WO2006016596A1 - リグノセルロース材料からの繊維成分の製造およびその利用 - Google Patents

リグノセルロース材料からの繊維成分の製造およびその利用 Download PDF

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WO2006016596A1
WO2006016596A1 PCT/JP2005/014624 JP2005014624W WO2006016596A1 WO 2006016596 A1 WO2006016596 A1 WO 2006016596A1 JP 2005014624 W JP2005014624 W JP 2005014624W WO 2006016596 A1 WO2006016596 A1 WO 2006016596A1
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WO
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hemicellulose
gene
enzyme
lignin
degrading
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PCT/JP2005/014624
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hisako Sakaguchi
Seiji Nakagame
Akira Tsukamoto
Mari Kabuto
Jun Sugiura
Original Assignee
Oji Paper Co., Ltd.
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Publication date
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    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a useful substance by extracting a fiber component from a lignocellulosic material. More specifically, the present invention relates to a method in which a microorganism having lignocellulose decomposability and cellulose degradability and / or suppressed hemicellulose degradability is brought into contact with a lignocellulosic material and then subjected to a fiberizing step. It relates to the above method, which involves taking out the ingredients. Therefore, the method of the present invention contributes to resource saving or energy saving. In particular, the method of the present invention is effective for the production of paper pulp from paper pulp raw materials and the production of sugars from lignocellulosic materials such as bagasse. Provide resource- or energy-saving manufacturing methods.
  • Lignocellulose material strength In the process of extracting fiber components, the structure of lignin and hemicellulose involved in bonding between fibers is destroyed by mechanical force, or lignin and hemicellulose are selectively chemically dissolved. The fiber component is taken out by decomposing.
  • lignocellulosic material is used as so-called biomass as a substrate for fermentation production of chemical raw materials and energy raw materials
  • lignin is decomposed without decomposing fiber components in order to produce saccharides as fermentation substrates.
  • Development of a pretreatment method to be removed is required
  • Pulp produced in the paper pulp industry is classified into mechanical pulp and chemical pulp depending on the production method.
  • Mechanical pulp uses mechanical energy to physically convert wood fibers Manufactured by grinding. Because it contains almost all of the wood components, it can be produced in high yields and can be made into thin, highly opaque paper. However, it has the disadvantage of requiring large electric power for grinding.
  • Nishibe et al. Used 10 types of white-rot fungi preliminarily selected from 85 and 85 strains to microbially decompose Sorghum wood pieces and coniferous secondary disaggregation TMP, and selectively delignify them.
  • N. elegans Coprinus cinereus
  • Phanerocaete chrysosporium which have less disrupted norep fibers, and showed that the decrease in paper strength was suppressed in the presence of gno-lecose and urea.
  • the decrease in pulp yield was 6.3% and 9.7% for 14 days and 30 ° C treatment, respectively.
  • the yield reduction was 7.5% when using allergic power oyster mushrooms (Non-patent Document 4).
  • a mutant with enhanced selectivity for lignin degradation has been produced by Ander et al. They mutated Sporotrichum pulverulentum by UV irradiation and developed a mutant strain Cel44 with weak cellulase activity. Decomposition of birch timber using a wild strain and this cellulase-suppressing strain Cel44, the former decomposes lignin and xylan well, while the latter decomposes lignin and xylan well, but glucan It hardly decomposed (Non-patent Document 7).
  • Non-patent Document 8 After the birch material was treated with this Cel44 for 6 weeks and mechanical pulp was produced, an increase in paper strength was observed (Non-patent Document 8). Also using birch and pine By conducting experiments and increasing the treatment time, it has been reported that fiber fibrillation and refining energy has decreased by 30% (Non-patent Document 9).
  • chemical pulp is a production method for extracting cellulose and hemicellulose by eluting lignin in wood using chemicals.
  • kraft pulp that delignifies using sodium hydroxide and sodium sulfide is the mainstream.
  • microbial treatment is performed in the same way as mechanical pulp, and delignification is performed before cooking to reduce production energy and improve pulp quality.
  • Non-patent Document 11 There is a report that when the treatment is performed for one day, the yield at the same Ka value is improved, the beating energy is reduced, and the tensile strength and burst strength are increased (Non-patent Document 11). In experiments using the same Phanerocaete chrysosporium, an increase in burst strength and tear strength has been reported (Non-patent Document 12). Molina et al. Report that 11-14% of the production energy can be reduced when Radia tapain is treated with power oyster mushrooms and oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus). However, in the case of force bracken, a decrease in pulp strength was observed (Non-Patent Document 13 and Non-Patent Document 14).
  • microbial treatment in kraft pulp improves digestibility and reduces energy, but may reduce yield and paper strength, and put microbial treatment to practical use in the same way as mechanical pulp. Therefore, the ability to decompose lignin is excellent. The ability to decompose cellulose is suppressed, and it is necessary to acquire and produce microorganisms with enhanced lignin degradation selectivity.
  • Enzymes that degrade cellulose are a collective term for several enzymes that hydrolyze the 1,4,1-glucan (cellulose) or its 1,4 and 1 dalcobilanosyl bonds, and endoglucanase (cellulase).
  • Abbreviation EG cellobiohydrolase
  • CBH cellobiohydrolase
  • EG breaks the cellulose chain by breaking the cellulose chain —1, 4 – darcoviranosyl bond into an endo-type, and then breaks the cellulose chain. It is known to decompose even the high part.
  • CBH I cuts cellobiose residues from the reducing end of the cell mouth chain
  • CBH II cuts from the non-reducing end.
  • Cellobiose dehydrogenase that oxidizes the resulting cellobiose and ⁇ -gnorecosidase that hydrolyzes the ⁇ bond from the end of cello-oligosaccharide are known. These hydrolases act synergistically to reduce the molecular weight of the cellulose substrate to produce cellobiose, and further, due to the involvement of gnorecosidase, it is degraded to glucose units.
  • Cellobiose dehydrogenase is an oxidoreductase that oxidizes cellobiose and cellooligosaccharide to produce cellopionolatone, and simultaneously reduces metal complexes such as quinone and iron, phenoxy radical, and oxygen.
  • This enzyme is produced at the same time as cellulase when microorganisms degrade cellulose (Non-patent document 18), and cellulase activity inhibition by cellobiose, that is, canceling product inhibition (Non-patent document 19). It is thought that cellulose degradation is promoted by conjugation with cellulase.
  • cellobiose dehydrogenase is considered to be deeply involved in cellulose degradation because it causes a Fenton reaction that generates hydrated xy radicals that strongly degrade cellulose.
  • Cellobiose dehydrogenase-deficient strains grow as wild strains when amorphous cellulose is used as the carbon source. Although the rate does not change, the growth rate is significantly slow when cultured on crystalline cellulose, and even in cellobiose dehydrogenase-deficient strains, it is lignin and synthetic lignin of undeciduous hardwood pulp.
  • Microorganisms that produce cellobiose dehydrogenase include Phanerocaete 'Chrysos polyum, power moth bamboo, Schizophyllum commune and other wood-rotting fungi, Coneophora cerena, Fungi such as Humicola insolens are known
  • cellobiose dehydrogenase gene for example, in the case of Fanerocaete thalisosporium, cDNA of K3 strain (Non-patent Document 21), in OGC101 strain, cDNA (non-patented) Reference 22) and chromosome genes (Non-patent reference 23) have been cloned. Cellobiose dehydrogenase inheritance is also found in power oyster mushrooms (Non-patent Document 24) and stamens (Non-patent Document 25). Child has been reported.
  • hemicellulose which is a main component of plant fibers, is also degraded by microorganisms, resulting in a decrease in the yield of fiber components.
  • Hemicellulose is known to contain xylan, mannan, galactan, pectin, and the like, and endo 1,4- / 3 xylanase, endo 1,4- / 3 mannanase, pectinase Etc. are known.
  • Mushrooms are also known to produce such enzymes. Was done. Two of them were glycoside hydrolase family 10 and the other one was classified as family 11 (Non-patent document 26). Oyster mushrooms have also been reported to produce xylanase, mannanase and cellulase ( Non-patent document 27).
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 describe enzyme gene elucidation, gene recombination technology using the gene, and effective pulp processing methods using transformants obtained by such technology. Are listed.
  • lignocellulosic materials are composed of cellulose, hemicellulose, and lignin, and lignocellulose materials with higher lignin content are more difficult to hydrolyze cellulose with cellulase.
  • Lignin is present in a form that wraps cellulose fibers together with hemicellulose. Enzyme sugary hinders the contact of the enzyme with cellulose, so the saccharification rate of lignocellulose material with high lignin content is low. .
  • Non-patent Document 29 In order to improve such problems, physical pretreatment to lower the molecular weight of lignin by steaming / explosion method, etc., chemical pretreatment to extract lignin from cellulosic biomass with solvent or alkali (non-patent document 28), lignin is separated using lignin-degrading bacteria Biological pretreatment to be understood has been studied (Non-patent Document 29).
  • Biological pretreatment can be performed under relatively mild conditions, and has less environmental impact than physical pretreatment or chemical pretreatment.
  • Patent Document 3 describes that cellobiose is efficiently produced by hydrolyzing lignocellulose in the presence of cellulase and lignin-degrading bacteria or lignin-degrading enzymes.
  • Patent Document 4 describes the ability to decompose lignin using microorganisms that have high lignin degrading activity and do not cause reverse polymerization of lignin degradation products. This bacterium also has lignocellulose components such as cellulose together with lignin. There is a drawback of consuming it.
  • Non-patent Document 30 proposed three types of cellulolytic enzymes in order to clarify the expression mechanism of cellulolytic enzymes at the transcriptional level of genes in the filamentous fungus Trichoderma resesei.
  • An experiment was conducted to suppress the expression of cbhll, egll, egl2 genes by antisense method.
  • the expression levels of these enzyme genes have not been confirmed, and it has not been shown whether or not multiple cellulolytic enzyme activities could actually be simultaneously suppressed. There was no suggestion that such an antisense method could be used to suppress the degradation of lignocellulose materials.
