KR20080093109A

KR20080093109A - 에스터라제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 재조합 에스터라제및 그의 용도

Info

Publication number: KR20080093109A
Application number: KR1020087018341A
Authority: KR
Inventors: 게르하르드 스테인바우어; 마이클 스태네크; 피터 포자리에브; 볼프강 스크랭크; 헬무트 슈밥; 마르셀 부볼쯔; 요아네스 키어켈스; 헤랄드 피칠러; 마누엘라 헤르만; 크리스토프 젠즈메이어
Original assignee: 데에스엠 피네 케미칼스 오스트리아 엔에프게 게엠베하 운트 코 카게
Priority date: 2005-12-27
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2008-10-20
Also published as: NO343225B1; JP5119166B2; IL192400A; ES2383702T3; WO2007073845A8; IL192400A0; US8158393B2; BRPI0621280A2; WO2007073845A2; CN101351548A; JP2009521239A; US20120220014A1; BRPI0621280A8; NO20082864L; HK1128306A1; CN101351548B; ATE549400T1; WO2007073845A3; SG170757A1; EP1966373B1

Abstract

아미노산 서열번호 1을 나타내는, 에스터라제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 재조합 단백질 및 그의 용도.

Description

에스터라제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 재조합 에스터라제 및 그의 용도{POLYPEPTIDE HAVING ESTERASE ACTIVITY AND RECOMBINANT ESTERASE AND USE THEREOF}

본 발명은 에스터라제 활성, 특히 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실에스터라제 활성을 갖는 신규 폴리펩티드, 및 에스터라제 활성을 갖는, 효소적으로 활성인 재조합 단백질, 및 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터 거울상이성질체 혼합물의 라세메이트를 분리하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 및 그의 에스터는, 예를 들면, 레닌-억제 특성을 가지며 약학 제제에 항고혈압제로 사용될 수 있는 델타-아미노-감마-하이드록시-오메가-아릴알케인카복스아마이드와 같은 의약품을 제조하는데 유용한 중간체이다.

에스터라제는 일반적으로 라세메이트의 분리 및 비대칭화에 사용된다. 그러나, 키랄 화합물을 제조하기에 적합한 매우 적은 수의 에스터라제만이 상업적으로 시판된다. 제조 규모상의 돼지 간으로부터의 에스터라제 추출물의 용도가 알려져 있다. 돼지 간 에스터라제(pig liver esterase, PLE)는 오래 전에 천연 공급원으로부터 분리되었으며, 그의 활성도 또한 오랫동안 알려져 왔다(문헌 [Simonds, J.P., Amer . J. Physiol., 48, 141, 1919; Bamann, E. et al., Hoppe - Seyler Z., 229, 15, 1934; Falconer J.S. and Taylor, D.B., Biochem . J., 40, 831-834, 1946]).

PLE를 특성화하기 위해 이미 다양한 연구가 또한 수행되었다(문헌 [Heymann, E. and Junge, W., Eur . J. Biochem., 95, 509-518, 1979; Lehner, R. and Verger, T., Biochemistry, 36, 1861-1868, 1997]). 또한, 예를 들면, WO 01/09079 호에서는 돼지 간으로부터의 에스터라제 추출물이 메틸 5-클로로-2-(1-메틸에틸)-4-펜테노에이트의 (R) 거울상이성질체를 선택적으로 가수분해할 수 있음을 밝히는 것도 가능하였다.

그러나, 돼지 간과 같은 천연 공급원으로부터의 상기 에스터라제 추출물의 사용은 단점이 있다. 먼저, 상이한 배치의 질이 달라지므로 산업 공정을 최적화하는 것이 어렵게 된다. 두 번째로, 약학 제품의 제조에 있어 동물 자원의 사용이 바람직하지 않은데, 그 이유는 바이러스 및 프리온의 존재가 항상 배제될 수 없기 때문이다. 이러한 이유로, 미생물에서 표준화된 품질의 재조합 돼지 간 에스터라제를 생산할 필요가 있다. 추정상의 에스터라제 유전자의 클로닝은, 예를 들면, 문헌 [FEBS Lett., 293, 37-41, 1991]에 기술되어 있다. 활성 돼지 간 에스터라제 효소의 첫 번째 작용성 발현은 WO 02/48322 호에서 처음으로 기술되었다. WO 2004/055177 호는 WO 02/48322 호에서의 서열번호 1의 재조합 돼지 간 에스터라 제(rPLE)의 부위 지향 돌연변이유발에 의한 또 다른 재조합 에스터라제의 제조를 기술하고 있다. WO 2004/055177 호의 설명 및 문헌 [Protein Engineering, 16, 1139-1145, 2003]에서의 동일 발명자의 논문으로부터 명백하듯이, WO 02/48322 호로부터의 rPLE 서열의 변형은 문헌 [David et al., Eur. J. Biochem., 257, 142-148, 1998]에 개시된 재조합 장 돼지 에스터라제(PICE)가 수득되도록 선택되었다. 라세미 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터의 분리는 상기 문헌들 어디에도 기술되어 있지 않다.

그러나, 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터에 대한 바람직한 입체선택적 활성을 가지며 생물공학적으로 용이하게 제조될 수 있는 에스터라제에 대한 요구가 충족되지 않기 때문에, 본 발명의 목적은 상응하는 신규 재조합 에스터라제를 제공하는 것이었다.

돼지 간으로부터 얻은 mRNA로부터 출발하는 cDNA로서 공지된 돼지 간 에스터라제(PLE)에 대해 문헌 [FEBS Lett., 293, 37-41, 1991] 및 WO 02/48322 호에서 기술된 유전자를 분리하고 클로닝하려는 시도에서, 공지된 PLE 서열 이외에 두 번째 새로운 에스터라제 서열을 밝혀내었다. 상응하는 단백질 또는 에스터라제, 즉 공지된 rPLE 및 신규 재조합 "대체" 에스터라제(rAPLE)가 제조된, 두 서열의 발현 후에, 예기치 않게 rAPLE 만이 라세미 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터를 선택적으로 분리할 수 있는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명의 목적은 에스터라제 활성을 갖는 신규 폴리펩티드 및 그 아미노산 서열이 공지된 PLE 서열과 총 548개 아미노산중 21개가 상이한 신규 재조 합 에스터라제(rAPLE)에 의해 달성할 수 있었다. 신규 rAPLE는 또한 공지된 돼지 장 카복실에스터라제(PICE)로부터의 아미노산 서열에 있어 총 548개 아미노산 중 12개가 상이하다. 그러나, PICE는 돼지 장관에서 발견된다.

