CN101351548A

CN101351548A - 具有酯酶活性的多肽和重组的酯酶及其用途

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Publication number: CN101351548A
Application number: CNA2006800496655A
Authority: CN
Inventors: 格哈德·斯坦保尔; 迈克尔·施塔内克; 彼得·波亚尔里尔; 沃夫冈·斯卡安可; 赫尔马特·施瓦布; 马塞尔·乌博尔特斯; 乔纳斯·西基尔科斯; 哈拉德·皮希勒; 马诺拉·埃尔曼; 克里斯托弗·赞兹马尔
Original assignee: DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH and Co KG
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2005-12-27
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2026-12-08
Also published as: SG170757A1; CN101351548B; WO2007073845A3; ATE549400T1; HK1128306A1; AT502990A1; NO20082864L; KR101388391B1; CA2635380C; WO2007073845A8; IL192400A0; BRPI0621280A2; IL192400A; ES2383702T3; PL1966373T3; US8158393B2; EP1966373A2; US8642312B2; KR20080093109A; NO343225B1

Abstract

本发明公开了具有酯酶活性的多肽和重组蛋白质(其展示出氨基酸序列SEQ.ID.No.1)及其用途。

Description

具有酯酶活性的多肽和重组的酯酶及其用途

本发明涉及具有酯酶活性、特别是具有2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯酶活性的新颖多肽，并涉及具有酯酶活性的酶活性重组蛋白质，及其用于拆分2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯对映异构体混合物外消旋化合物的用途。

富含对映异构体的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸及其酯是用于制备药物(例如用于δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基链烷羧酰胺)的有价值的中间产物，其具有肾素抑制特性，并可在药物制备中用作抗高血压剂。

酯酶通常被用于拆分外消旋化合物和不对称化。

然而，可商业获得的适用于制备手性化合物的酯酶非常少。

已知来自猪肝的酯酶提取物仅是制备规模上的。猪肝酯酶(PLE)在很久以前是从天然来源中分离的，其活性也已知很长时间了(Simonds，J.P.(1919)Amer.J.Physiol.48，141；Bamann，E.et al.(1934)Hoppe-Seyler Z.229，15；Falconer J.S.and Taylor，D.B.(1946)Biochem.J.40，831-834)。

为了表征PLE也已经进行了多种研究(Heymann，E.and Junge，W.(1979)Eur.J.Biochem.95，509-518；Lehner，R.and Verger，T.(1997)Biochemistry36，1861-1868)。此外，已可显示(例如在WO 01/09079中)，来自猪肝的酯酶提取物可选择性地水解甲基5-氯代-2-(1-甲基乙基)-4-戊烯酸盐的(R)对映异构体。

然而，来自天然来源如猪肝的这类酯酶提取物的用途伴有缺点。

首先，不同批次的品质不同，从而使得难以优化工业过程。其次，在药物制品制造中使用动物来源是人们不期望的，因为病毒和朊蛋白(prion)的存在不能总被清除。

因为这些原因，需要在微生物中生产具有标准化的品质的重组猪肝酯酶。

对可能的酯酶基因的克隆见例如FEBS Lett.(1991)，293，37-41所述。活性猪肝酯酶的第一次功能性表达首次被描述于WO 02/48322中。

WO 2004/055177描述了通过对来自WO 02/48322的seq.ID No.1的重组猪肝酯酶(rPLE)进行定点诱变来制备其它重组酯酶。如从WO2004/055177的描述中和从相同发明人写作的文章Protein Engineering，16，1139-1145，2003的描述中显而易见的，选择对来自WO 02/48322的rPLE序列的修饰，从而获得在David et al.，(1998)Eur.J.Biochem.257，142-148中公开的重组肠内猪酯酶(PICE)。

对外消旋2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的拆分在这些文章的任一中均未描述。

然而，因为对酯酶(其具有针对2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的期望的立体选择性活性并可以通过生物技术容易地制备)的需要没有满足，所以提供相应的新颖重组酯酶是本发明的一个目的。

在分离和克隆EBS Lett.(1991)，293，37-41和WO 02/48322所述的针对已知的猪肝酯酶(PLE)的基因(作为从来自猪肝的mRNA开始获得的cDNA)的尝试中，除了已知的PLE序列以外，还发现了第二个新颖的酯酶序列。表达这两个序列后(其中制备了相应的蛋白质或酯酶，即已知的rPLE和新颖的、重组的“备选”酯酶(rAPLE))，意外地发现仅rAPLE能够选择性拆分外消旋的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯。

