ES2354326A1 - Lipasa termófila. - Google Patents
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Abstract
Lipasa termófila.La presente invención se refiere a enzimas termófilas, en particular a lipasas termófilas, de Thermus thermophilus que pueden expresarse en organismos mesófilas y su empleo en la elaboración de una composición detergente, en la modificación de grasas y aceites y en la hidrólisis de las mismas.
Description
Lipasa termófila.
La presente invención se refiere a enzimas
termófilas, en particular a lipasas termófilas, de Thermus
thermophilus que pueden expresarse en organismos mesófilos.
Las enzimas son catalizadores muy potentes,
selectivos y muy específicos. El término lipasa es un término
general para denotar una enzima que hidroliza triglicéridos.
Las aplicaciones que tienen las lipasas en la
industria actual son múltiples: fabricación de detergentes, en la
industria de la leche y los quesos, en panaderías para mejoramiento
de sabores, en la industria de bebidas, producción de productos
químicos de interés por medio de enlaces éster, polimerización e
incluso, se están realizando investigaciones para la producción de
biodiésel. Las lipasas están entre las enzimas más útiles en
tecnología de alimentos ya que son capaces de hidrolizar grasas,
transesterificar e interesterificar grasas, etc. y de este modo
permiten obtener ácidos grasos o grasas y aceites de alto valor
nutricional y económico.
Sin embargo, las enzimas presentan también
importantes limitaciones para su aplicación industrial. Por
ejemplo, que son generalmente inestables y no pueden ser utilizadas
en numerosos ciclos de reacción.
El mayor requisito para una enzima comercial es
su estabilidad térmica porque la desnaturalización térmica es una
causa común de la inactivación enzimática. Adicionalmente, mediante
el incremento en la termoestabilidad enzimática se podrían llevar a
cabo reacciones enzimáticas a mayor temperatura, lo que podría
ayudar para aumentar los ratios de conversión, la solubilidad del
sustrato y reducir la posibilidad de crecimiento microbiano y la
viscosidad en el medio de reacción. En el procesado de los
alimentos, desde un punto de vista de higiene, las reacciones
enzimáticas a altas temperaturas son menos peligrosas para la
contaminación por bacterias. En la descomposición de grasas y
aceites, actualmente se emplean métodos en los que las grasas y
aceites se ponen en contacto con vapor a temperaturas de
aproximadamente 250ºC y a presiones de aproximadamente 50
atmósferas, lo que implica la necesidad de disponer de instalaciones
adecuadas para llevar a cabo tales reacciones. Grasas como el ácido
palmítico o el ácido esteárico son sólidas a temperatura ambiente y
tienen puntos de fusión de aproximadamente 65ºC. Por ello, las
reacciones de hidrólisis deben llevarse a cabo a temperaturas por
encima de dicho punto de fusión. Actualmente, también se están
empleando lipasas en la industria del papel para evitar los
depósitos de brea sobre la pasta de papel. Las enzimas
convencionales se inactivan a temperaturas superiores a los 70ºC,
por lo que la temperatura durante el proceso de la fabricación del
papel tiene que limitarse y controlarse.
La disponibilidad de lipasas termofílicas
permitiría operar a altas temperaturas, con el lógico incremento de
la velocidad de reacción y una más fácil solubilización de los
sustratos, aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante
en algunas aplicaciones de este tipo de enzimas (por ejemplo,
reacciones de síntesis en medios con bajo contenido en agua).
Los microorganismos extremófilos han despertado
un gran interés durante los últimos años, debido a la elevada
estabilidad térmica, resistencia a desnaturalizantes químicos y pHs
extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente 5 adecuadas
para su uso en procesos de biotransformación en condiciones extremas
de pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termófilos
crecen a temperaturas superiores a 45ºC, y en algunos casos
(hipertermófilos) incluso por encima de 90ºC.
Aunque los organismos termófilos pueden ser
buenos candidatos en producir enzimas termoestables, muchas veces no
resulta práctico debido al bajo rendimiento y al equipo de
fermentación de alta temperatura que sería necesario emplear.
La producción de enzimas de interés
biotecnológico procedentes de microorganismos termófilos extremos
suele efectuarse mediante su clonado y expresión a alto nivel en una
bacteria o levadura modelo fácilmente manipulable, tal como
Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Sin
embargo, existen una gran cantidad de enzimas termófilas cuya
complejidad de síntesis hace imposible su obtención en forma activa
en estos organismos modelo (Hidalgo, A. y cols., 2004. Appl.
Environ. Microbiol. Vol. 70 (7): 3839-3844). Este es
el caso frecuente de enzimas hetero-oligoméricas o
el de aquellas enzimas que requieren la incorporación de un cofactor
en el proceso de síntesis, que suele requerir la ayuda de chaperonas
específicas que mantienen la estructura de la enzima en posición
abierta para la entrada del mencionado cofactor. En tales casos, que
pueden llegar a constituir hasta el 50% de las enzimas codificadas
en cualquier termófilo, la alternativa evidente es la de utilizar en
la producción un microorganismo termófilo relacionado evolutivamente
con aquel del que procede la enzima de interés.
Las bacterias del género Thermus sp. se
caracterizan por su capacidad para crecer a altas temperaturas y
por su facilidad de manipulación genética, única entre organismos
termófilos extremos. Las bacterias del género Thermus sp.
tienen gran potencial de utilización como sistemas de obtención de
enzimas termoestables mediante selección funcional a elevadas
temperaturas, existiendo algunos ejemplos de ello en la literatura
científica (Fridjonsson y cols., 2002. J Bacteriol. Vol.
184:3385-3391; Brouns y cols., 2005. J Biol Chem.
Vol. 280:11422-31). No obstante, la aplicación de
estos métodos depende de la generación de una cepa de Thermus
sp. mutante que requiera de la actividad funcional de la enzima a
termoestabilizar para su crecimiento, siendo muy limitadas en la
actualidad las metodologías existentes para la obtención de dichos
mutantes.
La solicitud de patente japonesa JP6279782
describe una lipasa termoestable. La temperatura óptima de la enzima
está en un rango de 60 a 70ºC, sin embargo, la termoestabilidad de
la misma no es suficiente ya que la actividad residual de la enzima
tras el tratamiento a 70ºC durante 15 minutos está por debajo del
10%. Por otra parte, el documento US2006/0024789 describe una lipasa
termoestable de Geobacillus. Dicha lipasa se expresa en cepas
de bacterias recombinantes, tales como en E. coli. El
documento US5306636 describe una lipasa termoestable de
Pseudomonas que se expresa en bacterias recombinantes, tales
como E. coli y Bacillus subtitis o en levaduras. El
documento JP08089244 describe la preparación de una lipasa mutada de
Rhizopus expresada en Saccharomyces cerevisiae con
termoestabilidad mejorada.
