CN105255916B - 一种编码具有高水解活性的猪肝羧酸酯酶亚型基因 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程领域，具体涉及一种编码具有高水解活性的猪肝羧酸酯酶亚型基因。从健康的大白猪的肝脏组织中分离得到一种对通用底物对硝基苯基乙酸酯(p‑NPA)的水解活性比已见报道的PLE亚型都明显高的新亚型基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的PLE蛋白具有高水解活性，功能验证表明，这种PLE蛋白基因的酶活力为13.29U/mg，比已报道的7种亚型的酶活性都要高出很多。通过克隆表达获得催化水解活性强的单一组分的PLE同工酶，将大大降低生产成本，对有机化学合成工业和制药业具有巨大的实用价值。

Description

一种编码具有高水解活性的猪肝羧酸酯酶亚型基因

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，具体涉及一种编码具有高水解活性的猪肝羧酸酯酶亚型基因及应用。

背景技术

猪肝羧酸酯酶(pig liver carboxylesterase,PLE)又称为猪肝酯酶，是存在于猪肝中的一种丝氨酸水解酶，是一个由多种同工酶组成的酶家族，与其它动物种类的羧酸酯酶相比，PLE家族显得尤其复杂，从猪体内直接提取的PLE是多种同工酶的混合物，且不同批次的提取物活性差异较大。到目前为止，文献报道的PLE有7种亚型，分别为PLE1，PLE2，PLE3，PLE4，PLE5，PLE6以及APLE。单一组分的PLE在催化水解对映体化合物时具有高度的立体选择性，在反应中能选择性地水解对映异构体中的某一种，获得单一纯度的对映体产物，在单一对映体功能化合物和药物中间体工业生产中起到重要的作用，从而成为有机化学合成领域水解酶的主角。同时PLE也可以水解多种含有酯键、硫酯键和酰胺键的内、外源性物质，PLE可能通过其强大的水解作用控制药物的疗效及毒副作用，其催化水解活性的数据成为猪临床合理用药的理论依据。

由于猪体内提取的天然PLE是多种同工酶的混合物，而不同的同工酶对底物的专一性和立体选择性存在差异，使得提取物的应用受到很大的限制。因此，采用基因工程手段表达单一组分高活性的PLE是行之有效的方案。

通过克隆表达获得催化水解活性强的单一组分的PLE同工酶，将大大降低生产成本，对有机化学合成工业和制药业具有巨大的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，寻找一种对通用底物对硝基苯基乙酸酯(p-NPA)的水解活性比所有已经报道的PLE亚型都明显高的新亚型基因。

本发明的另一目的是提供一种新的编码高水解活性PLE蛋白的核苷酸序列，并对其进行原核功能性表达，制备单一组分高纯度的酶。

本发明通过克隆技术在猪体内分离得到一种高水解活性的猪肝羧酸酯酶亚型基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1中第1-1701bp所示的序列。

申请人同时得到该分离的高水解活性的猪肝羧酸酯酶蛋白，该蛋白编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。

实现本发明目的的具体技术方案如下：

1、新亚型基因的获得

从猪肝组织中提取总RNA，通过反转录合成cDNA，由于PLE各亚型ORF的5'和3'末端高度保守，因而根据PLE1cDNA的5'和3'端序列设计PLE ORF的通用PCR引物如下：

PLE-up：5'-ATGTGGCTTCTCCCGCTGGTCCTGA-3'

PLE-down：5'-CCTCAAGGTCAGCCGAGCCTCCCCT-3'

以cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增产物回收后连接到pMD18T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，用所得的连接产物转化DH5α感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，通过菌液PCR进行阳性克隆筛选，将阳性克隆送样测序。

对测序数据结果进行分析，在大量的克隆测序基础上，除了克隆得到已见报道的7种PLE亚型基因片段外，还克隆到大量的新亚型基因片段。

2、PLE蛋白的表达及纯化过程如下：

(1)用于原核表达的PLE目的基因的制备：

用于原核表达PCR扩增引物由武汉擎科创新生物公司合成，引物对的具体序列如下：

上游引物：5ˊ-GGAATTCCATATGGGGCAGCCAGCCTCGCC-3ˊ

下游引物：5ˊ-CCGCTCGAG CTTTATCTTGGGTGGCT-3ˊ

上游引物5ˊ端加上了保护性碱基(GGAATTC)和NdeI酶切位点(如下划线所示的序列)，下游引物5ˊ端加上了保护性碱基(CCG)、XhoI酶切位点(如下划线所示的序列)和终止密码子(如斜体所示的序列)。