因此可通过具有酯酶活性的新颖多肽和新颖的重组酯酶(rAPLE)来达成本发明的目的，所述重组酯酶的氨基酸序列与已知PLE序列在总共548个氨基酸中有21个不同。新颖的rAPLE与已知的猪肠道羧酸酯酶(PICE)的氨基酸序列也在总共548个氨基酸中有12个不同。然而，PICE被发现于猪肠道中。

本发明因此涉及具有酯酶活性的多肽，其包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1。

本发明还涉及具有酯酶活性的新颖的重组蛋白质，其包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1。

本发明的多肽和重组rAPLE具有立体选择性地拆分外消旋的式(I)

的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的活性，其中R是C₁-C₆的烷基，R₁是C₁-C₄的烷基且X是氯、溴或碘。

如上文所述，具有酯酶活性的本发明的多肽和新颖的重组酯酶rAPLE与FEBS Lett.(1991)，293，37-41中公开的已知序列的总计548个氨基酸中有21个不同，并与来自David et al.，(1998)Eur.J.Biochem.257，142-148中公开的已知PICE蛋白的总计548个氨基酸中有12个不同。

本发明的新颖rAPLE蛋白质的序列在以下的氨基酸位置上与PLE蛋白质的已知序列不同：

APLE 位置 PLE

Glu 73 Asp

Ile 75 Val

Gly 76 Val

Gly 77 Glu

Leu 80 Thr

Arg 87 Gly

Ile 92 Thr

Pro 93 Leu

Val 129 Leu

Ser 133 Pro

Thr 134 Met

Leu 138 Val

Ala 139 Val

Phe 234 Leu

Ala 236 Val

Gly 237 Ala

Phe 286 Leu

Ala 287 Thr

Leu 290 Phe

Pro 294 Gln

Thr 302 Pro

另外，本发明的蛋白质和新颖的重组rAPLE可以是SEQ ID No 1所示经修饰的序列的形式，所述经修饰的序列可得自例如常见修饰，例如序列N或C端的一个或多个氨基酸(例如来自α因子信号序列的GluAlaGluAla)的交换、删除或附加，或通过与其它蛋白质融合来进行修饰。

本发明还进一步包括在本发明的酶的蛋白质序列中具有修饰的突变蛋白质，所述本发明的酶具有合适的活性，尤其是对2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的活性。突变蛋白质可通过例如通过已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因改组等)修饰DNA(其编码本发明的酶)获得，使得所述DNA编码与本发明的酶差异至少一个氨基酸的酶，并随后在合适的宿主细胞中表达经修饰的DNA。因此，本发明还包括如SEQ ID.No 1所示的经修饰的DNA序列，其通过上述突变、删除、延伸、融合获得，并编码具有想要的酯酶活性的酶。

酯酶活性，尤其是2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯酶活性在本文中被定义为拆分式(I)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的外消旋化合物的能力。

本发明的多肽和重组rAPLE可以如下制备：

首先，使用合适的试剂盒从猪肝分离mRNA，然后基于mRNA提取物通过反转录产生cDNA。

接着，以GenBank编号No.X63323(Matsushima et al.，1991)的已知猪肝酯酶基因的序列为基础，制备特异性PCR引物，然后进行扩增及克隆。

这些特异性引物是：

引物1：5’-CAATGGCTAT

引物2：5’-CCG

AGCCTCCCCT

引物中包含编码PLE蛋白质的合适的核苷酸序列并且专属地存在于引物中的部分以粗体表示。

引物的其它序列部分包含例如下列信息：限制性内切核酸酶(斜体)的切割位点或对表达来说重要的序列元件。在本发明的rAPLE制备中该部分可变化。

然后可通过现有技术的PCR方法用引物1和2进行扩增。

随后使用PCR产物，通过现有技术方法，来制备表达构建体，所述表达构建体用于在合适的宿主生物中异源表达所编码的rAPLE蛋白质。优选地，PCR产物最初必须被克隆进合适的质粒载体中。

然后将以该方式获得的重组质粒转化进合适的宿主例如Escherichiacoli中。然后对若干得到的克隆的插入物进行测序。

出乎意料的是，其中鉴定了两组具有不同序列的重组克隆，一组与根据Matsushima et al.，(1991)FEBS Lett.293，37-41的PLE预期序列100％相同，还有如SEQ.ID.No.2所示的新颖的核苷酸序列(APLE序列)表达后得到本发明的氨基酸序列SEQ.ID.No.1。

本发明还涉及编码本发明的多肽和重组酯酶rAPLE的核酸或核苷酸序列。

例如，这类核酸具有SEQ.ID.No.2中所示的核苷酸序列。

本发明还涉及下述核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码本发明多肽和重组酯酶rAPLE的核苷酸序列，或包含SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序列。

