DE10251547A1

DE10251547A1 - Rekombinante (R)-Hydroxynitrillyase

Info

Publication number: DE10251547A1
Application number: DE10251547A
Authority: DE
Inventors: Hüseyin Dr. Aygün; Sylvia Dr. Wojczewski; Susann Dr. Rosmus
Original assignee: BioSpring GmbH
Current assignee: BioSpring GmbH
Priority date: 2002-11-05
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2022-11-06
Also published as: DE10251547B4; DE10251547C5

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die rekombinante Expression von (R)-Hydroxynitrillyase aus P. dulcis in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli. Es werden geeignete Polynucleotide bereitgestellt. Die Erfindung betrifft auch Polypeptide sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.

Description

Die Erfindung beschreibt die rekombinante Expression von Polypeptiden mit (R)-Hydroxynitrillyase-Aktivität in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli. Es werden geeignete Polynucleotide bereitgestellt. Die Erfindung betrifft auch Polypeptide mit (R)-Hydroxynitrillyase-Aktivität sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Oxynitrilasen, auch als Hydroxynitrillyasen bekannt, sind Enzyme, die die reversible Addition von HCN an Aldehyde bzw. Ketone katalysieren. Die sich aus einer solchen HCN-Addition ableitenden Produkte bezeichnet man auch als Cyanhydrine.
Chirale Cyanhydrine sind von großem Interesse für die Herstellung von optisch aktiven Aminoalkoholen, α-Hydroxycarbonsäuren, und Zwischenprodukten in der Pyrethroidsynthese (Effenberger, 1999).
Die Gewinnung optisch aktiver (R)-Cyanhydrine durch die enzymkatalysierte Addition von Blausäure wurde bereits von Eftenberger et al. beschrieben (Effenberger, 1987; Effenberger, 1990). Die Reaktionen finden in der Regel in einem Zwei-Phasen-System, bestehend aus Wasser und einer mit Wasser nicht-mischbaren, wässrig-gesättigten organischen Phase statt ( EP0276375 , EP0547655 ). Dabei kann das Enzym in löslicher bzw. immobilisierter Form ( EP0276375 ) oder als Gel-Einschlußverbindung ( DE10058342 ) zum Einsatz kommen. Bei der Cyanhydrierungsreaktion kommen im wesentlichen aufgearbeitete Enzymkonzentrate zum Einsatz. Eine weitere Möglichkeit besteht jedoch auch in der Verwendung getrockneter Zellen, die die Hydroxynitrillyasen zuvor überexprimiert haben ( EP1026256 ).
Neben dem direkten Einsatz von HCN als Cyaniddonor gibt es auch alternative Methoden für dessen Bereitstellung. Bei der Transhydrocyanierung wird durch Zusatz eines preiswerten, achiralen Cyanhydrins, z.B. Acetoncyanhydrin, HCN in situ generiert und steht somit der Reaktion unmittelbar zur Verfügung (Ognyanov, 1991).
Die Gewinnung von Hydroxynitrillyasen kann entweder aus natürlicher (Zandbergen, 1991) oder rekombinanter Quelle (Hevea barsiliensis: WO9830711, DE19529116 , Hasslacher, 1996 und 1997a,b; Manihot esculenta: EP0799894 , Förster, 1996, Hughes 1994 und Hughes, 1997; Linum usitatissimum: Trummler, 1998, Breithaupt, 1999) erfolgen. Für den industriellen Einsatz sind besonders rekombinante Expressionssysteme von Bedeutung. Solche Systeme eröffnen zusätzlich die Möglichkeit durch Optimierung Hydroxynitrillyasen gezielt an spezifische Substrate bzw. Reaktionsbedingungen anzupassen. So konnten bereits unterschiedliche Positionen im Bereich des aktiven Zentrums von (S)-Hydroxynitrillyasen aus Hevea brasiliensis bzw. Manihot esculenta substituiert werden, mit dem Resultat einer verbesserten Substratakzeptanz gegenüber sterisch anspruchsvollen Carbonylverbindungen (Wajant, 1996; EP0969095 ).
Heutzutage kennt man (R)- und (S)-spezifische Hydroxynitrillyasen, die sich in Größe, Struktur und anderen physikalischen Eigenschaften grundsätzlich voneinander unterscheiden (Griengl, 2000; Johnson, 2000). (S)- Hydroxynitrillyasen besitzen üblicherweise eine Größe zwischen 25 und 40 kD und haben eine typische Sekundärstruktur (α/β-Hydrolase-Faltung). Verschiedene Vertreter dieser Gruppe konnten bisher heterolog exprimiert werden (Johnson, 1999; Griengl, 2000; Johnson, 2000).