  • Patent Document 1 International Publication WO03 / 070939
  • Patent Document 2 International Publication WO03 / 070940
  • Patent Document 3 JP-A-8-89274
  • Patent Document 4 JP-A-5-292980
  • Non-Patent Literature l Bar- Lev and K.T. Kirk, Tappi J., 65, 111, 1982
  • Non-Patent Document 2 Myers., Tappi J., 105, 1988
  • Non-Patent Document 3 Akamatsu et al., Mokuzai Gakkaishi, 30 (8), 697-702, 1984
  • Non-Patent Document 4 Nishibe et al., Japan Tappi, 42 (2), 1988
  • Non-Patent Document 5 Kashino et al., Tappi J., 76 (12), 167, 1993
  • Non-Patent Document 6 Scott et al., Tappi J., 81 (12), 153, 1998
  • Non-Patent Document 7 Ander and Eriksson, Svensk Papperstid., 18, 643, 1975
  • Non-Patent Document 8 Ander and Eriksson, Svensk Papperstid., 18, 641, 1975
  • Non-Patent Document 9 1 * 33011 and & 11 & 11 (161 ⁇ , Svensk Papperstid, 85, R33, 1982
  • Non-Patent Document 10 Samuelsson et al., Svensk Papperstid., 8, 221, 1980
  • Non-Patent Document ll Oriaran et al., Tappi J., 73, 147, 1990
  • Non-Patent Document 12 Chen et al., Wood Fiber Sci "27, 198, 1995
  • Non-patent document 13 Molina, 50th Appita Annual General Conference, pp.57-63, 1996
  • Non-patent document 14 Molina, 51th Appita Annual General Conference, pp.199-2061997
  • Non-patent document 15 P. Bajpai et al., J. Pulp and Paper Science: 27 (7), 235-239, 2001
  • Non-patent document 16 Henrissat, Tsuji, Bairoch, A., Biochem. J., 293, 781, 1993
  • Non-Patent Document 17 Henrissat, Tsuji, Cellulose. Commun., 5, 84-90, 1998
  • Non-Patent Document 18 Eriksson et al., FEBS Lett., 49, 282-285, 1974
  • Non-Patent Document 19 Igarashi et al., Eur. J. Biochem., 253, 101, 1998
  • Non-Patent Document 20 Dumonceaux, Enzyme Microb., 29, 478-489, 2001
  • Non-Patent Document 21 G. Henriksson et al., J. Biotechnol "78, 93-113, 2000
  • Non-Patent Document 21 Raices et al., FEBS Letters, 69, 233-238, 1995
  • Non-Patent Document 22 Li et al., Appl. Environ. Microbiol., 62 (4), 1329-1335, 1996
  • Non-Patent Document 23 Li et al., Appl. Environ. Microbiol., 63 (2), 796-799, 1997
  • Non-Patent Document 24 T.J. Dumonceaux et al., Gene, 210, 211-219, 1998
  • Non-Patent Document 25 S.M. Moukha et al., Gene, 234, 23-33, 1999
  • Non-Patent Document 26 B. Decelle et al., Curr Genet., 46, 166-75, 2004
  • Non-Patent Document 27 P. Baldrian et al., Res Microbiol., 156 (5-6), 670-676, 2005
  • Non-Patent Literature 28 J.D.McMillan, Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Producti on, 292-324, 1994
  • Non-Patent Document 29 Y. Sun, J. Cheng, Bioresour. Technol., 83, 1-11, 2002
  • Non-Patent Document 30 Carle-Urioste et al., J. Biol. Chem., 272 (15), 10169-10174, 1997 Disclosure of the Invention Problems to be solved by the invention
  • Lignocellulosic material strength In the method of obtaining fiber components, particularly in the production of paper pulp, prior to the production of mechanical pulp or chemical pulp for the purpose of resource saving and energy saving, lignocellulosic material is made of microorganisms. During processing, cellulose and hemicellulose, which are the main components of paper, are decomposed by cellulose-degrading enzymes and hemicellulose-degrading enzymes produced by microorganisms. As a result, the yield of fiber components, especially pulp, and paper strength are reduced. There is a problem that it is necessary to suppress this because it will decrease.
  • the object of the present invention is to provide a microorganism capable of simultaneously depressing the expression of a plurality of cellulose-degrading enzyme genes and / or hemicellulose-degrading enzyme genes and degrading lignin. It is to provide a method for producing a useful substance from the fiber component of a lignocellulosic material, comprising using the lignocellulosic material to treat.
  • the present invention comprises the following.
  • the above-mentioned method comprising contacting a microorganism having suppressed expression and lignin degradability with the lignocellulosic material, and obtaining the material strength fiber component.
  • the microorganism is one in which expression of at least four different enzyme genes among a plurality of cellulolytic enzyme genes and / or a plurality of hemicellulose-degrading enzyme genes is suppressed. ) Method.
  • the microorganism is one in which expression of at least six different enzyme genes among a plurality of cellulolytic enzyme genes and / or a plurality of hemicellulose-degrading enzyme genes is suppressed. ) Method.
  • the microorganism comprises an antisense DNA fragment complementary to all or a part of each of a plurality of cellulolytic enzyme genes and / or a plurality of hemicellulose-degrading enzyme gene transcripts;
  • the method according to (1) comprising a synthetic DNA fragment obtained by ligating each of the variants having 90% or more homology with the nucleotide sequence of the sense DNA fragment in any order.
  • the plurality of cellulolytic enzyme genes are genes encoding endodarcanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, and cellobiose dehydrogenase, and an enzyme selected from these isozymes.
  • the plurality The method according to (1), wherein the hemicellulose-degrading enzyme gene is a gene encoding an enzyme selected from xylanase and mannanase and lysozyme thereof.
  • the plurality of cellulolytic enzyme genes code for an enzyme consisting of endodalcanase 61, endoglecanase 5, endognolecanase 12, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, and cellobiose dehydrogenase. And the gene encoding the plurality of hemicellulose-degrading enzyme gene forces xylanase I, xylanase II, mannanase I, and mannanase II. .
  • a converted microorganism is produced, and the microorganisms that have suppressed cellulose degradability and / or hemicellulose degradability are brought into contact with a lignocellulosic material to decompose lignin in the material, and a fiber component is obtained from the lignin decomposed material.
  • the method according to (1) comprising:
  • the cellulolytic enzyme gene is at least six types, and / or The method according to (1) or (16), wherein there are at least four hemicellulose-degrading enzymes.
  • lignocellulosic material refers to a plant material containing a large amount of lignocellulose composed of the structural polysaccharide cellulose and hemicellulose and the polymer lignin of an aromatic compound, such as wood, It refers to materials such as gas, grass (for example, orchard grass and timosi). Bagasse here refers to sugarcane after squeezing sugar juice
  • fiber component means a fibrous component obtained by chemically removing or mechanically cutting lignin from lignocellulose, specifically, cellulose or pulp fiber. This fibrous component is mainly composed of cellulose and hemicellulose.
  • pulp refers to an aggregate of cellulose fibers extracted from wood or other plants by mechanical or chemical treatment, depending on the production method into mechanical pulp and chemical pulp, and depending on the application, paper pulp. And dissolved pulp.
  • cellulolytic enzyme refers to an enzyme that degrades cellulose.
  • hemicellulose-degrading enzyme means an enzyme that degrades components constituting hemicellulose, and includes xylanase, mannanase and the like.
  • lignin-degrading microorganism refers to a microorganism that contains a lignin-degrading enzyme.
  • a gene encoding an endogenous or exogenous lignin-degrading enzyme can be expressed on the genome of the microorganism or on a vector such as an autonomously replicable plasmid contained in the cell.
  • Microorganisms include bacteria, fungi, basidiomycetes and yeasts.
  • white fungi, a kind of basidiomycete are known to contain lignin peroxidase, a lignin degrading enzyme, and are one of the preferred microorganisms.
  • cellulolytic enzyme expression is suppressed means that the cellulolytic enzyme gene expression is suppressed, so that the translation of the enzyme gene is inhibited, resulting in the production of cellulolytic enzyme. This means a state that does not occur or is difficult to occur.
  • the term "expression of hemicellulose-degrading enzyme is suppressed" is the same meaning as the cellulose-degrading enzyme for the hemicellulose-degrading enzyme gene and does not cause production of hemicellulose-degrading enzyme. , Or difficult to happen, means state.
  • transcript refers to the mRNA or pre-mRNA encoding the cellulolytic enzyme gene.
  • pre-mRNA refers to a pre-spliced mRNA precursor.
  • antisense DNA is a DNA comprising a sequence that is substantially complementary to all or a part of mRNA that is a transcript of a cellulolytic enzyme gene, the antisense DNA Means DNA that binds to the mRNA of the cellulolytic enzyme gene that is complementary to the antisense RNA that is the transcription product of the cell, thereby suppressing the expression of the cellulolytic enzyme gene and inhibiting translation. To do.
  • expression control sequence refers to a sequence that controls the expression of a gene.
  • the expression control sequence includes, for example, a promoter, an enhancer sequence, and the like, and is preferably a promoter sequence.
  • the present invention provides a method for producing a useful substance by extracting a fiber component from a lignocellulosic material, wherein the expression of a plurality of cellulose-degrading enzymes and / or hemicellulose-degrading enzymes is suppressed and has a lignin-degrading ability.
  • a method comprising contacting a microorganism with the lignocellulosic material and obtaining the material force fiber component.
  • a feature of the present invention is that the lignocellulosic material strength is pretreated by a microorganism having a suppressed lignin-degrading ability and / or expression of a plurality of cellulose-degrading enzymes and / or hemicellulose-degrading enzymes. It is in. This inhibits or inhibits enzymatic degradation of cellulose and / or hemicellulose while enzymatically degrading lignin. As a result, the advantage that the yield of cellulose and / or hemicellulose is further improved is achieved.
  • the microorganism used in the present invention contains an enzyme capable of degrading lignin in an expressible manner.
  • lignin degrading enzymes are manganese peroxidase, lignin peroxidase, laccase or phenoloxidase (European Patent Application Publication No. 1029922, PCT / J P03 / 02057) o
  • lignin degrading enzymes are manganese peroxidase, lignin peroxidase, laccase or phenoloxidase (European Patent Application Publication No. 1029922, PCT / J P03 / 02057) o
  • the natural gene inherent in the microorganism may be used, or it may be an exogenous gene introduced into the cell so that it can be expressed by a gene recombination technique because the microorganism does not exist.
  • Microorganisms containing a natural gene include white rot fungi such as Basidiomycetes, for example, wood rot fungi.
  • white rot fungi such as Basidiomycetes, for example, wood rot fungi.
  • the white-rot fungi the genus Coriolus, for example Coriolus hirsutus, has inherently lignin peroxidase.
  • microorganisms that produce manganese peroxidase include bacteria belonging to Phanerochaete, one of the basidiomycetes, such as Phanerochaete sordida, such as the YK-624 strain (ATCC 90872). Included (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-069881).
  • the culture of white rot fungi is preferably carried out by shaking culture under aerobic conditions.
  • the pH of the culture solution is 3-8, more preferably 4-6.
  • the culture temperature is 10 to 45 ° C, preferably 25 to 35 ° C.
  • the culture time is usually:! -10 days, preferably 7-10 days.
  • the medium can be a medium used for ordinary fungi, but it can be MnSO, MnCl.
  • a carbon source or a nitrogen source is added to the medium as necessary.
  • the carbon source include glucose, fructose, maltose, saccharose and the like.
  • nitrogen sources include meat extract, peptone, dartene meal, soybean flour, dry yeast, yeast extract, ammonium sulfate, ammonium tartrate, urea, L-asparagine and the like.
  • organic salts such as sodium, magnesium, iron, calcium, and phosphate, and vitamins such as inositol, vitamin B hydrochloride, and biotin.
  • An exogenous lignin-degrading enzyme gene is introduced so that it can be expressed in microorganisms that do not naturally possess the lignin-degrading enzyme gene or that possess this gene but have a weak activity of the enzyme. By doing so, it can be converted into a microorganism capable of degrading lignin.
  • microorganisms include, but are not limited to, basidiomycetes, fungi, fungi including yeasts, bacteria and the like.
  • Preferred microorganisms are basidiomycetes and fungi, in particular basidiomycetes, preferably white rot fungi.
  • lignin-degrading enzymes such as manganese peroxidase, lignin peroxidase, laccase or phenoloxidase from literature and data banks such as GenBank, and about 15-30 based on that sequence
  • a primer with a base length is prepared, and the genomic DNA of the microorganism containing the gene is trapezoidally shaped
  • the target enzyme gene can be amplified by performing polymerase chain reaction (PCR).