另一种可能性是通过标准化的合成技术(例如使用自动化DNA合成仪)，来制备对应于本发明核酸序列(其编码本发明的酯酶)的合适的寡核苷酸。

对编码本发明酯酶的核酸序列进行纯合成制备尤其有利于在生产药物或其中间代谢物时使用，因为由此所述酶不从动物来源获得。

然后对发现的两种序列(PLE和APLE序列)进行表达。

已知的猪肝酯酶(PLE，Swiss-Prot ID Q29550)包含N端信号序列和C端ER驻留信号(retension signal)——最后4个氨基酸HAEL。

为了表达已知的PLE和新颖的APLE，构建了下述载体，其中序列被引入合适的表达系统中。然后将这些表达构建体转化进入合适的宿主细胞中。

本文上下文中的合适宿主细胞是例如微生物、动物细胞系和植物。

原核和真核微生物均可使用。优选的原核宿主(细菌)为Escherichiacoli和来自Bacillus(例如B.subtilis、B.licheniformis、B.amyloliquefaciens)、Pseudomonas(例如P.fluorescens、P.putida)或Streptomyces(例如S.lividans、S.tendae)属的菌株。真核微生物是优选的，真菌是尤其优选的。其例子为Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyces lactis或Aspergillus sp.。

表达可以是分泌的或细胞内的，以及诱导型的和组成型的。

对于细菌表达而言，可以获得对物种特异信号的选择，a.o.作为可商业获得的用于蛋白质表达的菌株和载体(例如由如Invitrogen、Novagen、New England Biolabs的公司提供的)，所述菌株和载体允许诱导型或组成型的表达、靶蛋白的细胞内和分泌性定位；另外，可以使用下述技术，所述技术使得蛋白质能够正确折叠或促进该正确折叠以得到可溶的和活性的蛋白质。

蛋白质优选以分泌方式表达，在该情况下优选构建下述载体，在所述载体中PLE和APLE的序列以N末端方式连接到S.cerevisiae的α因子信号序列上。

还可制备其中C端四肽HAEL被额外删除的构建体，所述四肽如例如Hardwick et al.，(1990)EMBO J.9，623-630中所述作为ER保留信号作用。

另一优选的表达是带有或不带有ER保留信号的构建体的诱导型表达。

出乎意料的是，具有ER保留信号的构建体也可以被表达并得到rAPLE，所述rAPLE能够选择性拆分外消旋的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯。

来自APLE基因核苷酸序列的新颖酯酶rAPLE的氨基酸序列如SEQID No.1所述。

出乎意料的是，已可发现，与已知的rPLE相反，在每种情况下通过例如在P.pastoris细胞中表达分别编码APLE和PLE的DNA片断获得的新颖的多肽或rAPLE蛋白质，能够立体选择性地拆分外消旋的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯。

本发明因此还涉及本发明的具有酯酶活性的多肽和重组酯酶(rAPLE)用于拆分式(I)

的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的外消旋化合物的用途，所述多肽和重组酯酶与SEQ ID No.1所示序列具有至少80％的同一性，其中R为C₁-C₆的烷基，R₁是C₁-C₄的烷基且X是氯、溴或碘。

本发明具有酯酶活性的多肽和重组酯酶(rAPLE)优选与SEQ ID No.1所示蛋白质的序列具有至少90％、尤其优选至少98％的同一性。还可使用本发明的下述具有酯酶活性的多肽或重组酯酶(rAPLE)，其具有通过常见修饰例如突变、删除、延伸、融合获得的经修饰的SEQ ID.No.1所示DNA序列，所述经修饰的DNA序列编码具有想要的酯酶活性的酶。

在这方面，富含对映异构体的式(II)

的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸或其酯(其中R为C₁-C₆-烷基，A等于H、R₁或R₂，其中R₁可以是C₁-C₄的烷基，R₂是烷基但不等于R₁，且X为氯、溴或碘)是这样获得的：在存在水或式R₂OH(其中R₂是不等于R₁的烷基)的醇作为亲核体时，通过用本发明的多肽或本发明的rAPLE转化式(I)

的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯(其中R、R₁和X如上文定义)的对映异构体混合物，以及

a)对剩余的下述富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯加以分离，所述式中A等于R₁，或

b)如果使用醇作为亲核体，那么对得到的下述富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯加以分离，所述式中A等于R₂，或

c)如果使用水作为亲核体，对得到的下述式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸加以分离，所述式中A等于H。

式(II)中的R是C₁-C₆的烷基，例如甲基、乙基、正丙基和异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基、戊基和己基。