Por otra parte, Fuciños P., et al. (J
Biotechnology, (2005) 117; 233-241) describen la
identificación de enzimas extracelulares con actividad
lipasa/esterasa producidas en cultivos de Thermus
thermophilus HB27. Dichos autores describen la purificación
parcial y caracterización bioquímica preliminar de las mismas a
nivel de actividad y estabilidad a altas temperaturas
(80-90ºC). Sin embargo, el grado de purificación de
dichas enzimas es muy bajo (factor de purificación de 4 con respecto
al homogeneizado celular) y por otra parte, dichos autores no
describen la secuencia aminoacídica de dichas proteínas.
Por tanto, existe la necesidad de encontrar
nuevas lipasas termófilas que presenten estabilidad a elevadas
temperaturas y que puedan expresarse en organismos mesófilos.
En un primer aspecto, la invención se refiere a
un polipéptido aislado con actividad lipasa que comprende la
secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una
variante funcionalmente equivalente del mismo.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
una proteína de fusión que comprende
i) un polipéptido según la invención; y
ii) un péptido heterólogo.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona
con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o una
proteína de fusión según la invención.
En otro aspecto, la invención también se
relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de
nucleótidos según la invención.
En un aspecto adicional, la invención se
relaciona con un vector de expresión que comprende una secuencia de
nucleótidos o una construcción génica según la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
célula que comprende una secuencia de nucleótidos, una construcción
génica o un vector de expresión según la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición que comprende un polipéptido según la invención o una
proteína de fusión según la invención.
En otro aspecto, la invención también se refiere
a un procedimiento para la obtención de un polipéptido con actividad
lipasa que comprende cultivar una célula según la invención bajo
condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido y, si
se desea, recuperar dicho polipéptido.
En un aspecto adicional, la invención se
relaciona con el uso de un polipéptido según la invención o una
proteína de fusión según la invención en la elaboración de una
composición detergente.
Finalmente, la invención se refiere a un método
para la modificación de grasas o aceites que comprende poner en
contacto un polipéptido o una proteína de fusión según la invención
con una ©rasa o aceite en condiciones donde dicho polipéptido o
proteína de fusión pueda hidrolizar dicha grasa o aceite.
La Figura 1 muestra unas curvas de actividad
lipasa y biomasa en el medio de cultivo y en las células para el
polipéptido de la invención expresado en la levadura
Kluyveromyces lactis NRRL-Y1140 junto con la
señal de secreción del factor alfa-mating de K.
lactis medida a intervalos de tiempo de 24 horas. En la Figura
1B se especifica la actividad lipasa en las distintas fracciones:
medio extracelular, periplasma, intracelular, membranas y
lavado.
La Figura 2 muestra unas curvas de actividad
lipasa y biomasa en el medio de cultivo y en las células para el
fragmento del polipéptido de la invención que carece de la metionina
N-terminal expresado en la levadura Saccharomyces
cerevisiae BJ3505 junto con la secuencia de la señal de
secreción del alfa-mating factor de S.
cerevisiae.
La Figura 3 muestra una electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS del extracto crudo, del eluído de
la cromatografía de afinidad (empleando Anti-Flag
M2) realizada a partir de los cultivos de S. cerevisiae
(izquierda) y K. lactis (derecha), y de los eluídos
concentrados obtenidos a partir de dicha cromatografía de afinidad.
La cepa de S. cerevisiae está transformada con un plásmido
que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la lipasa
termófila de T. thermophilus sin la metionina
N-terminal, fusionada a una señal de secreción, a un
péptido Flag por el extremo amino-terminal y
expresada bajo un promotor que se reprime por glucosa. La cepa de
K. lactis presenta integrado en su genoma la secuencia de
nucleótidos que codifica la lipasa termófila de T.
thermophilus, fusionada a una señal de secreción, a un péptido
Flag por el extremo carboxilo-terminal y expresada
bajo el promotor de la beta-galactosidasa. En el
carril del gen que corresponde al eluído concentrado se aprecian
varias bandas correspondientes a la lipasa de T.
thermophilus. Carril (1): Marcador; (2) Extracto crudo; (3)
Elución 2; (4) Concentrado; (5) Marcador; (6) Extrato; (7) Elución
2; (8) Concentrado; (9) Marcador.
La Figura 4 muestra un western blot empleando
anticuerpos anti-Flag a partir de muestras
procedentes del extracto crudo, del eluído de la cromatografía de
afinidad (empleando Anti-Flag M2) realizada a
partir de los cultivos de S. cerevisiae (izquierda) y K.
lactis (derecha), y de los eluídos concentrados obtenidos a
partir de dicha cromatografía de afinidad. Los carriles 1, 5 y 9
corresponden al marcador de pesos moleculares. En los carriles 4 y 8
pueden apreciarse varias bandas que corresponden a la lipasa de
T. thermophilus. Carril (1): Marcador; (2) Extracto crudo;
(3) elución; (4) Concentrado; (5) Marcador; (6) Extracto; (7)
Elución 2; (8) Concentrado; (9) Marcador.
La Figura 5 muestra una electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS PAGE al 12%, en donde las bandas
corresponden a la lipasa purificada producida por la cepa de S.
cerevisiae tras su tratamiento con la enzima enterokinasa
durante 0, 2, 5 y 8. La leve proteolisis que se observa a tiempo
cero se debe a la actividad residual de la enteroquinasa a 4ºC
(temperatura de almacenamiento de las muestras hasta que son
cargadas en el gel SDS-PAGE).
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con un polipéptido aislado, de aquí en adelante polipéptido de la
invención, con actividad lipasa que comprende la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante
funcionalmente equivalente del mismo.
El término "lipasa", tal como aquí se
emplea, se refiere a una enzima de tipo hidrolasa que cataliza la
hidrólisis de enlaces de tipo éster en sustratos lipídicos.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "variante funcionalmente equivalente" de una
secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia de aminoácidos
que (i) es sustancialmente homóloga a dicha secuencia de aminoácidos
y (ii) ejerce la misma función, es decir, tiene actividad
lipasa.