  • the lignin-degrading enzyme gene obtained from a microbial cell by a well-known method is encoded from mRNA, or a cDNA library prepared by a commercially available or well-known method, or the enzyme is encoded by a well-known cDNA cloning method.
  • cDNA can be prepared.
  • a DNA fragment in which the obtained genomic DNA or cDNA is operably linked to a suitable expression control sequence such as a promoter or enhancer is prepared, and inserted in an appropriate direction between appropriate restriction sites of the vector.
  • the vector may further contain a selection marker, a replication origin, a terminator, a ribosome binding site, a poly A signal, etc., if necessary, a polylinker.
  • Microorganism host cells can be transformed with the obtained expression vector to produce a microorganism containing a lignin-degrading enzyme gene.
  • Transformation may be performed by appropriately selecting from general methods such as calcium chloride / PEG method, calcium phosphate method, lithium acetate method, electroporation method, protoplast method, spheroplast method, and lipofuxion method. it can.
  • the formation of protoplasts from microbial cells can be performed by a conventional method in which a cell wall degrading enzyme such as lysozyme is brought into contact with the microorganism.
  • heterologous promoter regions such as cellobiohydrolase or II gene promoter region can be introduced into white rot fungi by genetic recombination (Europe). Patent Application Publication No. 1029922, PCT / JP03 / 02057).
  • the microorganism used in the present invention contains lignin-degrading enzyme but does not contain cellulose-degrading enzyme and / or hemicellulose-degrading enzyme, or has extremely high cellulose-degrading enzyme activity and / or hemicellulose-degrading enzyme activity.
  • Microorganisms that are highly suppressed are preferred.
  • lignocellulosic materials such as wood, bamboo, cotton, linter, corn cobs, bagasse, beer lees, straws, rice husks and other agricultural waste, or old newspapers, magazines, cardboard, office waste paper.
  • the use of microorganisms that have a harmful effect on the environment is restricted when waste pulp, etc. discharged from pulp and paper manufacturers are treated with microorganisms.
  • microorganisms that can be used for lignin degradation of lignocellulose materials
  • Microorganisms whose safety is ensured by exogenously introducing lignin-degrading activity and microorganisms whose safety is inherently possessing lignin-degrading activity by the above methods are candidates for microorganisms that can be used in the present invention. is there.
  • basidiomycetes especially white rot fungi are preferable.
  • basidiomycetes generally contain more than one cellulolytic enzyme activity and / or more than one hemicellulose-degrading enzyme activity, causing degradation of cellulose and / or hemicellulose when processing lignocellulosic materials.
  • the object of the present invention can be achieved if a microorganism capable of enhancing the decomposition power of lignin and extremely suppressing the decomposition of cellulose and / or hemicellulose can be produced.
  • the microorganism that can be used in the present invention is a microorganism having a lignin-degrading enzyme gene so that expression of a plurality of endogenous cellulose-degrading enzymes and / or a plurality of hemicellulose-degrading enzymes is suppressed. Operated.
  • a method for suppressing such expression in the present invention, a method using an antisense RNA complementary to a transcription product of an endogenous cellulolytic enzyme gene and / or a hemicellulolytic enzyme gene is used.
  • Cellulolytic enzyme genes include, but are not limited to, endodalcanase (hereinafter also referred to as EG), cellohydrolase 1 (hereinafter also referred to as CBH I), cellobiohydrolase II (hereinafter referred to as CBH). And II), cellobiose dehydrogenase, and genes encoding enzymes consisting of these isozymes.
  • EG endodalcanase
  • CBH I cellohydrolase 1
  • CBH cellobiohydrolase II
  • gene encoding enzymes consisting of these isozymes refers to a group of enzymes having different primary structures but similar catalytic action.
  • isozymes examples include endoglucanase 61, endoglucanase 5, endoglucanase 12, endoglucanase 17, endoglucanase 45, endoglucanase 9, cellobiohydrolase I (M. Sandgren et al., J. Mol. Biol. 308: 295-310, 2001); AV Wymelenberg et al., Appl. Environ. Microbiol. 68: 5765-5768, 2002).
  • the hemicellulose-degrading enzyme genes include, but are not limited to, genes encoding xylanase, mannanase and their isozymes. Isozy Examples of thymes include xylanase family 10, family 11 and the like. More specifically, hemicellulose-degrading enzyme genes include, for example, genes encoding enzymes consisting of xylanase I, xylanase II, mannanase I, and mannanase II.
  • the sequence of the cellulose or hemicellulose-degrading enzyme gene can be obtained from literatures or data banks such as GenBank.
  • GenBank the endoglucanase 61 gene has accession number AY094489
  • the endoglucanase 5 gene has accession number AB125597
  • the endoglucanase 12 gene has accession number AAD02275
  • the cellobiose dehydrogenase gene has accession number AAC50004
  • the cellohydrohydrolase I-27 gene can use the sequence information registered as accession number BAD16575
  • the cellobiohydrolase II gene can use the accession number AAB32942.
  • the target DNA in the genomic library or cDNA library prepared from the microorganism cell by a known method is used.
  • forward and reverse primers were constructed based on the known sequences of six enzyme genes, endodalcanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, cellobiose dehydrogenase, xylanase and mannanase.
  • PCR was performed, and the gene sequence was amplified and the enzyme gene sequence was determined using a known sequencing method such as the Sanger method (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977)). Can be determined.
  • antisense RNA in order to simultaneously suppress the expression of all or part of a plurality of endogenous cellulose and / or a plurality of hemicellulose-degrading enzyme genes, A synthetic DNA fragment in which each antisense DNA fragment complementary to all or a part thereof is ligated in an arbitrary order, and introduced into a microbial host cell.
  • antisense RNA which is a transcription product of the introduced synthetic DNA fragment, is present in a microbial cell, it binds to the complementary cellulose-degrading enzyme gene or mRNA of the hemicellulose-degrading enzyme gene, thereby degrading cellulose.
  • linker sequence between the antisense DNA fragments to be ligated.
  • the length of the linker sequence is preferably about 20 bases or less, more preferably about 10 bases or less, and may exceed 20 bases.
  • the linker sequence is a sequence for linking antisense DNA fragments to each other and can be arbitrarily selected as long as it does not affect the inhibition of transcription of the cellulolytic enzyme gene or the hemicellulose degrading enzyme gene.
  • An example of a linker sequence is a restriction enzyme recognition sequence.
  • restriction enzyme recognition sequence is a sequence that is convenient for the cleavage and ligation of antisense DNA fragments, and can be any sequence that recognizes any restriction enzyme.
  • Restriction enzyme recognition sequences include, for example, sequences of palindrome and non-palindromes that are recognized by enzymes such as BamH I, EcoR I, Bgl II, Hae III, Hind III, Hpa I, and Pst I. Can take.
  • the cellulose-degrading enzyme gene is not particularly limited as long as it is an enzyme gene capable of degrading cellulose, but it suppresses cell-mouth decomposition ability possessed by microorganisms that preliminarily process lignocell-mouth materials. As long as it has the arrangement
  • cellobiose dehydrogenase gene, CBHI gene, CBHII gene and EG gene are preferable.
  • the hemicellulose-degrading enzyme gene is not particularly limited as long as it is an enzyme gene capable of degrading hemicellulose, but has a sequence that suppresses the hemicellulose-degrading ability of microorganisms that pretreat lignocellulose materials. Any one can be used. For example
  • genes are combined in two or more, preferably three or more, more preferably four or more, and particularly preferably six or more including the genes encoding isozymes in addition to the above four. As a result, a strain with enhanced inhibition of cellulose and / or hemicellulose degradability can be obtained.
  • antisense DNA binds to the mRNA to form a double strand, which inhibits the translation of the mRNA into a protein
  • one or more, preferably one, in the antisense DNA sequence may be included, or antisense DNA is preferably about 90% or more compared to the antisense DNA sequence corresponding to the natural type. May have a homology or identity of about 95% or more, more preferably about 98% or more.
  • mutations include oligonucleotide site-directed mutagenesis and cassettes. It can be performed using well-known site-directed mutagenesis techniques such as mutation methods (eg, Short protocols In Molecular Biology, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc.).
  • the length of the sequence of each antisense DNA fragment constituting the synthetic DNA fragment can suppress the expression of any of the cellulose degrading enzyme genes and / or the hemicellulose degrading enzyme gene of the present invention.
  • the length can be set as appropriate, and it is not always necessary to have the same length as the genomic nucleotide sequence or mature nucleotide sequence of the cellulolytic enzyme gene and / or the hemicellulose degrading enzyme gene.
  • an exon sequence of a plurality of exons of a cellulolytic enzyme gene sequence on the genome or at least 30 bases (or base pairs), at least 50 bases (or base pairs), preferably at least Even a fragment consisting of 100 bases (or base pairs), more preferably at least 200 bases (or base pairs) There.
  • the cellulolytic enzyme gene antisense DNA is amplified by PCR to obtain DNA containing at least one exon region of the cellulolytic enzyme gene, or the cellulolytic enzyme gene is appropriately restricted. It can be obtained by digesting with enzymes. It can also be obtained from the cDNA of the cellulolytic enzyme gene.
  • the target cDNA can be amplified by a PCR method using a primer pair based on a unique sequence of the enzyme gene after a cDNA library is prepared by a known method.
  • this antisense DNA may be a synthetic DNA artificially produced based on the base sequence information of the cellulolytic enzyme gene (above). The above method is the same for the hemicellulose-degrading enzyme gene.
  • a genomic sequence of a cellulose or hemicellulose-degrading enzyme gene (exon 1J, intron IJ, 5 'untranslated region or 3' untranslated region) ) Or about 15 bases or more, preferably about 15 to about 30 bases, more preferably about 15 to about 25 bases based on the cDNA sequence.
  • a DNA sequence containing an exon region can be amplified by performing a PCR reaction.
  • PCR reaction conditions include, for example, denaturation of DNA (eg, 94 ° C, 15 to 30 seconds), primer annealing (for example, 55 ° C, 30 seconds to 1 minute) and extension reaction (for example, 72 ° C, 30 seconds to 10 minutes) are usually 25 to 40 cycles.
  • primer annealing for example, 55 ° C, 30 seconds to 1 minute
  • extension reaction for example, 72 ° C, 30 seconds to 10 minutes
  • thermostable polymerases such as Taq polymerase and Pfi polymerase are used as DNA synthases.
  • Antisense DNA has a sequence complementary to the mRNA sequence encoded by the various active cellulose or hemicellulose-degrading enzymes or their isozyme genes. In the present invention, it is preferable to bind as many types of antisense DNA as possible. For example, endodalcanase 61, endodalcanase 5, endodalcanase 12, cellobiohydrolase I, cellobia.
  • Examples include antisense DNAs complementary to the mRNA of an enzyme consisting of hydrolase II, cellobiose dehydrogenase, xylanase, and mannanase.
  • the order of the sequences of the various antisense DNAs is not particularly limited, but may be any order, but in the order of high cellulolytic activity and in the order of high hemicellulose degradation activity, it is adjacent to expression control sequences such as promoters. It can also be arranged from the 5 'side.
  • DNA encoding the antisense RNA in the direction of antisense is placed downstream of a DNA fragment having an expression control sequence such as a promoter sequence. It can be bound and transcribed into mRNA by the operation of a promoter. The resulting mRNA is an antisense RNA having the base sequence of the enzyme gene.