去除PLE亚型的起始密码子(ATG)和信号肽序列(TGGCTTCTCCCGCTGGTCCTGACCTCCCTCGCCTCTTCTGCAACTTGGGCA)以及内质网滞留信号(CATGCTGAGCTG)。

用上述插入PLE基因的pMD18-T为模板，使用上述引物对扩增PLE的ORF，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小正确后，将目标片段切下，用凝胶回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)回收。

(2)原核表达载体(质粒)pET15b-PLE的构建：

将上述获得的PLE基因片段和表达载体pET15b(购自Merck Millipore公司，质粒图谱见图6)分别进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将目标片段切下，用凝胶回收试剂盒回收，16℃条件下连接。用连接产物转化DH5a感受态细胞，经双酶切和测序鉴定正确后，申请人将所得的原核表达载体命名为表达质粒pET15b-PLE(图谱见图7)。

(3)PLE功能性表达及纯化：

首先将分子伴侣质粒pGro7(购自宝生物工程大连有限公司)转化Origami^TM2(DE3)感受态细胞(购自Merck Millipore公司)，在LB(Chl⁺)琼脂平板上筛选出阳性菌落，经酶切鉴定正确后命名为Origami-pGro7，然后扩大培养用来制备Origami-pGro7感受态细胞。取上述表达质粒pET15b-PLE转化Origami-pGro7感受态细胞，将转化产物涂布LB(Amp⁺和Chl⁺)琼脂平板。37℃培养16h后挑取平板上的单个菌落进行培养，3h后用菌液PCR进行鉴定。将所得的阳性克隆命名为Origami-pGro7-pET15b-PLE。

将阳性菌接种于LB(Amp⁺和Chl⁺)培养基中，首先加入L-阿拉伯糖(L-Arabinose)至终浓度为1mg·mL^-1，30℃摇床200r/min条件下培养2-3h，诱导分子伴侣pGro7表达，当浓度达到OD₆₀₀值为0.6-0.8时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为40uM诱导目的基因PLE的表达，同样条件下振荡培养6小时后离心收集菌体，进行破碎处理，高速离心后取上清用0.45um滤膜进行过滤，用带有His标签的镍离子亲和层析柱对上清液过柱纯化，所得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳分析鉴定，正确后超滤浓缩，置-80℃保存备用。

(4)PLE蛋白酶催化水解活性的鉴定：

具有催化水解活性的PLE能够把通用底物p-NPA(181mg p-NPA，置于10mL棕色容量瓶中，采用乙腈溶解后定容为标准贮备液)水解为p-NP，溶液颜色由原来的无色的p-NPA变为黄色的p-NP。用p-NPA检测PLE蛋白酶活性试验的结果显示，表达菌Origami-pGro7-pET15b-PLE破碎分离获得的上清具有水解活性，可水解p-NPA产生p-NP，使溶液颜色由无色变为黄色。

以p-NPA为底物，使用安捷伦8453型紫外-可见分光光度仪，对纯化的PLE蛋白进行酶活力检测，发现一种新出现的亚型PLE-F4基因片段对通用底物p-NPA显示出很高的催化水解活性。

本发明的积极效果如下：

(1)对通用底物p-NPA显示出很高的酶活力。

(2)在单一对映体功能化合物生产中和药物中间体工业生产中起到重要的作用。

(3)在药物代谢中起到重要作用。

更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是猪肝羧酸酯酶PLE-F4亚型基因的核苷酸序列(1-1701bp)，序列全长为1701bp,其中第1-1701bp也是该基因的编码区(CDS),显示对应的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是猪肝羧酸酯酶PLE-F4亚型基因编码的蛋白质序列。

