AT502990A1

AT502990A1 - Neues polypeptid mit esteraseaktivität, und rekombinante esterase sowie deren verwendung

Info

Publication number: AT502990A1
Application number: AT0208105A
Authority: AT
Original assignee: Dsm Fine Chem Austria Gmbh
Priority date: 2005-12-27
Filing date: 2005-12-27
Publication date: 2007-07-15
Also published as: CA2635380A1; JP2009521239A; SG170757A1; WO2007073845A3; HK1128306A1; WO2007073845A8; CN101351548B; US8642312B2; ES2383702T3; ATE549400T1; IL192400A; KR101388391B1; NO343225B1; US20120220014A1; CN101351548A; CA2635380C; IL192400A0; JP5119166B2; BRPI0621280A2; WO2007073845A2

Description

Neues Polypeptid mit Esteraseaktivität und rekombinante Esterase und deren Verwendung.
Die Erfindung betrifft ein neues Polypeptid mit Esteraseaktivität, im Besonderen mit 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureesterase-Aktivität, sowie ein enzymatisch aktives rekombinantes Protein mit Esteraseaktivität und deren Verwendung zur Racematspaltung von Enantiomerengemischen von 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäureestern.
Enantiomerenangereicherte 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäuren und deren Ester stellen wertvolle Intermediate zur Herstellung von Pharmazeutika dar, wie etwa für delta-Amino-gamma-hydroxy-omega-aryl-alkancarbonsäureamide,

die reninhemmende Eigenschaften aufweisen und als antihypertensive Mittel in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden können.
Esterasen werden im allgemeinen in der Racematspaltung und Asymmetrisierung eingesetzt.
Kommerziell erhältlich sind jedoch nur sehr wenige Esterasen, die sich zur
Herstellung von chiralen Verbindungen eignen.
Bekannt ist im präparativen Massstab die Verwendung von Esteraseextrakten aus
Schweineleber. Schweineleberesterase (PLE) wurde schon vor langer Zeit aus natürlichen Quellen isoliert und auch deren Aktivität ist schon seit längerem bekannt
(Simonds, J.P. (1919) Amer. J. Physiol. 48, 141; Bamann, E. et al. (1934) Hoppe-
Seyler Z. 229, 15; Falconer J.S. and Taylor, D.B. (1946) Biochem. J. 40, 831-834).
Es wurden auch schon verschiedene Studien durchgeführt, um PLE zu charakterisieren (Heymann, E. and Junge, W. (1979) Eur. J.

Biochem. 95, 509-518;
Lehner, R. and Verger, R. (1997) Biochemistry 36, 1861-1868).
Weiters konnte gezeigt werden, beispielsweise in WO 01/09079, dass
Esteraseextrakte aus Schweineleber das (R)-Enantiomere des 5-Chlor-2-(1methylethyl)-4-pentensäure-methylester selektiv hydrolisieren kann. Jedoch ist die Verwendung von solchen Esteraseextrakten aus natürlichen Quellen, wie Schweineleber, mit Nachteilen verbunden.
Erstens schwanken die Qualitäten der verschiedenen Batches und erschweren damit die Optimierung von technischen Prozessen.

Zweitens ist die Verwendung von tierischen Ressourcen in der Herstellung von pharmazeutischen Produkten nicht erwünscht, da die Anwesenheit von Viren und Prionen nicht grundsätzlich ausgeschlossen werden kann.
Aus diesen Gründen besteht der Bedarf an der Produktion von rekombinanten
Schweineleberesterasen mit standardisierter Qualität in Mikroorganismen.
Die Klonierung putativer Esterase-Gene ist beispielsweise in FEBS Lett. (1991), 293,
37-41 beschrieben. Die erste funktioneile Expression eines aktiven Schweineleberesterase-Enzyms ist erstmals in WO 02/48322 beschrieben.
WO 2004/055177 beschreibt die Herstellung von weiteren rekombinanten Esterasen durch Site Directed Mutagenesis der rekombinanten Schweineleber-Esterase Seq.
ID No.1 (rPLE) aus WO 02/48322.

Wie aus der Beschreibung von WO 2004/055177 und aus dem von denselben Erfindern verfassten Artikel in Protein Engineering, 16,
1139-1145, 2003, hervorgeht, wurden die Veränderungen der rPLE-Sequenz aus
WO 02/48322 so gewählt, dass eine rekombinante intestinale Schweineesterase
(PICE) bekannt aus David et al., (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148, erhalten wird.
Die Spaltung von racemischen 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureestern ist in keinem dieser Artikel beschrieben.
Da jedoch der Bedarf an biotechnologisch einfach herstellbaren Esterasen mit der gewünschten stereoselektiven Aktivität für 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäureestern nicht gedeckt ist, war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine entsprechende neue rekombinante Esterase bereitzustellen.
Beim Versuch das in FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 bzw.

WO 02/ 48322 beschriebene Gen für bekannte Schweineleberesterase (PLE) als cDNA ausgehend < von mRNA aus Schweineleber zu isolieren und zu klonieren, wurde neben der bekannten PLE-Sequenz noch eine zweite, neue Esterasesequenz gefunden. Nach Expression beider Sequenzen, bei der die entsprechenden Proteine bzw.

Esterasen, nämlich die bekannte rPLE und eine neue, rekombinante "alternative" Esterase (rAPLE) hergestellt wurde, zeigte sich unerwarteterweise, dass nur die rAPLE racemische 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureester selektiv spalten kann.
Somit konnte die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein neues Polypeptid mit Esteraseaktivität und eine neue rekombinante Esterase (rAPLE) gelöst werden, deren Aminosäuresequenz sich in 21 von insgesamt 548 Aminosäure von der bekannten PLE-Sequenz unterscheidet.
Die neue rAPLE unterscheidet sich in der Aminsäuresequenz auch von der bekannten Pig Intestinal Carboxyl Esterase (PICE) in 12 von insgesamt 548 Aminosäuren. PICE wird jedoch im Intestinaltrakt des Schweins gefunden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Polypeptid mit Esteraseaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Aminosäuresequenz SEQ.