Una secuencia de aminoácidos es sustancialmente
homóloga a una secuencia de aminoácidos determinada cuando presenta
un grado de identidad de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al
menos, un 75%, típicamente de, al menos, un 80%, preferentemente
de, al menos, un 85%, más preferentemente de, al menos, un 90%, aún
más preferentemente de, al menos, un 95%, 97%, 98% ó 99%, respecto a
dicha secuencia de aminoácidos determinada. El grado de identidad
entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de
alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica,
tales como, por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic
local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;
215(3):403-10). El experto en la materia
entenderá que las secuencias de aminoácidos a las que se hace
referencia en esta descripción pueden estar modificadas
químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son
fisiológicamente relevantes, tales como, fosforilaciones,
acetilaciones, etc. Así, la expresión "variante funcionalmente
equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que el
polipéptido o proteína en cuestión mantiene, al menos, una de las
funciones del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEQ ID NO: 1, preferentemente, al menos, una función
relacionada con la hidrólisis, en particular, que mantiene la
actividad lipasa. La actividad lipasa del polipéptido de la
invención puede ser determinada mediante el empleo de métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia, por
ejemplo, a modo simplemente ilustrativo, la actividad lipasa de
dicho polipéptido se puede determinar mediante métodos tales como
los ensayos descritos en los Ejemplos 1-3 donde se
describe que para la medida de actividad lipolítica, se emplea el
método descrito por Fuciños et al.) (J. Biotechnol., 2005,
117:233-241) o el ensayo descrito en el Ejemplo 12
de la solicitud de patente WO2006/096834.
En una realización particular, el polipéptido de
la invención es una variante que presenta una o más inserciones,
deleciones y/o modificaciones de uno o más aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, y mantiene la
actividad lipasa.
En otra realización particular, dicha variante
es un fragmento del polipéptido de la invención. El término
"fragmento" tal como se utiliza en la presente descripción se
refiere a un polipéptido que comprende una porción de dicho
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEQ ID NO: 1, es decir, una secuencia de aminoácidos contiguos
comprendida dentro de dicha SEQ ID NO: 1. Para su empleo en la
presente invención dicho fragmento debe ser funcionalmente
equivalente a dicho polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, es decir, debe tener
actividad lipasa. En una realización particular de la invención,
dicha lipasa es una lipasa termófila. En una realización concreta,
dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEQ ID NO: 1 en la que se ha eliminado la metionina del extremo
N-terminal.
El término "termófilo" tal como aquí se
emplea se refiere a una enzima, en particular, una lipasa que puede
soportar condiciones de temperatura relativamente altas, es decir,
que es estable y es capaz de realizar su actividad en condiciones de
temperatura elevadas, en particular a una temperatura igual o
superior a 50ºC, más preferiblemente a una temperatura comprendida
entre 60 y 90ºC. En una realización particular, dicha enzima
proviene de un organismo termófilo, en particular de Thermus
thermophilus HB27.
Adicionalmente, el polipéptido de la invención
puede formar parte de una proteína de fusión. En este sentido, a
modo ilustrativo, no limitativo, dicha proteína de fusión puede
contener una región A constituida por un cebador polipéptido que
comprende el polipéptido de la invención unido a una región B que
comprende un segundo péptido. Dicho segundo péptido puede ser
cualquier péptido apropiado, por ejemplo, un péptido señal de
secreción extracelular.
Dicha región B puede estar unida a la región
amino-terminal de dicha región A, o bien,
alternativamente, dicha región B puede estar unida a la región
carboxilo-terminal de dicha región A. Ambas
regiones A y B pueden estar unidas directamente o a través de un
péptido espaciador (linker) entre dichas regiones A y B. La proteína
de fusión puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por
los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la expresión
génica de la secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína de
fusión en células hospedadoras apropiadas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
refiere a una proteína de fusión que comprende
i) un polipéptido según la invención; y
ii) un péptido heterólogo.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular de la invención,
dicho péptido heterólogo es un péptido señal de secreción
extracelular, es decir, una secuencia que permita la secreción de
dicha proteína de fusión al medio extracelular. Por "péptido señal
de secreción extracelular" según se usa en el contexto de la
presente invención, se entiende todo péptido que comprende o que
consiste en una secuencia señal que se encuentra de forma natural
asociada a una proteína distinta al polipéptido según la invención
que se desea expresar. Así, la presente invención contempla el uso
de secuencias señal derivadas de cualquier péptido secretado,
incluyendo tanto aquellas secuencias señal pertenecientes al mismo
organismo cuyo polipéptido queremos expresar pero cuya función es
promover la secreción al medio de proteínas distintas al polipéptido
de la invención, así como de secuencias señal que derivan de otros
microorganismos y que se encargan de promover la secreción al medio
de cualquier enzima. Así, ejemplos ilustrativos pero no limitativos
de secuencias señal que pueden usarse en el contexto de la presente
invención incluyen polipéptidos que contienen o que consisten en la
secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae y
de otras especies de los géneros Kluyveromyces,
Pichia, y Hansenula, la secuencia señal de la toxina
killer de K. lactis, la secuencia señal de la
glucoamilasa II de S. diastaticus, la secuencia señal de la
glucoamilasa de C. albicans, la secuencia señal de la
fosfatasa de S. cerevisiae, la secuencia señal de la toxina
killer de 128 kDa de S. cerevisiae, la secuencia señal
de la invertasa de S. cerevisiae, así como secuencias
aleatorias que son conocidas por su capacidad por reemplazar
funcionalmente secuencias señales nativas de E. coli, tal y
como han sido descritas por Kaiser, C. et al. (Science,
1987, 235:312-317) y secuencias señal que pueden ser
identificadas usando los métodos conocidos en la técnica (por
ejemplo por Gallicioti, G. et al. J. Membrane Biology,
183:175-182). En una forma de realización preferida,
cuando la célula a transformar es S. cerevisiae, la proteína
de fusión de la invención comprende una secuencia que codifica para
la secuencia señal alfa-mating factor de S.
cerevisiae fusionado a través de su extremo 3' y en el mismo
marco de lectura con la secuencia que codifica para el polipéptido
de la invención. En otra realización preferida, cuando la célula a
transformar es K. lactis, la proteína de fusión de la
invención comprende una secuencia que codifica para la secuencia
señal alfa-mating factor domain de K. lactis
fusionado a través de su extremo 3' y en el mismo marco de lectura
con la secuencia que codifica para el polipéptido de la
invención.
El polipéptido de la invención o la proteína de
fusión de la invención puede incluir, además, una secuencia
aminoacídica útil para el aislamiento o purificación de la proteína
de fusión de la invención. Dicha secuencia estará situada en una
región de la proteína de fusión de la invención que no afecte
adversamente a la funcionalidad del polipéptido de la invención.
Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser
utilizada para aislar o purificar una proteína de fusión
(denominadas genéricamente péptidos etiqueta o "tag") puede
estar presente en dicha proteína de fusión de la invención. A modo
ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia aminoacídica útil para
aislar o purificar una proteína de fusión puede ser, por ejemplo,
una cola de argininas (Arg-tag), una cola de
histidinas (His-tag), FLAG-tag,
Strep-tag, un epítopo susceptible de ser reconocido
por un anticuerpo, tal como
c-myc-tag, SBP-tag,
S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de
unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión
S-transferasa-tag, proteína de unión
a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc. (Terpe
K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003),
60:523-525), \beta-galactosidasa,
VSV-glicoproteína, etc. En una realización preferida
de la invención, dicho péptido de purificación se selecciona entre
un péptido Flag o una cola de polihistidinas.