도 1은 메틸 5-클로로-2-(1-메틸에틸)-4-펜테노에이트에 대한 입체선택적 에스터라제 활성을 나타낸 것이다. A는 라세미 기질에 대한 피치아 파스토리스( X-33 형질전환체의 활성을 나타낸 것이고, B는 (S) 거울상이성질체 대 라세미 기질에 대한 활성을 나타낸 것이다.

도 2는 재조합 APLE의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 레인 1은 PAGE 룰러 단백질 사다리(Page Ruler Protein Ladder)(퍼멘타스(Fermentas))이고, 레인 2는 상업적으로 시판하는 PLE이고, 레인 3은 통합된 pGAPZ A를 갖는 피치아 파스토리스 X-33(대조용 균주)이고, 레인 4는 통합된 pGAPZ A APLE-ER을 갖는 피치아 파스토리스 X-33이다.

도 3은 AOX1 프로모터를 사용한 돼지 간 에스터라제의 유도성 발현을 나타낸 것이다. 1번 콜로니는 통합된 pPIC9 APLE-ER을 갖는 피치아 파스토리스 KM71이고, 2번 콜로니는 통합된 pPIC9 APLE-ER을 갖는 피치아 파스토리스 KM71이고, 3번 콜로니는 통합된 pPIC9 APLE-ER을 갖는 피치아 파스토리스 KM71이고, 4번 콜로니는 통합된 pPIC9 APLE+ER을 갖는 피치아 파스토리스 KM71이고, 5번 콜로니는 통합된 pPIC9 APLE+ER을 갖는 피치아 파스토리스 KM71이고, 6번 콜로니는 통합된 pPIC9 PLE-ER을 갖는 피치아 파스토리스 KM71이고, 7번 콜로니는 통합된 pPIC9 PLE+ER을 갖는 피치아 파스토리스 KM71이고, 8번 콜로니는 피치아 파스토리스 KM71이고, 9번 콜로니는 상업적으로 시판하는 PLE이다.

도 4는 rAPLE의 단백질 서열인 서열번호 1 및 rAPLE의 뉴클레오티드 서열인 서열번호 2를 나타낸다.

도 5는 프라이머 1의 서열번호 3, 프라이머 2의 서열번호 4, EcoRI알파1의 서열번호 5, 알파PLE2의 서열번호 6, PLE알파1의 서열번호 7, EcoRIPLE+ER2의 서열번호 8 및 EcoRIPLE2의 서열번호 9를 나타낸다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 에스터라제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 에스터라제 활성을 갖는 신규 재조합 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드 및 재조합 rAPLE는 하기 화학식 I의 라세미 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터를 입체선택적으로 분리하는 능력을 갖는다:

상기 식에서,

R은 C₁-C₆-알킬 라디칼이고,

R₁은 C₁-C₄-알킬이고,

X는 염소, 브롬 또는 요오드이다.

에스터라제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드 및 신규 재조합 에스터라제 rAPLE는, 상기 언급한 바와 같이, 문헌 [FEBS Lett., 293, 37-41, 1991]에 개시된 공지된 서열의 총 548개 아미노산 중 21개, 및 문헌 [David et al., Eur. J. Biochem., 257, 142-148, 1998]에 개시된 공지된 PICE 단백질의 총 548개 아미노산중 12개가 상이하다.

본 발명의 신규 rAPLE의 단백질의 서열은 PLE 단백질의 공지된 서열과 하기의 아미노산 위치에서 상이하다:

APLE	위치	PLE
Glu	73	Asp
Ile	75	Val
Gly	76	Val
Gly	77	Glu
Leu	80	Thr
Arg	87	Gly
Ile	92	Thr
Pro	93	Leu
Val	129	Leu
Ser	133	Pro
Thr	134	Met
Leu	138	Val
Ala	139	Val
Phe	234	Leu
Ala	236	Val
Gly	237	Ala
Phe	286	Leu
Ala	287	Thr
Leu	290	Phe
Pro	294	Gln
Thr	302	Pro

본 발명의 단백질 및 신규 재조합 rAPLE는 또한 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 변형된 서열의 형태일 수 있으며, 이것은 예를 들면, N 또는 C 말단에서의 서열, 예를 들면, α 인자 신호 서열로부터 GluAlaGluAla에, 예를 들면, 아미노산의 교환, 결실 또는 결합과 같은 통상적인 변형에 의해, 또는 다른 단백질로의 융합에 의해 수득될 수 있다. 본 발명은 또한 특히 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터에 대해 적절한 활성을 갖는 본 발명의 효소의 단백질 서열내에 변형을 갖는 뮤테인을 포함한다. 뮤테인은, 예를 들면, DNA가 본 발명의 효소의 하나 이상의 아미노산에 의해 상이한 효소를 암호화하도록, 공지된 돌연변이유발 기술(무작위 돌연변이유발, 부위-지향 돌연변이유발, 유도 진화(directed evolution), 유전자 재편성(gene shuffling) 등)에 의해, 본 발명의 효소를 암호화하는 DNA를 변형시키고, 이어서 적당한 숙주 세포에서 변형된 DNA를 발현시킴으로써 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 전술한 돌연변이, 결실, 연장, 융합에 의해 수득되고, 목적하는 에스터라제 활성을 갖는 효소를 암호화하는, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 변형된 DNA 서열을 포함한다.

이와 관련하여, 에스터라제 활성, 특히 2-알킬-5-할로펜트-4-엔 카복실에스터라제 활성은 상기 화학식 I의 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터의 라세메이트를 분리하는 능력으로 정의된다.