C₁-C₄的烷基是优选的，异丙基是尤其优选的。

A为H、R₁(其中R₁是C₁-C₄的烷基，优选是C₁-C₂的烷基，尤其优选是甲基)或R₂(其中R₂为不等于R₁的烷基)。尤其优选地，R₂是C₁-C₆的烷基。

X为氯、溴或碘，优选氯。

在这方面富含对映异构体的化合物表示：显示出＞80％的对映体过量(ee)、优选＞90％、尤其优选＞97％的那些。

另外，本发明的酶可以以任何形式使用。例如作为分散剂、作为溶液、被固定的、作为粗酶、作为已经通过已知的纯化方法的组合得自其来源的酶、作为具有所需酶活性(天然或通过遗传活性)的完整细胞(其被适当固定和/或透化)或处于这类细胞的裂解物中。

用于本发明的转化的反应温度通常在0℃和99℃之间，优选10和66℃之间。反应溶液的pH在4和11之间，优选6和9之间。

对溶剂的选择取决于使用的亲核体。

如果例如水为亲核体，则可以使用的溶剂是水，水和与水混溶的溶剂(例如与醇例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等，二噁烷，四氢呋喃，丙酮或二甲基亚砜)的混合物或水和与水不混溶的溶剂(例如芳香化合物例如甲苯、二甲苯等，链烷例如己烷、庚烷、环己烷等，醚例如二异丙醚、甲基叔丁基醚等)的两相系统。如果亲核体是醇，则优选地使用的溶剂是醇R₂OH，其中R₂是不等于R₁的烷基。然而，还可能使用醇与有机溶剂(例如四氢呋喃、庚烷、甲苯、己烷、CH₃CN、甲基叔丁基醚等)的混合物。

酶催化的外消旋化合物拆分发生后，想要的终产物被分离。这可以是剩余的富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯(其中，A等于R₁)，或当水为亲核体时是形成的富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸(其中，A等于H)，或当醇为亲核体时是富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯(其中，A等于R₂)。

分离可例如通过常规方法(例如抽提、结晶、柱色谱、蒸馏等)发生。

本发明的方法以多达98％的理论产率和多达＞99％的e.e.得到相应的式(I)的酸或酯。

实施例1：mRNA分离和cDNA的产生

将来自新鲜宰杀的猪(其得自地方屠宰场)的0.7g肝在液氮中冷冻并用研钵匀化，使用Fast Track mRNA抽提试剂盒2.0(Invitrogen，Carlsbad，Calif.，USA)，根据制造商的说明书(Fast Track 2.0试剂盒手册；version J；082301；25-0099)，来分离或抽提被解离的mRNA。抽提提供了12.9μg的mRNA总量。

然后使用0.26μg该mRNA作为模板，使用用于RT-PCR的SuperScript III First-Strand第一链合成系统，根据制造商的说明书来产生cDNA。

实施例2：从猪肝扩增和克隆cDNA

制备基于GenBank编号No.X63323(Matsushima et al.，1991)的猪肝酯酶基因序列的特异性引物：

引物1：5’-CAGA

ATGGCTATC

(SEQ ID No.3)

引物2：5’-CCG

AGCCTCCCCT

(SEQID No.4)

与已知的PLE序列同源的碱基用粗体表示。限制性内切核酸酶的识别序列用斜体表示。

根据‘Phusion High-Fidelity DNA聚合酶’手册(Finnzymes)，在50μl混合物中进行扩增，其中使用1U husion DNA聚合酶(Finnzymes，Espoo，Finland)，用500ng cDNA作为模板，使用20μmol每种引物1和2、5μl的dNTP混合物(每种2mM)，所有都在1×Phusion HF缓冲液中，从在98℃变性30秒开始，随后是用于扩增的30个循环(98℃10秒、68℃20秒、72℃1分钟)和在70℃孵育8分钟以制备完整的产物。

该PCR产生了大小为1.8kb(通过琼脂糖凝胶电泳测定)的DNA片段。

然后使用Qiaquick试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，根据内含的手册纯化该PCR产物。

用限制性核酸内切酶EcoRI切割约0.1μg经纯化的PCR产物，并通过EcoRI切割位点，将其克隆进质粒载体pHILZ和pHIL-D2中。

然后将载体转化进根据‘Current Protocols in Molecular Biology’制备的TOP10电感受态细胞中。

使用‘Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing’试剂盒(AppliedBiosystems Inc.，Forster City，Calif.，USA)，对若干个得到的克隆的插入物进行测序。

藉此鉴定了两条序列，一条100％对应于由Matsushima et al.，(1991)FEBS Lett.293，37-41公开的预期序列，另一条序列对应于SEQ ID No.2。