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a gene fragment having a promoter action, and promoters of all genes can be used. Examples thereof include a cellobiose dehydrogenase gene promoter, a GPD (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene promoter, and a ras gene promoter. This These promoters can be obtained by well-known genomic cloning, PCR, DNA synthesis, etc. based on sequences registered in GenBank, sequences described in literatures, and the like. Or, as for the deposited genes, it is possible to use those that are available upon request for distribution.
  • the gene containing the promoter sequence and the cellulolytic enzyme gene or the DNA encoding the antisense RNA of the gene may be subjected to appropriate DNA ligase after introduction of restriction sites, blunting or cohesive termination as necessary. Can be used together. Recombinant DNA techniques, including cloning, ligation, PCR, etc., are described in, for example, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second Edition, old Spring Harbor Laooratory Press, 1989 and FS Ausbel et al. ) Can be used.
  • the type of vector is not particularly limited, and is selected according to the type of host transformed with this vector.
  • a vector that can autonomously replicate in a prokaryotic or eukaryotic host cell or can homologously recombine in a chromosome can be used.
  • vectors are pUC-based plasmids (eg pUC19), plasmids including pBluescript (Stratagene), YIp5 (ATCC 37061), phages, viruses, cosmids and the like.
  • the vector can appropriately contain a selection marker, a replication origin, a terminator, a polylinker, an enhancer, a ribosome binding site, and the like.
  • DNA into a vector can be performed, for example, using the technique described in J. Sambrook et al. (Supra).
  • a vector such as a universal vector or a polylinker transfer vector
  • a cassette containing, for example, a promoter, an antisense DNA, and a terminator can be incorporated into the vector at a specific site.
  • a cassette containing, for example, a promoter, an antisense DNA, and a terminator can be incorporated into the vector at a specific site.
  • a cassette containing, for example, a promoter, an antisense DNA, and a terminator can be incorporated into the vector at a specific site.
  • antisense RNA of the cellulolytic enzyme gene is generated by transcription.
  • Use the resulting recombinant DNA in a circular form for transformation It is also possible.
  • in order to avoid simultaneous transformation of genes derived from other organisms it is possible to cut out only the necessary region and use it for transformation.
  • Transformation with the above vector or DNA fragment is carried out to prepare a microorganism with suppressed cellulose degrading ability.
  • the host cells are not only fungi including basidiomycetes, fungi and yeasts, but also other eukaryotic cells (animal cells, plant cells, insect cells, algae, etc.) and prokaryotic cells (bacteria, cyanobacteria, etc.).
  • any host cell can be used as long as it can exert promoter activity in the expression of DNA encoding the antisense RNA of the cellulolytic enzyme gene of the present invention.
  • preferred host cells are basidiomycetes having lignin-degrading ability, more preferably white-rot fungi, and particularly preferably the genus Coriolus, for example, larvae agaric.
  • basidiomycetes having lignin-degrading ability
  • white-rot fungi and particularly preferably the genus Coriolus, for example, larvae agaric.
  • an auxotrophic mutant OJI-1078 (FERM BP-4210) lacking the onorenitin-powered ruberamoyltransferase activity of the allergic power oyster mushroom described in the examples described below is used as a host.
  • transformation method examples include the salt calcium / PEG method, the calcium phosphate method, the lithium acetate method, the electopore method, the protoplast method, the spheroplast method, the lipofuxion method, and the agrobatterium method. Les, not limited to these.
  • the method of the present invention comprises antisense DNA fragments that are substantially complementary to all or part of each transcript of at least four different cellulolytic enzyme genes in any order.
  • a ligated synthetic DNA fragment is prepared, an expression vector in which the synthetic DNA fragment is operably linked to an expression control sequence is prepared, and a lignin-degrading microorganism is transformed with the expression vector to produce a transformed microorganism. And bringing the microorganisms, whose cell mouth decomposition ability is suppressed, into contact with the lignocellulose material, decomposing lignin in the material, and obtaining fiber components from the lignin-decomposed material.
  • the method of the present invention is substantially complementary to all or part of each transcript of at least one different hemicellulose-degrading enzyme gene.
  • a synthetic antisense DNA fragment is prepared, an expression vector in which the synthetic DNA fragment is operably linked to the expression control marker 1J is prepared, and a lignin-degrading microorganism is transformed with the expression vector.
  • a more preferred embodiment is a transformed microorganism in which the expression of four or more cellulase degrading enzyme genes and one or more hemicellulose degrading enzyme genes are simultaneously suppressed by the same antisense method as described above.
  • cellulose and hemicellulose-degradable microorganisms are brought into contact with the lignocellulose material to decompose lignin in the material, and a fiber component is obtained from the lignin-decomposed material.
  • the term "substantially” refers to antisense 1 ⁇ 8 ⁇ 1 ⁇ 8 binding to form a double strand, which is As long as translation is inhibited, the antisense DNA sequence contains one or more, preferably one or several mutations such as deletions, substitutions or additions, compared to the sequence corresponding to the native form. Or about 90% or more, about 95% or more, or about 98% or more homology.
  • % Homology is the percentage of the number of different amino acids relative to the total number of amino acids that can be determined by a sequence alignment comparison that introduces gaps. The% identity can be determined using, for example, a known BLAST program.
  • Lignocellulosic materials targeted in the present invention are wood, bamboo, cotton, linter, corn cobs, sawdust, beer lees, straws, rice husks and other agricultural wastes, old newspapers, magazines, cardboard Office waste paper, pulp and waste pulp discharged from paper manufacturers.
  • the effect is particularly exerted on wood having high lignin content, agricultural waste, and the like.
  • wood chips that are mechanically broken into pieces of 2 to 3 cm and a thickness of about 5 mm can be mentioned.
  • it is obtained from timber including conifers such as pine, cedar, fir, spruce, Douglas fir, radixtapine and broad-leaved trees such as beech, hippopotamus, alder, ripe, eucalyptus, poplar, acacia, lawan, and rubber.
  • Any type of chip can be used as long as it can be used as a raw material for pulp and the like.
  • the lignocellulosic material is treated with microorganisms that suppress cellulose and / or hemicellulose degradability. Slightly suppressed degradation of cellulose and / or hemicellulose The ability of lignocellulosic materials to be used as they are without pretreatment if the organisms are fully grown Microorganisms with reduced degradability of cellulose and / or hemicellulose when pretreated to sterilize other microorganisms If it is easy to grow, it is preferable to pre-treat the cellulose and / or hemicellulose material by autoclaving or steaming.
  • the temperature at which the lignocellulosic material is treated with a microorganism having suppressed cellulose and / or hemicellulose degradability is preferably 10 to 60 ° C, more preferably 20 to 35 ° C.
  • the water content in the lignocellulosic material should be 20-80%, preferably 30-50%.
  • the amount of air supplied to the lignocellulosic material after inoculation is not necessary if microorganisms with reduced cellulose decomposing ability can grow sufficiently, but the amount of air supplied per liter of chip or lignocellulosic material volume is usually per minute.
  • L / (min) (hereinafter referred to as the unit of air supply L / (min) is referred to as wm), preferably 0.01 wm to 0.1 wm per chip or lignosenorelose volume is there.
  • the inoculation amount of the microorganism having suppressed cellulose and / or hemicellulose degradability to the lignocellulosic material can be appropriately set as long as the pulp yield and paper strength are not reduced.
  • the bacterial cells are sprayed or dripped so as to produce about 0.01 to 1,000,000 colonies, particularly preferably 0.1 to 1,000 colonies per square centimeter of the raw material surface area. It is preferable to maintain conditions suitable for growth of the cells, that is, appropriate temperature and pH. In the case of ragweed brackish, the range of 0 ° C to 40 ° C and pH4 to pH8 is preferred.
  • Microorganisms having suppressed cellulose and / or hemicellulose degradability can be pulverized with sterilized water, inoculated into lignocellulosic material and cultured, and a medium is added to lignosenorelose material. You can handle it.
  • the medium any medium can be used as long as it can grow a microorganism having a suppressed ability to decompose cellulose and / or hemicellulose.
  • glucose, cellobiose, amorphous cellulose, etc. can be used as the carbon source.
  • nitrogen compounds such as yeast extract, peptone, various amino acids, soybean meal, corn steep liquor and various inorganic nitrogen can be used.
  • various salts, vitamins, minerals, etc. can be appropriately collected. it can.
  • a pulp or cellulose 'micelle mouth can be obtained as a fiber component.
  • useful substances are produced from fiber components obtained from the lignocellulosic material.
  • the fiber component is composed of cellulose or pulp fiber.
  • paper pulp can be produced from pulp fiber, and saccharides such as monosaccharides, polysaccharides and oligosaccharides can be produced from cellulose fibers.
  • the fiber component obtained by the above method can be used for the production of paper pulp.
  • the wood chip treated with the microorganism of the present invention is then used as a pulp material for papermaking as mechanical pulp by mechanical treatment or chemical pulp by chemical treatment.
  • the chemical pulp method is a method of taking out fibers by chemically decomposing and eluting components other than cellulose from wood fibers using chemicals such as alkali.
  • the mechanical pulping method is a method in which the wood chips treated by this method are mechanically pulverized into fibers.
  • the semi-chemical pulping method is an intermediate method between the mechanical pulping method and the chemical pulping method, in which the chips are digested to an extent that softens the chips with an alkaline chemical and then fiberized with a refiner. In the present invention, any of the above methods can be used in the production of paper pulp.
  • thermomechanical pulp TMP
  • RGP refiner ground pulp
  • CGP chemiground pulp
  • a cooking method for obtaining chemical pulp known cooking methods such as kraft cooking, polysulfide cooking, soda cooking, alkali sulfite cooking and the like can be used. Considering pulp quality, energy efficiency, etc.
  • a kraft cooking method is preferably used.
  • the sulfidity of the kraft cooking liquor is 5 to 75%, preferably 15 to 45%, effective alkali loading ratio is 5-30% by mass, preferably 10-25% by mass, and cooking temperature is 130-170 ° C.
  • thermomechanical pulp TMP
  • RGP refiner ground pulp
  • the fiber component obtained by the above method can be used directly or after drying for the subsequent sugar-sugar reaction.
  • the above-described bacterial treatment and saccharification reaction can be performed simultaneously.
  • physical pretreatment and / or chemical pretreatment can be applied before and after the fungus treatment.
  • cellulase any commercially available cellulase can be used as the cellulase used in the present invention.
  • Clostridium (Clostridium) cellulase derived from the genus and the like can be used.
  • cellulose is hydrolyzed and converted into cellooligosaccharide and glucose.
  • the hemicellulose-degrading enzyme also known as hemicellulase
  • sugars such as xylooligosaccharides xylose, mannose, and arabinose. Due to the above reaction, the saccharification rate of polysaccharides existing in biomass, which also depends on the biomass used as the raw material, was previously determined using lignin-degrading bacteria with suppressed cellulose degradability. It can be improved by processing.
  • the fiber component obtained by the method of the present invention can also be used as a raw material for biomass such as alcohol (eg, ethanol) after saccharification as described above. That is, alcohol can be produced using sugar from the fiber component as a raw material in the presence of an alcohol-fermenting bacterium (for example, yeast). Ethanol is in high demand worldwide for fuel, industrial and beverage use.