(R)-spezifische Hydroxynitrillyasen, wie sie sich z.B. in den Gattungen Prunus oder Arabidopsis finden, haben hingegen eine Größe von ca. 60 kD, besitzen FAD als Cofaktor und sind mehrfach glykosyliert (Schmidt, 1999; Griengl, 2000). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter (R)-Hydroxynitrillyasen Enzyme verstanden, die die (R)-spezifische Addition von Cyanwasserstoff an allgemein Carbonylverbindungen des Typs „Aldehyd" bzw. „Keton" oder carbonylverwandte Verbindungen (z.B. Sulfoxide) bzw. deren Umkehrreaktion katalysieren. (R)-Hydroxynitrillyasen mit dieser Aktivität finden sich z.B. in der Gattung Prunus, Linum oder Arabidopsis (Suelves, 1998). Die Hydroxynitrillyase aus Prunus dulcis (Mandel) gilt als die am besten untersuchte (R)-spezifische Hydroxynitrillyase (Schmidt, 1999). Das 536 Aminosäuren lange Enzym liegt als N-glycosiliertes Monomer in P. dulcis vor. Das FAD nimmt zwar bei der Katalysereaktion nicht direkt teil, ist jedoch eine notwendige Vorraussetzung für die Oxynitrilaseaktivität des Proteins (Dreveny, 2001). Als natürliches Substrat dient (R)-Mandelonitril.
Bisher wurde das glycosilierte Enzym aus der Mandel zwar kristallisiert (Dreveny, 2001), aber es bestehen noch immer Unklarheiten über den Reaktionsmechanismus (Dreveny, 2002). Eine heterologe Expression der (R)-Hydroxynitrillyasen der Gattungen Prunus oder Arabidopsis, im Speziellen aus P. dulcis, in Mikroorganismen war bisher nicht möglich gewesen. Stand der Technik für die Gewinnung von (R)-Oxynitrilase für die großtechnische Anwendung ist deshalb die Isolation dieses Enzyms aus entfettetem Mandelmehl. Obwohl das Enzym in ausreichenden Mengen isoliert werden kann, gibt es starke Chargenunterschiede in der Qualität des Enzyms, was auf die Vorbehandlung des Mandelmehls durch die verarbeitenden Mühlen zurückzuführen ist. Außerdem existieren in der Mandel verschiedene Isoformen der (R)-Hydroxynitrillyase, die möglicherweise Einfluß auf die Enantiomerenüberschüsse der Synthesereaktionen haben können.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Quelle für eine (R)-Hydroxynitrillyase bereitzustellen, die die genannten Nachteile nicht aufweist.
Den Erfindern ist es gelungen, erstmals ein Polypeptid, das von (R)-Hydroxynitrillyasen aus Prunus dulcis abgeleitet ist und (R)-Hydroxynitrillyase-Aktivität aufweist, heterolog zu exprimieren.
Gegenstand der Erfindung sind daher Polypeptide, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1 umfassen (siehe 2). Die Polypeptide können glycosiliert oder nicht glycosiliert sein. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Polypeptide in Bakterien exprimiert. Die Erfindung betrifft daher auch nicht-glycosilierte Polypeptide, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 umfassen. Die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 entspricht den Aminosäuren 28 bis 559 von (R)-Hydroxynitrillyase aus P. dulcis (Swissprot 024243) bzw. den Aminosäuren 3 bis 534 von SEQ ID NO:1.