实施例3：引入α因子信号序列和改变C末端

为了能够对本发明的蛋白质rAPLE和已知蛋白质PLE进行分泌型表达，构建下述载体，在所述载体中PLE和APLE的序列以N末端方式与克隆载体pPICZα(Invitrogen)的α因子起始序列相连。另外，制备其中C端四肽HAEL被删除的构建体。

PCR I：使用EcoRI alpha 1/alpha PLE2引物对来扩增克隆载体pPICZα(Invitrogen)的α因子信号序列。PCR在50μl混合物(2ng模板、0.5μmol每种引物、0.2mM dNTPs、1U Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，均在1×Phusion HF缓冲液中，根据‘Phusion High-Fidelity DNA聚合酶’手册(Finnzymes))中进行。

在95℃变性3分钟，随后在30个循环(95℃30秒、57℃30秒、72℃15秒)中扩增，最终步骤为72℃7分钟。

PCR II：使用PLEalpha1/EcoRIPLE+ER2引物对或PLEalpha1/EcoRIPLE2(删除C端HAEL四肽)引物对，从pHILZ质粒扩增PLE和APLE序列。

再在50μl混合物(2ng模板、0.5μmol每种引物、0.2mM dNTPs、1U Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，均在1×Phusion HF缓冲液中，根据‘Phusion High-Fidelity DNA聚合酶’手册(Finnzymes))中进行这些PCR。

95℃3分钟变性，然后在30个循环(95℃30秒、57℃30秒、72℃15秒)中扩增，最终步骤为72℃7分钟。

PCR III：使用3μl来自PCR I和PCR II的产物，通过无引物PCR将这两种产物组合起来。

延伸在45μl混合物(0.2mM dNTPs、1U的Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，均在1×Phusion HF缓冲液中)中进行。

在95℃将反应混合物加热3分钟，然后在95℃30秒和72℃45秒进行10个循环。为了扩增这些重叠的延伸产物，加入5μl引物混合物(3μl水、1μl 5μM的EcoRIalphal引物和1μl 5μM的EcoRIPLE+ER2或EcoRIPLE2引物)。用20个PCR循环(95℃30秒、57℃30秒、72℃1分钟)扩增产物，并在72℃单温度停止7分钟。

引物序列：

EcoRlalpha1：5′-TCTTCGAA

ACG(SEQ ID No.5)

alphaPLE2：5′-GAGGCTGGCTGCCC

(SEQ ID No.6)

PLEalpha1：5′-AGAGAGGCTGAAGCT

(SEQ ID No.7)

EcoRIPLE+ER2：5′-AT

(SEQ ID No.8)

EcoRIPLE2：5′-AT

TCA

(SEQ ID No.9)

与模板具有同源性的区域是粗体，限制性内切核酸酶的识别序列是斜体。

实施例4：对用于在Pichia pastoris中异源表达猪肝酯酶的表达构建体的构建

使用Qiaquick试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，根据内含的手册来纯化来自实施例3的重叠延伸PCR产物。使用EcoRI限制性内切核酸酶切割约0.1μg经纯化的PCR产物，并通过EcoRI切割位点将其克隆进质粒载体pGAPZ A(Invitrogen)中。

借助于对照切割(例如使用NcoI)，检查插入物相对于启动子的正确方向。

在每种情况下，选择带有方向正确的插入物的克隆，对其测序并保存。

按照下文所述，对相应的质粒命名：

含有Matsushima et al.，(1991)FEBS Lett.293，37-41中公开的已知PLE序列的质粒被称作pGAPZ A PLE-ER(HAEL四肽被删除)和pGAPZ APLE+ER(HAEL四肽仍然存在)。

来自新颖的APLE序列的质粒被称作pGAPZ A APLE-ER(HAEL四肽被删除)和pGAPZ A APLE-ER(HAEL四肽仍然存在)。

实施例5：猪肝酯酶在Pichia pastoris中的组成型表达

将质粒pGAPZ A PLE-ER、pGAPZ A PLE+ER、pGAPZ A APLE-ER和pGAPZ A APLE+ER转化进P.pastoris X-33。根据来自Invitrogen的Pichia Expressions试剂盒的方案说明书来进行转化。在含有100mg/lzeocin的YPD平板(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％D-葡萄糖、2％琼脂)上选择转化子。在含有100mg/l zeocin的YPD平板上对经52个zeocin抗性的克隆划线，并将其保存于15％甘油中。