본 발명의 폴리펩티드 및 재조합 rAPLE는 하기에 기술하는 바와 같이 제조할 수 있다:

먼저, mRNA를 적절한 키트를 사용하여 돼지 간으로부터 분리한 다음, mRNA 추출물을 기준으로 역전사에 의해 cDNA를 생성한다. 이어서, 유전자은행(GenBank) 수탁번호 X63323(마츠시마(Matsushima) 등, 1991)의 공지된 돼지 간 에스터라제 유전자의 서열을 기준으로 특정 PCR 프라이머를 제조한 후 증폭하고 클로닝하다. 이들 특정 프라이머는 다음과 같다:

프라이머 1: 5'-CAGAATTCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3'

프라이머 2: 5'-CCGGAATTCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3'

PLE 단백질을 암호화하는 적절한 뉴클레오티드 서열을 포함하고 프라이머에 필수적으로 존재하는 프라이머의 상기 부분은 굵은 활자로 나타내었다. 프라이머의 다른 서열 부분은, 예를 들면, 제한 엔도뉴클레아제를 위한 절단 부위에 대한 정보(이탤릭체) 또는 발현에 중요한 서열 요소를 포함한다. 상기 부분은 본 발명의 rAPLE의 제조시 달라질 수 있다.

이어서, 선행기술의 PCR 방법에 의해 프라이머 1 및 2를 사용하여 증폭을 수행한다. 계속해서, PCR 생성물을 사용하여 선행 기술의 방법에 의해 적당한 숙주 유기체에서 암호화된 rAPLE 단백질의 이종 발현을 위한 발현 구조물을 제조한다. 이것은 바람직하게는 초기에 적당한 플라스미드 벡터내에 클로닝된 PCR 생성물을 수반한다.

그 다음, 상기 방식으로 수득된 재조합 플라스미드를 적절한 숙주, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 형질전환시킨다. 이어서, 여러 생성된 클론의 삽입물을 서열화한다. 예기치 않게, 상이한 서열을 갖는 2개 군의 재조합 클론, 즉, 문헌 [Matsushima et al., FEBS Lett., 293, 37-41, 1991]에 따른 PLE의 예상 서열에 100% 동일한 서열, 및 발현후 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 유도하는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 신규 뉴클레오티드 서열(APLE 서열)이 그 중에서 확인되었다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및 재조합 에스터라제 rAPLE를 암호화하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 핵산은 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및 재조합 에스터라제 rAPLE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

또 다른 가능성은 본 발명의 에스터라제를 암호화하는 본 발명에 따른 핵산 서열에 상응하는 적절한 올리고뉴클레오티드를 표준화 합성 기술에 의해, 예를 들면, 자동 DNA 합성기를 사용하여 제조하는 것이다. 본 발명의 에스터라제를 암호화하는 핵산 서열의 순수한 합성 제조가 의약품 또는 그의 중간체의 제조에 사용하기에 특히 유리한데, 그 이유는 효소가 동물 공급원으로부터 수득되지 않기 때문이다.

이어서, 발견된 두 서열(PLE 및 APLE 서열)의 발현을 수행한다. 공지된 돼지 간 에스터라제(PLE, 스위스-프롯(Swiss-Prot) ID Q29550)는 N-말단 신호 서열 및 C-말단 ER 보유 신호, 마지막 4개 아미노산 HAEL을 포함한다. 공지된 PLE 및 신규 APLE를 발현하기 위해, 적절한 발현 시스템내에 서열이 도입된 벡터를 제작한다. 이어서, 이들 발현 구조물을 적당한 숙주 세포로 형질전환시킨다. 이와 관련하여 적당한 숙주 세포는, 예를 들면, 미생물, 동물 세포주 및 식물이다. 원핵세 포 및 진핵세포 미생물을 둘 다 사용할 수 있다. 바람직한 원핵세포 숙주(세균)는 에스케리키아 콜라이, 및 바실러스(Bacillus)속(예를 들면, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens)), 슈도모나스(Pseudomanas)속(예를 들면, 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens), 슈도모나스 푸티다(P. putida)) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속(예를 들면, 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans), 스트렙토마이세스 텐다(S. tendae))의 균주이다. 진핵세포 미생물이 바람직하며, 진균류가 특히 바람직하다. 그의 예는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces serevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 또는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)이다. 발현은 분비성이거나 세포내 발현일 수 있으며, 유도성 및 구성적 발현이다. 세균 발현의 경우, 일종의 종-특이적 신호가 단백질 발현을 위한 상업적으로 시판하는 균주 및 벡터로서(예를 들면, 인비트로겐(Invitrogen), 노바겐(Novagen), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)와 같은 회사에 의해 제공된다) 수득될 수 있어서, 표적 단백질의 유도적 또는 구성적 발현, 세포내 및 분비성 편재화가 가능하며; 또한, 가용성 및 활성 단백질을 수득하기 위해 단백질의 정확한 접힘을 가능케하거나 촉진하는 기술을 적용할 수 있다. 단백질은 바람직하게는 분비성 방식으로 발현되며, 이 경우, PLE 및 APLE의 서열이 N-말단으로 사카로마이세스 세레비지에의 α 인자 신호 서열에 연결되는 벡터를 제작하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 문헌 [Hardwick et al., EMBO J., 9, 623-630, 1990]에 기술된 바와 같이 ER 보유 신호 로 작용하는 C-말단 테트라펩티드 HAEL이 추가로 결실된 구조물을 제조하는 것도 또한 가능하다. 또 다른 바람직한 발현은 ER 보유 신호를 갖거나 갖지 않는 구조물의 유도성 발현이다. 예기치않게, ER 보유 신호를 갖는 구조물도 또한 발현되어, 라세미 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터를 선택적으로 분리할 수 있는 rAPLE를 유도할 수 있다.

APLE 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 신규 에스터라제 rAPLE의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타나 있다.

예기치 않게, 신규 폴리펩티드 또는 rAPLE 단백질이, 예를 들면, 피치아 파스토리스 세포에서 APLE 및 PLE를 각각 암호화하는 DNA 단편의 발현에 의해 수득된 경우, 공지된 rPLE와 대조적으로, 라세미 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터를 입체선택적으로 분리할 수 있음을 밝혀낼 수 있었다.

따라서, 본 발명은 또한 하기 화학식 I의 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터의 라세메이트를 분리하기 위한, 서열번호 1에 나타낸 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는, 본 발명의 에스터라제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 본 발명의 재조합 에스터라제(rAPLE)의 용도에 관한 것이다:

화학식 I

상기 식에서, R은 C₁-C₆-알킬 라디칼이고, R₁은 C₁-C₄-알킬이고, X는 염소, 브롬 또 는 요오드이다.