图1：为原核表达PLE ORF的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图。

附图标记说明：泳道M为：DL2000marker；泳道1为：原核表达PLE ORF(1635)PCR扩增片段。

图2：为原核表达载体pET15b-PLE双酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测图。

附图标记说明：泳道M1为：DL2000marker；泳道M2为：DL15000marker；泳道3为：NdeⅠ和XhoⅠ酶切pET15b-PLE产物。

图3：为PLE原核表达产物SDS-PAGE电泳鉴定图。

附图标记说明：泳道M为：蛋白Marker；泳道1为：Origami WT；泳道2为：Origami-pGro7-pET15b；泳道3为：Origami-pGro7-pET15b-PLE；泳道4为：His-tag-purifiedOrigami-pGro7-pET15b-PLE；泳道5为：His-tag-purified Origami-pGro7。

图4：为PLE原核表达产物的纯化结果SDS-PAGE电泳鉴定图。

附图标记说明：泳道M为：蛋白Marker；泳道1为：200-222mM咪唑洗脱蛋白样品；

泳道2为：223-245mM咪唑洗脱蛋白样品；泳道3为：246-267mM咪唑洗脱蛋白样品；

泳道4为：268-290mM咪唑洗脱蛋白样品；泳道5为：290-312.5mM咪唑洗脱蛋白样品；

泳道6为：312.5-335mM咪唑洗脱蛋白样品。

图5：为原核表达PLE蛋白水解p-NPA的活性检测图。

附图标记说明：1-为：Origami WT；2-为：Origami-pGro7；3-为：Origami-pGro7-pET15b-PLE；4-为：Origami-pGro7-pET15b；5-为：PBS(50mM，pH7.2)。

图6：为本发明应用的pET-15b空载体图谱(5708bp)。

图7：为本发明制备的重组表达质粒pET15b-PLE的图谱(7343bp)。

具体实施方式

实施例1：PLE亚型基因的获得

(1)将健康的大白猪(来源于湖北天种畜牧股份有限公司，为常规品种)放血处死，剪取肝脏组织，从新鲜的肝组织中提取总RNA(提取方法采用宝生物工程大连有限公司生产的试剂盒，按照试剂盒的说明书操作)，通过反转录合成cDNA，根据PLE1基因的5'和3'端序列(GenBank登录号X63323)设计PLE的扩增PCR引物，并送交武汉擎科创新生物科技有限公司合成，引物对的序列如下：

PLE-up：5'-ATGTGGCTTCTCCCGCTGGTCCTGA-3'

PLE-down：5'-CCTCAAGGTCAGCCGAGCCTCCCCT-3'

按照下列步骤进行逆转录：

(1)在Microtube管中按照表1配制混合液，全量为6μL。

(2)在70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。

(3)离心数秒钟使RNA混合液聚集于管底。

(4)再按照表2在Microtube管中配制混合液反转录体系。

(5)在42℃保温1h。

(6)在70℃保温15min后冰上冷却，得到cDNA溶液。

(7)以上述cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如表3所示。PCR扩增条件设定为：94℃5min，94℃1min，57℃1min，72℃2min，30个循环后72℃延伸10min。

表1 反转录反应体系1

反应成分	使用量
		肝组织总RNA	1μg
Oligo-d(T)(100pmol/L)	0.5μL
		RNase free dH<sub>2</sub>O	up to 6μL

表2 反转录反应体系2

反应成分	用量(μL)
		M-MLV 5×Reaction Buffer	2.0
模板RNA/引物变性溶液	6.0
		RTaseM-MLV(RNase H-)	0.5
dNTP Mixture(10mM)	0.5
		RNase Inhibitor(20U/μL)	0.5
RNase free dH<sub>2</sub>O	up to 10

表3 PLE的PCR扩增体系

反应成分	用量(μL)
		10×Buffer(Mg<sup>2+</sup>)	2.5
dNTP Mix(10mM)	1.5
		PLE-up(10pmol/L)	1.0
PLE-down(10pmol/L)	1.0
		cDNA	2.0
rTaq(5U/μL)	0.25
		ddH<sub>2</sub>O	up to 25

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，通过胶回收试剂盒胶回收后连接到pMD18-T载体上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素100μg/ml的LB平板培养基上，在37℃培养箱中培养16h，挑取菌落培养3h后进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆送武汉擎科创新生物科技有限公司测序。

对测序结果进行分析归纳后发现，除了获得已见报道的7种PLE亚型(PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE)基因片段外，还发现了至少47种新亚型片段，依据文献报道的PLE亚型分类方法，按PLE亚型氨基酸序列中25个变异位点氨基酸的相似度，将这54种亚型片段分为7大类，分别用大写字母A～G来表示，每一大类再用阿拉伯数字1～9进行区分。