ID. No. 1 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neues rekombinantes Protein mit Esteraseaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Aminosäuresequenz SEQ. ID. No. 1 aufweist.
Das Polypeptid und die erfindungsgemässe rekombinante rAPLE weisen die Fähigkeit auf, racemische 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureestem der Formel (I)
<EMI ID=4.1>

R1
(I) in der R einen CrC6-Alkylrest, Ri d-C4-Alkyl und X Chlor, Brom oder lod bedeuten, stereoselektiv zu spalten.
Das erfindungsgemässe Polypeptid mit Esteraseaktivität, sowie die neue rekombinante Esterase rAPLE unterscheiden sich, wie oben angeführt, in 21 von insgesamt 548 Aminosäure der bekannten Sequenz gemäss FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 bzw. in 12 von insgesamt 548 Aminosäuren vom bekannten PICE Protein gemäss David et al., (1998) Eur. J.

Biochem. 257, 142-148.
Die Sequenz des Proteins der neuen, erfindungsgemässen rAPLE unterscheidet sich in folgenden Aminosäurepositionen von der bekannten Sequenz des PLE-Proteins:
APLE
Position
PLE
Glu 73 - Asp lle 75 Val
Gly 76 Val
Gly 77 Glu
Leu 80 Thr
Arg 87 Gly lle. 92 Thr
Pro 93 Leu
Val 129 Leu
Ser 133 Pro
<EMI ID=4.2>
Thr 134 Met
-Jt, Leu 138 Val
Ala 139 Val
Phe 234 Leu
Ala 236 \l \
Gly 237 Ala
Phe 286 Leu
Ala 287 Thr
Leu 290 Phe
Pro 294 Gin
<EMI ID=5.1>
Thr 302 Pro
Das erfindungsgemässe Protein und die neue rekombinante rAPLE können dabei auch in einer veränderten Sequenz gemäss SEQ ID No 1 vorliegen, die beispielsweise durch übliche Modifikationen, wie etwa Austausch, Entfernen oder Anfügen von Aminosäure(n) in der Sequenz am N- oder C-Terminus, wie etwa GluAlaGluAla aus der [alpha]-Faktor Signalsequenz,

oder durch Fusion mit anderen Proteinen erhalten werden kann .
Die Erfindung umfasst weiters auch Muteine mit Änderungen innerhalb der Proteinsequenz des erfindungsgemässen Enzyms mit der entsprechenden Aktivität, insbesondere auf 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureestern. Muteine können beispielsweise durch Änderungen der DNA, die für das erfindungsgemässe Enzym kodiert, durch bekannte Mutagenesetechniken (Random Mutagenese, Site-directed Mutagenese, Directed evolution, Gene shuffling, u.s.w.), sodass die DNA für ein Enzym kodiert, das sich zumindest durch eine Aminosäure vom erfindungsgemässen Enzym unterscheidet, und anschliessender Expression der modifizierten DNA in einer geeigneten Wirtszelle erhalten werden.
Die Erfindung umfasst somit auch abgeänderte DNA-Sequenzen gemäss SEQ ID.

No 1, erhalten durch oben beschriebene Mutationen, Deletionen, Verlängerungen, Fusionen, und die für Enzyme mit der gewünschten Esteraseaktivität kodieren.

Esteraseaktivität, im Besonderen 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureesteraseAktivität, ist dabei als Fähigkeit Racemate von 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäureestern der Formel (I) zu spalten definiert.
Die Herstellung des erfindungsgemässen Polypeptides und der rekombinanten rAPLE kann wie nachfolgend beschrieben erfolgen:

Zuerst wird mRNA mittels eines geeigneten Kits aus Schweineleber isoliert und anschliessend die cDNA auf Basis des mRNA-Extraktes durch reverse Transkription generiert.
Im Anschluss daran werden spezifische PCR-Primer, basierend auf der Sequenz des bekannten Schweineleberesterase-Gens GenBank Accession No X63323
(Matsushima et al., 1991) hergestellt, worauf die Amplifikation und Klonierung erfolgt.
Diese spezifischen Primer sind:
Primer 1 : 5'-CAGA47TCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3'
Primer 2:

5'-CCGG,447TCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG -3'
Fett geschrieben ist dieser Teil der Primer, der die entsprechenden Nukleotidsequenzen codierend für das PLE-Proteins enthält und der zwingend in den Primern enthalten ist.
Der andere Sequenzteil der Primer enthält beispielsweise Informationen für Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen (in kursiver Schrift) oder Sequenzelemente, die für die Expression von Bedeutung sind. Dieser Teil kann bei der Herstellung der erfindungsgemässen rAPLE variieren.
Die Amplifikation erfolgt sodann mit den Primern 1 und 2 durch PCR-Methoden nach dem Stand der Technik.
Das PCR -Produkt wird anschliessend verwendet, um mit Methoden nach dem Stand der Technik Expressionskonstrukte für die heterologe Expression des codierten rAPLE Proteins in geeigneten Wirtsorganismen herzustellen.

Vorzugsweise wird dabei das PCR Produkt vorerst in geeignete Plasmidvektoren einkloniert. Die auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmide werden sodann in einen geeigneten Wirt, beispielsweise Escherichia coli, transformiert. Anschliessend werden Inserts von mehreren erhaltenen Klonen sequenziert.
Unerwarteterweise wurden dabei 2 Gruppen von rekombinanten Klonen mit unterschiedlichen Sequenzen identifiziert, wobei eine zu 100% identisch ist mit der erwarteten Sequenz für PLE gemäss Matsushima et al., (1991) FEBS Lett. 293, 3741 , und eine neue Nukleotid-Sequenz gemäss SEQ. ID. No. 2 (Sequenz APLE), die nach Expression zu der erfindungsgemässen Aminosäuresequenz SEQ. ID.