\newpage
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una secuencia de nucleótidos, de aquí en adelante secuencia de
nucleótidos de la invención, que codifica un polipéptido o una
proteína de fusión según la invención. Por razones de simplicidad,
bajo la denominación "secuencia de nucleótidos de la invención"
se incluyen la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido
de la invención, es decir, el polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, así como una
secuencia de nucleótidos que codifica una variante o un fragmento
funcionalmente equivalente de dicho polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según
la invención. En otro aspecto adicional, la invención se refiere a
un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o
una construcción génica según la invención.
El término "vector de expresión" se refiere
a una construcción de ADN replicativo utilizado para expresar ADN
que codifica el polipéptido de la invención o la proteína de fusión
de la invención y que incluye una unidad transcripcional que
comprende un ensamblaje de (1) elemento/s genético/s que tienen un
papel regulatorio en la expresión génica, por ejemplo, promotores,
operadores o "enhancers" (aumentadores), operativamente
unidos a (2) una secuencia de ADN que codifica el polipéptido o la
proteína de fusión de la invención que es transcrito a ARN mensajero
y traducido a proteína y (3) secuencias apropiadas de iniciación y
terminación de la transcripción y traducción.
Preferentemente, la invención contempla el uso
de vectores que puedan ser propagados tanto en procariotas, por
ejemplo, una bacteria, como en levaduras. Cuando la célula es una
célula procariota, tal como una bacteria, vectores adecuados según
la invención son, por ejemplo, los vectores pUC18, pUC19, pUC118,
pUC119 (Messing, 1983. Meth. in Enzymology
101:20-77; Vieira y Messing, 1982. Gene
19:259-268), Bluescript (Stratagene, La Jolla,
California) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIE1, pCR1,
RP4, pNH8A, pNH16a, pNH18a. En una realización particular de la
invención, cuando dicha bacteria es E. coli, dicho vector es
el plásmido pET, en particular, el plásmido pET21d. Los genes
clonados en dicho plásmido se transcriben bajo el control del
promotor del bacteriófago T7, cuando se activa la T7 RNA polimerasa
en la célula huésped. La expresión se induce con IPTG, el cual
remueve al represor del operador para que se lleve a cabo la
transcripción y se promueva la expresión de la proteína de interés.
En una realización particular, cuando la célula es una bacteria,
dicho vector es el plásmido pET21d.
Adicionalmente, ejemplos ilustrativos de
vectores adecuados para la presente invención cuando la célula a
transformar es una célula de levadura son los siguientes:
- -
- Plásmidos autónomos multicopia: Estos plásmidos contienen secuencias que permiten la generación de múltiples copias de dichos vectores. Estas secuencias pueden ser las denominadas 2 \mu, como la que aparece en los plásmidos episomales (YEp o "yeast episomal plasmids") o secuencias tipo ARS, como las que aparecen en los plásmidos de replicación (YRps o "yeast replication plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son p426GPD, p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD o p426GAL, YEp24 y YEplac.
- -
- Plásmidos autónomos de una única copia: Plásmidos que contienen la secuencia autónoma de replicación ARS1 y una secuencia centromérica (CEN4). Este tipo de plásmidos incluye los plásmidos centroméricos (YCps o "yeast centromere plasmids").
- -
- Plásmidos de integración: Plásmidos que son capaces de integrarse en el genoma de la célula que los hospeda. Este tipo de plásmidos incluye plásmidos de integración (YIPs o "yeast integrating plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son pRS303, pRS304, pRS305 o pRS306 y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular de la invención,
cuando la célula transformada es una célula de levadura, en
particular Kluyveromyces lactis, el vector de expresión es el
plásmido pKLAC1.
La elección de un promotor y otro/s elemento/s
regulatorios generalmente varía en función de la célula huésped
utilizada. Promotores adecuados en el contexto de la presente
invención incluyen promotores constitutivos que promueven la
expresión de las secuencias asociadas a ellas de forma constante y
promotores inducibles, que requieren de un estímulo externo para
promover la transcripción de las secuencias asociadas a ellos.
Promotores útiles para la realización de la
presente invención incluyen:
- -
- Promotores constitutivos como por ejemplo, el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1), el promotor del factor de elongación 1 alfa (TEF) y el promotor del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa (TPI), el promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) y el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa (GPK), el promotor MRP7 y el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1).
- -
- Promotores inducibles como por ejemplo el promotor de la metalotioneina (CUP1) cuya expresión se regula mediante adición de cobre al medio de cultivo, el promotor del gen que codifica el gen FUS1 o el gen FUS2, cuya expresión se activa en presencia de feromonas (el factor \alpha) según se describen en US5063154, el promotor TET cuya expresión se regula en presencia de tetraciclinas, los promotores GAL1-10, GALL, GALS que se activan en presencia de galactosa, el promotor VP16-ER, inducible por estrógenos, y el promotor de la fosfatasa (PHO5) cuya expresión se activa en presencia de fosfato y el promotor de la proteína de choque térmico HSP150, cuya expresión se activa a elevada temperatura.
- -
- Promotores reprimibles como por ejemplo el promotor del gen de la enolasa (ENO-1) de S. cerevisiae cuya expresión se puede reprimir cuando se hace crecer el microorganismo en una fuente de carbono no fermentable así como promotores cuya expresión está sujeta a represión por glucosa, de forma que la expresión se verá reprimida cuando parte de la lactosa se ha hidrolizado y comienza a aumentar la concentración de glucosa en el medio, el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de S. cerevisiae y el promotor de la galactoquinasa (GAL1). Preferiblemente, el promotor que es reprimible por glucosa es el promotor del gen ADH2.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular, cuando la célula
a transformar con dicho vector o construcción de la invención es una
bacteria, dicho promotor es el sistema promotor
beta-lactamasa y lactosa (Chang et al.,
Nature 275:615, 1978), el promotor T7 RNA polimerasa (Studier et
al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990), el
promotor lambda (Elvin et al., Gene
87:123-126, 1990), el promotor trp (Nichols and
Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155, 1983) y el promotor tac
(Russell et al., Gene 20:231, 1982).
En una realización particular de la invención,
dicho promotor es un promotor inducible. En una realización más
particular, dicho promotor es un promotor inducible por galactosa,
lactosa o por IPTG. En una realización preferida, dicho promotor es
el promotor de la beta-galactosidasa de forma que
las enzimas se secretan al medio de cultivo cuando las células
transformadas crecen en presencia de un inductor como galactosa o
lactosa. En otra realización particular de la invención, dicho
promotor es un promotor que se reprime en presencia de glucosa.
