JP5453238B2 - ブタ肝臓エステラーゼのイソ型 - Google Patents
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Description
発現系とは、本発明の核酸の組換え発現系、ひいては本発明のポリペプチドの組換え産生系を意味する。前記産生は、好ましくは対応する核酸配列またはベクター(下記参照)を用いて形質転換または形質移入された(「形質転換」および「形質移入」という用語を本発明では同義的に用いる)微生物または他の宿主においておこなうことができる。形質転換および形質移入は公知の方法、例えばリン酸カルシウム共沈、リポフェクション、エレクトロポレーション、PEG/DMSO法、粒子衝撃またはウイルス/バクテリオファージ感染に従っておこなうことができる。本発明の細胞は、組換え核酸を染色体外または染色体に組み込まれた形態で含み得る。言い換えると、形質移入/形質転換は安定であるか、または一時的であり得る。形質移入および形質転換プロトコルは当業者に公知である(Chan and Cohen.1979.High Frequency Transformation of Bacillus subtilis Protoplasts by Plasmid DNA.Mol Gen Genet.168(1):111−5;Kieser et al.2000.Practical Streptomyces Genetics.The John Innes Foundation Norwich;Sambrook et al.1989.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.In:second ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor.NY.;Irani and Rowe.1997.Enhancement of transformation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 by Mg2+ and heat.Biotechniques 22:54−56;Balbas,P.and Bolivar,F.(1990),Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli,Methods Enzymol.185,14−37;Rodriguez,R.L. and Denhardt,D.T(eds)(1988),Vectors:a survey of molecular cloning vectors and their uses,205−225,Butterworth,Stoneham)。一般的な手順(PCR、クローニング、発現等)に関しては、以下の文献およびその中で言及されている引例も参照する:Universal GenomeWalker(商標)Kit User Manual,Clontech,3/2000;Triglia T.;Peterson,M.G.and Kemp,D.J.(1988),A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences,Nucleic Acids Res.16,8186。
真核生物、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞もしくは植物細胞または生命体、例えばハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピチア種(Pichia sp.)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母、あるいは真菌、例えばアスペルギルス種(Aspergillus sp.)等をポリペプチドの組み換え産生に用いることが同様に可能である。好適な真核細胞としては、CHO細胞、HeLa細胞等が挙げられる。これらの細胞の多くはATCCまたはDMSZ等の寄託機関経由で入手できる。
・DNA切片(これから一本鎖RNAコピーを転写により作製する)
・このコピープロセスの調節に関与するすべての追加のDNA切片
からなる分子レベルでの部分を意味する。
本発明の核酸配列またはこれらを含む遺伝子構築物を非常に好適な方法で宿主生物中にクローニングするために用いることができるプラスミドは次のものである:pUC18(Roche Biochemicals)、pKK−177−3H(Roche Biochemicals)、pBTac2(Roche Biochemicals)、pKK223−3(Amersham Pharmacia Biotech)、pKK−233−3(Stratagene)またはpET(Novagen)。好適なベクターはまた、例えばE.coliについてはpET−21a(+)であるが、原核単細胞生物の他の発現ベクターおよび真核生物のベクターも使用できる。酵母に好適であることがわかっている好適なベクターの例は、pREPベクターおよびplNTベクターである。バクロウイルスベクター、例えば欧州特許第127839号または同第549721号のバクロウイルスベクターが昆虫細胞における発現について開示されており、SV40ベクターは、例えば哺乳動物細胞における発現に好適であり、一般に入手可能である。E.coli細胞、特にE.coli Origamiの形質転換に関して、単細胞真核生物のベクター、特にpETベクター群からのもの特に好適である。