Weiterhin betrifft die Erfindung nicht-glycosilierte Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die wenigstens 60 % Identität zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 aufweist, vorzugsweise wenigstens 80 % Identität, bevorzugter wenigstens 90 % Identität, noch bevorzugter wenigstens 95 % Identität, am bevorzugtesten wenigstens 98 % Identität. Alle Angaben von Sequenzidentitäten zwischen Aminosäuresequenzen in der vorliegenden Anmeldung beziehen sich auf folgende Bedingungen: Der Sequenzvergleich erfolgt mit dem Programm "Blast 2 Sequences version Blastp" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) mit folgenden Parametern: matrix: BLOSUM62; gap open: 11; gap extension: 1; x_dropoff: 50; expect: 10; word size: 3; filter: no. Die Länge des Bereichs, auf den sich der Sequenzvergleich erstreckt, beträgt mindestens 300, bevorzugt mindestens 400, bevorzugter mindestens 500, am bevorzugtesten mindestens 550 Aminosäuren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind nicht-glycosilierte Polypeptide, die ein Fragment der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2, das (R)-Hydroxynitrillyaseaktivität aufweist, umfassen. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Polypeptide eine (R)-Hydroxynitrillyaseaktivität von mindestens 100 U/mg Protein, bevorzugter mindestens 1000 U/mg Protein, am bevorzugtesten mindestens 3000 U/mg Protein. Die Aktivität der Polypeptide kann durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt werden; Aktivitätsangaben in der vorliegenden Anmeldung beziehen sich auf dieses Verfahren.
Es ist ebenfalls bevorzugt, daß die Polypeptide in im wesentlichen reiner Form vorliegen. Das bedeutet, daß die Polypeptide mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, am bevorzugtesten mindestens 97 % rein sind. Die Polypeptide können aber auch in lediglich angereicherter Form oder als Rohextrakt vorliegen.
Dem Fachmann ist bewußt, daß durch Aminosäure-Deletionen, -Mutationen und/oder -Additionen die Aktivität der Polypeptide nicht beeinträchtigt sein muß. Der Fachmann kann derartige Varianten exprimieren und ihre Aktivität überprüfen, solche Varianten sind von der Erfindung mit umfaßt. Vorzugsweise sind höchstens 50 Aminosäuren deletiert, ausgetauscht oder addiert, bevorzugter höchstens 25, noch bevorzugter höchstens 10, am bevorzugtesten höchstens 5.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfassen die Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die bei der rekombinanten Expression des Polypeptids zu einer Expression im Periplasma von Bakterien oder zu einem Ausschleusen des Polypeptids in das umgebende Kulturmedium führt. Beispiele für solche anfusionierten Sequenzen sind TAT-Signalsequenzen, Sec-Signalsequenzen (z.B. Omp) und ABC-Transporter Signalsequenzen. Diese Fusionsproteine können gegebenenfalls durch Spaltung wieder in die reife (R)-Hydroxynitrillyase überführt werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfassen die Polypeptide eine Teilsequenz des E. coli-Chaperones GroES. Die Teilsequenz ist vorzugsweise mit dem N-Terminus fusioniert. Sie hat eine Mindestlänge von 10 Aminosäuren, vorzugsweise 20 Aminosäuren, am bevorzugtesten 30 Aminosäuren.
Es werden auch Polynucleotide bereitgestellt, die zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide geeignet sind. Die Erfindung betrifft daher Polynucleotide, die für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1 (siehe 2) kodieren. In einer besonderen Ausführungsform umfassen die Polynucleotide die Nucleotidsequenz SEQ ID NO:3. Die Nucleotidsequenz SEQ ID NO:3 kodiert für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2.
Die Erfindung betrifft aber auch Polynucleotide, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die wenigstens 95 % Identität zu der Sequenz SEQ ID NO:3 aufweist, vorzugsweise wenigstens 97 %, am bevorzugtesten wenigstens 99 %. Alle Angaben von Sequenzidentitäten zwischen Nucleotidsequenzen der vorliegenden Anmeldung beziehen sich auf die folgenden Bedingungen: Der Sequenzvergleich erfolgt mit dem Programm "Blast 2 Sequences version Blastn" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) mit folgenden Parametern: reward for a match: 1; penalty for a mismatch: -2; open gap penalty: 5; extension gap penalty: 2; gap x_dropoff: 50; expect: 10; Word size: 1; filter: no. 3. Die Länge des Bereichs, auf den sich der Sequenzvergleich erstreckt, beträgt mindestens 900, bevorzugt mindestens 1200, bevorzugter mindestens 1500, am bevorzugtesten mindestens 1650 Nucleotide.