  • alcohol eg, ethanol
  • yeast an alcohol-fermenting bacterium
  • a) Preparation of a vector plasmid having a promoter that expresses the antisense strand In order to amplify the cellobiose dehydrogenase gene promoter region, which has high enzyme activity when cultivating moth moth bamboo shoots on pulp, A PCR reaction was carried out using a primer represented by 5′-GAGGATCGCAACCGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and a primer represented by 5′-GTTGCTGACATGGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 2). The obtained DNA fragment of about 2.2 kb was cloned using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) to obtain pTACDHP.
  • TOPO TA Cloning Kit manufactured by Invitrogen
  • pTACDHP was digested with the restriction enzyme Nml, followed by a blunting reaction and a ligation reaction again.
  • This plasmid was digested with restriction enzymes BamHI and restriction enzyme ⁇ I, and then introduced into a vector digested with pBluescriptll SK + plasmid with restriction enzymes BamHI and restriction enzyme 1 to obtain pCDHP.
  • an intron of the manganese peroxidase gene is included downstream of pCDHP.
  • the plasmid pBSMPOGl containing the MnP gene derived from the allergic power oyster mushroom pBSMPOGl was used in the vertical form, and the 5'-CACCATGGCCTTCCCGACCCTTC—3' (primary IJ number 3) primer and 5 PCR reaction was performed using the primer shown in '-GCGGCCGCGGGTACTGTG -3' (SEQ ID NO: 4).
  • the obtained 0.8 kb DNA fragment was cloned using the TOPO TA Cloning Kit, the resulting plasmid was digested with restriction enzyme ⁇ ⁇ and restriction enzyme Notl, and then 0.8 kb DNA was analyzed by agarose gel electrophoresis. Collect fragments and top
  • the plasmid pCDHP was introduced into the vector PCDHP digested with the restriction enzymes Nml and Neil to obtain the plasmid pCDHP-Mnpter.
  • A61NcoI N1 5 '-CATGCCATGGGTCATGTTCTCGTCTAC-3' (sequence) Endoglucanase 'Family 61 gene (EG61)
  • A61NcoI N1 5' -CATGCCATGGGTCATGTTCTCGTCTAC-3 '(sequence) No. 5
  • A61NcoICl 5, _CATGCCATGGATTCACCAGCCTTGAGC-3, (SEQ ID NO: 6) were used to amplify by PCR, and a 430 bp fragment was cloned using the TOPO TA Cloning Kit.
  • the obtained plasmid was analyzed using the M13 forward (-20) primer shown in 5'-GTAAACGACGGCCAG-3 '(SEQ ID NO: 7), and against the lacZ gene ( ⁇ -galatatosidase gene) present on pCR-TOPO.
  • a clone inserted in the sense direction was selected and designated pTA-EG61.
  • H3-Nco-CBH2F 5 _cccaagcttCCA TGGATCTACCTGAGC-3 PCR was performed using the primer shown in (SEQ ID NO: 8) and the primer shown in H2-CBH2R: 5,-gccgtc aacTCACTAGTGGCGAGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 9).
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzyme mndiii and restriction enzyme Hindi to obtain an insert fragment.
  • This DNA fragment was introduced into a vector obtained by digesting the plasmid pTA_EG61 with the restriction enzyme Hindin and the restriction enzyme Hindi to obtain pTA-CBHII-EG61.
  • genomic DNA was converted into a saddle shape and a restriction enzyme site was added.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzyme I to obtain a inserted DNA fragment.
  • This DNA fragment was introduced into a vector obtained by digesting the above plasmid pTA-CBHII-EG61_CBHI with ⁇ I, and the resulting plasmid was subjected to PCR using the primer shown in SEQ ID NO: 11 and the primer shown in SEQ ID NO: 12 to obtain about 1.4.
  • a clone in which a kb DNA fragment was amplified was selected and designated pTA-CBHII-EG61-CDH-CBHI.
  • a sac-EG5f2 5, -ccgagctcGGCAGAAGCTTGCCGCTGA_3, (SEQ ID NO: 14) and xho-EG5r2: PCR was performed using the primer shown in (5, -ccgctcgagGCCTGCTGCATCTCGCAGA_3, (SEQ ID NO: 15) to amplify the DNA fragment.
  • the obtained DNA fragment was cloned using the TOPO TA Cloning Kit, and as a result of analysis using the M13 primer, a clone inserted in the sense direction with the ⁇ -galactosidase gene was designated as pTA-EG5.
  • a cDNA library prepared from the allergic power oyster mushrooms growing on the chip was used as a xho-EG12fl: Amplification was performed by PCR using the primer shown in 5, -ccgctcgagGAAGAGCTTCACGAACATCCAG-3 '(SEQ ID NO: 16) and the primer shown in Xba—EG12rl: 5, _gctctagaACATGTTTCGTCTCCCTAGTTGA TA-3' (SEQ ID NO: 17). The obtained fragment was digested with restriction enzyme 1 and restriction enzyme 1, and then introduced into the vector obtained by digesting plasmid pTA-EG5 obtained above with restriction enzyme Xi ⁇ I and restriction enzyme 1 to obtain pTA-EG5-EG12. did.
  • a plasmid pTA_CBHII_EG61-EG5-EG12-CDH-CBHI having a DNA sequence in which 6 types of gene fragments were ligated in the same direction was prepared by introducing it into the Kml site existing at the CDH gene site of pTA-CBHII-EG61_CDH-CBHI.
  • the obtained DNA fragment was digested with ⁇ ⁇ and inserted in the antisense direction with respect to the cellobiose dehydrogenase gene promoter at the tei site at the junction of the promoter region of pCDHP-Mnpter and the 3 ′ end region of the ⁇ gene.
  • CBHI_27, CDH, EG12, EG5, EG61, and CBHII gene fragments are sequentially linked downstream of the promoter region (SEQ ID NO: 34).
  • SMY medium 1% sucrose, 1% malt extract, 0.4% yeast extract
  • SMY medium 1% sucrose, 1% malt extract, 0.4% yeast extract
  • a 5 mm diameter agar piece was punched out from a plate agar medium of OJI-1078 strain with a cork borer, inoculated into SMY medium, and allowed to stand at 28 ° C for 7 days (preculture). However, in order to subdivide the mycelium, it was shaken once or twice a day.
  • cell wall-degrading enzyme solution The suspension was suspended in 1 ml of cell wall-degrading enzyme solution and incubated at 28 ° C for 3 hours with gentle shaking to release protoplasts.
  • the following commercially available enzyme preparations were used in combination as cell wall lytic enzymes. That is, cellulase ONOZUKA RS (manufactured by Yakuruto, Tokyo, Japan) 5 mg, yatalasase (Takara Shuzo, Kyoto, Japan) 10 mg was dissolved in 1 mg of the osmotic pressure adjusting solution. Used as an enzyme solution.
  • the hyphal fragments remaining on the nylon mesh and the protoplasts are removed once with the osmotic pressure adjusting solution in order to increase the recovery rate of protoplasts. Washed. Centrifuge the resulting protoplast suspension (1,000,000 x g for 5 minutes), remove the supernatant, and resuspend in 20 mM MOPS buffer (pH 6.3) containing 4 ml of 1M sucrose. Thereafter, the centrifugation was repeated, and the cells were washed twice with the 1M sucrose solution. The precipitate was suspended in 500 ⁇ of a solution of 20 mM MES buffer (pH 6.4) containing 1 M sorbitol in 40 mM calcium chloride to obtain a protoplast suspension. This suspension was stored at 4 ° C.
  • the protoplast concentration was determined by direct microscopy using a hemocytometer. All centrifugation operations were performed on a swing rotator at 1,000 Xg for 5 minutes at room temperature.
  • Transformants isolated by the above transformation method were oxygen bleached hardwood pulp (LOKP) 'peptone medium (LOKP 1%, polypeptone 1%, KHPO 0.15%, MgSO 0.05%, p
  • the transformed strain selected in Example 3 and having suppressed cellulolytic enzyme activity was cultured at 28 ° C. on potato dextrose agar medium and then stored at 4 ° C. Five sections of this plate punched with a 5 mm diameter cork borer were adjusted to pH 5.0 with glucose-peptone medium (glucose 3%, polypeptone 1%, KH PO 0.15%, MgSO 0.05%, phosphoric acid.
  • Wood chips that have been treated with bacteria are beaten using a lab refiner (manufactured by Kumagai Riki Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan) to make Canadian Standard Freeness 200 ml, and then used for pulp physics.
  • the test handsheets were prepared according to the JIS test method (P8209), and the pulp handsheets were physically tested according to the Tappi method T220 om_83.
  • the electric energy used was a watt meter (Hi okidenki model 3133) and an integrator (model 3141).
  • For the chip yield measurement 1 kg of moisture-containing wood chips were dispensed into a container at an absolute dry weight, the absolute dry weight of the chips before and after treatment was measured, and the chip yield was calculated using the following formula.
  • Chip yield (absolute dry weight after treatment) / (absolute dry weight before treatment) X 100
  • Example 4 the same experiment was conducted without inoculating bacteria. The results are shown in Table 1.
  • the soot was dried at 105 ° C and then measured for its dry weight. In addition, a portion of unbleached pulp was taken and the absolute dry weight was measured to determine the yield from the chip (selection yield). The pulp kappa monovalent was measured in accordance with JIS P 8211. The results are shown in Table 2.
  • Example 5 the same experiment was conducted without inoculating the bacteria. The results are shown in Table 2.
  • Example 6 the amount of Krason lignin in the raw bagasse was measured. The results are shown in Table 3.
  • Example 6 without inoculating bacteria, the same medium as in Example 6 was added, left to stand, extracted with alkali, and saccharified in the same manner as in Example 7. The results are shown in Table 4.
  • kpn-chxyn2-N 5 ′ _CATGGTACCG CTGTCGCGGTCTGGGG-3, (SEQ ID NO .: PCR was performed using the primer shown in 24) and the primer shown in bam-chxyn2-C: 5, -CATGGATCCGCCGAGACCCAGGACGG-3 ′ (SEQ ID NO: 25) to obtain a 480 bp fragment.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Kpnl and BamHI to obtain an insert fragment.
  • This DNA fragment was introduced into a vector obtained by digesting the above plasmid pTA-Xynl with the restriction enzyme Kpnl and the restriction enzyme BamHI to obtain a plasmid pTA_Xyn2_Xynl.
  • EV-Manl_N 5'-CATGGATATC CAATGGGATCAGGAGCC-3 '(SEQ ID NO: 26) added with a restriction enzyme site from the above cDNA library PCR was performed using the primer shown in FIG. 5 and the primer shown in Xh-Manl-C: 5′-CATGCTCGAGGCCACCATACCCGACCC-3 ′ (SEQ ID NO: 27) to obtain a DNA fragment of about 400 bp.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoR V and Xhol to obtain an inserted fragment.
  • This DNA fragment was introduced into a vector obtained by digesting the plasmid pTA-Xyn2-Xynl with the restriction enzymes EcoRV and Xhol to obtain a plasmid pTA-Xyn2-Xyn1-Man1.