R1、R2およびR3は同一または互いに異なり、特に、H、(C1−C8)アルキル、(C1−C8)アルコキシ、HO−(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルコキシアルキル、シクロペンタジエニル、(C6−C18)アリール、(C7−C19)アルアルキル、(C3−C18)ヘテロアリール、(C4−C19)ヘテロアルアルキル、(C1−C8)アルキル−(C6−C18)アリール、(C1−C8)アルキル−(C3−C18)ヘテロアリール、(C3−C8)シクロアルキル、(C1−C8)アルキル−(C3−C8)シクロアルキル、(C3−C8)シクロアルキル−(C1−C8)アルキルであるか、またはR1およびR2および/またはR1およびR3および/またはR2およびR3は(C3−C5)アルキレン架橋を形成する]により指定できる。
(i)本発明の核酸、好ましくは配列番号3、5、7、9の突然変異誘発、
(ii)(i)から得ることができる核酸配列の好適なベクター中へのクローニングと、それに続く好適な発現系中への形質転換、ならびに
(iii)改善された活性および/または選択性および/または安定性を有する前記ポリペプチドの検出および単離
による、配列番号2のポリペプチドよりも改善された活性および/または選択性および/または安定性を有するポリペプチドの製造に関する。
mRNAの単離およびcDNAの合成
新鮮なブタ肝臓組織(0.1g)をTrizol(登録商標)試薬(TRIzol(登録商標)Plus RNA Purification Kit、Invitrogen(米国カリフォルニア州))で処理し、均質化し(室温で10分;Ultraturrax T25、IKA−Labortechnik)、製造元の指示に従ってRNAを単離した。RNA濃度を分光光度法で測定した。oligo(dT)15プライマーおよびRNaseH活性を有するMMLV逆転写酵素(Promega(米国ウィスコンシン州マディソン))を用いたRT−PCRによりcDNA合成を実施した。
RT−PCR生成物を、γPLE配列(5’−CACCCATATGGGGCAGCCAGCCTCGC−3’(配列番号11)(Ndel制限切断部位を斜字体で表す)、および5’−CCGCTCGAGTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTGC−3’(配列番号12)(Xhol制限切断部位を斜字体で表し;開始コドンおよび終始コドンに下線を施す)に基づく2つの遺伝子特異的プライマーを用いたPLE遺伝子の増幅に使用した。順プライマーはさらにその5’末端で、その後のTOPOベクター中へのクローニングを可能にする塩基CACCを含む(下記参照)。これらのプライマーは、もとのブタ遺伝子のN末端と結合した18アミノ酸シグナル配列、および4アミノ酸C末端ER(小胞体)残留シグナルをすでに削除し、これによりE.coliにおけるその後の発現を促進する(Lange,S,et.al.,ChemBioChem(2001),2,576−582)。PCRをサーモサイクラー(Techne Progene(Jepson Bolton Laboratory Equipment(英国ウォトフォード))で実施した。PCRは製造元の指示に従い、下記の温度プログラムにしたがって、Pfu Plus Polymerase(Roboklon(ドイツ国ベルリン))を使用した:95℃で5分間変性後、95℃で1分、60℃で1分、72℃で3分を30サイクル実施し、最後は72℃で7分であった。PCR産物をアガロースゲル中で分画し、精製し、製造元の指示にしたがってTOPO/pET101ベクター中にクローニングした(ChampionTM pET Directional TOPO(登録商標)Expression Kit;Invitrogen(米国カリフォルニア州カールズバッド))。E.coli TOP10細胞[FmcrA D(mrr−hsdRMSmcrBC)(F801acZDM15)DlacX74 recA1 deoR araD139 D(ara−leu)7697 galU galK rpsL(StrR)endAl nupG](Invitrogen)を、構築物混合物を用いて形質転換し、寒天プレート上で分離させた。このようにして得られた組換えシグナルクローンを別々に培養し、プラスミドDNAを単離し、サイズ決定または制限マッピングにより同定し、PLE配列のPCR増幅用テンプレートとして使用した。増幅された配列を次いで配列決定した(MWG−Biotech(ドイツ国マーチンスリード))。