La invención también contempla el uso de
aumentadores de la expresión. En una realización particular, dichos
aumentadores de la expresión son aumentadores específicos de
levaduras (los denominados UAS o "upstream activating
sequences") con el fin de regular la expresión del polipéptido o
proteína de fusión de la invención. Alternativamente, se pueden
utilizar promotores sintéticos híbridos que resultan de la unión de
un UAS con la región de activación de la transcripción de otro
promotor. Ejemplos de promotores híbridos incluyen la región
reguladora del gen ADH unido a la región de activación del promotor
del gen GAP, así como promotores que comprenden las secuencias
reguladoras de los promotores de los genes ADH2, GAL4, GAL10, y PHO5
combinadas con las regiones de activación de la transcripción de
genes que codifican enzimas glicolíticos, tales como GAP o piruvato
quinasa. Adicionalmente, cuando la célula a transformar es una
célula de levadura, los promotores de levadura pueden contener
promotores de otros orígenes que tienen la habilidad de unirse al
RNA de levadura y de iniciar la transcripción.
En otra forma de realización, el vector de
expresión de la invención incorpora un terminador transcripcional en
dirección 3' de la secuencia que codifica para el polipéptido o la
proteína de fusión de la invención. Terminadores transcripcionales
preferidos que pueden ser incorporados incluyen los terminadores que
se encuentran en el gen de la enolasa de S. cerevisiae, en el
gen CYC1 de S. cerevisiae y en el gen
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa.
En general, todos los vectores mencionados en
Sikorski ("Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces
cerevisiae", in Plasmid, A Practical Approach, Ed. K. G.
Hardy, IRL Press, 1993) y en Ausubel et al. ("Yeast Cloning
Vectors and Genes" Current Protocole in Molecular Biology,
Section II, Unit 13.4, 1994) son útiles en el contexto de la
presente invención.
Los vectores que se pueden usar en el contexto
de la presente invención incluyen, típicamente, un origen de
replicación, un gen de resistencia a antibióticos, un origen de
replicación en bacterias (necesario para la propagación en
bacterias), sitios múltiples de clonaje, y un marcador genético. El
marcador genético es, habitualmente, un gen que confiere resistencia
a un antibiótico o, alternativamente, un marcador autotrófico.
Así, genes marcadores útiles en el contexto de
la presente invención incluyen, por ejemplo, el gen de resistencia a
la neomicina, que confiere resistencia al aminoglucósido G418, el
gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a
higromicina, el gen ODC, que confiere resistencia al inhibidor de la
ornitina descarboxilasa
(2-(difluorometil)-DL-ornitina
(DFMO), el gen de la dihidrofolato reductase que confiere
resistencia a metrotexato, el gen de la
puromicina-N-acetil transferasa, que
confiere resistencia a puromicina, el gen ble que confiere
resistencia a zeocina, el gen de la adenosina deaminasa que confiere
resistencia a
9-beta-D-xilofuranosil
adenina, el gen de la citosina deaminasa, que permite a las células
crecer en presencia de
N-(fosfonacetil)-L-aspartato,
el gen de la timidina kinasa, que permite a las células crecer en
presencia de aminopterina, o el gen de
Xantina-guanina fosforibosiltransferasa, que permite
a las células crecer en presencia de xantina y ausencia de
guanina.
En el caso de los marcadores autotróficos, se
pueden usar los genes TRP1, URA3, LEU2, HIS3 o LYS2, que
complementan defectos genéticos en las células que los portan, lo
que permite a dichas células crecer en ausencia de triptófano,
uracilo, leucina, histidina y lisina, respectivamente.
El vector de la invención puede ser utilizado
para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de
ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector.
Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en
otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que
comprende un vector de la invención, para lo cual dicha célula ha
podido ser transformada, transfectada o infectada con un vector
proporcionado por esta invención. Células huéspedes adecuadas
incluyen: células procariotas o células eucariotas. Las células
huésped preferidas son células de procariotas, en particular, de
bacteria, o células eucariotas, en particular, de levadura.
Así, ejemplos ilustrativos, no limitativos de
bacterias según la presente invención, incluyen bacterias Gram
negativas, por ejemplo, una cepa de Escherichia spp. (e.g.,
E. coli, etc.), una cepa de Salmonella spp. (e.g.,
S. tiphymurium, etc.), una cepa de Pseudomonas sp.
(e.g., P. aeruginosa, P. putida, etc.), etc., que
puede ser transformada con una construcción génica de la invención o
con un vector de la invención, tal como un vector de expresión
proporcionado por esta invención. En una realización preferida,
dicha bacteria es Escherichia coli. Ejemplos ilustrativos de
cepas de E. coli que pueden ser empleadas según la invención
son las cepas BL21 (DE3), DH10B y DH5\alpha.
Por levadura se entiende cualquier organismo
eucariota perteneciente al tipo de los ascomicetes que incluye los
organismos conocidos de forma general como levaduras así como los
conocidos de forma general como hongos filamentosos. Las levaduras y
los hongos filamentosos incluyen Pichia sp (por ejemplo,
P. pastoris, P. finlandica, P. trehalophila,
P. koclamae, P. membranaefaciens, P. minuta,
P. opuntiae, P. thermotolerans, P. salictaria,
P. guercuum, P. pijperi, P. stiptis, P.
methanolica), Saccharomyces (S. cerevisiae),
Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo,
K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K.
wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K.
thernotolerans, and K. marxianus, K. yarrowia),
Trichoderma reesia, Neurospora crassa,
Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis,
Penicillium, Totypocladium, Aspergillus (por
ejemplo, A. nidulans, A. niger, A. oryzae),
Hansenula polymorpha, Candida, Kloeckera,
Torulopsis, and Rhodotorula, Hansenula,
Kluyveromyces sp. (por ejemplo, Kluyveromyces lactis),
Candida albicans, Aspergillus sp (por ejemplo,
Aspergillus nidulans, Aspergillum niger,
Aspergillus oryzae), Trichoderma reesei,
Chrysosporium luchiowense, Fusarium sp. (por ejemplo,
Fusarium gramineum, Fusarium venenatm),
Physcomitrella patens. Por tanto, en otro aspecto, la
invención se refiere a una célula que comprende una secuencia de
nucleótidos o una construcción génica o un vector de expresión
según la invención. En una realización preferida de la invención,
dicha levadura se selecciona entre Saccharomyces cerevisiae y
Kluyveromyces lactis.
El polipéptido o la proteína de fusión de la
invención se puede obtener mediante diversos métodos conocidos por
el experto en la materia, por ejemplo, mediante el empleo de
técnicas de ADN recombinante. De hecho, la secuencia de nucleótidos
o vector de la invención puede ser utilizado para producir el
polipéptido o la proteína de fusión de la invención. Por tanto, a
modo ilustrativo, no limitativo, un método para producir dicho
polipéptido o dicha proteína de fusión de la invención comprende
crecer una célula proporcionada por esta invención bajo condiciones
que permiten la producción de dicho polipéptido o proteína de
fusión. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula
dependerán de la célula utilizada. Si se desea, el polipéptido o la
proteína de fusión de la invención puede ser aislado y,
opcionalmente, purificada, por métodos convencionales.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un procedimiento para la obtención de un polipéptido
con actividad lipasa que comprende cultivar una célula según la
invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho
polipéptido y, si se desea, recuperar dicho polipéptido. Así, el
polipéptido de la invención, si se desea, es aislado y,
opcionalmente, purificado.