  • a restriction enzyme site was added from the above cDNA library in order to amplify the DNA fragment of the managenase 2 gene of the jellyfish oyster mushroom Xh-Man2-N: 5 '_CATGCTCGAGCG PCR was performed using the primer shown in CCCCAGAGTGGGGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 28) and the primer shown in Xb_Man2_C: 5, _CATGTCTAGAGTTGGCCTTTGCCGCGG-3 ′ (SEQ ID NO: 29) to obtain a DNA fragment of about 500 bp. The obtained fragment was deleted with restriction enzymes XhoI and Xbal to obtain inserted fragments.
  • This DNA fragment was introduced into a vector digested with the above plasmid pTA_Xyn2-Xynl-Manl with restriction enzymes XhoI and Xbal, and a plasmid pTA-Xyn2- having a DNA sequence in which four hemicellulose-degrading gene fragments were ligated in the same direction.
  • Xy nl- Manl-Man2 was obtained.
  • the obtained DNA fragment was digested with, and a clone inserted in the antisense direction with respect to the cellobiose dehydrogenase gene promoter at the site of the junction site of the promoter region of pCDHP-Mnpter and the 3 ′ end region of the Mnp gene was selected.
  • a clone inserted in the antisense direction with respect to the cellobiose dehydrogenase gene promoter at the site of the junction site of the promoter region of pCDHP-Mnpter and the 3 ′ end region of the Mnp gene was selected.
  • Man2, Manl, Xynl, and Xyn2 gene fragments are sequentially linked downstream of the promoter region.
  • the antisense strand expression plasmid pCDHP_HCT4 was obtained, in which antisense RNA of four types of hemicellulose-degrading enzyme genes was transcribed by the CDH gene promoter.
  • the moth moth bamboo was transformed with the hemicellulose-degrading enzyme gene antisense strand expression gene, and it was confirmed by PCR that the target suppressor gene PCDHP-HCT4 had been incorporated. .
  • Example 9 Selection of transformants with reduced hemicellulose-degrading enzyme activity
  • the transformant isolated in Example 9 was cultured according to Example 3, and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm, sampling was performed over time, and xylanase activity and mannanase. Activity was measured. Enzyme activity was performed using sodium citrate buffer (pH 4.5). Endo- ⁇ -1,4_D-xylanase activity was measured using the DNS method to determine the amount of reducing sugar released by dissolving Sigma's birch silane to 1% and reacting at 50 ° C for 5 minutes. .
  • endo-j3_l, 4-D-mannanase activity was reacted in a 0.5% locust bean ratatomannan solution at 50 ° C for 5 minutes, and the amount of reducing sugar released was measured by the DNS method.
  • the xylanase activity of the transformant obtained above was suppressed to 40% compared to the host cell, and the mannanase activity was suppressed to 20%.
  • the transformant having suppressed hemicellulose-degrading enzyme activity selected according to Example 10 was treated with bacteria according to Example 4 to produce mechanical pulp. The results are shown in Table 1.
  • Example 9 Using the transformant selected according to Example 9, the eucalyptus wood was chipped according to Example 5 to prepare kraft panolep, and the pulp yield and physical effects were evaluated. The results are shown in Table 2.
  • Example 9 Using the transformant obtained in Example 9, bacterial treatment was performed on bagasse as a lignocellulosic material according to Example 6, and the amount of clathon lignin was measured. Asked. The results are shown in Table 3.
  • a cDNA library prepared from the allergic power oyster mushrooms grown on the chip was used as a cage, and the primers shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 PCR was performed using the indicated primers to amplify the DNA fragment.
  • the obtained DNA fragment was cloned using the TOPO TA Cloning Kit, and as a result of analysis using the M13 primer, the clone inserted in the sense direction with the ⁇ -galactosidase gene was designated as pTA-Xynl.
  • a cDNA library prepared from allergic power oyster mushrooms growing on the chip was used in a cocoon shape and the primer and sequence shown in SEQ ID NO: 28 Amplification was performed by PCR using the primer shown in No. 29.
  • the obtained fragment was digested with restriction enzyme 1 and restriction enzyme 3 ⁇ 41, and then introduced into the vector obtained by digesting plasmid PTA-EG5 obtained above with restriction enzyme 1 and restriction enzyme 1 to obtain pTA-Xynl-Man2. .
  • This DNA fragment was introduced into the Kpnl site in the CDH gene site of the plasmid PTA-CBHII-EG61-CDH-CBHI, which has four types of cellulose-degrading enzyme gene fragments, and the six DNA fragments were ligated in the same direction. Plasmid pTA-CBHII-FG61-Xynl-Man2-CDH-CBHI was prepared.
  • the obtained DNA fragment was digested with Nml, and inserted into the Nml site at the junction of the promoter region of pCDHP-Mnpter and the 3 'end region of Mnp gene in the antisense direction with respect to the cellobiose dehydrogenase gene promoter. Downstream of the promoter region are CBHI-27, CDH, EG12, Xynl, Man2, and CBHII gene fragments.
  • the antisense strand expression plasmid PCDHP-MT6 was obtained, in which the antisense RNA of the six types of cellulose and hemicellulose-degrading enzyme gene fragments was transcribed by the CDH gene promoter.
  • Example 2 the cellulose degrading enzyme gene and the hemicellulose degrading enzyme gene produced in Example 15 were transformed using the antisense strand expression gene produced as a single transcript, and the purpose and It was confirmed by PCR that the suppressor gene PCDHP-MT4 was incorporated.
  • the transformant having suppressed cellular nest degrading enzyme activity and hemicellulose degrading enzyme activity selected according to Example 17 was treated with bacteria according to Example 4 to produce mechanical pulp. The results are shown in Table 1.
  • Example 17 Using the transformant selected in Example 17, eucalyptus wood was chipped according to Example 5 to prepare kraft panolep, and the pulp yield and physical effects were evaluated. The results are shown in Table 2.
  • Example 20 The lignocellulosic material after alkali extraction obtained in Example 20 was enzymatically treated with a commercially available cellulase preparation in the same manner as in Example 7 to saccharify lignocellulose. The results are shown in Table 4.
  • the transformed strains of Examples 4, 11 and 18 that suppressed cellulolytic enzyme activity and hemicellulose degrading enzyme activity were able to reduce the fibrillation energy compared to Comparative Example 2 in which the bacteria were not treated. It was.
  • the wild type strain of Comparative Example 1 is not treated with the fungus of Comparative Example 2, but the fibrillation energy can be reduced compared to the case, but the chip yield is also paper strength (specific tear strength and specific burst strength). In both cases, the decline was significant.