본 발명의 에스터라제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 재조합 에스터라제(rAPLE)는 바람직하게는 서열번호 1에 나타낸 단백질의 서열과 90% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는다. 목적하는 에스터라제 활성을 갖는 효소를 암호화하는, 예를 들면, 돌연변이, 결실, 연장, 융합과 같은 통상적인 변형에 의해 수득된, 서열번호 1에 나타낸 변형된 DNA 서열을 갖는 본 발명의 에스터라제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 재조합 에스터라제(rAPLE)를 사용하는 것도 또한 가능하다.

이와 관련하여, 하기 화학식 II의 거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 또는 그의 에스터는, 하기 화학식 I의 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터의 거울상이성질체 혼합물을, 친핵체로서 물 또는 화학식 R₂OH(여기서, R₂는 R₁과 상이한 알킬기이다)의 알콜의 존재하에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 rAPLE에 의해 전환시키고, (a) A가 R₁과 동일한 화학식 II의 잔류하는 거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터를 분리하고, 또는 (b) 친핵체로서 알콜을 사용하는 경우, A가 R₂와 동일한 화학식 II의 생성된 거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터를 분리하고, 또는 (c) 친핵체로서 물을 사용하는 경우, A가 H인 화학식 II의 생성된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산을 분리함으로써 수득된다:

화학식 I

상기 식에서, R은 C₁-C₆-알킬 라디칼이고, A는 H, R₁, 또는 R₂이고, 여기서 R₁은 C₁-C₄-알킬일 수 있고, R₂는 알킬기이나 R₁과 동일하지 않으며, X는 염소, 브롬 또는 요오드이다.

화학식 II에서 R은 C₁-C₆-알킬 라디칼, 예를 들면, 메틸, 에틸, n- 및 i-프로필, n-, i- 및 t-뷰틸, 펜틸 및 헥실이다. C₁-C₄-알킬 라디칼이 바람직하며, i-프로필 라디칼이 특히 바람직하다. A는 H, R₁, 또는 R₂이고, 이때 R₁은 C₁-C₄-알킬 라디칼, 바람직하게는 C₁-C₂-알킬 라디칼, 특히 바람직하게는 메틸 라디칼이고, R₂는 R₁과 상이한 알킬 라디칼이다. R₂는 특히 바람직하게는 C₁-C₆-알킬 라디칼이다. X는 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 염소이다.

이와 관련하여 거울상이성질체가 증대된 화합물은 >80%, 바람직하게는 >90%, 특히 바람직하게는 >97%의 거울상이성질체 과량(enantiomeric excess, ee)을 나타내는 화합물을 의미한다.

본 발명의 효소는 또한 임의의 형태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 분산액으로, 용액으로, 고정화되어, 조 효소로서, 공지된 정제 방법의 조합에 의해 그 공급원으로부터 수득된 효소로서, 필요한 효소 활성(천연적으로 또는 유전자 변형을 통해)을 갖는 전세포(경우에 따라 고정화되고/되거나 투과된다)로서, 또는 상기 세포의 용해물로서 사용될 수 있다.

본 발명의 전환을 위한 반응 온도는 통상적으로 0 내지 90 ℃, 바람직하게는 10 내지 60 ℃이다. 반응 용액의 pH는 4 내지 11, 바람직하게는 6 내지 9이다.

용매의 종류는 사용되는 친핵체에 따라 달라진다. 예를 들어, 물이 친핵체인 경우, 사용될 수 있는 용매는 물, 물과 수-혼화성 용매, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 아이소프로판올, t-뷰탄올 등과 같은 알콜, 다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, 아세톤 또는 다이메틸 설폭사이드와의 혼합물, 또는 물과 수-비혼화성 용매, 예를 들어, 톨루엔, 자일렌 등과 같은 방향족 화합물, 예를 들면, 헥세인, 헵테인, 사이클로헥세인 등과 같은 알케인, 예를 들면, 다이아이소프로필 에테르, 메틸 t-뷰틸 에테르 등과 같은 에테르와의 2-상 시스템이다. 친핵체가 알콜인 경우, 바람직하게 사용되는 용매는 알콜 R₂OH이고, 이때 R₂는 알킬기이나, 단 R₁과 동일하지 않다. 그러나, 알콜과, 예를 들어, 테트라하이드로퓨란, 헵테인, 톨루엔, 헥세인, CH₃CN, 메틸 t-뷰틸 에테르 등과의 혼합물을 사용하는 것도 또한 가능하다.

효소에 의해 촉진된 라세메이트 분리가 수행된 후, 목적하는 최종 생성물을 분리한다. 이것은 A가 R₁인 화학식 II의 잔류하는 거울상이성질체가 증대된 2-알킬 -5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터이거나, 또는 물이 친핵체인 경우, A가 H인 화학식 II의 생성된 거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산이거나, 또는 알콜이 친핵체인 경우, A가 R₂인 화학식 II의 거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터일 수 있다. 분리는, 예를 들면, 추출, 결정화, 컬럼 크로마토그래피, 증류 등과 같은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 화학식 I의 상응하는 산 또는 에스터를 98% 이하 수율의 이론적 수율로 및 >99% 까지의 e.e.하에 제공하였다.

실시예 1: mRNA 분리 및 cDNA의 제조

지방의 도살장으로부터 입수한, 새로 도살된 돼지로부터 얻은 간 0.7 g을 액체 질소에 냉동시키고, 모르타르로 균질화시키고, 유리된 mRNA를 제조업자가 제공한 설명서(패스트 트랙 2.0 키트 매뉴얼(Fast Track 2.0 kit manual); 버전 J; 082310; 25-0099)에 따라 패스트 트랙 mRNA 추출 키트 2.0(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)을 사용하여 분리하거나 추출하였다. 추출에 의해 총 12.9 μg의 mRNA를 수득하였다. 이어서, 0.26 μg의, 상기 mRNA를 제조업자의 설명서에 따른 RT-PCR에 슈퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드(SuperScript III First-Strand) 합성 시스템을 사용하여 cDNA를 제조하기 위한 주형으로 사용하였다.