Prácticamente cualquier método conocido en la
técnica puede ser utilizado para la recuperación de la proteína de
interés, ya sea a partir de extractos celulares (a partir del
citoplasma o del periplasma del interior celular) o del medio de
cultivo.
En una realización particular, cuando la
proteína de interés (polipéptido con actividad lipasa) comprende la
secuencia de aminoácidos de un péptido de secreción extracelular, la
recuperación de dicho polipéptido se realiza a partir del medio de
cultivo.
En otra realización particular, la recuperación
de dicho polipéptido con actividad lipasa se realiza a partir de los
extractos celulares.
Como entiende el experto en la materia, si la
proteína se produce en el citoplasma de la célula, es necesario
lisar las células para liberar las proteínas de interés.
Así, en el caso de que dicha célula sea una
bacteria, dichas células se pueden lisar por diferentes métodos que
incluyen tratamiento con álcalis o calor, detergentes iónicos o no
iónicos y disolventes orgánicos. La elección del método de
extracción dependerá de la especie bacteriana que se quiera lisar,
de forma que el tratamiento debe modificarse según la cepa
hospedadora (especie bacteriana o estirpe, debido a la diferente
composición de la pared celular de distintos microorganismos).
Convencionalmente, cuando la célula es una célula de levadura, éstas
se lisan mediante lisis hipotónica de esferoplastos formados
previamente mediante tratamiento con glucanasas, mediante sonicación
o mediante agitación en presencia de bolas de vidrio.
Por otro lado, si la proteína de interés se
produce en el espacio periplasmático, entonces la recuperación de la
proteína de interés puede hacerse, por ejemplo, mediante ciclos
repetidos de congelación-descongelación, mediante
shock osmótico y sonicación breve, etc.
Una vez que la proteína de interés se encuentra
en el medio, bien mediante liberación del interior celular bien
porque la proteína es secretada por la propia maquinaria de
secreción de la célula, se emplean métodos convencionales para la
purificación de dicha proteína, incluyendo, sin estar limitado,
cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, de
interacción hidrofóbica, de filtración en gel, HPLC), métodos
electroforéticos (isoelectroenfoque preparativo, electroforesis
preparativa en geles de poliacrilamida-SDS),
solubilidad diferencial (precipitación con sulfato amónico),
ultracentrifugación preparativa en gradiente de sacarosa. Una vez
que se ha alcanzado el grado deseado de pureza, lo que puede
requerir más de un paso cromatográfico, es frecuente que sea
necesario concentrar la proteína o eliminar sales e iones que puedan
ser perjudiciales para su posterior uso. En ese caso, se recurre a
técnicas conocidas, tales como liofilización o ultrafiltración.
La determinación del grado de pureza de dicho
polipéptido se puede estimar mediante el valor de la actividad
enzimática específica que se calcula dividiendo el número de
unidades de actividad enzimática entre la cantidad de mg de proteína
en un volumen determinado. Preferiblemente, la actividad enzimática
se determina mediante el método de medida de actividad lipolítica
descrito según Fuciños et al. (2005) (J. Biotechnol.
117:233-241).
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición que comprende un polipéptido o una proteína de fusión
según la invención.
Las lipasas son enzimas que catalizan la
hidrólisis de enlaces de tipo éster en sustratos lipídicos. Por
tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un
polipéptido o una proteína de fusión según la invención en la
elaboración de una composición detergente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para la modificación de grasas o aceites que comprende poner
en contacto un polipéptido o una proteína de fusión según la
invención con una grasa o aceite en condiciones donde dicho
polipéptido o proteína de fusión pueda hidrolizar dicha grasa o
aceite.
La invención se describe a continuación mediante
los siguientes ejemplos que deben ser considerados como meramente
ilustrativos y no limitativos de la misma.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la enzima heteróloga con actividad lipasa (secuencia completa que
codifica una proteína de 161 aminoácidos) se amplificó por PCR a
partir de DNA genómico de T. thermophilus HB27 con los
siguientes cebadores que comprenden los sitios BamHI (F) y HindIII
(R)
El producto de amplificación se clonó en los
correspondientes sitios de restricción del plásmido pET21d
(NOVAGEN).
La bacteria Escherichia coli BL21 (DE3)
se transformó con la secuencia clonada en el plásmido pET21d de
forma que la proteína se sintetiza fusionada a una cola
C-terminal de 6 histidinas tras inducción con IPTG
(Isopropil
\beta-D-tiogalactopiranósido).
Las bacterias transformadas con el plásmido
recombinante, se cultivaron en medio líquido LBA (1%
Bacto-Triptona, 0,5%
Bacto-Yeast-Extract, 0,5% Cloruro
Sódico, 0,1% Glucosa, Ampicilina 40 mg/mL) a 37ºC en agitación
orbital y al alcanzar una DO a 600 nm de 0,6 se llevó a cabo la
inducción añadiendo al medio de cultivo IPTG.
La medida de la actividad lipolítica y
definición de unidad enzimática de la enzima recombinante se realizó
según Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol.
117:233-241).
Por otro lado, se transformaron cepas de la
levadura Kluyveromyces lactis NRRL-Y1140 con
la secuencia de la proteína heteróloga fusionada a una señal de
secreción, al péptido Flag por el extremo
C-terminal, y expresándose bajo el promotor de la
beta-galactosidasa. De esta forma, la enzima se
secreta al medio de cultivo cuando las levaduras crecen en
presencia de un inductor como galactosa o lactosa.
La secuencia se amplificó por PCR a partir de
DNA genómico de T. thermophilus HB27 con los siguientes
cebadores para clonarla entre los sitios BglII y KpnI del plásmido
pKLAC1 (New England Biolabs) en pauta de lectura con la señal de
secreción alfa-mating factor de K.
lactis.
En negrita se señala la secuencia de nucleótidos
correspondiente al péptido Flag.
Con los plásmidos linearizados por digestión
enzimática con SaclI se transformó la levadura K. lactis
NRRL-Y1140 y se seleccionaron los transformantes por
crecimiento en medio sólido con 5 mM de acetamida como fuente de
nitrógeno, y se comprobó que la construcción se había integrado en
multicopia en el genoma. Las levaduras se transformaron según el
método del acetato de litio descrito en Ito et al. (1983) (J.
Bacteriol, 153: 163-168).