No. 1 führt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure bzw.
Nukleotidsequenz, die für das erfindungsgemässe Polypeptid und die rekombinante
Esterase rAPLE codiert.
Beispielsweise weist eine solche Nukleinsäure die Nukleotid-Sequenz gemäss SEQ.
Id. No. 2 auf.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleotidsequenzen, die eine
Nukleotidsequenz, die für das erfindungsgemässe Polypeptid und die rekombinante
Esterase rAPLE codiert oder die Nukleotid-Sequenz gemäss SEQ. Id.

No. 2, enthält.
Weiters können entsprechende Oligonucleotide, korrespondierend zu Nukleinsäuresequenzen gemäss vorliegender Erfindung, die für die erfindungsgemässe Esterase kodieren, durch standardisierte, synthetische Techniken, beispielsweise unter Verwendung von automatisierten DNASynthesizern, hergestellt werden.
Die rein synthetische Herstellung der Nukleinsäuresequenzen, die für die erfindungsgemässe Esterase kodieren, ist besonders für den Einsatz in der Herstellung von Pharmazeutika oder deren Intemnediate von Vorteil, da damit Enzyme aus nicht tierischen Quellen erhalten werden.

Nunmehr erfolgt die Expression der beiden gefundenen Sequenzen (PLE- und
APLE-Sequenz).
Die bekannte Schweineleberesterase (PLE, Swiss-Prot ID Q29550) enthält eine Nterminale Signalsequenz und ein C-terminales ER-Retentions Signal, die 4 letzten
Aminosäuren HAEL.
Um die bekannte PLE und die neue APLE zu exprimieren, werden Vektoren konstruiert, bei welchen die Sequenzen in geeignete Expressionssysteme eingebracht werden. Diese Expressionskonstrukte werden sodann in geeignete
Wirtszellen transformiert.
Geeignete Wirtszellen sind dabei beispielsweise Mikroorganismen, tierische Zelllinien und Pflanzen. Bevorzugt sind eukaryotische Mikroorganismen, besonders bevorzugt
Pilze.

Beispiele dafür sind Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris,
Kluyveromyces lactis oder Aspergillus sp..
Die Expression kann sekretorisch oder intrazellulär und sowohl induzierbar als auch konstitutiv erfolgen.
Vorzugsweise werden die Proteine in sekretorischer Weise exprimiert, wobei bevorzugt Vektoren konstruiert werden, bei welchen die Sequenzen der PLE und der
APLE N-terminal mit der [alpha]-Faktor Signalsequenz von S. cerevisiae verbunden werden.
Weiters können Konstrukte hergestellt, bei welchen das C-terminale Tetrapeptide
HAEL, das als ER-Retentionssignal dient, wie es beispielsweise in Hardwick et al.,
(1990) EMBO J.

9, 623-630, beschrieben ist, zusätzlich entfernt ist.
Eine weitere bevorzugte Expression ist die induzierbare Expression von Konstrukten mit oder ohne ER-Retensionssignal.
Unerwarteterweise lassen sich auch Konstrukte mit dem ER-Retentionssignal exprimieren und führen zu einer rAPLE die racemische 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäureesternselektiv spalten können.
Die aus der Nukleotidsequenz des APLE-Gens abgeleitete Aminosäuresequenz der neuen Esterase rAPLE ist durch SEQ ID No. 1 dargestellt. Unerwarteterweise konnte festgestellt werden, dass das neue Polypeptid bzw. das rAPLE-Protein im Gegensatz zu der bekannten rPLE, jeweils erhalten durch Expression der für APLE bzw.

PLE codierenden DNA-Abschnitte, beispielsweise in P. pastons Zellen, racemische 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureester stereoselektiv spalten kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist demnach die Verwendung des Polypeptides mit Esteraseaktivität bzw. der erfindungsgemässen rekombinanten Esterase (rAPLE), die eine zumindest 80%ige Identität mit der Sequenz gemäss SEQ ID No 1 aufweisen, zur Racematspaltung von 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäureestern der Formel (I)
R
R1
<EMI ID=9.1>
O 0) in der R einen CrC[beta]-Alkylrest, R- C[iota]-C4-Alkyl und X Chlor, Brom oder lod bedeuten.
Bevorzugt weisen das Polypeptid mit Esteraseaktivität bzw. die erfindungsgemässe rekombinante Esterase (rAPLE) eine zumindest 90%ige, besonders bevorzugt eine zumindest 98%ige Identität mit der Sequenz des Porteins gemäss SEQ ID No 1 auf.