Die Erfindung betrifft auch Polynucleotide, die eine mutierte Nucleotidsequenz umfassen, die wenigstens 60% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO:3 aufweist, vorzugsweise wenigstens 70% Identität, bevorzugter wenigstens 80% Identität, bevorzugter wenigstens 90% Identität, am bevorzugtesten wenigstens 95% Identität. Eine Nucleotidsequenz ist "mutiert" im Sinne dieser Anmeldung, wenn sie künstlich hergestellt wurde und von natürlich vorkommenden Nucleotidsequenzen verschieden ist. Es ist bevorzugt, daß sich durch die Mutationen keine Änderungen der kodierten Aminosäuren ergeben. Bevorzugte Mutationen sind somit Variationen der "codon usage". Die Mutationen können ein oder mehrere Codons betreffen. Mögliche Variationen der "codon usage" können SEQ ID NO:3 entnommen werden (durch Vergleich mit der natürlichen Gensequenz). Von der Erfindung umfaßt sind auch Kombinationen der hier beschriebenen Ausführungsformen.
Vorzugsweise kodieren die erfindungsgemäßen Polynucleotide für Polypeptide, die (R)-Hydroxynitrillyase-Aktivität besitzen. Die bevorzugten Aktivitäten entsprechen den oben für die Polypeptide angegebenen Aktivitäten.
Von der Erfindung umfaßt sind auch Polynucleotide, die komplementär sind zu den oben genannten erfindungsgemäßen Polynucleotiden.
In einer besonderen Ausführungsform umfaßt das Polynucleotid die Nucleotidsequenz SEQ ID NO:4 (siehe 1).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Plasmid oder Vektor, der ein erfindungsgemäßes Polynucleotid enthält. Dabei kann es sich um Plasmide handeln, die lediglich der Vermehrung der DNA dienen oder um Expressionsplasmide. Dementsprechend kann das Plasmid weitere geeignete Sequenzen enthalten, die dem Fachmann an sich bekannt sind, beispielsweise Sequenzen für die Replikation des Plasmids, eine Promotorsequenz, Sequenzen, die die Transkription und/oder Translation des Genprodukts verbessern können sowie Terminationssignale. Als Promotor kann z. B. ein lac- oder ein ara-Promotor eingesetzt werden. Die Plasmide können beispielsweise von den Plasmiden pBR322, pBAD (Invitrogen) oder pET23a (Novagen) abgeleitet sein. In dem Plasmid können die erfindungsgemäßen Polynucleotide auch mit Nucleotidsequenzen verbunden sein, die für Fusionspartner eines Fusionsproteins kodieren. Solche Fusionspartner können die Aufreinigung durch affinitätschromatographische Methoden erleichtern, es kann sich aber auch um Sequenzen handeln, die zu einer Expression des Polypeptids im Periplasma von Bakterien oder zu einem Ausschleusen des Polypeptids in das umgebende Kulturmedium führen. Gegebenenfalls können derartige anfusionierte Aminosäuresequenzen wieder abgespalten werden, um das reife Enzym zu erhalten.
Weiter betrifft die Erfindung eine Zelle enthaltend einen erfindungsgemäßen Vektor oder ein erfindungsgemäßes Plasmid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynucleotid. Die kodierende Region oder das Genkonstrukt kann temporär oder stabil-genomisch verankert sein. Dem Fachmann ist bewußt, daß durch den Vorgang des Einbringens der Nucleinsäure in die Zellen die Nucleinsäure verändert werden kann, insbesondere durch Vorgänge innerhalb der Zelle. Zellen, die derart modifizierte Nucleinsäuren enthalten, sind auch Gegenstand der Erfindung.
Vorzugsweise handelt es sich um Zellen von Mikroorganismen, bevorzugter um prokaryontische Zellen, am bevorzugtesten handelt es sich um E. coli-Zellen. Beispiele für derartige Stämme sind die Bakterienstämme Top10, Ori, JM 109, BI21 oder LMG194, bevorzugt sind Protease-defizierte Stämme, z.B. CAG 629, CAG 626, CAG 748, ER 2508, KS 1000 und UT 5600. Die Erfindung umfaßt dabei Zellen in jeglicher Form, als Kultur, als Sediment, in getrockneter Form und/oder in gefrorener Form.