실시예 2: 돼지 간으로부터 cDNA 단편의 증폭 및 클로닝

유전자은행 수탁번호 X63323의 돼지 간 에스터라제 유전자의 서열을 기초로 하는 특정 프라이머(마츠시마 등, 1991)를 제조하였다:

프라이머 1: 5'-CAGAATTCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3'(서열번호 3)

프라이머 2: 5'-CCGGAATTCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3'(서열번호 4)

공지된 PLE 서열에 상동성인 염기를 굵은 활자로 나타내었다. 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열을 강조하기 위해 이탤릭체로 나타내었다. '퓨션 고충실도 DNA 폴리머라제(Phusion High-Fidelity DNA Polymerase)' 매뉴얼(핀자임(Finnzymes))에 따른 1 x 퓨션 HF 완충액중 1 U의 퓨션(Phusion) DNA 폴리머라제(핀자임, 핀란드 에스푸), 주형으로서 500 ng의 cDNA, 각각 20 마이크로몰의 프라이머 1 및 2, 5 μl의 dNTP 혼합물(각각 2mM)을 갖는 50 μl의 혼합물 중에서, 98 ℃에서 30 초의 변성 단계로 출발하여, 증폭을 위한 30 주기(98 ℃ 10초, 68 ℃ 20초, 72 ℃ 1 분)후 70 ℃에서 8 분간 최종 배양에 의해 증폭을 수행하여 완전한 생성물을 제조하였다. 상기 PCR은 1.8 kb(아가로스 겔 전기영동으로 측정)의 크기를 갖는 DNA 단편을 제공하였다.

이어서, 상기 PCR 생성물을 키아퀵(Qiaquick) 키트(키아겐(Qiagen), 독일 힐덴)를 사용하여 포함된 매뉴얼에 따라 정제하였다. 약 0.1 μg의 정제된 PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 절단하고 EcoRI 절단 부위를 통해 플라스미드 벡터 pHILZ 및 pHIL-D2에 클로닝하였다. 이어서, 벡터를 "분자 생물학에서의 현행 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology)"에 따라 제조된 TOP10 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포내에 형질전환시켰다. 여러 생성 클론의 삽입 물을 '염료 데옥시 터미네이터 사이클 서열분석(Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing)' 키트(어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드(Applied Biosystems Inc.), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 서열화하였다. 이에 의해 두 개의 서열, 즉, 문헌 [Matsushima et al., FEBS Lett. 293, 37-41, 1991]에 공개된 예상 서열에 100% 상응하는 한 서열과 서열번호 2에 상응하는 다른 서열을 확인하였다.

실시예 3: α 인자 신호 서열의 도입 및 C-말단부의 변이

공지된 단백질 PLE 및 본 발명의 단백질 rAPLE의 분비성 발현을 가능케 하기 위해, PLE 및 APLE의 서열이 클로닝 벡터 pPICZ α(인비트로겐)의 α 인자 출발 서열에 N-말단이 연결된 벡터를 제작하였다. 또한, C-말단 테트라펩티드 HAEL이 결실된 구조물도 제조하였다.

PCR I: EcoRI알파1/알파PLE2 프라이머 쌍을 사용하여 클로닝 벡터 pPICZ α(인비트로겐)의 α 인자 신호 서열을 증폭시켰다. 50 μl의 혼합물('퓨션 고충실도 DNA 폴리머라제' 매뉴얼(핀자임)에 따른 1x퓨션 HF 완충액중 2 ng의 주형, 0.5μM의 각 프라이머, 0.2mM dNTP, 1 U의 퓨선 DNA 폴리머라제(핀자임))중에서 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 3 분간 변성시킨 후 30 주기(95 ℃ 30 초, 57 ℃ 30 초, 72 ℃ 15 초)로 증폭시키고 72 ℃에서 7 분간 최종 단계를 수행하였다.

PCR II: PLE알파1/EcoRIPLE+ER2 프라이머 쌍 또는 PLE알파1/EcoRIPLE2(C-말단 HAEL 테트라펩티드의 결실) 프라이머 쌍을 사용하여 pHILZ 플라스미드로부터 PLE 및 APLE 서열을 증폭시켰다. 50 μl의 혼합물('퓨션 고충실도 DNA 폴리머라 제' 매뉴얼(핀자임)에 따른 1x퓨션 HF 완충액중 2 ng의 주형, 0.5μM의 각 프라이머, 0.2mM dNTP, 1 U의 퓨선 DNA 폴리머라제(핀자임))중에서 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 3 분간 변성시킨 후 30 주기(95 ℃ 30 초, 57 ℃ 30 초, 72 ℃ 15 초)로 증폭시키고 72 ℃에서 7 분간 최종 단계를 수행하였다.

PCR III: PCR I 및 PCR II의 생성물 3 μl를 사용하여 이들 두 생성물을 폴리머라제 PCR에 의해 결합시켰다. 1x퓨션 HF 완충액중 0.2mM dNTP, 1 U의 퓨션 DNA 폴리머라제(핀자임)를 갖는 45 μl의 혼합물중에서 연장을 수행하였다. 반응 혼합물을 95 ℃에서 3 분간 가열한 다음, 95 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 45 초의 10 주기를 수행하였다. 이들 중복 연장 생성물을 증폭시키기 위해, 5 μl의 프라이머 혼합물(3 μl의 물, 1 μl의 5 μM EcoRI알파1 프라이머 및 1 μl의 5 μM EcoRIPLE+ER2 또는 EcoRIPLE2 프라이머)을 가하였다. 생성물을 20 PCR 주기(95 ℃ 30 초, 57 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분) 및 72 ℃에서 7 분간 단일 온도 정지에 의해 증폭시켰다.

프라이머 서열:

EcoRI알파1: 5'-TCTTCGAAGAATTCACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3'(서열번호 5)

알파PLE2: 5'-GAGGCTGGCTGCCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'(서열번호 6)

PLE알파1: 5'-AGAGAGGCTGAAGCTGGGCAGCCAGCCTCGCCG-3'(서열번호 7)

EcoRIPLE+ER2: 5'-ATGGTACCGAATTC TCACAGCTCAGCATGCTTTATCTTG-3'(서열번호 8)

EcoRIPLE2: 5'-ATGGTACCGAATTCTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTG-3'(서열번호 9)

주형에 상동성을 갖는 영역은 굵은 활자로, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열 은 이탤릭체로 나타내었다.