各TOPO/pET101−PLE構築物のプラスミドDNAを製造元の指示にしたがってNdelおよびXholで消化し(New England Biolabs(米国マサチューセッツ州ベバリー);Promega(米国ウィスコンシン州マディソン))、約1694bpのサイズの特定のフラグメントをNdel/Xhol消化されたアガロースゲル精製pET15bベクター(Novagen(米国ウィスコンシン州マディソン))中に挿入し、これはさらにN末端Hisタグを遺伝子に追加した。結紮産物をE.coli DH5α株(Novagen(米国ウィスコンシン州マディソン))[supE44ΔlacU169(Φ801acZΔM15)hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi−lrelAl]の形質転換のために使用し、形質転換された株を培養することによりプラスミドを増殖させた。プラスミドを組換え株から単離し、試験するために再度配列決定した。このようにして得られたpET15b−PLE構築物を、あらかじめpGro7プラスミド(Chaperone Plasmid Set(タカラバイオ株式会社会社(日本国滋賀県大津市))で形質転換したE.coli Origami(DE3)株[Δ(ara−leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F’[lac+ laclq pro](DE3)gor522::Tn10 trxB(KanR、StrR、TetR)4](Novagen(米国ウィスコンシン州マディソン))の形質転換のために使用し、これによりシャペロンGroEL+GroESを発現させることができる。
プラスミド選択のために20μgmL-1のクロラムフェニコールおよび50μgmL-1のアンピシリンを含む150mLのLB培地中でシャペロンをPLEイソ酵素と同時発現させた。1mgmL-1のL−アラビノースを添加することにより、シャペロン発現を直ちに開始した。40μMのIPTGを添加することにより、OD600=0.5でPLE産生を誘発した。24時間後、細胞を遠心分離により除去し、10mlのリン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.5)中に再懸濁させ、超音波を用いて破壊した。細胞片を遠心分離により除去し、上清をさらなる実験に使用した(粗細胞抽出物)。タンパク質含量およびエステラーゼ活性をBradfordにしたがうか、またはpNPA分析を用いて決定した。
組換え産生されたPLEの粗抽出物を含む混合物(5〜15μL、pNPA分析の0.05〜0.15Uに相当)を緩衝液(20%(w/v)グリセリン;0.0025%(w/v)dH20中ブロモフェノールブルー)(5〜10μL)と混合した。そのアリコートを天然ポリアクリルアミドゲル(7.5%)上で分離した。活性染色のために、新たに製造したα−ナフチルアセテートおよびFast Redの混合物中でゲルをインキュベートした。生成したα−ナフトールおよびFast Red間に赤色複合体が形成されることはエステラーゼの加水分解活性を示す。(Krebsfaenger,N.,et.al.,(1998)Enzyme Microb.Technol,22,641−646)。ゲルを次にクマシーブリリアントブルーで染色した。
基質としてp−ニトロフェニルアセテート(10mM、ジメチルスルホキシド中に溶解)を用いて、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM)中分光光度法でエステラーゼ活性を決定した。生成したp−ニトロフェノールの量を410nm(ε=15*103M-1cm-1)の波長、RTおよびpH7.5で決定した。1単位(U)を、1分あたり1μMのp−ニトロフェノールを分析条件下で変換できる酵素の量と定義する(Krebsfaenger,N.,et.al.(1998)Enzyme Microb.Technol,22,641−646)。
エステラーゼの基質特異性を一定pHで分析した。既知量のエステラーゼを、エステル基質(5%(v/v);トリブチリン、酢酸エチル、トリオレインまたは酪酸メチル)およびアラビアゴム(2%(w/v))を含むエマルジョン(20mL)に37℃で添加した。遊離した酸をpH−Statiometer(Schott(ドイツ国マインツ))中、一定のpH7.5に維持するために0.01NのNaOHを用いて自動的に滴定した。1単位(U)を、分析条件下で1分あたり1μMの酸を生成できる酵素の量と定義する。
加水分解をサーモミキサー(Thermomixer comfort Eppendorf(ドイツ国ハンブルク))中の1.5mlの反応容器中、37℃で実施した。1mlの基質溶液(リン酸ナトリウム緩衝液中(pH7.5、50mM)中10mM)について0.5Uのエステラーゼ粗抽出物(pNPA分析に基づく)を使用した。混合物をジクロロメタンで抽出することにより反応を停止し、有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。
実験手順は、第2アルコールのラセミ化合物の分割についてと同じであり、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5、50mM)中10mMの基質を含む1mlの反応混合物において0.5単位(pNPA)のPLE粗抽出物を使用した。反応を37℃で実施し、表示した時間で試料を採取した。変換率および生成物エナンチオマー過剰の分析をガスクロマトグラフィーにより実施した。分析はC−R5A Chromatopac/Integrator GC装置(Shimadzu(ドイツ国デュイスブルク))中Hydrodex(登録商標)−b−3P(ヘプタキス−(2,6−ジ−O−メチル−3−O−ペンチル−b−シクロデキストリン(25m、0.25mM))GCカラム(Machery Nagel(ドイツ国デューレン))を使用した。110℃のカラム温度での等温分別の滞留時間は次のとおりであった:シス−3,5−ジアセトキシ−シクロペント−1−エン:21.8分、3(S)アセトキシ−5(R)−ヒドロキシ−シクロペント−1−エン:18.2分、3(R)アセトキシ−5(S)−ヒドロキシ−シクロペント−1−エン:16.0分。