Durch Einsatz derartiger Zellen können die erfindungsgemäßen Polypeptide erfolgreich exprimiert werden. Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, das umfaßt, daß man die genannten Zellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert und gegebenenfalls anschließend das gewünschte Polypeptid gewinnt. Die Zellen können in verschiedenen handelsüblichen Medien kultiviert werden. Alle handelsüblichen Medien wie z.B. Terrific Broth (TB), Luria-Bertani (LB), SOB und M9-Minimalmedium können Verwendung finden. Je nach Beschaffenheit des Genkonstrukts kann dann während der Kultivierung der Zellen ein Induktionsmittel zu den Zellen gegeben werden. Das Induktionsmittel kann z. B. Isopropyl-Thiogalactosid (IPTG) oder L-Arabinose handeln. IPTG wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,001 bis 100 mM, bevorzugter von 0,01 bis 10 mM, am bevorzugtesten von 0,1 bis 2 mM eingesetzt. L-Arabinose kann in einem Konzentrationsbereich von 10^–8 bis 5 % (w/v), bevorzugt von 0,01 % bis 10 %, am bevorzugtesten von 0,1 % bis 1 % eingesetzt werden.
Temperatur, Induktionsdauer und -höhe werden nach gängigen Erfahrungen vorteilhaft aufeinander abgestimmt. Die Induktionsdauer beträgt üblicherweise 0,5 bis 120 Stunden, vorzugsweise ungefähr 2 bis 24 Stunden, am bevorzugtesten 2 bis 10 Stunden. Die Temperatur bei der Kultivierung beträgt zwischen 17 und 40 °C, bevorzugt zwischen 20 und 37°C. In einer Ausführungsform wird die Temperatur nach Zugabe des Induktors gesenkt. Das Verfahren kann aber auch ohne Zugabe eines Induktors durchgeführt werden (konstitutive Expression).
Während der Kultivierung der Zellen können Zusätze im Medium anwesend sein, z. B. Salze, FAD, Redoxsysteme und/oder Alkohole. Weiter kann die Kultivierung mit erhöhtem oder erniedrigtem Sauerstoffanteil in der Luft durchgeführt werden. Die Kultivierung kann auch unter verschiedenen Druckverhältnissen erfolgen. Die Drücke können zwischen 0,05 bar und 5 bar variieren.
Die Expressionsgeschwindigkeit ist stark abhängig von der Kultivierung der Bakterien, weshalb individuelle Anpassungen und verschiedene Medien Verwendung finden. Vorteilhafte Ausführungsformen hinsichtlich der Expressionsbedingungen sind auch in den Beispielen erläutert.
In einer besonderen Ausgestaltung des Verfahrens wird das Polypeptid gewonnen, nachdem anfusionierte Peptide abgespalten wurden. So kann beispielsweise die GroES-Sequenz mit einer Proteasespaltstelle verbunden werden, so daß das reife Protein die GroES-Sequenz nicht mehr aufweist. Andere faltungshelfende oder löslichkeitsvermittelnde Sequenzen (z.B. Maltose-Bindungsprotein oder Glutathiontransferase) können später wieder abgespalten werden, man kann ebenso Affinitätstags (z.B. His-tags) nach der Aufreinigung abspalten, man kann Exportsignalsequenzen abspalten.
Gegebenenfalls können nach der Expression die erfindungsgemäßen Polypeptide angereichert und/oder gereinigt werden. Dazu werden die Zellen geerntet und nach gängigen Methoden aufgeschlossen. Der Zellaufschluß kann beispielsweise durch Ultraschall, aber auch durch mechanische Einwirkung erfolgen. Besonders vorteilhaft ist eine Anreicherung der Polypeptide durch Gelfiltration. Dazu kann der native Extrakt auf entsprechende Gelfiltrations-Säulen aufgetragen werden. Weitere, dem Fachmann an sich bekannte Verfahren zur Reinigung von Proteinen können eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Cyanhydrinen, bei dem man eine Carbonylverbindung oder eine Carbonyl-verwandte Verbindung mit einem Cyanid-Donor und einem erfindungsgemäßen Polypeptid in Kontakt bringt. Carbonylverbindungen sind insbesondere Aldehyde und Ketone, Carbonyl-verwandte Verbindungen sind beispielsweise Sulfoxide. Als Cyanid-Donoren kommen verschiedene Verbindungen in Betracht. Am bevorzugtesten ist HCN, es können aber auch achirale Cyanhydrine, z.B. Aceton-Cyanhydrin eingesetzt werden (Ognyanov, 1991). Gegebenenfalls kann das hergestellte Cyanhydrin aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden. Verfahren zum Abtrennen sind dem Fachmann an sich bekannt. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann mit der Carbonylverbindung in Kontakt gebracht werden in Form eines gereinigten Polypeptids, es kann aber auch eine angereicherte Zusammensetzung, ein Rohextrakt oder sogar das Zellgemisch eingesetzt werden, das die Zellen enthält, in denen die erfindungsgemäßen Polypeptide exprimiert werden. Bei der zuletzt genannten Ausgestaltung muß keine spezifische Anreicherung oder Reinigung der Polypeptide erfolgen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die erfolgreiche Expression von (R)-Hydroxynitrillyase (E.C.4.1.2.10) aus P. dulcis in E. coli und damit die Möglichkeit, dieses technisch sehr bedeutende Enzym auch Optimierungen zugänglich zu machen. Gleichzeitig wird damit das Problem der wechselnden Qualität sowie der Bioverfügbarkeit aus Mandeln umgangen. Weiterhin ist die gentechnische Optimierung der Expressionshöhe und der Aufreinigung durch die vorliegende Erfindung erstmals ermöglicht.