실시예 4: 피치아 파스토리스 에서 돼지 간 에스터라제의 이종 발현을 위한 발현 구조물의 제작

실시예 3으로부터의 중복 연장 PCR 생성물을 키아퀵 키트(키아겐, 독일 힐덴)를 포함된 매뉴얼에 따라 사용하여 정제하였다. 약 0.1 μg의 정제된 PCR 생성물을 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단하고 EcoRI 절단 부위를 통해 플라스미드 벡터 pGAPZ A(인비트로겐)에 클로닝시켰다. 프로모터에 관한 삽입물의 정확한 배향을, 예를 들면, NcoI로 대조용 절단을 이용하여 조사하였다. 각 경우에, 정확하게 배향된 삽입물을 갖는 클론을 선별하고 서열화하고 보존하였다. 상응하는 플라스미드는 다음과 같이 명명하였다: 문헌 [Matsushima et al., FEBS Lett. 293, 37-41, 1991]에 개시된 바와 같은 공지된 PLE 서열을 함유한 플라스미드를 pGAPZ A PLE-ER(HAEL 테트라펩티드가 결실됨) 및 pGAPZ A PLE+ER(HAEL 테트라펩티드가 여전히 존재)로 지칭하였다. 신규 APLE 서열로부터 유도된 플라스미드는 pGAPZ A APLE-ER(HAEL 테트라펩티드가 결실됨) 및 pGAPZ A APLE+ER(HAEL 테트라펩티드가 여전히 존재)로 지칭하였다.

실시예 5: 피치아 파스토리스 에서 돼지 간 에스터라제의 구성적 발현

플라스미드 pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER 및 pGAPZ A APLE+ER을 피치아 파스토리스 X-33에 형질전환시켰다. 인비트로겐사의 피치아 발현 키트용 프로토콜의 설명에 따라 형질전환을 수행하였다. 형질전환체는 100 mg/l의 제오신을 함유하는 YPD 플레이트(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% D-글루코스, 2% 아가) 상에서 선별하였다. 52개의 제오신-내성 클론을 100 mg/l의 제오신을 갖는 YPD 플레이트 상에 스트리킹하고 15% 글리세롤중에 보존시켰다.

실시예 6: 에스터라제 활성의 정량적 분석

피치아 파스토리스 형질전환체를 30 ℃에서 100 mg/l의 제오신을 갖는 YPD 플레이트 상에서 48 시간동안 배양하였다. 세포를 와트만(Whatman) 541 경화 무회(ashless) 70 mmØ 필터 상에 올리고 공기-건조시켰다. 에스터라제 활성을 색 반응에 의해 가시화하기 위해, 6 mg의 α-나프틸 아세테이트(시그마, 500 μl의 아세톤에 용해), 2.5 mg의 테트라아조화 o-다이아니시딘(패스트 블루 솔트(Fast Blue Salt) BN, 시그마, 125 μl의 물에 용해) 및 5 ml의 0.1M 인산 칼륨 완충액(pH 7)의 용액을 사용하여 배양하였다. 4개 플라스미드 pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER 및 pGAPZ A APLE+ER 중 통합된 하나를 갖는 모든 형질전환체에서 활성을 검출하였다. 이것은 에스터라제 활성을 갖는 기능성 단백질의 발현을 입증한다. 대조군으로, 통합된 빈 벡터를 갖는 클론도 또한 동일한 방법으로 시험하였다. 이 경우, 필적하는 반응 시간내에 의미있는 에스터라제 활성이 나타나지 않았다.

실시예 7: 메틸 5-클로로-2-(1-메틸에틸)-4-펜테노에이트에 대한 입체선택적 에스터라제 활성

실시예 6에 기술된 바와 같은 피치아 파스토리스 형질전환체를 30 ℃에서 100 mg/l의 제오신을 갖는 YPD 플레이트 상에서 48 시간동안 배양하였다. 세포를 와트만 541 경화 무회 70 mmØ 필터 상에 올리고 공기-건조시켰다. 필터를 기질 용액 A[100 μl의 라세미 메틸 5-클로로-2-(1-메틸에틸)-4-펜테노에이트, 200 μl의 0.1M 인산 칼륨 완충액(pH 8); 150 μl의 10 mg/ml 페놀 레드; 450 μl의 DMSO; 650 μl의 H₂O]와 함께, 또는 기질 용액 B[용액 A와 동일하나, 라세메이트 대신 메틸 (2S,4E)-5-클로로-2-(1-메틸에틸)-4-펜테노에이트를 사용]와 함께 배양하였다. 기질에 대한 특정 에스터라제 활성으로 인해, 에스터 기질의 가수분해시 산의 유리는 pH의 감소를 야기하고, 이것은 이어서 페놀 레드 지시약의 색을 황색으로 변화시킨다. 이로부터, 플라스미드 pGAPZ A APLE-ER을 함유하는 형질전환체가, 이들을 기질 용액 A에 대해 시험한 경우 3 내지 4 시간동안 배양한 후 신호(콜로니 주위의 황색 착색)를 제공한 반면, 기질 용액 B의 경우에는 의미있는 전환을 발견할 수 없는 것으로 밝혀졌다(도 1). 플라스미드 pGAPZ A PLE-ER 또는 pGAPZ A PLE+ER에 의해 수득된 형질전환체는 동일한 조건하에서 기질 용액 A 또는 B와 반응을 나타내지 않았다. 이로부터 재조합 rAPLE가 재조합 rPLE와 상이한 기질 특이성을 가지며 rAPLE를 사용한 메틸 5-클로로-2-(1-메틸에틸)-4-펜테노에이트의 가수분해는 (R) 거울상이성질체에 대해 입체선택적으로 수행되는 것으로 나타났다.

