的培养载体上，以利于幼虫自食虫草菌法感染。
3.根据权利要求1所述的北冬虫夏草栽培方法，其特征在于：所述液体种是在菌种营养基上接入如权利要求1中所述母种后培养而得到，菌种营养基包括以下重量份的原料：土豆200±20份、葡萄糖20±2份、麦麸30±3份、腐殖土20±2份、硫酸镁1.5±0.15份、 磷酸二氢钾3±0.3份、蛋白胨2±0.2份、牛肉膏1±0.1份、水1000份；上述菌种营养基的制备，先将土豆用水煮25分钟后过滤，将其它原料加入土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为菌种培养基，用高压1.5公斤压力灭菌1小时后，冷却到20-24℃接入母种，三天静止培养后，摇动培养菌丝72-96小时后得到液体种；所述液体种培养载体包括以下重量份的原料：红萝卜180-220份、葡萄糖20-25份、蛋白胨2-2.5份、土豆50-60份、琼脂20-23份、水1000份；液体种培养载体的制备，将红萝卜和土豆用水煮25分钟后过滤，再其它原料加入红萝卜和土豆过滤液中煮5分钟，过滤，过滤液即为培养基，再倒入生产所需容器中，高压灭菌1.5公斤压力下灭菌40-50分钟，冷却后接入液体种，得到液体种培养载体。
4.根据权利要求1所述的北冬虫夏草栽培方法，其特征在于：所述光照诱导为：光照度150-200勒克斯光，温度调到13-15℃，早中晚一天三次通风。
5.根据权利要求1所述的北冬虫夏草栽培方法，其特征在于：所述定向培养为，将已僵化幼虫头与头排好，头在外，尾深埋土中埋好，晚上开日光灯照射4-6小时，保持光照300-400勒克斯光，温度调到14-16℃，相对空气湿度80-90%，一天三次通风。
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