Das hier beschriebene Verfahren und die nicht natürliche Gensequenz der neuen (R)-Hydroxynitrillyase ermöglichen zum ersten Mal die Expression dieses Enzyms in einem anderen Organismus als P. dulcis (heterologe Genexpression). Wesentlich zum Erfolg trägt dabei das zuvor durch Gensynthese künstlich hergestellte, optimierte (R)-Hydroxynitrillyase-Gen bei. Durch eine zusätzliche Verkürzung des natürlichen Gens wird das reife Protein der Mandel in den Bakterien überraschenderweise in einer löslichen und aktiven Form exprimiert. Die Erfindung umfaßt daher ein neu entworfenes, synthetisch hergestelltes (R)-Hydroxynitrillyasegen, welches exemplarisch mit verschiedenen N-Termini versehen und in verschiedene Vektoren integriert ist.
1 zeigt die Nucleotidsequenz eines an den Organismus E. coli angepassten und optimierten synthetischen Gens der (R)-Hydroxynitrillyase aus Prunus dulcis (SEQ ID NO:4; siehe Beispiel 1).
2 zeigt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1, die aus der Nucleotidsequenz von 1 abgeleitet ist.
3 zeigt eine schematische Darstellung der in den Beispielen 1 und 4 hergestellten Expressionskonstrukte.
4 zeigt die Ergebnisse der Aktivitätsbestimmung von Beispiel 3. Die Umsetzung von Mandelonitril wurde photometrisch verfolgt.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
Beispiel 1: Genaufbau der (R)-Oxynitrilase
Ein an den Organismus E. coli angepasstes und optimiertes synthetisches Gen der (R)-Hydroxynitrillyase aus Mandel (Prunus dulcis) mit der in 1 dargestellten Sequenz (SEQ ID NO:4) wurde hergestellt.
In 1 sind die Schnittstellen Xho I und Kpn I fett gedruckt dargestellt. Insgesamt wurden 9,1 % der Tripletts im Vergleich zum natürlichen Gen (Swissprot entry 024243) verändert, entfernt oder zugefügt, um eine optimale tRNA-Nutzung in E. coli zu gewährleisten bzw. eine Expression zu ermöglichen.
Der Aufbau des Gens erfolgte über eine klassische, in einzelnen Stufen ablaufende Schnittstellenklonierung mit hybridisierten Oligonukleotiden (80-100 mere), die teils schon außerhalb eines Plasmides durch 4-Basen-Überhänge hybridisiert und ligiert wurden. Unterstrichen sind die verwendeten Schnittstellen dargestellt (1).
Daraus abgeleitet ergibt sich die in 2 dargestellte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:1).
Der lac-Promotor des gängigen Plasmids pUC19 wurde mit den zwei folgenden Primern durch PCR (50°C Hybridisierung, 30 sec. Verlängerungszeit), amplifiziert:
Das Amplifikat wurde mit EcoR I und Hind III verdaut und in das ebenso geöffnete und dephosphorylierte Plasmid pBR322 ligiert. Der entstandene Vektor wurde mit Xho I und Kpn I verdaut und dephosphoryliert, so dass obige Sequenz der (R)-Hydroxynitrillyase, ebenso mit Xho I und Kpn I geschnitten, eingebracht werden konnte.
Beispiel 2: Expression der (R)-Hydroxynitrillyase (RO-lac)
Das Plasmid aus Beispiel 1 (RO-lac) wurde in den E. coli-Expressionsstamm Top10 (Invitrogen) transformiert.
Die neuen Stämme wurden unter verschiedenen Expressionsbedingungen analysiert.