실시예 8: SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동

10 μl의 2x SDS 샘플 완충액(125 mM 트리스-HCl, pH 6.8; 4% SDS, 20% 글리세롤, 5% β-머캅토에탄올, 0.05% 브로모페놀 블루)을 10 μl의 상업적으로 시판하는 돼지 간 에스터라제 또는 10 μl의 60-배 농축된(사토리우스(Sartorius)의 센트리콘 한외여과-스핀 컬럼(Centricon Ultrafiltrations-Spin Columns)), 플라스미드 pGAPZ A APLE-ER 또는 빈 pGAPZ A 플라스미드(대조 균주)를 함유하는 피치아 파스토리스 배양물의 상등액(배플이 있는 2 l 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 250 ml의 YPD 배지중 100 rpm 및 28 ℃에서 72 시간)에 가하였다. 샘플을 95 ℃에서 5 분간 가열한 후, 단백질을 12.5% 폴리아크릴아마이드 겔(4% 축적 겔) 상에서 분리하고 검출을 위해 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R250으로 염색하였다. SDS-PAGE는 pGAPZ A APLE 플라스미드를 갖는 효모 균주에서 rAPLE(약 60 kDa)에 대해 예상된 크기를 갖는 단백질 띠를 나타내었지만, 대조용 균주에서는 나타내지 않았다(도 2). 비교를 위해 또한 분석한 상업적으로 시판하는 돼지 간 에스터라제는 동일 크기 범위의 2개의 단백질 띠를 나타내었다(도 2에서 화살표).

실시예 9: AOX1 프로모터에 의한 돼지 간 에스터라제의 유도성 발현

플라스미드 pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER 및 pGAPZ A APLE+ER을 제한 엔도뉴클레아데 XhoI으로 절단하고, ER 보유 신호를 갖거나 갖지 않는, APLE 및 PLE 단백질을 암호화하는 각각의 단편들을 XhoI 절단 부위를 통해 pPIC9 벡터(인비트로겐)내에 클로닝하였다. AOX1 프로모터에 대한 단편들의 정확한 배향을 제한 엔도뉴클레아제 NcoI을 이용한 대조군 절단에 의해 확인하였다. AOX1 프로모터를 갖는 벡터는, 실시예 4에서 명명한 플라스미드와 유사하게, pPIC9 PLE-ER, pPIC9 PLE+ER, pPIC9 APLE-ER 및 pPIC9 APLE+ER로 명명하고, SalI으로 선형화하고 피치아 파스토리스 KM71에 형질전환시켰다. 형질전환 및 His 독립영양성(prototrophy)에 대한 선별은 인비트로겐의 피치아 발현 키트의 지시에 따라 수 행하였다. 선별된 형질전환체 및 KM71 균주를 인비트로겐의 피치아 발현 키트에 따라 완전 배지 상에서 밤새 배양하고 1% 메탄올을 사용하여 48 시간동안 유도하였다. 생성 배양물을 실시예 7에 기술된 정량적 pH-변동 분석을 이용하여 분석하였으며, 이때 각 경우에 혼합물 중 2 μl의 배양물을 시험하였다. 유도성 AOX1 프로모터의 조절하에서의 발현은, 실시예 7에서의 구성적 발현에 대해 기술된 상황과 비교하여, 라세미 메틸 5-클로로-2-(1-메틸에틸)-4-펜테노에이트에 대해 훨씬 더 높은 rAPLE 효소 활성을 유도하였다. 페닐 레드 색 변화(적색에서 황색으로)는 단지 수분후에 검출가능하였다(도 3). 예기치 않게, rAPLE 활성은 C-말단에서 ER 보유 신호 HAEL의 존재와 무관하였다, 즉, ER 보유 신호를 갖는 rAPLE를 발현시킨 세포도 활성을 나타내었다. 대조적으로, rPLE를 생성하기 위한 효모 균주는 라세미 메틸 5-클로로-2-(1-메틸에틸)-4-펜테노에이트에 대한 활성을 갖지 않았다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH & Co KG <120> polypeptide having esterase activity and recombinant esterase and use thereof <130> O.Z.1302a <140> PCT/EP2006/011832 <141> 2006-12-08 <150> AT A2081/2005 <151> 2005-12-27 <160> 9 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 548 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rAPLE <400> 1 Gly Gln Pro Ala Ser Pro Pro Val Val Asp Thr Ala Gln Gly Arg Val 1 5 10 15 Leu Gly Lys Tyr Val Ser Leu Glu Gly Leu Ala Gln Pro Val Ala Val 20 25 30 Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly Ser Leu Arg Phe 35 40 45 Ala Pro Pro Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Glu Pro Ile Gly Gly Gln Met Leu 65 70 75 80 Ser Asp Leu Phe Thr Asn Arg Lys Glu Arg Leu Ile Pro Glu Phe Ser 85 90 95 Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Thr Lys 100 105 110 Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Leu Val 115 120 125 Val Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Leu Ala Ala His Glu 130 135 140 Asn Val Val Val Val Ala Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly Phe 145 150 155 160 Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu Asp 165 170 175 Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe Gly 180 185 190 Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Glu 195 200 205 Ser Val Ser Val Leu Val Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe His 210 215 220 Arg Ala Ile Ser Glu Ser Gly Val Ala Phe Thr Ala Gly Leu Val Arg 225 230 235 240 Lys Asp Met Lys Ala Ala Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly Cys 245 250 255 Lys Thr Thr Thr Ser Ala Val Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys Ser 260 265 270 Glu Asp Glu Leu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Phe Ala Leu 275 280 285 Asp Leu His Gly Asp Pro Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Thr Thr Val 290 295 300 Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala Glu 305 310 315 320 Lys Asp Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln Glu 325 330 335 Phe Gly Trp Leu Leu Pro Thr Met Met Gly Phe Pro Leu Ser Glu Gly 340 345 350 Lys Leu Asp Gln Lys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr Pro 355 360 365 Ile Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Asp Lys Tyr 370 375 380 Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu Asp 385 390 395 400 Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala Arg 405 410 415 Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln Tyr 420 425 430 Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Lys Pro Lys Thr Val Ile Gly Asp 435 440 445 His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu Lys Gly 450 455 460 Asp Ala Pro Glu Glu Glu Val Ser Leu Ser Lys Thr Val Met Lys Phe 465 470 475 480 Trp Ala Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asn Pro Asn Gly Glu Gly Leu Pro 485 490 495 His Trp Pro Met Tyr Asp Gln Glu Glu Gly Tyr Leu Gln Ile Gly Val 500 505 510 Asn Thr Gln Ala Ala Lys Arg Leu Lys Gly Glu Glu Val Ala Phe Trp 515 520 525 Asn Asp Leu Leu Ser Lys Glu Ala Ala Lys Lys Pro Pro Lys Ile Lys 530 535 540 His Ala Glu Leu 545 <210> 2 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> rAPLE <400> 2 gggcagccag cctcgccgcc tgttgtggac actgcccagg gccgagtcct ggggaagtac 60 gtcagcttag aaggcctggc acagccggtg gccgtcttcc tgggagtccc ttttgccaag 120 ccccctctcg gatccttgag gtttgctccg ccgcagcctg cagaaccatg gagcttcgtg 180 aagaacacca cctcctaccc tcccatgtgc tgccaagagc caattggggg acagatgctc 240 tcagatctat ttaccaacag aaaggagagg ctcattccgg agttttctga agactgtctc 300 tacctaaata tttacacccc tgctgacctg acaaagaggg gcagactgcc ggtgatggtg 360 tggatccacg gaggaggtct ggtggtgggc ggggcttcca cctatgatgg actggccctc 420 gctgcgcatg aaaacgtggt ggtggtggcc atccagtacc gcctgggcat ctggggattc 480 ttcagcacag gggacgaaca cagccggggc aactggggtc acttggacca ggtggccgca 540 ctgcactggg tccaggagaa catcgccaac tttggaggcg acccaggctc tgtgaccatc 600 tttggagagt cagcaggagg ggaaagtgtc tctgttctgg tgttgtctcc cttggccaag 660 aacctcttcc accgggccat ctctgagagt ggcgtggcct tcactgctgg cctggtcagg 720 aaggacatga aggctgcagc taagcaaatt gctgtccttg ctgggtgtaa aaccaccacc 780 tcggctgtct ttgttcactg cctgcgccag aagtcggagg acgagctctt ggacttaacg 840 ctgaagatga aatttttcgc tcttgatttg catggagacc ccagagagag ccatcccttc 900 ctgaccactg tggtggatgg agtgctgctg cccaagatgc ctgaagagat tctggctgaa 960 aaggatttca acactgtccc ctacatcgtg ggaatcaaca agcaagagtt tggctggctt 1020 ctgccaacga tgatgggctt ccccctctct gaaggcaagc tggaccagaa gacggccacg 1080 tcactcctgt ggaagtccta ccccatcgct aacatccctg aggaactgac tccagtggcc 1140 actgacaagt atttgggggg gacagacgac cccgtcaaaa agaaagacct gttcctggac 1200 ttgatggggg atgtggtgtt tggtgtccca tctgtgacgg tggcccgtca acacagagat 1260 gcaggagccc ccacctacat gtatgagttt cagtatcgcc caagcttctc atcggacaag 1320 aaacccaaga cggtgatcgg ggaccacggg gatgagatct tctccgtctt tggttttcca 1380 ctgttaaaag gcgatgcccc agaagaggag gtcagtctca gcaagacggt gatgaaattc 1440 tgggccaact ttgctcgcag tgggaacccc aatggggagg ggctgcccca ttggccgatg 1500 tacgaccagg aagaagggta ccttcagatc ggcgtcaaca cccaggcagc caagaggctg 1560 aaaggtgaag aagtggcctt ctggaacgat ctcctgtcca aggaggcagc aaagaagcca 1620 cccaagataa agcatgctga gctgtga 1647 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 cagaattcat ggctatcggg cagccagcct cgc 33 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 ccggaattca gcctcccctt cacagctcag 30 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 tcttcgaaga attcacgatg agatttcctt caatttttac tgc 43 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 gaggctggct gcccagcttc agcctctctt ttctcg 36 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 agagaggctg aagctgggca gccagcctcg ccg 33 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 atggtaccga attctcacag ctcagcatgc tttatcttg 39 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 atggtaccga attctcactt tatcttgggt ggcttctttg 40