ブタ肝臓からのmRNAの単離およびRT−PCR
単離されたRNAの品質をアガロースゲル上で試験し(不図示)、前記RNAを分光光度法により定量し(2.6μg/μl);このようにして、使用した組織0.1gから260μgのRNAを得た。RT−PCRによりcDNA中に転写した後、前記cDNAの品質を、ハウスホールド遺伝子β−アクチン増幅用の鋳型として使用することにより試験した。図1は、cDNAによりβ−アクチン遺伝子の増幅が可能になり、その品質はしたがってさらなる実験に適していることを示す。
γPLEの配列に基づいたプライマーを使用したPLE遺伝子の増幅のためにcDNAを使用した。図2に示すように、PCR後に反応混合物をアガロースゲルに付すことにより、約1.7kbpでγPLEのサイズに対応する鋭いバンドが得られた。このバンドを切除し、DNAを単離し、順プライマーを介して結合したCACCオーバーハングを用いてTOPOベクター中にクローニングした。E.coli Top10細胞を、この構造混合物を用いて形質転換した後、組換えクローンを得た。プラスミドDNAをこれらのクローンから単離し、制限マッピングにより試験し、配列決定した。
新規PLE遺伝子の配列決定により、互いに異なり、γ−PLEに関して異なる4つの新規遺伝子配列が得られたことが明らかになった。γ−PLE配列と異なる部位を図3のアミノ酸配列のアラインメントで図示する。このように存在するPLEおよびその遺伝子に1から5の番号をつけ、PLE1はすでに開示されているγ−PLEに相当する。新規PLEの公知のγ−PLEとの違いは次のようにまとめることができる:
PLE2:6ヌクレオチド置換(3アミノ酸置換)[イソ酵素4]
PLE3:35ヌクレオチド置換(20アミノ酸置換)[イソ酵素24]
PLE4:34ヌクレオチド置換(20アミノ酸置換)[イソ酵素39]
PLE5:34ヌクレオチド置換(21アミノ酸置換)[イソ酵素41]
見いだされた5つの遺伝子をpET15bベクター中にサブクローニングした。E.coli Origamiをこれらの構築物ならびに2つのシャペロン部分であるGroESおよびGroELをコードするプラスミドpGro7で形質転換した。この発現系に関してE.coliにおけるPLEの有効な過剰発現が記載されている(独国特許第10061864号)。株を小規模(50ml/150ml)で培養し、シャペロンおよびPLE構築物のタンパク質発現を誘発した。加えて、pGro7を用い、pETベクターを用いないでγPLEおよびE.coli Origamiを比較のために同時培養し、タンパク質発現を誘発した。上清を破砕し(体積:3ml/9ml)、遠心分離により可溶性細胞内タンパク質を含む粗抽出物を得、次の実験に使用した。
粗抽出物を天然ゲルに適用し、これを次いで、α−ナフチルアセテートを基質として含むFast Red溶液中でインキュベートすることにより、エステラーゼ活性を試験した。これに続いてクマシー染色をおこなった(図4:PLE2、クローン12、PLE3、PLE4、PLE5、γPLEおよびE.coli Origami pGro7野生型(負の対照)の粗抽出物の天然PAGE。左図:α−ナフチルアセテートを用いたFast Red染色、右図:その後のクマシーブリリアントブルー染色)。
まずpNPA分析を用いることによりエステラーゼ活性を試験した。これにより、第1表に記載する結果が得られた。
pHスタットを用いて新規PLE変異体のアキラルエステルに関する活性を調べた。酵素の精製後、比活性を測定し、第2表に記載した。
粗抽出物を3つのエステラーゼ阻害剤のいずれかで処理することにより、新規PLE変異体の阻害可能性を決定した。フェニルメチルスルホニルフルオリド、フッ化ナトリウムおよびフィゾスチグミンの影響を調べた。試料をある時点で採取し、残存エステラーゼ活性をpNPA分析により決定した。第8表に結果を示す。
Claims (6)
- 配列番号4、6、8または10のエステラーゼ。
- 請求項1に記載のエステラーゼをコードする単離された核酸。
- 請求項2に記載のクローニングされた核酸を有する遺伝子、ベクター、プラスミドまたは組み換え型微生物。
- 少なくとも1つのクローニングされたシャペロン遺伝子をさらに含む、請求項3に記載の組み換え型微生物。
- エナンチオマー的に富化されたアルコール、カルボン酸およびエステルを製造するための請求項1に記載のエステラーゼの使用。
- (i)配列番号3、5、7または9の突然変異誘発、
(ii)(i)から得られる核酸配列の好適なベクター中へのクローニングと、それに続く好適な発現系中への形質転換、ならびに
(iii)改善された活性および/または選択性および/または安定性を有するポリペプチドの検出および単離
により製造される、配列番号2のポリペプチドに対して改善された活性および/または選択性および/または安定性を有するポリペプチドの製造法における請求項2に記載の核酸の使用。
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