实施例6：对酯酶活性的定量分析

在含有100mg/l zeocin的YPD平板上，于30℃下，对P.pastoris转化子进行48小时的培养。将细胞挑至Whatman 541硬化的无灰70mm

滤纸上并晾干。用6mg α-萘基醋酸盐(Sigma，溶于500μl丙酮中)、2.5mg邻联茴香胺(tetrazotized o-dianisidine)(Fast Blue Salt BN，Sigma，溶于125μl水中)和5ml 0.1M磷酸氢二钾缓冲液，pH 7的溶液孵育滤纸，以通过显色反应来观察酯酶活性。

在整合了4种质粒pGAPZ A PLE-ER、pGAPZ A PLE+ER、pGAPZ AAPLE-ER和pGAPZ A APLE+ER之一的所有转化子中都检测到了活性。这证明了具有酯酶活性的功能蛋白质的表达。为了核实，也以相同方式测试整合了空载体的克隆。在该情况下，在相当长的反应周期内都未看到显著的酯酶活性。

实施例7：与甲基5-氯代-2-(1-甲基乙基)-4-戊烯酸酯相关的立体选择性酯酶活性

在含有100mg/l zeocin的YPD平板上，于30℃下，对实施例6中所述的P.pastoris转化子进行48小时的培养。将细胞挑至Whatman 541硬化的无灰70mm

滤纸上并晾干。将滤纸与底物溶液A(100μl外消旋的甲基5-氯代-2-(1-甲基乙基)-4-戊烯酸酯、200μl 0.1M磷酸二氢钾缓冲液，pH 8；150μl 10mg/ml酚磺酞；450μl DMSO；650μl H₂O)或底物溶液B(与底溶液A相同，但是使用甲基(2S，4E)-5-氯代-2-(1-甲基乙基)-4-戊烯酸酯代替外消旋化合物)一起孵育。

由于有针对底物的特异酯酶活性，酯底物水解得到的酸释放导致pH降低，这随后导致酚磺酞指示剂的颜色变黄。

这显示：含有质粒pGAPZ A APLE-ER的转化子如果在底物溶液A上测试时在孵育3到4小时后给出信号(菌落周围黄色)，而使用底物溶液B时不能发现显著的转化(图1)。

使用质粒pGAPZ A PLE-ER或pGAPZ A PLE+ER获得的转化子在相同的条件下显示不与底物溶液A或B反应。

这显示重组的rAPLE与重组的rPLE具有底物特异性差异，且使用rAPLE对甲基5-氯代-2-(1-甲基乙基)-4-戊烯酸酯的水解是立体选择性地针对(R)对映异构体发生的。

实施例8：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

向10μl可商业获得的猪肝酯酶或10μl P.pastoris培养物(在带盖2LErlenmeyer摇瓶中的250ml YPD培养基中，于100rpm和28℃下培养72小时)的60倍浓缩(Centricon Ultrafiltrations-Spin Columns，来自Sartorius)的上清液中加入10μl 2×SDS样品缓冲液(125mM Tris-HCl，pH6.8；4％SDS，20％甘油、5％β-巯基乙醇、0.05％溴酚蓝)，所述培养物含有质粒pGAPZ A APLE-ER或空的pGAPZ A质粒(对照菌株)。

样品已经在95℃加热5分钟后，在12.5％的聚丙烯酰胺凝胶(4％成层胶)上分离蛋白质，用考马斯亮蓝R250染色用于检测。SDS-PAGE显示：在具有pGAPZ A APLE质粒的酵母菌株中有具有rAPLE的期望大小(～60kDa)的蛋白质条带，但是在对照菌株中没有(图2)。

也被分析以用于比较的可商业获得的猪肝酯酶在相同尺寸范围内显示出两条蛋白质条带(图2中箭头)。

实施例9：用AOX1启动子对猪肝酯酶的诱导表达

用限制性内切核酸酶XhoI切割质粒pGAPZ A PLE-ER、pGAPZ APLE+ER、pGAPZ A APLE-ER和pGAPZ A APLE+ER，并通过XhoI切割位点将编码APLE和PLE蛋白质的各片段(其具有或不具有ER保留信号)克隆进pPIC9载体(Invitrogen)中。通过用限制性内切核酸酶NcoI核实片段相对于AOX1启动子的正确方向。与实施例4中命名的质粒类似，具有AOX1启动子的载体被称作pPIC9 PLE-ER、pPIC9 PLE+ER、pPIC9APLE-ER和pPIC9 APLE+ER，用SalI对其进行线性化，并将其转化进P.pastoris KM71中。根据来自Invitrogen的Pichia表达试剂盒的说明书进行转化以及对His原营养型的选择。根据来自Invitrogen的Pichia表达试剂盒的说明书，在完全培养基上对选出的转化子和KM71菌株进行过夜培养，并用1％的甲醇诱导48小时。通过实施例7中所述的定量pH-迁移测定法分析得到的培养物，在每种情况下对混合物中2μl的培养物进行测试。与实施例7中针对组成型表达所述的情况相比，诱导型AOX1控制下的表达导致高得多的与外消旋的甲基5-氯代-2-(1-甲基乙基)-4-戊烯酸酯相关的rAPLE酶活性。仅在几分钟后就可检测到酚磺酞颜色改变(红到黄)(图3)。出乎意料的是，rAPLE活性与C端ER保留信号HAEL的存在无关，即，甚至表达带有ER保留信号的rAPLE的细胞也显示活性。相反，用于生产rPLE的酵母菌株不具有与外消旋甲基5-氯代-2-(1-甲基乙基)-4-戊烯酸酯相关的活性。