Claims

에스터라제 활성을 가지며 서열번호 1의 아미노산 서열을 나타내는 폴리펩티드.
에스터라제 활성을 가지며 서열번호 1의 아미노산 서열을 나타내는 재조합 단백질.
서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 나타내며, 하기 화학식 I의 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터의 라세메이트 분리에 대한 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 재조합 단백질:

화학식 I

상기 식에서,

R은 C₁-C₆-알킬 라디칼이고,

R₁은 C₁-C₄-알킬이고,

X는 염소, 브롬 또는 요오드이다.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

돌연변이, 결실, 삽입, 연장 및/또는 융합으로 이루어진 군에서 선택된 통상적인 변형에 의해 변형된 아미노산 서열을 나타내는, 에스터라제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 재조합 단백질.
제 1 항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드 또는 제 2 항에 청구된 바와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
서열번호 2에 나타낸 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열.
제 5 항 또는 제 6 항에 청구된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
하기 화학식 I의 2-알킬-5-할로펜트-4-엔-카복실산 에스터의 라세미 분리를 위한, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드 또는 재조합 단백질의 용도:

화학식 I

상기 식에서,

R은 C₁-C₆-알킬 라디칼이고,

R₁은 C₁-C₄-알킬이고,

X는 염소, 브롬 또는 요오드이다.
하기 화학식 I의 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터의 거울상이성질체의 혼합물을, 친핵체로서 물 또는 화학식 R₂OH(여기서, R₂는 R₁과 상이한 알킬기이다)의 알콜의 존재하에서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드 또는 재조합 에스터라제에 의해 전환시키고,

(a) A가 R₁과 동일한 화학식 II의 잔류하는 거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터를 분리하거나,

(b) 친핵체로서 알콜을 사용하는 경우, A가 R₂와 동일한 화학식 II의 생성된 거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 에스터를 분리하거나,

(c) 친핵체로서 물을 사용하는 경우, A가 H인 화학식 II의 생성된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산을 분리하는 것

을 포함하는, 하기 화학식 II의 거울상이성질체가 증대된 2-알킬-5-할로펜트-4-엔카복실산 또는 그의 에스터를 제조하는 방법:

화학식 II

화학식 I

상기 식에서,

R은 C₁-C₆-알킬 라디칼이고,

A는 H, R₁, 또는 R₂이고, 여기서 R₁은 C₁-C₄-알킬일 수 있고, R₂는 알킬기이나 R₁과 동일하지 않으며,

X는 염소, 브롬 또는 요오드이다.