Es können auch Polypeptid mit Esteraseaktivität bzw. die erfindungsgemässe rekombinante Esterase (rAPLE) mit abgeänderten DNA-Sequenzen gemäss SEQ ID. No 1, erhalten durch übliche Modifikationen, wie etwa Mutationen, Deletionen, Verlängerungen, Fusionen, die für Enzyme mit der gewünschten Esteraseaktivität kodieren, eingesetzt werden.
Dabei werden enantiomeren-angereicherte 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäuren oder deren Ester der Formel (II)
<EMI ID=9.1>

R1
<EMI ID=10.2>
O (I) in der R, R1und X wie oben definiert sind, mittels dem erfindungsgemässen Polypeptid bzw.

der erfindungsgemässen rAPLE in Gegenwart von Wasser oder einem Alkohol der Formel R2OH, wobei R2eine Alkylgruppe bedeutet, die nicht gleich R1ist, als Nukleophil umgesetzt wird und a) entweder der verbleibende enantiomeren-angereicherte 2-Alkyl-5-halogen-pent-4en-carbonsäureester der Formel (II), mit A gleich R1, isoliert wird oder b) falls als Nukleophil ein Alkohol eingesetzt wird, der entstehende enantiomerenangereicherte 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureester der Formel (II) oder (II), mit A gleich R2isoliert wird oder c) falls als Nukleophil Wasser eingesetzt wird, die entstehende 2-Alkyl-5-halogenpent-4-en-carbonsäure der Formel (II), mit A gleich H, isoliert wird.
In der Formel (II) bedeutet R einen CrC6-Alkylrest, wie etwa Methyl, Ethyl, n- und i-
Propyl, n-, i- und t-Butyl, Pentyl und Hexyl.
Bevorzugt sind C[iota]-C4-Alkylreste,

besonders bevorzugt ist der i-Propylrest.
A bedeutet H, R1, wobei R1einen C[iota]-C4-Alkylrest bedeutet, bevorzugt einen C1-C2-
Alkylrest und besonders bevorzugt einen Methylrest, oder R2, wobei R2 eine
O
(ii) in der R einen CrC[beta]-Alkylrest, A gleich H, R-i, wobei Ri C[iota]-C4-Alkyl sein kann, oder R2, wobei R2eine Alkylgruppe ist, aber nicht gleich R1ist, und X Chlor, Brom oder lod bedeutet, erhalten, in dem ein Enantiomerengemisch eines 2-Alkyl-5-halogenpent-4-en-carbonsäureesters der Formel (I)
R
X^s[iota]s¯^ s [lambda]
<EMI ID=10.2>

Alkylgruppe bedeutet, die nicht gleich Ri ist.

R2bedeutet bevorzugt einen CrC6-
Alkylrest.
X steht für Chlor, Brom oder lod, bevorzugt für Chlor.
Unter enantiomeren-angereicherten Verbindungen sind dabei solche zu verstehen, die einen Enantiomerenüberschuss (ee) von > 80%, bevorzugt von 90% und besonders bevorzugt von > 97% aufweisen.
Das erfindungsgemässe Enzym kann dabei in jeglicher Form verwendet werden.

Beispielsweise als Dispersion, als Lösung, immobilisiert, als rohes Enzym, als Enzym, das aus seiner Quelle durch Kombination von bekannten Reinigungsmethoden erhalten wurde, als ganze Zellen (gegebenenfalls immobilisiert und/oder permeabilisiert), die die erforderliche enzymatische Aktivität (natürlich oder durch genetische Modifikationen) besitzen oder in einem Lysat solcher Zellen.
Normalerweise liegt die Reaktionstemperatur für die erfindungsgemässe Umsetzung zwischen 0 und 90[deg.]C, bevorzugt zwischen 10 und 60[deg.]C.

Der pH-Wert der Reaktionslösung liegt zwischen 4 und 11 , bevorzugt zwischen 6 und 9.
Die Wahl des Lösungsmittels hängt vom eingesetzten Nukleophil ab.
Ist beispielsweise Wasser das Nukleophil, kann als Lösungsmittel Wasser, ein
Gemisch von Wasser mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, beispielsweise mit einem Alkohol, wie etwa Methanol, Ethanol, Isopropanol, t.-
Butanol, u.s.w., Dioxan, Tetrahydrofuran, Aceton oder Dimethylsulfoxid oder ein
Zwei-Phasensystem aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren
Lösungsmittel, beispielsweise einem Aromaten, wie etwa Toluol, Xylol, uis.w., einem
Alkan, wie etwa Hexan, Heptan, Cyclohexan, u.s.w., Ether, wie etwa
Diisopropylether, Methyl-t.butylether, u.s.w., eingesetzt werden.
Ist das Nukleophil ein Alkohol, so wird als Lösungsmittel bevorzugt der Alkohol R2OH eingesetzt, wobei R2eine Alkylgruppe ist,

die jedoch nicht gleich Ri ist. Es können **aber auch Gemische des Alkohols mit einem organischen Lösungsmittel, wie etwa Tetrahydrofuran, Heptan, Toluol, Hexan, CH3CN, Methyl-t.butylether, u.s.w., verwendet werden.
Nach erfolgter enzymatisch katalysierter Racematspaltung erfolgt die Isolierung des gewünschten Endproduktes.
Dies kann entweder der verbleibende enantiomeren-angereicherte 2-Alkyl-5halogen-pent-4-en-carbonsäureester der Formel (II), mit A gleich Ri, oder falls
Wasser das Nukleophil ist, die gebildete enantiomeren-angereicherte 2-Alkyl-5halogen-pent-4-en-carbonsäure der Formel (II), mit A gleich H, oder falls der Alkohol das Nukleophil ist, der enantiomeren-angereicherte 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäureester der Formel (II), mit A gleich R2.
Die Isolierung kann beispielsweise durch übliche Methoden, wie etwa Extraktion,
Kristallisation,

Säulenchromatographie, Destillation, u.s.w. erfolgen.
Durch das erfindungsgemässe Verfahren werden die entsprechenden Säuren oder
Ester der Formel (I) in theoretischen Ausbeuten von bis zu 98% Ausbeute und mit einem e.e. von bis zu >99% erhalten.
Beispiel 1: mRNA Isolierung und Generierung von cDNA
0,7 g schlachtfrische Schweineleber, erhalten aus einem lokalen Schlachthof, wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, mit einem Mörser homogenisiert und die freigesetzte mRNA unter Verwendung des Fast Track mRNA Extraktions Kit 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) gemäss den vom Hersteller gemachten Angaben isoliert bzw. extrahiert (Fast Track 2.0 Kit Manual; Version J; 082301 ; 25-0099).