序列表

<110>DSM精细化学奥地利NFG两合公司

<120>具有酯酶活性的多肽和重组的酯酶及其用途

<130>O.Z.1302a

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>548

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>rAPLE

<400>1

Gly Gln Pro Ala Ser Pro Pro Val Val Asp Thr Ala Gln Gly Arg Val

1 5 10 15

Leu Gly Lys Tyr Val Ser Leu Glu Gly Leu Ala Gln Pro Val Ala Val

20 25 30

Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly Ser Leu Arg Phe

35 40 45

Ala Pro Pro Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val Lys Asn Thr Thr

50 55 60

Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Glu Pro Ile Gly Gly Gln Met Leu

65 70 75 80

Ser Asp Leu Phe Thr Asn Arg Lys Glu Arg Leu Ile Pro Glu Phe Ser

85 90 95

Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Thr Lys

100 105 110

Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Leu Val

115 120 125

Val Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Leu Ala Ala His Glu

130 135 140

Asn Val Val Val Val Ala Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly Phe

145 150 155 160

Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu Asp

165 170 175

Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe Gly

180 185 190

Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Glu

195 200 205

Ser Val Ser Val Leu Val Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe His

210 215 220

Arg Ala Ile Ser Glu Ser Gly Val Ala Phe Thr Ala Gly Leu Val Arg

225 230 235 240

Lys Asp Met Lys Ala Ala Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly Cys

245 250 255

Lys Thr Thr Thr Ser Ala Val Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys Ser

260 265 270

Glu Asp Glu Leu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Phe Ala Leu

275 280 285

Asp Leu His Gly Asp Pro Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Thr Thr Val

290 295 300

Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala Glu

305 310 315 320

Lys Asp Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln Glu

325 330 335

Phe Gly Trp Leu Leu Pro Thr Met Met Gly Phe Pro Leu Ser Glu Gly

340 345 350

Lys Leu Asp Gln Lys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr Pro

355 360 365

Ile Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Asp Lys Tyr

370 375 380

Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu Asp

385 390 395 400

Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala Arg

405 410 415

Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln Tyr

420 425 430

Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Lys Pro Lys Thr Val Ile Gly Asp

435 440 445

His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu Lys Gly

450 455 460

Asp Ala Pro Glu Glu Glu Val Ser Leu Ser Lys Thr Val Met Lys Phe

465 470 475 480

Trp Ala Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asn Pro Asn Gly Glu Gly Leu Pro