Die Bakterien wurden z.B. in 3 l eines handelsüblichen Mediums (LB-Medium mit 200 μg/ml Carbenicillin) bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (ODsoo) von 0,8 hochgezogen. Anschließend wurden sie mit einer gängigen Konzentration (2 mM) an Isopropyl-Thiogalactosid (IPTG) für 14 Stunden induziert, oder ohne IPTG-Zusatz weiter kultiviert.
Nach der Produktionsphase wurden die Zellen sedimentiert (5.000 g, 15 min.), in 20 mM Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst (5 ml/l Kulturmedium) und durch eine Ultraschallbehandlung (30 min., 70%, auf Eis) aufgeschlossen. Anschließend wurde die Zelldebris sedimentiert (10.000 g, 45 min.) und in dem gewonnenen, nativ extrahierten Überstand die Aktivität der (R)-Hydroxynitrillyase bestimmt.
Der Aktivitätstest wurde in 80 mM Natrium-Citrat pH 4,8 durchgeführt. Als Substrat wurde 1 mM Mandelonitril eingesetzt. Zur Aktivitätsbestimmung wurden üblicherweise 5 μl des sogenannten nativ extrahierten Überstandes eingesetzt. Die Umsetzung des Mandelonitrils kann bei 250 nm photometrisch verfolgt werden. Aus der Anfangssteigung der Extinktionsänderung können mit dem Extinktionskoeffizienten (ε^{Benzaldehyd
250 nm}: 13.2 × 10³/mol × cm) die erhaltenen Enzymaktivitäten berechnet werden. 4 zeigt den Umsatz von Mandelonitril von der bakteriellen (R)-Hydroxynitrillyase (5 μl, ca. 10 μg Gesamtprotein = Probe 1 im Vergleich zur Spontanhydrolyse von Mandelonitril = Nullwert).
Besonders gute Expressionsraten des RO-lac Konstruktes können bei einer Induktionsdauer von 14 Stunden bei 37 °C mit einer IPTG-Konzentration von 2 mM in LB-Medium erreicht werden.
Unter diesen Bedingungen wurden in einem 3 l-Fermenter üblicherweise zwischen 7000 und 10.000 Units/l¹⁾ an (R)-Hydroxynitrillyase gewonnen. Im Folgenden sind tabellarisch verschiedene Fermentationen und Aktivitäten pro Liter Kulturmedium angegeben. Tabelle 1: Expression von (R)-Hydroxynitrillyase
Beispiel 3: Aufreinigung von (R)-Hydroxynitrillyase
Die (R)-Hydroxynitrillyase kann aus dem nativen Extrakt durch Gelfiltration angereichert werden.
Im Einzelnen wurden 5 ml des nativen Extraktes auf eine HiLoad 16/60 Superdex G200 prep grade Gelfiltrationssäule (Amersham Biosciences) aufgetragen. Die Proteine wurden mit PBS (50 mM NaHP₂O₄ pH 7,5, 110 mM NaCl, 2 mM KCl) eluiert und die deutlich gelben Fraktionen (je 5 ml) auf ihre Aktivität hin untersucht. Die rekombinante (R)-Hydroxynitrillyase wurde nach dem gleichen Retentionsvolumen wie die natürliche (R)-Hydroxynitrillyase aus Mandel eluiert.
Darüber hinaus zeigten beide Enzyme ((R)-Hydroxynitrillyase aus Mandel und aus E. coli) eine sehr hohe Stabilität gegenüber Harnstoffdenaturierung. Die bakterielle (R)-Hydroxynitrillyase wurde über Gelfiltration aufgereinigt, für 2 Stunden bei 23° C mit unterschiedlichen Konzentrationen an Harnstoff inkubiert. Anschließend wurde die Aktivität vermessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: Aktivität in Gegenwart von Harnstoff
Beispiel 4: Konstruktion von pBAD-LRO
Das optimierte und adaptierte Gen der (R)-Hydroxynitrillyase aus Beispiel 1 wurde in den handelsüblichen Vektor pBAD/HisA (Invitrogen) über die Xho I und Kpn I-Schnittstellen ligiert (pBAD-RO).