根据GenBank中PLE1开放阅读框中成熟氨基酸序列(GenBank登录号X63323)，设计用于表达PLE的PCR扩增引物，上游引物从去除信号肽之后的第55个核苷酸序列开始，在5'端依次加上7个保护性碱基GGAATTC，NdeI酶切位点CATATG；下游引物去除编码内质网滞留信号的12个核苷酸(CATGCTGAGCTG)，5'端依次加入3个保护性碱基CCG，XhoI酶切位点CTCGAG和终止密码子TCA。具体的引物对序列如下：

上游引物：5ˊ-GGAATTCCATATGGGGCAGCCAGCCTCGCC-3ˊ

下游引物：5ˊ-CCGCTCGAGTCACTTTATCTTGGGTGGCT-3ˊ

用含有PLE基因片段的pMD18-T为模板，使用上游引物和下游引物对PLE基因进行PCR扩增，扩增体系如表4所示，扩增条件设定为：98℃2min,98℃10sec,63℃15sec,72℃1min，35个循环后72℃延伸5min。

表4 PLE的PCR扩增体系

反应成分	用量(μL)
		2×High-Fidelity-Master Mix(10mM)	12.5
上游引物(10uM)	1.0
		下游引物(10uM)	1.0
模板	1.0
		ddH<sub>2</sub>O	up to 25

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后用PCR产物纯化试剂盒(购自天根生化科技有限公司)纯化，然后用NdeI和XhoI进行双酶切，37℃条件下酶切1小时，酶切体系如表5所示：

表5 双酶切体系

反应成分	用量(μL)
		NdeI	2.0
XhoI	2.0
		10×FastDigest Buffer	2.0
PLE	8.0
		ddH<sub>2</sub>O	up to 20

同时也对载体pET-15b(质粒图谱见说明书附图图6)用NdeI和XhoI双酶切，37℃条件下酶切1小时，酶切体系如表6所示：

表6 双酶切体系

反应成分	用量(μL)
		NdeI	2.0
XhoI	2.0
		10×FastDigest Buffer	2.0
pET15b	10
		ddH<sub>2</sub>O	up to 20

酶切后的PCR产物和载体pET15b产物分别用胶回收试剂盒纯化，然后于16℃条件下过夜连接，连接体系如表7所示：

表7 连接体系

反应成分	用量(μL)
		酶切回收PCR产物PLE	5.0
酶切回收载体pET15b	2.0
		T4DNA ligase	1.0
10×T4ligase Buffer	1.0
		ddH<sub>2</sub>O	up to 10

将所得连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉100μg/ml的LB平板培养基上，并在37℃培养箱中培养16h，挑取菌落培养3h后进行菌液PCR鉴定，引物设计与扩增程序与表达PLE基因相同，扩增体系建表8所示，扩增条件设定为：94℃3min,94℃30sec,55℃30sec,72℃1min，30个循环后72℃延伸5min。

表8 菌液PCR扩增体系

反应成分	用量(μL)
		2×MasterMix	12.5
上游引物(10uM)	1.0
		下游引物(10uM)	1.0
菌液	1.0
		ddH<sub>2</sub>O	up to 25

取阳性菌进行扩大培养，用质粒小提试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司提取质粒进行双酶切鉴定，双酶切体系如表9所示：

表9 双酶切体系

反应成分

用量(μL)

NdeI	2
		XhoI	2
10×FastDigest Buffer	2
		质粒	10
ddH<sub>2</sub>O	up to 20

经双酶切鉴定条带大小正确后，交武汉擎科生物公司进行测序，测序结果表明PLE目的基因片段正确插入到载体pET-15b中，且无突变发生，将获得的表达质粒命名为pET15b-PLE(质粒图谱见图7)。

实施例2：PLE基因的原核功能性表达

为了表达出以可溶性形式存在且具有天然酶活性的PLE蛋白，本实施例选取了具有trxB和gor双突变的Origami^TM2(DE3)为宿主菌(购自Merck Millipore公司)，该菌可形成氧化性微环境利于重组蛋白二硫键的正确折叠，从而更有利于重组蛋白的可溶性表达。关键是同时选取了分子伴侣pGro7(购自宝生物工程大连有限公司)作为表达的辅助质粒，通过表达分子伴侣pGro7辅助重组蛋白的正确折叠，从而大大提高了PLE蛋白的可溶性表达。具体步骤如下：