  • the transformed strains of Examples 4, 11 and 18 can improve the yield reduction compared to the wild strain shown in Comparative Example 1, and both the tear strength and the burst strength are wild strains of Comparative Example 1. It was possible to improve more.
  • the wood chips treated with the transformants (Example 5, Example 12, Example 19) and the wood chips treated with the wild strain (Comparative Example 3) were adjusted to a kappa monovalent of 16.
  • the refined yield of the pulp when digested increased compared to the case where no fungus was treated (Comparative Example 4), and the drought rate decreased.
  • the PFI mill was used until the target freeness reached 410 ml. The number of beat rotations was reduced.
  • a wood chip is inoculated with a transformant that suppresses the cellulose-degrading enzyme activity and / or hemicellulose-degrading enzyme activity of the lignin-degrading bacterium obtained according to the present invention, and the pulp is obtained by aeration and insulation.
  • the lignin in wood is decomposed by a method with little reduction in yield and paper strength, and in the mechanical pulp manufacturing process, it is possible to reduce the beating energy, which consumes a large amount of power energy, without reducing the yield. Can be.
  • the chemical pulp manufacturing process it is possible to improve the digestibility and increase the yield, and provide a method advantageous in the paper pulp manufacturing process.

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Abstract

　この発明は、リグノセルロース材料を微生物で処理して繊維成分を得るに際して、微生物が産生するセルロース分解酵素および/またはヘミセルロース分解酵素により紙の主成分であるセルロースおよび/またはヘミセルロースが分解されることを防止する方法に関する。具体的には、この発明は、リグノセルロース材料から繊維成分を取り出して有用な物質を製造する方法において、複数のセルロース分解酵素および/またはヘミセルロース分解酵素の発現が抑制された、かつリグニン分解力のある微生物を該リグノセルロース材料と接触させること、および該材料から繊維成分を得ることを含む方法を提供する。

Description

明 細 書
リグノセルロース材料からの繊維成分の製造およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、リグノセルロース材料から繊維成分を取り出して有用物質を製造する方 法に関する。より具体的には、本発明は、リグノセルロース分解性がありかつセルロー ス分解性および/またはへミセルロース分解性が抑制された微生物をリグノセルロー ス材料と接触させたのち、繊維化工程を経て繊維成分を取り出すことを含む、上記方 法に関する。従って、本発明の方法は、省資源または省エネルギーに寄与するもの であり、特に、紙パルプ原料からの紙パルプの製造や、バガスなどのリグノセルロース 材料からの糖類の製造にぉレ、て、省資源または省エネルギー型の製造方法を提供 する。
背景技術
[0002] リグノセルロース材料力 繊維成分を取り出す工程では、繊維間の結合に関与する リグニンやへミセルロースの構造を機械的な力によって破壊するもしくはリグニンやへ ミセルロースを選択的に化学的に溶解、分解することによって繊維成分を取り出すこ とが行われている。
[0003] 紙パルプの製造工程も、木材やその他のリグノセルロース材料力 機械的、化学的 処理により、繊維間結合物質を切断または分解し、繊維成分であるパルプを製造し ている。この様な紙パルプの製造工程はエネルギーを必要とする工程であり、省エネ ルギー化には長年に亘りさまざまな対策が実施されてきた。しかし、環境問題を解決 するため、更に省エネルギー化する技術の開発が求められている。
[0004] また、リグノセルロース材料をいわゆるバイオマスとして化学原料やエネルギー原料 の発酵生産の基質として利用する場合、発酵基質となる糖類を製造するために、繊 維成分を分解せずに、リグニンを分解除去する前処理方法の開発が求められている
[0005] 紙パルプ工業で製造されているパルプは、その製造方法により機械パルプと化学 パルプに分けられる。機械パルプは、機械的エネルギーを用いて木材繊維を物理的 に摩砕して製造される。木材成分をほとんどそのまま含んでいるため、高い収率で製 造することができ、薄く不透明度の高い紙を作ることができる。し力 ながら、摩砕の ために大きな電力を必要とする欠点がある。
[0006] 上記のような多大な電力の消費を抑制するため、微生物特に白色腐朽菌と呼ばれ るリグニン分解力を有する担子菌で予め木材チップを処理し、エネルギーを削減しよ うという研究が行われてきた。例えば、ハンノキの一次解繊サーモメカニカルパルプ（ TMP)の製造に先立ち、ファネロカエテ 'タリソスポリゥム (Phanerochaete chrysosporiu m)をグルコースとともに木材チップに添加し、 2週間放置すると、 TMP製造の二次解 繊のエネルギーを 25から 30%削減できたという報告がある（非特許文献 1)。また、フ ァネロカエテ.タリソスポリゥムとディコミタス.スクアレンス (Dichomitus squalens)を用レヽ 、アスペン材を処理した際には、コントロールと比べて紙力強度が増加している（非特 許文献 2)。
[0007] Akamatsuらは、ァラゲ力ワラタケ (Coriolus hirsutus)を含む白色腐朽菌 10株を用レヽ ポプラ材上に培養し、パルプ収率、解繊エネルギー、パルプ強度について調べてい る。その結果、ァラゲ力ワラタケで処理すると解繊エネルギーが減少し、結晶化度が 増加するなど、用いた菌株の中ではァラゲ力ワラタケがチップの前処理菌として好ま しいことが示された。し力 ながら、このときの収率が約 7%低下した（非特許文献 3)。
[0008] Nishibeらは、白色腐朽菌 61種、 85株から予備選抜した 10種類の腐朽菌を使って、 サヮグルミ木片と針葉樹 2次離解 TMPを微生物分解し、選択的に脱リグニンを行い、 ノ ノレプ繊維の崩壊が少ないネナガノヒトヨタケ (Coprinus cinereus)、ファネロカエテ 'ク リソスポリゥムを選抜し、グノレコースと尿素の存在下では紙力強度の低下が抑えられ ることを示した。し力し、パルプ収率の低下が、 14日間、 30°Cの処理でそれぞれ 6.3% 、 9.7%であった。ァラゲ力ワラタケを用いた場合、収率減は 7.5%であった（非特許文 献 4)。
[0009] Kashinoらは、白色腐朽菌 IZU- 154を自然界力もスクリーニングし、ファネロカエテ. タリソスポリウムゃカワラタケ (Trametes versicolor)より選択的にリグニンを分解し、広 葉樹を 7日間処理した場合、解繊エネルギー力 /2〜2/3減少することを確認した。ま た、パルプ強度は約 2倍増加した。針葉樹を 10〜14日間処理した場合では解繊エネ ルギ一力 Sl/3減少し、強度増加も得られた。培地を加えた場合には 7日間で同等の結 果を得ることができた (非特許文献 5)。
[0010] さらに、米国では USDA Forest Products Laboratoryのグループを中心に研究機関 、紙パルプ産業数社から成るリグニンコンソーシアムを形成し、リグニン分解力が高く 、セルロース分解力の低い菌株のスクリーニングを行レ、、セリポリオプシス'サブバー ミスポラ (Ceriporiopsis subvermispora)を新たに選抜した。この株を用いて機械パルプ の動力削減を検討し、例えば、 TMPの製造エネルギーの 40%近くを削減でき、このと きの収率の低下が 3〜5%程度であり、心配される紙の強度への悪影響はなぐむし ろ強度が上がっていると報告している（非特許文献 6)。 USDA Forest Products Labor atoryでは既にパイロットプラントを建設し、単離したセリポリオプシス.サブバーミスポ ラの実証試験を行っている。米国内の工場を想定し、工場のチップヤードで微生物 処理を行うことを考えている。し力し、セリポリオプシス 'サブバーミスボラは増殖に好 適な温度が低ぐ 32°Cまでの温度でしか効果が得られないが、チップを保存している パイル内部が高温となるため、冷却のための通気のエネルギーおよびコストが大きく 、温暖な地域での使用には不適切である。
[0011] また、これまでスクリーニングで得られてきた微生物はリグニン分解の選択性が必ず しも高くなぐリグニンのみでなぐセルロースも分解するため、パルプ収率や紙力低 下を生じる。従って、リグニン分解の選択性を高めた微生物、すなわち、リグニン分解 能力には優れるが、セルロース分解は抑制されている微生物の取得 '作製が求めら れている。
[0012] リグニン分解の選択性を高めた変異体は Anderらにより作製されている。彼らは、 U V照射によりスポロトリカム'プルベルレンタム (Sporotrichum pulverulentum)に変異処 理を行い、セルラーゼ活性が弱い変異株 Cel44株の菌株を開発している。野生株とこ のセルラーゼ抑制株 Cel44とを用いてカバ材木片の分解を行ったところ、前者がリグ ニン及びキシランをよく分解するのに対し、後者はリグニン及びキシランをよく分解す るが、グルカンをほとんど分解しなかった (非特許文献 7)。
[0013] この Cel44を用いてバーチ材を 6週間処理した後、機械パルプの製造を行ったとこ ろ、紙力強度の増加が見られた (非特許文献 8)。また、バーチ材とパイン材を用いて 実験を行い、処理時間を増加させることによって、繊維のフィブリルィ匕とリファイユング のエネルギーが 30%減少したと報告してレ、る (非特許文献 9)。
[0014] 彼らはフレビア'ラヂァータ (Phlebia radiata)においても同様にセルラーゼ活性の弱 い株 Cel26を作製した。この Cel26でパイン材のチップとパルプを処理した後、機械パ ルプを製造した際、いずれの場合も紙力の改善は見られなかったものの、解繊エネ ルギ一の低下が見られた。また、重量減少は 2%以下であった (非特許文献 10)。
[0015] 一方、化学パルプは、化学薬品を用いて木材中のリグニンを溶出させセルロース、 へミセルロースを取り出す製造方法である。現在では水酸化ナトリウムと硫化ナトリウ ムを用いて脱リグニンを行うクラフトパルプが主流となっている。クラフトパルプにおい ても機械パルプと同様に微生物処理を行い、蒸解前に脱リグニンを行うことでの製造 エネルギーの削減、パルプ品質の向上が試みられてレ、る。
[0016] 例えばファネロカエテ 'タリソスポリゥムを用いて、レッドオーク材ゃアスペン材を 30
日間処理すると、同一 Ka価における収率が向上し、叩解エネルギーが削減すること、 また、引張り強度と破裂強度が増加するという報告がある (非特許文献 11)。同じぐ ファネロカエテ .クリソスポリゥムを用いた実験において、破裂強度、引裂き強度の増 加が報告されてレ、る（非特許文献 12)。 Molinaらはラジア一タパインを力ワラタケとヒラ タケ (Pleurotus ostreatus)で処理した際には、 11〜14%の製造エネルギーが削減でき ると報告している。し力 ながら、力ワラタケの場合にはパルプ強度の減少が見られた (非特許文献 13及び非特許文献 14)。
[0017] Bajpaiらは、セリポリオプシス ·サブバーミスボラを用いた実験において活性アルカリ を 18%削減し、蒸解時間を 33%削減し、白液中の硫化度を 30%削減することができ ることを報告してレ、る (非特許文献 15)。
[0018] 上記のように、クラフトパルプにおける微生物処理は蒸解性を向上させエネルギー の削減をもたらすが、収率や紙力強度を低下させる場合があり、機械パルプと同様に 微生物処理を実用化するには、リグニンを分解する能力には優れる力 セルロースを 分解する能力は抑制されかつリグニン分解の選択性を高めた微生物の取得 '作製が 必要となっている。
[0019] それに対し、上記のようにセルラーゼ活性の弱い変異株の作製が行われ、機械パ ルプ処理への利用の検討が行われている力 これらの変異株は紫外線照射により変 異処理しているため、変異株の成長速度が遅 分解処理に長時間力かってしまうと レ、う問題がある。このため、成長速度には影響せずセルロース分解活性のみを抑え る変異株の作製が望まれてレ、る。
[0020] セルロースを分解する酵素（セルラーゼ）は /3 _ 1 , 4—グルカン（セルロース）又は その誘導体の 一 1， 4一ダルコビラノシル結合を加水分解する数種の酵素の総称 であり、エンドグルカナーゼ（EGと略）、セロビォヒドロラーゼ（CBHと略） I、 II、などから なる。 EGはセルロース主鎖の —1 , 4—ダルコビラノシル結合をエンド型に加水分 解することでセルロース鎖に断点を入れ、続いて CBHがその断点力 順次セロビォ ース単位で分解し結晶性の高い部分も分解することが知られている。 CBH Iはセル口 ース鎖の還元末端からセロビオース残基を切り取り、 CBH IIは非還元末端から切り取 つてゆく。また生じたセロビオースを酸化するセロビオースデヒドロゲナーゼ、セロオリ ゴ糖の末端から β結合を加水分解する β—グノレコシダーゼが知られている。そして、 これらの加水分解酵素が相乗的に作用することによりセルロース基質が低分子化し てセロビオースを生じ、さらに —グノレコシダーゼが関与することにより、グルコース 単位まで分解される。
[0021] し力しながらセルロース分解酵素の研究が進むに連れて、セロビォヒドロラーゼが E Gのような活性を示すケース、その逆のケースもあり、これまでの分類方法では説明で きなレ、酵素が見つかつてきてレ、る。
[0022] これまでに多数のセルロース分解酵素が単離精製され、また遺伝子の配列が明ら 力にされている。セルロース分解酵素はハイド口フォービッククラスターアナリシスとよ ばれる疎水性アミノ酸のクラスタ構造に基づく二次元的解析によりグリコシドヒドロラー ゼファミリ一としてグループ分けできることが明らかにされている（非特許文献 16)。