Die Extraktion ergab eine Gesamtmenge von 12,9 [mu]g an mRNA.
0,26 [mu]g dieser mRNA wurden sodann als Template zur Generierung von cDNA mittels<'>SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR<'>nach Herstellerangaben verwendet.
Beispiel 2: Amplifikation und Klonierung von cDNA Fragmenten aus Schweineleber
Es wurden spezifische Primer, basierend auf der Sequenz des Schweineleberesterase-Gens GenBank Acession No X63323 (Matsushima et al., 1991) hergestellt:
Primer 1 : 5 DAG[Lambda][Lambda]7TCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3' (SEQ ID. No. 3) Primer 2: 5'-CCGG,4[Lambda]77CAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG -3' (SEQ ID No. 4) Fett geschrieben sind Basen homolog zur bekannten PLE-Sequenz. Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen sind kursiv hervorgehoben.

Die Amplifikation erfolgte in einem 50 [mu]l Ansatz mit 1 U Phusion DNA Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland), mit 500 ng cDNA als Template, je 20 [mu]mol Primer 1 und 2, 5 [mu]l eines dNTP-Mix (je 2 mM), alles in 1x Phusion HF Puffer entsprechend dem 'Phusion High-Fidelity DNA Polymerase<'>-Manuals (Finnzymes), beginnend mit einem 30-sekündigen Denaturierungsschritt bei 98[deg.]C, gefolgt von 30 Zyklen (10 sec 98[deg.]C, 20 sec 68[deg.]C, 1 min 72[deg.]C) zur Amplifikation und einer abschliessenden Inkubation für 8 min bei 72[deg.]C zur Herstellung vollständiger Produkte.

Durch diese PCR wurde ein DNA-Fragment in der Grösse von 1,8 kb (festgestellt durch Agarose Gelelektrophorese) erhalten.
Diese PCR-Produkt wurde sodann mittels 'Quiaquick Kit'(Quiagen, Hilden, Germany) entsprechend dem beigefügten Manual gereinigt.
Etwa 0,1 [mu]g des gereinigten PCR-Produktes wurden mit der
Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten und in die Plasmidvektoren pHILZ und pHIL-D2 über die EcoRI Schnittstellen einkloniert.
Die Vektoren wurden dann in TOP10 electrocompetent cells, hergestellt gemäss
<'>Current Protocols in Molecular Biology<'>transformiert.
Inserts von mehreren resultierenden Klonen wurden unter Verwendung des 'Dye
Deoxy Terminator Cycle Sequencing'Kits (Applied Biosystems Inc., Forster City,
Calif., USA) sequenziert
Dabei wurden zwei Sequenzen identifiziert, wobei die eine zu 100% der erwarteten durch Matsushima et al., (1991) FEBS Lett.

293, 37-41, publizierten Sequenz entsprach und die andere Sequenz entsprechend SEQ ID No 2.
Beispiel 3: Einführen der [alpha]-Faktor Signalsequenz und Variationen des Cterminalen Endes.
Um das bekannte Protein PLE und das erfindungsgemässe Protein rAPLE in sekretorischer Weise exprimieren zu können, wurden Vektoren konstruiert, bei welchen die Sequenz von PLE und APLE N-terminal mit der [alpha]-Faktor Startsequenz des cloning Vektors pPICZ [alpha] (Invitrogen) verbunden wurde. Zusätzlich wurden Konstrukte hergestellt, bei welchen das C-terminale Tetrapeptid HAEL entfernt wurde.
PCR I: Das Primerpaar EcoRlalpha1/alphaPLE2 wurde zur Amplifizierung der [alpha]Faktor Signalsequenz des cloning Vektors pPICZ [alpha] (Invitrogen) verwendet.

Die PCR wurde in einem 50 [mu]l Ansatz (2 ng Template, je 0,5 [mu]M Primer, 0,2 mM dNTPs, 1U der Phusion DNA-Polymerase (Finnzymes), alles in 1x Phusion HF Puffer entsprechend dem<'>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase<'>Manual (Finnzymes)) durchgeführt.
Nach einer 3-minütigen Denaturierung bei 95[deg.]C, wurde die Amplifikation in 30 Zyklen
(30 sec 95[deg.]C, 30 sec 57[deg.]C, 15 sec 72[deg.]C) und einem abschliessenden Schritt für 7 min bei 72[deg.]C erreicht.
PCR II:

Die PLE und APLE Sequenzen wurden von pHILZ Plasmiden unter
Verwendung entweder des Primerpaares PLEalpha1/EcoRIPLE+ER2 oder des
Primerpaares PLEalpha1/EcoRIPLE2 (Deletion des C-terminalen HAEL
Tetrapeptides) amplifiziert.
Diese PCRs wurden wiederum in 50 [mu]l Ansätzen ( 2 ng Template, je 0,5 [mu]M Primer,
0,2 mM dNTPs, 1U der Phusion DNA-Polymerase (Finnzymes), alles in 1x Phusion
HF Puffer entsprechend dem 'Phusion High-Fidelity DNA Polymerase'Manual
(Finnzymes) durchgeführt.
Nach einer 3-minütigen Denaturierung bei 95[deg.]C, wurde die Amplifikation in 30 Zyklen
(30 sec 95[deg.]C, 30 sec 57[deg.]C, 15 sec 72[deg.]C) und einem abschliessenden Schritt für 7 min bei 72[deg.]C erreicht.
PCR III:

3 [mu]l der Produkte von PCR I und PCR II wurden zur Kombination dieser beiden Produkte durch primerlose PCR verwendet.
Die Verlängerung wurde in einem 45 [mu]l Ansatz mit 0.2 mM dNTPs, 1 U der Phusion
DNA-Polymerase (Finnzymes), alles in 1x Phusion HF Puffer durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde für 3 Minuten auf 95[deg.]C erwärmt und dann wurden 10
Zyklen mit 30 sec bei 95[deg.]C und 45 sec bei 72[deg.]C durchgeführt. Zur Amplifikation dieser überlappenden Verlängerungsprodukte wurden 5 [mu]l Primermix (3 [mu]l Wasser, 1 [mu]l 5 [mu]M Primer EcoRlalphal und 1 [mu]l 5 [mu]M Primer EcoRIPLE+ER2 oder EcoRIPLE2) zugesetzt.