Das Plasmid wurde durch die Restriktionsenzyme Xho I und Nco I wieder geöffnet und anschließend dephosphoryliert. Ein doppelsträngiger Linker wurde eingesetzt, und das durch das Plasmid vorgegebene His-tag und der Rest der vorhandenen Sequenz zwischen den beiden Schnittstellen damit ersetzt (pBAD-LRO). Der hybridisierte Linker hat folgende Sequenz:
Fett gedruckt sind die Basen, die die Nco I und die Xho I-Schnittstellen darstellen. Der Linker kodiert eine Teilsequenz des E. coli Chaperones GroES. Der N-Terminus sollte die Löslichkeit des Proteins erhöhen und den Translationsbeginn vereinfachen.
Im Einzelnen wurden die zwei synthetischen Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 in Wasser in einer Konzentration von 100 μM gelöst. Anschließend wurden sie 1:10 in T4 Polynukleotidkinase-Puffer (50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, 25 μg/ml Rinderserumalbumin) verdünnt und mit 1 μl T4-Polynukleotidkinase (400.000 units/ml (New England Biolabs, NEB) für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden beide Oligonukleotide vereinigt, aufgekocht und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Der so hybridisierte Linker wurde mit dem geschnittenen und dephosphorylierten Plasmid mit T4-Ligase (NEB) unter Standardbedingungen (s. Hersteller-Anleitung) ligiert.
Beispiel 5: Expression der (R)-Hydroxynitrillyase (pBAD-LRO)
Der Vektor aus Beispiel 4 (pBAD-LRO) wurde in den Expressionsstamm Top 10 transformiert. Die Expression der (R)-Hydroxynitrillyase wurde wieder unter verschiedenen Bedingungen (sh. Beispiel 2) untersucht.
Der Vektor pBAD enthält einen Arabinosepromotor, weshalb in Beispiel 5 mit L-Arabinose induziert wird. Alle anderen Parameter können wie in Beispiel 2 gewählt werden. In der folgenden Tabelle sind einige Expressionsstudien mit den erzielten Enzymaktivitäten pro Liter Kulturmedium aufgeführt. Tabelle 3: Enzymaktivitäten
Wird die N-terminate Sequenz durch die in Beispiel 4 beschriebene ausgetauscht, so wird ein lösliches Protein mit der Aktivität der (R)-Hydroxynitrillyase exprimiert.
Literatur:

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Polypeptiden umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1; b) nicht-glycosilierten Polypeptiden umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2; c) nicht-glycosilierten Polypeptiden umfassend eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 60% Identität zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 aufweist; und d) nicht-glycosilierten Polypeptiden, die ein Fragment der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2, das (R)-Hydroxynitrillyase-Aktivität aufweist, umfassen.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine (R)-Hydroxynitrillyase-Aktivität von mindestens 10 U/mg Protein hat.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aminosäuresequenz umfasst, die bei der rekombinanten Expression des Polypeptids zu einer Expression im Periplasma von Bakterien oder zu einem Ausschleusen des Polypeptids in das umgebende Kulturmedium führt.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Teilsequenz des E. coli-Chaperones GroES umfasst.
Polynucleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Polynucleotiden umfassend die Nucleotidsequenz SEQ ID NO:3; b) Polynucleotiden, die für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1 kodieren; c) Polynucleotiden umfassend eine Nucleotidsequenz, die wenigstens 95% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO:3 aufweist; und d) Polynucleotiden umfassend eine mutierte Nucleotidsequenz, die wenigstens 60% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO:3 aufweist; oder ein dazu komplementäres Polynucleotid.
Polynucleotid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Polypeptid kodiert, das (R)-Hydroxynitrillyase-Aktivität hat.
Polynucleotid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nucleotidsequenz SEQ ID NO:4 umfaßt.
Plasmid oder Vektor enthaltend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
Zelle enthaltend ein Plasmid oder einen Vektor nach Anspruch 8 und/oder ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
Zelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine E. coli-Zelle ist.
Verfahren zur Herstellung eine Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das umfaßt, daß man Zellen nach Anspruch 9 oder 10 unter geeigneten Bedingungen kultiviert und gegebenenfalls anschließend das gewünschte Polypeptid gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß während der Kultivierung der Zellen ein Induktionsmittel zu den Zellen gegeben wird oder die Herstellung konstitutiv erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung des Polypeptids eine Gelfiltration durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung von Cyanhydrinen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Carbonylverbindung oder eine Carbonyl-verwandte Verbindung mit einem Cyanid-Donor und einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kontakt bringt.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Cyaniddonor HCN oder Acetoncyanhydrin ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man das hergestellte Cyanhydrin abtrennt.