Las cepas transformadas se cultivaron en
matraces de 500 mL con 100 mL de medio YPga1 (Extracto de levadura:
10 g/L, Bacto-peptona: 20 g/L, Lactosa: 20 g/L) a
30ºC en agitación orbital (250 rpm). Cada 24 horas se tomó una
muestra de 10 mL del cultivo y se midió la actividad lipolítica en
el medio de cultivo y en las células, alcanzando valores de
actividad enzimática total de unas 200 U/L con una distribución
mayoritaria en el periplasma celular, según se muestra en la Figura
1. El método de fraccionamiento celular empleado es el descrito
según Becerra et al (2001) (Prot. Eng. 14:
379-386).
La medida de la actividad lipolítica y
definición de unidad enzimática de la enzima recombinante se realizó
según Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol.
117:233-241).
Se transformó la levadura Saccharomyces
cerevisiae BJ3505 con la secuencia de nucleótidos de la
proteína heteróloga clonada en yEpFlag1 (Eastman Kodak Company) en
pauta de lectura con la secuencia de la señal de secreción del
alfa-mating factor de S. cerevisiae y del
péptido Flag. El plásmido yEpFlag1 lleva un promotor que se reprime
por glucosa. Las enzimas se secretan al medio de cultivo, cuando se
ha agotado la glucosa, fusionadas al péptido Flag por el extremo
N-terminal.
Para ello, se amplificó por PCR la secuencia de
la enzima a partir de DNA genómico de T. thermophilus HB27
con los siguientes cebadores que tienen colas homologas al vector
MCS (del inglés, múltiple cloning site):
Con el producto de PCR y el vector linearizado
por digestión en el sitio de clonación múltiple MSC con EcoRI y
SalI, se transformó la levadura S. cerevisiae BJ3505
seleccionando los transformantes (que contienen el plásmido
recombinante que se ha recircularizado por recombinación) por
crecimiento en medio CM-trp. El medio CM sin el
correspondiente aminoácido (triptófano) empleado como marcador
auxotrófico se preparó según (Zitomer y Hall, 1976, J. Biol. Chem.,
251: 6320-6326). Las levaduras se transformaron
según el método del acetato de litio de Ito et al. (1983) (J.
Bacteriol., 153: 163-168).
Las cepas transformadas con el plásmido
recombinante se cultivaron en un medio que contiene 1% glucosa, 3%
glicerol, 1% extracto de levadura y 8% de peptona. Se realizó un
cultivo de 100 ml en un matraz de 500 ml, a 30ºC con agitación
orbital continua (250 rpm). Cada 24 horas se tomó una muestra de 10
mL del cultivo y se midió la actividad lipolítica en el medio de
cultivo y en las células, alcanzando valores de actividad
enzimática total de unas 130 U/L con una distribución mayoritaria en
el periplasma celular, según se muestra en las Figuras 2A y 2B. Se
empleó el método de fraccionamiento celular descrito según Becerra
et al. (2001) (Prot. Eng. 14: 379-386).
La medida de la actividad lipolítica y
definición de unidad enzimática de la enzima recombinante se realizó
según Fuciños et al. (2005) (J. Biotechnol.
117:233-241).
La purificación de la lipasa termófila se
realizó a partir de cultivos de las cepas de S. cerevisiae y
K. lactis que presentan en un plásmido o integrado en su
genoma la secuencia de nucleótidos que codifica la lipasa termófila
de T. thermophilus, fusionada a una señal de secreción, a un
péptido Flag por el extremo amino- o
carboxilo-terminal y expresada bajo el promotor
ADH2 o de la beta-galactosidasa,
respectivamente.
Se partió de 1 litro de cultivo en medio YPga1
inoculado a una DO_{600} de 0,1 e incubado durante 60 horas, las
células se recogieron por centrifugación y se realizó un extracto
crudo rompiendo las células por procedimientos mecánicos según se
describe en Tarrío et al (2004) Biochim. Biophys. Acta 1678:
170-175, y añadiendo el detergente CHAPS al 1%.
Partiendo de este extracto crudo se realizó la purificación por
cromatografía de afinidad con AntiFlag M2 agarosa (Sigma) siguiendo
las instrucciones del proveedor. Las eluciones de mayor actividad se
concentraron por ultrafiltración (corte 3000 Da). La actividad
específica aumentó desde 0,03 U/mg en el extracto crudo hasta 1,66
U/mg en el eluído-concentrado de la cromatografía de
afinidad (Factor de purificación = 50,5).
Se partió de 1 litro de cultivo en medio YPHSM
modificado (sin CaCl_{2}) inoculado a una DO_{600} de 0,1 e
incubado durante 60 horas, las células se recogieron por
centrifugación y se realizó un extracto crudo rompiendo las células
por procedimientos mecánicos según se describe en Tarrío et
al (2004) Biochim. Biophys. Acta 1678: 170-175,
y añadiendo el detergente CHAPS al 1%. Partiendo de este extracto
crudo se realizó la purificación por cromatografía de afinidad con
AntiFlag M2 agarosa (Sigma) siguiendo las instrucciones del
proveedor. Las eluciones de mayor actividad se concentraron por
ultrafiltración (corte 3000 Da). La actividad específica aumentó
desde 0,06 U/mg en el extracto crudo hasta 0,19 U/mg en el
eluído-concentrado de la cromatografía de afinidad
(Factor de purificación = 3,3).
En la Figura 3 se muestra una electroforesis en
gel de poliacrilamida-SDS del extracto crudo y del
eluído de la cromatografía de afinidad y los eluídos concentrados de
dicha cromatografía de afinidad de ambas purificaciones (S.
cerevisiae al lado izquierdo y K. lactis al lado
derecho). En los carriles que corresponden al eluído concentrado se
pueden apreciar varias bandas que corresponden a la lipasa termófila
de T. termophilus. En la Figura 4 se muestra el western blot
con anticuerpos anti-Flag de un gel realizado en
paralelo con las mismas muestras que las empleadas en la
electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la
Figura 3.
Como puede apreciarse de en la Figuras 3 y 4, la
aparición de varias bandas mayoritarias se atribuye al procesamiento
deficiente del extremo amino terminal ya que la purificación de la
lipasa termófila se realiza a partir de extracto crudos
intracelulares. El procesamiento de la lipasa recombinante comprende
la eliminación del péptido señal en el retículo endoplamático rugoso
y el procesamiento proteolítico en el aparato de Golgi (Caplan, S.,
Green, R., Rocco, J., Kuijan, J. (1991). J Bacteriol. 173(2):
627-635). El procesamiento incompleto de la lipasa
termófila daría lugar a las bandas que aparecen en los geles de las
Figuras 3 y 4 (Takahashi, S., Ueda, M., Tanaka, A. (2000). J. Mol.