Die Produkte wurden mit 20 PCR-Zyklen (30 sec 95[deg.]C, 30 sec 57[deg.]C, 1 min 72[deg.]C) und einem einzelnen Temperaturstop für 7 min bei 72[deg.]C amplifiziert.
Primer-Sequenzen:
EcoRlalphal : 5^TCTTCGAAG4 7TCACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3'
(SEQ ID No. 5) alphaPLE2: 5'-GAGGCTGGCTGCCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'
(SEQ ID No. 6)
PLEalphal : 5'-AGAGAGGCTGAAGCTGGGCAGCCAGCCTCGCCG-3'
(SEQ ID No. 7)
EcoRI PLE+ER2: 5'-ATGGTACCGAA TTCTCACAGCTCAGCATGCTTTATCTTG-S'
(SEQ ID No. 8)
EcoRIPLE2: 5<,>-ATGG7>^CCG ^47TCTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTG-3<,>
(SEQ ID No. 9)
Bereiche mit Homologie zu den Templates in Fettdruck, Erkennungssequenzen für
Restriktionsendonukleasen in kursiver Schrift.
Beispiel 4:

Konstruktion von Expressionskonstrukten für die heterologe Expression von Schweineleberesterasen in Pichia pastons
Die überlappenden Extensions-PCR-Produkte aus Beispiel 3 wurden mittels
<'>Qiaquick Kit'(Qiagen, Hilden, Germany) gemäss dem beigelegten Manual gereinigt.
Etwa 0,1 [mu]g der gereinigten PCR-Produkte wurden mittels Restriktionsendonuklease
EcoRI geschnitten und in den Plasmidvektor pGAPZ A (Invitrogen) über die EcoRI-
Schnittstelle einkloniert.
Die korrekte Orientierung des Inserts zu den Promotoren wurde mit Hilfe von
Kontrollschnitten, beispielsweise mit Ncol, geprüft.
In jedem Fall wurde ein Klon mit korrekt orientiertem Insert ausgewählt, sequenziert und konserviert.
Die entsprechenden Plasmide wurden wie folgt benannt:

Plasmide, die die bekannte PLE-Sequenz gemäss Matsushima et al., (1991) FEBS
Lett. 293, 37-41, enthielten wurden pGAPZ A PLE-ER (das HAEL Tetrapeptid wurde entfernt) und pGAPZ A PLE+ER (HAEL Tetrapeptid noch vorhanden) genannt. Plasmide, die sich von der neuen APLE Sequenz ableiteten wurden pGAPZ A APLEER (das HAEL Tetrapeptid wurde entfernt) und pGAPZ A APLE+ER (HAEL Tetrapeptid noch vorhanden) genannt.
Beispiel 5: Konstitutive Expression von Schweineleberesterasen in Pichia pastons
Die Plasmide pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER und pGAPZ A APLE+ER wurden in P.pastoris X-33 transformiert. Die Transformation erfolgte nach den Vorschriften des Protokolls des Pichia Expressions Kit von Invitrogen.

Die Selektion von Transformanten erfolgte auf YPD-Platten (1% Hefeextrakt, 2%Pepton, 2% D-Glukose, 2% Agar), die 100mg/l Zeocin enthielten. 52 Zeocin-resistente Klone wurden auf YPD-Platten mit 100 mg/l Zeocin ausgestrichen und in 15% Glycerol konserviert.
Beispiel 6: Qualitative Analyse der Esteraseaktivität
P.pastoris Transformanten wurden auf YPD-Platten mit 100 mg/l Zeocin für 48 h bei 30[deg.]C angezüchtet. Die Zellen wurden auf Whatman 541 hardened ashless 7Omm0 Filter abgehoben und luftgetrocknet.

Die Filter wurden mit einer Lösung aus 6 mg [alpha]Naphthylacetat (Sigma, gelöst in 500 [mu]l Aceton), 2,5 mg tetrazodiertem o-Dianisidin (Fast Blue Salt BN, Sigma, gelöst in 125 [mu]l Wasser) und 5 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7, inkubiert, um die Esteraseaktivität durch Farbreaktion zu visualisieren.
Aktivitäten wurden in allen Transformanten detektiert, die eines der 4 Plasmiden pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER und pGAPZ A APLE+ER integriert hatten. Dies beweist die Expression von funktionalen Proteinen mit Esteraseaktivität. Zur Kontrolle wurde auch ein Klon mit integriertem leerem Vektor auf gleiche Weise getestet.

Hier konnte im vergleichbaren Reaktionszeitraum keine signifikante Esteraseaktivität gesehen werden.<"> Beispiel 7: Stereoselektive Esteraseaktivität bezüglich 5-Chlor-2-(1methylethyl)-4-pentensäure-methylester
P.pastoris Transformanten, wie in Beispiel 6 beschrieben, wurden auf YPD-Platten mit 100 mg/l Zeocin für 48 h bei 30[deg.]C angezüchtet. Die Zellen wurden auf Whatman 541 hardened ashless 7Omm0 Filter abgehoben und luftgetrocknet. Die Filter wurden entweder mit Substratlösung A (100 [mu]l razemischer 5-Chlor-2-(1methylethyl)-4-pentensäure-methylester, 200 [mu]l 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8; 150 [mu]l 10 mg/ml Phenolrot; 450 [mu]l DMSO; 650 [mu]l H2O) oder mit Substratlösung B (identisch mit Lösung A, jedoch wurde (2S,4E)-5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4pentensäure-methylester anstelle des Razemats eingesetzt).