首先将分子伴侣质粒pGro7转化Origami^TM2(DE3)感受态细胞，转化产物涂布于含氯霉素20μg/ml LB琼脂平板进行筛选，37℃培养16h后，挑取平板上的单个菌落，扩大培养提取质粒经酶切鉴定正确后，命名为Origami-pGro7。制备Origami-pGro7感受态，具体步骤如下：

1、大肠杆菌Origami-pGro7感受态的制备：

(1)挑取单菌落：从含有氯霉素的平皿中挑取大肠杆菌Origami-pGro7菌落，接种于2mL LB液体培养基中，放置摇床中，37℃200r/min振荡过夜。

(2)菌液复苏：取500uL Origami-pGro7菌液接种到50mL LB(无抗生素)的LB液体培养基中，于37℃200r/min培养至OD₆₀₀值达到0.3-0.4即可。

(3)冰浴：在无菌条件下将菌液转移到无菌预冷的50mL离心管中，冰浴30min，4℃3000r/min离心10min，弃上清，将离心管倒置于无菌吸水纸上，使液体流尽回收细菌。

(4)重悬沉淀：菌体加入10mL预冷的0.1mol/L CaCl₂轻轻重悬沉淀，冰浴30min，4℃3000r/min离心10min。

(5)重复上述步骤(3)、(4)各1次。

(6)分装：沉淀中加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬后按每管100μL的量分装。加入无菌甘油至终浓度为15％，置-80℃保存备用。

取构建好的表达质粒pET15b-PLE(图7)转化Origami-pGro7感受态细胞，转化产物涂布含氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)和氯霉素(Chl，20μg/ml)双抗性的LB琼脂平板进行筛选。37℃培养16h后，挑取平板上的单个菌落，进行菌液PCR鉴定。筛选出阳性克隆，将其命名为Origami-pGro7-pET15b-PLE。

2、PLE和pGro7的共表达：

无菌条件下取活化后的Origami-pGro7-pET15b-PLE菌液6mL加入到600mL LB(Amp和Chl双抗性)LB液体培养基中，加入L-阿拉伯糖(L-Arabinose)至终浓度为1mg/mL，首先诱导分子伴侣pGro7表达，放入摇床30℃200r/min条件下振荡培养。培养2-3h至菌液OD₆₀₀值为0.6-0.8时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为40uM，诱导PLE目的蛋白表达，继续振荡培养，6小时后取出培养基，4℃5000r/min离心10min，收集菌体，用PBS(常用磷酸盐缓冲液，配方为：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.27g，加双蒸水至800mL，调pH值为7.4，在加双蒸水定容至1L)重悬菌体，在4℃5000r/min离心10min，重复2次。用十分之一培养基体积的PBS重悬菌体，然后进行压力破碎至溶液澄清，4℃10000r/min离心收集上清，进行SDS-PAGE检测，结果显示经诱导表达的PLE蛋白以可溶性方式存在于上清中，分子量约为61KDa，与预期的PLE蛋白分子量一致。

3、表达产物的纯化：

收集离心后的上清，经0.45um的滤膜过滤处理后，使用AKTApurifier全自动层析仪进行纯化。纯化方法为：

(1)打开电脑主机和电脑电源，待仪器自检完毕(例如：仪器型号为CU950上面的3个指示灯完全点亮不闪烁)，双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。首先将A1管道放入平衡液或banding buffering中，将B1管道放入高盐溶液中或elution buffering中，在system control窗口点击manual→pump→pump wash basic，选中A1，BI管道为ON，execute。泵清洗程序会自动运行结束。选择manual→pump→flow rate,输入流速1ml/ml，insert；选择manual→Alarm﹠mon→alarm pressure，设置high alarm，insert，execut。将进样阀的1号为管道接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉，直接拧入紫外流动池或连接管道。