Cat. B: Enzymatic 10 (1-3):
233-240). Por este motivo, y para reducir el número
de bandas, previo a la realización del gel se procedió a tratar los
eluídos de las muestras obtenidas a partir de la expresión con S.
cerevisiae con la enzima enterokinasa que corta en el extremo
carboxilo terminal del péptido FLAG que se encuentra en el extremo
amino terminal de la proteína, eliminando así la señal de secreción
si estuviera presente. Tras un tratamiento de 12 horas a temperatura
ambiente, se obtuvieron dos únicas bandas de un peso molecular de,
aproximadamente, 1 KDa menor que las bandas anteriores (Figura
5).
A continuación, para confirmar que ambas bandas
corresponden a la lipasa purificada producida por S.
cerevisiae, se procedió a secuenciar el extremo amino terminal
de ambas bandas. El resultado fue la identificación inequívoca de
ambas bandas como la lipasa recombinante producida por la cepa S.
cerevisiae, pues en la secuenciación se obtuvo la secuencia
aminoacídica de la lipasa a continuación del optapéptido FLAG. Por
tanto, la existencia de dos bandas mayoritarias de distinto peso
molecular se atribuye a un procesamiento proteolítico del extremo
carboxilo terminal de la lipasa recombinante. La obtención de
proteína recombinante de menor tamaño que el esperado por rotura de
parte del extremo carboxilo terminal, es un fenómeno que ha sido
documentado con el sistema de expresión YEpFLAG1 en S.
cerevisiae [Mersich, C., et al (2007). Biotechnol. J.
2007, 2, 672-677; and Schuster, M., et al
(2000). J. Biotechnol. 84: 237-248].
<110> UNIVERSIDADE DA CORUÑA y UNIVERSIDAD
DE VIGO
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Lipasa termófila
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> P3669ES00
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 161
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<212> PRT
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<213> Thermus thermophilus
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> source
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<222> (1)..(161)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /organism="Thermus
thermofilus"
\hskip1cm/mol_t ype="PRT"
\hskip1cm/strain="HB27"
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PURLIP directo empleado para
amplificar la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la
enzima heteróloga con actividad lipasa
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatccga atgctcttcc cccgggaggt
\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador PURLIP inverso empleado para
amplificar la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la
enzima heteróloga con actividad lipasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttt ctcgtcacac cccctcg
\hfill27
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<210> 4
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador LIP1K directo empleado para
amplificar la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la
enzima heteróloga con actividad lipasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttagatcta tgctcttccc ccgggaggtc
\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador LIP1K inverso empleado para
amplificar la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la
enzima heteróloga con actividad lipasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttggtacct tacttgtcat cgtcatcctt gtagtctctc gtcacacccc ctcgagg
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PFLAG-LIP
directo empleado para amplificar la secuencia de nucleótidos del gen
que codifica la enzima heteróloga con actividad lipasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaagagact acaaggatga cgatgacaag ctcttccccc gggaggtcct c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PFLAG-LIP
inverso empleado para amplificar la secuencia de nucleótidos del gen
que codifica la enzima heteróloga con actividad lipasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggacgctc gacggatcag cggccgctta tctcgtcaca ccccctcgag g
\hfill51
Claims (24)
1. Un polipéptido aislado con actividad lipasa
que comprende la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID
NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, donde
dicha lipasa es una lipasa termófila.
3. Polipéptido según la reivindicación 2, donde
dicha lipasa termófila es estable a una temperatura comprendida
entre 60 y 90ºC.
4. Una proteína de fusión que comprende
i) un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3; y
ii) al menos un péptido heterólogo.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Proteína de fusión según la reivindicación 4,
donde dicho péptido heterólogo se selecciona del grupo de un péptido
señal de secreción extracelular, un péptido de purificación o una
combinación de ambos.
6. Proteína de fusión según la reivindicación 5,
donde dicho péptido de purificación se selecciona entre un péptido
Flag o una cola de polihistidinas.
7. Una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una
proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a
6.
8. Una construcción génica que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7.
9. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7 o una
construcción génica según la reivindicación 8.
10. Vector de expresión según la reivindicación
9, que comprende, además, la secuencia de nucleótidos de un
promotor.
11. Vector de expresión según la reivindicación
10, donde dicho promotor es un promotor inducible o reprimible.
12. Vector de expresión según la reivindicación
11, donde dicho promotor es un promotor inducible por galactosa o
lactosa.
13. Vector de expresión según la reivindicación
11, donde dicho promotor es un promotor inducible por IPTG.
14. Vector de expresión según la reivindicación
11, donde dicho promotor es un promotor que se reprime en presencia
de glucosa.
15. Una célula que comprende una secuencia de
nucleótidos según la reivindicación 7 o una construcción génica
según la reivindicación 8 o un vector de expresión según cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 14.
16. Célula según la reivindicación 15, donde
dicha célula se selecciona entre una bacteria y una levadura.
17. Célula según la reivindicación 16, donde
dicha bacteria es Escherichia coli.
18. Célula según la reivindicación 16, donde
dicha levadura se selecciona entre Saccharomyces cerevisiae y
Kluyveromyces lactis.
19. Una composición que comprende un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
20. Un procedimiento para la obtención de un
polipéptido con actividad lipasa o una variante funcionalmente
equivalente del mismo que comprende cultivar una célula según
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 bajo condiciones que
permiten la producción de dicho polipéptido y, si se desea,
recuperar dicho polipéptido.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
donde cuando dicho polipéptido con actividad lipasa comprende la
secuencia de aminoácidos de un péptido de secreción extracelular, la
recuperación de dicho polipéptido se realiza a partir del medio de
cultivo.
22. Procedimiento según la reivindicación 20, en
donde la recuperación de dicho polipéptido con actividad lipasa se
realiza a partir de los extractos celulares.
23. Uso de un polipéptido según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según una
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en la elaboración de una
composición detergente.
24. Método para la modificación de grasas o
aceites que comprende poner en contacto un polipéptido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión
según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 con una grasa o
aceite en condiciones donde dicho polipéptido o proteína de fusión
pueda hidrolizar dicha grasa o aceite.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200900613A ES2354326B8 (es) | 2009-03-04 | 2009-03-04 | Lipasa termófila. |
Applications Claiming Priority (1)
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| ES200900613A ES2354326B8 (es) | 2009-03-04 | 2009-03-04 | Lipasa termófila. |
Publications (3)
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|---|---|
| ES2354326A1 true ES2354326A1 (es) | 2011-03-14 |
| ES2354326B1 ES2354326B1 (es) | 2011-12-23 |
| ES2354326B8 ES2354326B8 (es) | 2012-06-26 |
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ID=43626889
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| Country | Link |
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-
2009
- 2009-03-04 ES ES200900613A patent/ES2354326B8/es active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2354326B1 (es) | 2011-12-23 |
| ES2354326B8 (es) | 2012-06-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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