Aufgrund der spezifischen Esteraseaktivität auf die Substrate resultiert die Säurefreisetzung bei Hydrolyse des Estersubstrates in einer pH-Abnahme, die wiederum zu einer Änderung der Farbe des Indikators Phenolrot zu gelb führt. Dabei stellte sich heraus, dass Transformanten, die das Plasmid pGAPZ A APLE-ER enthielten, nach Inkubation für 3 bis 4 Stunden Signale (Gelbfärbung um Kolonie) gaben, wenn sie auf Substratlösung A getestet wurden, während bei Substrat Lösung B keine signifikante Konversion festgestellt werden konnte.

(Figur 1) Transformanten, die mit den Plasmiden pGAPZ A PLE-ER oder pGAPZ A PLE+ER erhalten wurden, zeigten unter denselben Bedingungen keine Reaktion mit den Substratlösungen A oder B.
Dies zeigte, dass die rekombinante rAPLE eine andere Substratspezifität als rekombinante rPLE aufweist und dass die Hydrolyse von 5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4pentensäure-methylester mittels rAPLE stereoselektiv für das (R)-Enantiomere erfolgt. Beispiel 8: SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese
10 [mu]l eines 2x SDS-Proben puffere (125 mM Tris-HCI, pH 6,8; 4% SDS, 20% Glycerol, 5 % ss-Mercaptoethanol, 0,05% Bromphenolblau) wurden zu 10 [mu]l kommerziell erhältlicher Schweineleberesterase oder 10 [mu]l der 60-fach konzentrierten (Centricon Ultrafiltrations-Spin Columns, Fa.

Sartorius) Überstände der P. pastoris Kulturen (72 h bei 100 rpm und 28[deg.]C in 250 ml YPD-Medium in 2 I Schikanenerlenmeyerkolben), die entweder das Plasmid pGAPZ A APLE-ER oder ein leeres pGAPZ A Plasmid (Kontrollstamm) enthielten, zugesetzt. Nach dem Erhitzen der Proben auf 95[deg.]C für 5 Minuten, wurden die Proteine auf einem 12.5% Polyacrylamidgel (4%iges Sammelgel) getrennt und zum Nachweis mit Coomassie Brilliant Blue R250 angefärbt. Die SDS-PAGE zeigt eine Proteinbande bei der erwarteten Grösse für rAPLE (¯ 60 kDa) im Hefestamm mit dem pGAPZ A APLE Plasmid, aber nicht im Kontrollstamm (Figur 2).
Die zum Vergleich mitanalysierte kommerziell erhältliche Schweineleberesterase zeigte zwei Proteinbanden im gleichen Grössenbereich.

(Pfeil in Figur 2)
Beispiel 9: Induzierte Expression von Schweineleberesterasen mit dem AOX1 Promotor
Die Plasmide pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER und pGAPZ A APLE+ER wurden mit der Restriktionsendonuklease Xhol geschnitten und die respektiven Fragmente codierend für APLE und PLE-Proteine, mit oder ohne ERRetentionssignal, wurden über die Xhol Schnittstelle in den pPIC9-Vektor (Invitrogen) einkloniert. Die korrekte Orientierung der Fragmente zum AOX1 Promotor wurde mit Hilfe von Kontrollschnitten mit Restriktionsendonuklease Ncol, geprüft. Die Vektoren mit AOX1 Promotor, wurden in Analogie zu den in Beispiel 4 genannten Plasmiden pPIC9 PLE-ER, pPIC9 PLE+ER, pPIC9 APLE-ER und pPIC9 APLE+ER genannt, mit Sah linearisiert und in P. pastoris KM71 transformiert.

Transformation und Selektion auf His-Prototrophie erfolgten nach den Vorschriften des Pichia Expressions Kit von Invitrogen. Ausgewählte Transformanten und der KM71 -Stamm wurden gemäss Pichia Expressions Kit von Invitrogen über Nacht auf Vollmedium angezüchtet und 48 h mit 1 % Methanol induziert. Die erhaltenen Kulturen wurden mittels des in Beispiel 7 beschriebenen qualitativen pH-Shift Assay analysiert wobei in den Ansätzen jeweils 2 [mu]l der Kulturen getestet wurden Die Expression unter Kontrolle des induzierbaren AOX1 Promotors führte, im Vergleich zu der in Beispiel 7 für konstitutive Expression beschriebenen Situation, zu sehr viel höheren Enzymaktivitäten von rAPLE gegenüber razemischem 5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4pentensäure-methylester. Bereits nach wenigen Minuten konnte der Farbumschlag von Phenolrot (rot zu gelb) erkannt werden (Figur 3).

Unerwarteterweise war die Aktivität von rAPLE unabhängig von der Anwesenheit des ER-Retentionssignals HAEL am C-Terminus, d.h. auch Zellen, die rAPLE mit ER-Retentionssignal exprimierten zeigten Aktivität. Dagegen hatten Hefestämme zur Produktion von rPLE keine Aktivität gegenüber razemischem 5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4-pentensäuremethylester.