(2)柱子平衡好了(观察电导COND，pH的数值正确曲线走稳了)。此时将紫外调零，选择manual→Alarm﹠mon→autozero，exectue，准备上样。用系统泵上样：点击pause，将A1放入样品中，点击countine；待样品上完后，再将放入到平衡液中继续清洗柱子。用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。选择manual→pump→gradient，按照自己的条件选择target％B和length，execute。固定体积收集：选择manual→Frac→fractionation-900，输入每管收集体积，exectue。结束固定体积收集选择manual→Frac→fractionation-stop-900，exectue。峰收集：选择manual→Frac→Peak-FracParametersUV，输入峰收集参数，insert,点击Peak-Fraction-900,输入每管最大收集体积，insert，exectue。结束峰收集，选择Peak-FracStop-900，execute。

(3)编程及自动运行。点击mothed editor窗口里工具栏的mothed wizard快捷图标，打开对话框。按照对话框的要求选择条件，编好后按finish出现编程结果，在变量框中可以更改变量。保存点击工具栏里的保存快捷图标，输入文件名，点击ok。在systemcontrol窗口点击工具栏中的RUN打开编好的方法，点击next直到start开始运行。

(4)清洗系统及拆柱。运行结束后，将A1和B1入口放入纯水中，启动pump washpurifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。然后在将A1和B1入口放入20％乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。系统给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，拧上堵头，在拆柱子的上端，拧上堵头。收集纯化的蛋白，用超滤管在4℃4000r/min的条件下离心浓缩至1ml左右，置-80℃保存备用。

4、利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量：

使用Thermo Pierce^TM BCA Protein Assay Kit蛋白测定试剂盒对PLE蛋白浓度进行测量，步骤如下：

配制工作液(该试剂盒自带)，该试剂盒由3部分构成，分别为Reagent A，ReagentB，Albumin Standard Ampules。工作液体积配比为A:B＝50:1，样品与工作液体积配比为1:8。

吸取25μL各标准品和待测样品加入微孔板(浓度范围为20-2000μg/mL)，每孔加入工作液200μL，震荡混匀30s。37℃条件下孵育30min。

使用分光光度计测定562nm处吸光值。除去空白样品吸光值后，制作标准曲线，计算PLE蛋白浓度。

实施例3：PLE蛋白催化水解p-NPA活力测定

用p-NPA检测PLE蛋白酶水解活性试验的结果显示，表达菌Origami-pGro7-pET15b-PLE破碎分离获得的上清具有水解活性，可水解p-NPA产生p-NP，使溶液颜色由无色变为黄色(图5)。

使用安捷伦8453型紫外-可见分光光度仪，采用全波长(200-500nm)扫描模式，测定p-NP的最大吸收波长，经测定p-NP的最大吸收波长为405nm。

PLE水解p-NPA反应在25℃条件下进行，反应体系如表10所示：

表10 PLE水解p-NPA体系

反应成分	用量(μL)
		PLE	10(μg)
p-NPA(1mM)	10
		PB(50mM，pH7.2)	up to 1000

使用安捷伦8453型紫外-可见分光光度仪，把波长设定在405nm处，采用时间扫描模式，测定反应最初1min内反应体系吸光值的变化。

酶水解p-NPA活性单位(U)的定义为：25℃条件下，每分钟将1μmol p-NPA转化为p-NP所需的酶量。

根据朗伯比尔定律ΔA＝E*ΔC*L(A为吸光值，E为消光系数，L为光程)。计算酶活性单位。根据时间和吸光度的相关性曲线，可求出酶促反应最初1分钟内吸光度的变化值ΔA，已知p-NP的消光系数E为13mM^-1cm^-1，本试验所用比色皿光程为1cm，由此可计算出PLE催化水解p-NPA的活力单位。

经测定和计算，发现已见报道的PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE基因的酶活力分别为3.5U/mg、1.75U/mg、1.19U/mg、1.41U/mg、1.78U/mg、6.72U/mg、2.91U/mg；而本发明新克隆出的亚型PLE-F4基因的酶活力为13.29U/mg，比已报道的7种亚型基因的酶活性都要高出很多，这种高活力的PLE-F4的核苷酸序列见序列1所示。

本发明的PLE-F4基因编码的蛋白可在单一对映体功能化合物和药物中间体工业生产中应用。

主要参考文献

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Claims (3)

1.一种分离的具有高水解活性的猪肝羧酸酯酶基因，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.一种分离的具有高水解活性的猪肝羧酸酯酶基因，该基因编码的蛋白质序列如SEQID NO：2所示。

3.权利要求1所述的猪肝羧酸酯酶基因在有机合成和制药业中的应用。