485 490 495

His Trp Pro Met Tyr Asp Gln Glu Glu Gly Tyr Leu Gln Ile Gly Val

500 505 510

Asn Thr Gln Ala Ala Lys Arg Leu Lys Gly Glu Glu Val Ala Phe Trp

515 520 525

Asn Asp Leu Leu Ser Lys Glu Ala Ala Lys Lys Pro Pro Lys Ile Lys

530 535 540

His Ala Glu Leu

545

<210>2

<211>1647

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>rAPLE

<400>2

gggcagccag cctcgccgcc tgttgtggac actgcccagg gccgagtcct ggggaagtac 60

gtcagcttag aaggcctggc acagccggtg gccgtcttcc tgggagtccc ttttgccaag 120

ccccctctcg gatccttgag gtttgctccg ccgcagcctg cagaaccatg gagcttcgtg 180

aagaacacca cctcctaccc tcccatgtgc tgccaagagc caattggggg acagatgctc 240

tcagatctat ttaccaacag aaaggagagg ctcattccgg agttttctga agactgtctc 300

tacctaaata tttacacccc tgctgacctg acaaagaggg gcagactgcc ggtgatggtg 360

tggatccacg gaggaggtct ggtggtgggc ggggcttcca cctatgatgg actggccctc 420

gctgcgcatg aaaacgtggt ggtggtggcc atccagtacc gcctgggcat ctggggattc 480

ttcagcacag gggacgaaca cagccggggc aactggggtc acttggacca ggtggccgca 540

ctgcactggg tccaggagaa catcgccaac tttggaggcg acccaggctc tgtgaccatc 600

tttggagagt cagcaggagg ggaaagtgtc tctgttctgg tgttgtctcc cttggccaag 660

aacctcttcc accgggccat ctctgagagt ggcgtggcct tcactgctgg cctggtcagg 720

aaggacatga aggctgcagc taagcaaatt gctgtccttg ctgggtgtaa aaccaccacc 780

tcggctgtct ttgttcactg cctgcgccag aagtcggagg acgagctctt ggacttaacg 840

ctgaagatga aatttttcgc tcttgatttg catggagacc ccagagagag ccatcccttc 900

ctgaccactg tggtggatgg agtgctgctg cccaagatgc ctgaagagat tctggctgaa 960

aaggatttca acactgtccc ctacatcgtg ggaatcaaca agcaagagtt tggctggctt 1020

ctgccaacga tgatgggctt ccccctctct gaaggcaagc tggaccagaa gacggccacg 1080

tcactcctgt ggaagtccta ccccatcgct aacatccctg aggaactgac tccagtggcc 1140

actgacaagt atttgggggg gacagacgac cccgtcaaaa agaaagacct gttcctggac 1200

ttgatggggg atgtggtgtt tggtgtccca tctgtgacgg tggcccgtca acacagagat 1260

gcaggagccc ccacctacat gtatgagttt cagtatcgcc caagcttctc atcggacaag 1320

aaacccaaga cggtgatcgg ggaccacggg gatgagatct tctccgtctt tggttttcca 1380

ctgttaaaag gcgatgcccc agaagaggag gtcagtctca gcaagacggt gatgaaattc 1440

tgggccaact ttgctcgcag tgggaacccc aatggggagg ggctgcccca ttggccgatg 1500

tacgaccagg aagaagggta ccttcagatc ggcgtcaaca cccaggcagc caagaggctg 1560

aaaggtgaag aagtggcctt ctggaacgat ctcctgtcca aggaggcagc aaagaagcca 1620

cccaagataa agcatgctga gctgtga 1647

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>3

cagaattcat ggctatcggg cagccagcct cgc 33

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>4

ccggaattca gcctcccctt cacagctcag 30

<210>5

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>5

tcttcgaaga attcacgatg agatttcctt caatttttac tgc 43

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>6

gaggctggct gcccagcttc agcctctctt ttctcg 36

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>7

agagaggctg aagctgggca gccagcctcg ccg 33

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>8

atggtaccga attctcacag ctcagcatgc tttatcttg 39

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>9

atggtaccga attctcactttatcttgggt ggcttctttg 40

Claims

1.具有酯酶活性并显示氨基酸序列SEQ.ID.No.1的多肽。

2.具有酯酶活性并显示氨基酸序列SEQ.ID.No.1的重组蛋白质。

3.多肽或重组蛋白质，其显示与SEQ.ID.No.1所示氨基酸序列至少80％的同一性，并具有对式(I)

的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯进行外消旋拆分的活性，其中R是C₁-C₆的烷基，R₁是C₁-C₄的烷基，且X是氯、溴或碘。

4.权利要求1-3中任一项所述的多肽或重组蛋白质，其具有酯酶活性，其显示通过常见修饰而被修饰的氨基酸序列，所述常见修饰选自突变、缺失、插入、延伸和/或融合。

5.核苷酸序列，其编码权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的重组蛋白质。

6.核苷酸序列，其具有SEQ ID No.2所示的序列。

7.核苷酸序列，其包含权利要求5或6所示的核苷酸序列。

8.权利要求1、2、3或4所述的多肽或重组蛋白质用于对式(I)

的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯进行外消旋拆分的用途，其中R是C₁-C₆的烷基，R₁是C₁-C₄的烷基，且X是氯、溴或碘。

9.用于制备富含对映异构体的式(II)

的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸或其酯的方法，其中R是C₁-C₆的烷基，A等于H、R₁或R₂，其中R₁可以是C₁-C₄的烷基，其中R₂是烷基但是不等于R₁，且X为氯、溴或碘，所述方法包括在存在水或其中R₂是不等于R₁的烷基的式R₂OH的醇作为亲核体时，通过权利要求1、2、3或4所述的多肽或重组酯酶来转化式(I)

的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的对映异构体混合物，其中R、R₁和X如上文定义，以及

a)分离剩余的下述富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯，所述式中A等于R₁，或

b)如果使用醇作为亲核体，分离得到的下述富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯，所述式中A等于R₂，或

c)如果使用水作为亲核体，分离得到的下述式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸，所述式中A等于H。