Claims

> mt Patentansprüche

1. Polypeptid mit Esteraseaktivität, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz SEQ. ID. No. 1 aufweist.

1 ,2,3 oder 4, in Gegenwart von Wasser oder einem Alkohol der Formel R2OH, wobei R2eine Alkylgruppe bedeutet, die nicht gleich Ri ist, als Nukleophil umgesetzt wird und a) entweder der verbleibende enantiomeren-angereicherte 2-Alkyl-5-halogen-pent4-en-carbonsäureester der Formel (II), mit A gleich Ri, isoliert wird oder b) falls als Nukleophil ein Alkohol eingesetzt wird, der entstehende enantiomerenangereicherte 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureester der Formel (II) oder (II), mit A gleich R2isoliert wird oder c) falls als Nukleophil Wasser eingesetzt wird, die entstehende 2-Alkyl-5-halogenpent-4-en-carbonsäure der Formel (II), mit A gleich H, isoliert wird.

O.Z.1302-a 22.12.2005 <EMI ID=23.2> <EMI ID=23.1>

DSM Fine Chemicals Austri[beta]^Nfg GmbH & Co KG <EMI ID=23.1> <EMI ID=23.2>

m

Patentansprüche

2. Rekombinantes Protein mit Esteraseaktivität, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz SEQ. ID. No. 1 aufweist.

2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureesters der Formel (I)

R

R1 <EMI ID=22.3> in der R, Ri und X wie oben definiert sind, mittels eines Polypeptides oder einer rekombinanten Esterase gemäss Anspruch

3. Polypeptid oder rekombinantes Protein, das eine zu der Aminosäuesequenz gemäss SEQ ID No. 1 zumindest 80%ige Identität aufweist, mit Aktivität zur Racematspaltung von 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureestem der Formel (I)

R

o

(i) in der R einen C C[beta]-Alkylrest, R-[iota] CrC4-Alkyl und X Chlor, Brom oder lod bedeuten.

3. Polypeptid oder rekombinantes Protein, das eine zu der Aminosäuesequenz gemäss SEQ ID No. 1 zumindest 80%ige Identität aufweist, mit Aktivität zur Racematspaltung von 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureestern der Formel

(D <EMI ID=21.1>

R1

(I) in der R einen C[iota]-C6-Alkylrest, Ri CrC4-Alkyl und X Chlor, Brom oder lod bedeuten.

4. Polypeptid oder rekombinantes Protein mit Esteraseaktivität gemäss einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine durch übliche Modifikationen aus der Gruppe Mutation, Deletion, Insertion, Verlängerung und/oder Fusion, abgeänderte Aminosäuresequenz aufweist.

5. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 oder ein rekombinantes Protein gemäss Anspruch 2 codiert.

6. Nukleotidsequenz, die die Sequenz gemäss SEQ ID No. 2 aufweist.

NACHGÖ^SÜ R1 <EMI ID=25.1> O

(I) in der R einen CrC6-Alkylrest, Ri C C4-Alkyl und X Chlor, Brom oder lod bedeuten.

9. Verfahren zur Herstellung von enantiomeren-angereicherten 2-Alkyl-5-halogenpent-4-en-carbonsäuren oder deren Ester der Formel (II)

R x^s-^^

6. Nukleotidsequenz, die die Sequenz gemäss SEQ ID No. 2 aufweist.

7. Nukleotidsequenz, die eine Nukleotidsequenz gemäss Anspruch 5 oder 6 enthält.

8. Verwendung eines Polypeptids oder eines rekombinanten Proteins gemäss Anspruch 1 ,2, 3 oder 4 zur Racematspaltung von 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-encarbonsäureestern der Formel (I)

R

R1 <EMI ID=22.1> in der R einen C[iota]-C6-Alkylrest, Ri d-C4-Alkyl und X Chlor, Brom oder lod bedeuten.

R <EMI ID=22.2> in der R einen CrC6-Alkylrest, A gleich H, Ri, wobei Ri C[iota]-C4-Alkyl sein kann, oder R2, wobei R2eine Alkylgruppe ist, aber nicht gleich Ri ist, und X Chlor, Brom oder lod bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enantiomerengemisch eines

8. Verwendung eines Polypeptids oder eines rekombinanten Proteins gemäss An spruch 1,2, 3 oder 4 zur Racematspaltung von 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en carbonsäureestern der Formel (I)

R <EMI ID=25.1>

A <EMI ID=25.2> O

ÖD in der R einen CrC6-Alkylrest bedeutet und

A gleich H ist oder R, mit Ri gleich C[iota]-C4-Alkyl oder R2, wobei R2eine Alkylgruppe, aber nicht gleich Ri ist, bedeutet und

X Chlor, Brom oder lod bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enantiomerengemisch eines 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureesters der Formel (I)

R X^ S[Iota]^ ' <EMI ID=25.2> , <EMI ID=25.3> R1 O

(D in der R, Ri und X wie oben definiert sind, <EMI ID=25.3>

' ,

NACHGEREICHT . mattels e<i>nes Polypeptides eder einer rekombinanten Esterase gemäss Anspnac 1.2.3 oder 4. in Gegenwart von Wasser oder einem Alkohol der Formel R2OH wobei R2eine Alkylgruppe bedeutet, die nicht gleich R, ist, als Nukleophil mg setzt wird und<y>

a) entweder der verbleibende enantiomeren-angereicherte 2-Alky,.5-halogen-pent4-en-carbonsäureester der Formel (II), mit A gleich R,, isoliert wird oder b) falls als Nukleophil ein Alkohol eingesetzt wird, der entstehende enantiomerenangereicherte 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäureester der Formel (II) oder (II), mit A gleich R2isoliert wird oder c) falls als Nukleophil Wasser eingesetzt wird, die entstehende 2-Alkvl-5-halogenpent-4-en-carbonsäure der Formel (II), mit A gleich H, isoliert wird.

O.Z.1302-a 04.12.2006

DSM Fine Che m-icals i <EMI ID=26.1> & Co KG

NACHGEREICHT