[0023] これらの酵素の分類では、 CBHと EGのセルロース分解特性の違いはそれぞれの活 性中心を上から覆うペプチドループの有無並びにその存在状態の際に基づくことが 示されてレ、る。 Trichodermaでは CBHIと CBHIIの三次元の結晶構造の特徴として活 性中心がペプチドループによって覆い隠されているトンネル構造を持つことが報告さ れている。一方、エンド型の酵素は活性中心にクレフトと呼ばれる溝を持ち、そこでセ ルロース鎖を捕捉、切断後、一旦セルロース鎖から離れ、再度セルロース鎖を捕捉 するノンプロセッシブな切断様式で作用する（非特許文献 17)。
[0024] また、セロビオースデヒドロゲナーゼは、セロビオースゃセロオリゴ糖を酸化してセロ ピオノラタトンを生成すると同時にキノン、鉄などの金属錯体、フエノキシラジカル、酸 素などを還元する酸化還元酵素である。この酵素は、微生物がセルロースを分解す るときにセルラーゼと同時に産生される（非特許文献 18)こと、セロビオースによるセ ルラーゼ活性の阻害、すなわち生成物阻害を解除する（非特許文献 19)ことから、セ ルラーゼとの共役でセルロース分解を促進すると考えられている。
[0025] また、セロビオースデヒドロゲナーゼは強力にセルロースを分解するハイド口キシラ ジカルを発生する Fenton反応を引き起こすため、セルロース分解に深く関与している と考えられている。このことは Dumonceauxらによるセロビオースデヒドロゲナーゼ活性 を抑制した変異株の作製ならびにその諸性質の検討結果によっても示唆されている 。彼らは、抗生物質であるフエロマイシンを指標にした相同組換え法によるセロピオ 一スデヒドロゲナーゼ欠損株の作製を行い、セロビオースデヒドロゲナーゼ欠損株で は非晶性セルロースを炭素源とした場合には野生株と成長速度が変わらないが、結 晶性セルロース上で培養した際には生育速度が著しく遅くなること、セロビオースデヒ ドロゲナーゼ欠損株においても広葉樹未漂白パルプのリグニンや合成リグニンである
C-DHPを野生株と同等に分解することを報告している（非特許文献 20)。
14
[0026] セロビオースデヒドロゲナーゼを生産する微生物としては、ファネロカエテ'クリソス ポリゥム、力ワラタケ、スェヒロタケ（Schizophyllum commune)等の木材腐朽菌、コネオ フオラ-プテアナ (Coneophora puteana)、ミセリオフトラ-テノレモフイラ (Myceliophthora thermophila) ,フミコーラ'インソレンス（Humicola insolens)等のカビ類が知られている
[0027] また、セロビオースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下、セロビオースデヒド ログナーゼ遺伝子と称する）については、例えば、ファネロカエテ 'タリソスポリウムで は、 K3株の cDNA (非特許文献 21)、 OGC101株では cDNA (非特許文献 22)、染色 体遺伝子（非特許文献 23)のクローニングが行われている。また、力ワラタケ (非特許 文献 24)や、シュタケ (非特許文献 25)においてもセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝 子が報告されている。
[0028] また植物繊維の主要構成成分であるへミセルロースも微生物により分解を受け、繊 維成分の収率低下をもたらす。へミセルロースには、キシラン、マンナン、ガラクタン、 ぺクチンなどが知られており、これらを分解する酵素として、エンド 1，4- /3キシラナ一 ゼ、エンド 1,4- /3マンナナーゼ、ぺクチナーゼなどが知られている。キノコもこれらの 酵素を生産することが知られており、例えば白色腐朽菌の 1種である Phanerochaete c hrysosporium力ら 3種類のキシラナーゼ遺伝子がクローニングされ、 Aspergillus niger を宿主として酵素の発現、生産、精製が行われた。これらのうち 2っはグリコシドヒドロ ラーゼファミリー 10で、残りの 1つはファミリー 11に分類されていた（非特許文献 26) また、ヒラタケもキシラナーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼを生産することが報告され ている (非特許文献 27)。
[0029] 機械パルプや化学パルプ製造における微生物処理にあたって、リグニン分解の選 択性を高めた微生物の取得 '作製に必要なァラゲ力ワラタケ由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼをはじめとするセルロース分解酵素やセルロース分解酵素遺伝子の解 明、並びに該遺伝子を用いた遺伝子組換え技術、及びそのような技術によって得ら れる形質転換体を用いた効果的なパルプ処理方法については、特許文献 1及び特 許文献 2に記載されている。
[0030] 一方リグノセルロース材料の糖化は、セルロース成分を取り出した後、酵素による糖 化する方法が環境面、コスト面で注目されている。一般にリグノセルロース材料はセ ルロース、へミセルロース、リグニンから構成されており、リグニン含量が多いリグノセ ルロース材料ほどセルラーゼによるセルロースの加水分解が困難になる。リグニンは へミセルロースと共にセルロースの繊維質を包み込むような形で存在しており、酵素 糖ィ匕では酵素のセルロースへの接触を妨害するため、リグニン含量が多いリグノセル ロース材料の糖化率は低くなる。
[0031] このような問題を改良するため、蒸煮 ·爆砕法等によりリグニンを低分子化する物理 的前処理、セルロース系バイオマスを溶媒やアルカリ等でリグニンを抽出する化学的 前処理 (非特許文献 28)、リグニン分解菌ゃリグニン分解酵素を用いてリグニンを分 解する生物前処理が検討されてレ、る（非特許文献 29)。
[0032] 生物前処理は比較的温和な条件で処理ができ、物理的前処理や化学的前処理よ りも環境への負荷が少なレ、。特許文献 3にはリグノセルロースをセルラーゼ及びリグ二 ン分解菌又はリグニン分解酵素存在下で加水分解することによりセロビオースを効率 的に製造することが記載されてレ、る。
[0033] し力 ながら、この技術で用いられる菌を含め、生物前処理に用いられるリグニン分 解菌の多くは、リグノセルロース材料の分解の際に、リグニンと共にセルロース等リグ ノセルロースの他の成分も消費してしまうため、結果的にリグノセルロース材料の糖化 率を下げてしまう。特許文献 4には、リグニンの分解活性が高ぐさらにリグニン分解 物の逆重合化を起こさない微生物を用いたリグニンの分解が記載されている力 この 菌もまたリグニンと共にセルロース等のリグノセルロース成分も消費してしまうという欠 点、がある。
[0034] Carle-Uriosteら（非特許文献 30)は、糸状菌トリコデルマ'リーセィ（Trichoderma re esei)においてセルロース分解酵素の発現メカニズムを遺伝子の転写レベルで明らか にする目的で、 3種類のセルロース分解酵素 cbhll、 egll、 egl2遺伝子の発現をアンチ センス法で抑制する実験を行った。しかし、これらの酵素遺伝子の発現量は確認され なかったし、また実際に複数のセルロース分解酵素活性の同時抑制が可能であった か否かは示されていなレ、。またこのようなアンチセンス法が、リグノセルロース材料の セルロース分解の抑制に使用することについて、その示唆はなかった。
特許文献 1：国際公開 WO03/070939
特許文献 2：国際公開 WO03/070940
特許文献 3：特開平 8— 89274号公報
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非特許文献 13: Molina, 50th Appita Annual General Conference, pp.57- 63， 1996 非特許文献 14: Molina, 51th Appita Annual General Conference, pp.199- 2061997 非特許文献 15: P. Bajpaiら, J. Pulp and Paper Science: 27 (7), 235-239， 2001 非特許文献 16:Henrissat， Β·， Bairoch, A., Biochem. J., 293， 781, 1993
非特許文献 17:Henrissat， Β·， Cellulose. Commun., 5, 84-90， 1998
非特許文献 18: Erikssonら， FEBS Lett., 49, 282-285, 1974
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非特許文献 20 : Dumonceaux, Enzyme Microb., 29， 478-489, 2001
非特許文献 21: G. Henrikssonら, J. Biotechnol" 78， 93-113, 2000
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非特許文献 22: Liら， Appl. Environ. Microbiol., 62(4), 1329-1335， 1996
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非特許文献 24: T.J. Dumonceauxら， Gene, 210, 211-219, 1998
非特許文献 25:S.M. Moukhaら， Gene, 234, 23-33, 1999
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非特許文献 29: Y. Sun, J. Cheng, Bioresour. Technol., 83， 1-11, 2002
非特許文献 30:Carle-Uriosteら， J. Biol. Chem., 272(15), 10169-10174, 1997 発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0035] リグノセルロース材料力 繊維成分を得る方法、特に紙パルプを製造する方法にお いて、省資源、省エネルギー化を目的に機械パルプ又は化学パルプの製造に先立 ち、リグノセルロース材料を微生物で処理するときに、微生物が生産するセルロース 分解酵素やへミセルロース分解酵素により紙の主成分であるセルロースやへミセルロ ースが分解される結果、繊維成分特にパルプの収率の低下や紙力の低下が生じる ので、これを抑制する必要がある、という課題がある。
[0036] この課題を解決する方法としてリグニン分解能力に優れ、セルロース分解酵素の活 性の低い微生物の作出が求められている。し力しながら微生物のセルロース分解系 は複数のセルロース分解酵素から構成されているため、これらの酵素の活性をより効 果的に抑制するためには、複数の酵素の活性を抑制することが好ましい。すなわち、 そのためには、複数のセルロース分解酵素の活性を同時に抑制した微生物を作出 する必要がある。ァラゲ力ワラタケのようなキノコの形質転換法において、これまで行 われてきた個別の遺伝子を用いて抑制する方法では、複数の酵素の生産を同時に 抑制することは困難であった。また同様の課題はへミセルロースの分解についても存 在するが、へミセルロース分解酵素の抑制は研究されてレ、なレ、。
[0037] このような状況にあって、本発明の目的は、複数のセルロース分解酵素遺伝子およ び/またはへミセルロース分解酵素遺伝子の発現が同時に抑制された、かつリグニン 分解性のある微生物を使用してリグノセルロース材料を処理することを含む、リグノセ ルロース材料の繊維成分から有用物質を製造する方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0038] 上記課題を解決するために、本発明者らは今回、ある種の担子菌が産生するセル ロース分解酵素遺伝子の DNA断片を作製し、プロモーターの下流に複数のセルロー ス分解酵素遺伝子の DNA断片をアンチセンス方向に直列に連結することにより、複 数のセルロース分解酵素遺伝子を同時に抑制する方法、および/または、同様の手 法でへミセルロース分解酵素遺伝子を抑制する方法を開発し、さらに紙パルプ、糖 類、ノ ィォマスエタノールなどの製造を目的として、それらの製造に使用するための 繊維成分をリグノセルロースからセルロース収率を下げずに取り出す方法を確立した [0039] <発明の概要 >
本発明は、以下のものからなる。
[0040] (1) リグノセルロース材料から繊維成分を取り出して該繊維成分から有用物質を製 造する方法にぉレ、て、複数のセルロース分解酵素遺伝子および/または複数のへミ セルロース分解酵素遺伝子の発現が抑制されたかつリグニン分解性のある微生物を 該リグノセルロース材料と接触させること、および該材料力 繊維成分を得ることを含 む上記方法。
[0041] (2) 前記微生物が、複数のセルロース分解酵素遺伝子および/または複数のへミセ ルロース分解酵素遺伝子のうち、少なくとも 4種類の異なる酵素遺伝子の発現が抑制 されているものである、 （1)に記載の方法。
[0042] (3) 前記微生物が、複数のセルロース分解酵素遺伝子および/または複数のへミセ ルロース分解酵素遺伝子のうち、少なくとも 6種類の異なる酵素遺伝子の発現が抑制 されているものである、 （2)に記載の方法。
[0043] (4) 前記微生物が、複数のセルロース分解酵素遺伝子および/または複数のへミセ ルロース分解酵素遺伝子の各転写産物の全部またはその一部に対して相補的なァ ンチセンス DNA断片、あるいは該アンチセンス DNA断片のヌクレオチド配列と 90%以 上の相同性を有するその変異体、の各々を任意の順序で連結した合成 DNA断片を 含む、（1)に記載の方法。
[0044] (5) 前記アンチセンス DNA断片の各々がリンカ一を介して連結されている、（4)に 記載の方法。
[0045] (6) 前記微生物が、前記合成 DNA断片を含む発現ベクターで形質転換されたもの である、 (4)に記載の方法。
[0046] (7) 前記発現ベクターにおいて、前記合成 DNA断片が発現制御配列と作動可能に 連結されている、 （6)に記載の方法。
[0047] (8) 前記複数のセルロース分解酵素遺伝子が、エンドダルカナーゼ、セロビォヒドロ ラーゼ I、セロビォヒドロラーゼ II、およびセロビオースデヒドロゲナーゼ、ならびにそれ らのァイソザィムから選択される酵素をコードしている遺伝子であり、また前記複数の へミセルロース分解酵素遺伝子が、キシラナーゼおよびマンナナーゼ、ならびにそれ らのァイソザィムから選択される酵素をコードしている遺伝子である、 (1)に記載の方 法。
[0048] (9) 前記複数のセルロース分解酵素遺伝子が、エンドダルカナーゼ 61、エンドグノレ カナーゼ 5、エンドグノレカナーゼ 12、セロビォヒドロラーゼ I、セロビォヒドロラーゼ II、お よびセロビオースデヒドロゲナーゼからなる酵素をコードしている遺伝子であり、また 前記複数のへミセルロース分解酵素遺伝子力 キシラナーゼ I、キシラナーゼ II、マン ナナーゼ I、およびマンナナーゼ IIからなる酵素をコードしている遺伝子である、（8)に 記載の方法。
[0049] (10) 前記発現制御配列が、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子もしくはダリセルァ ルデヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの配列である、 (7)に記載の 方法。
[0050] (11) 前記微生物が担子菌である、（1)に記載の方法。
[0051] (12) 前記担子菌が白色腐朽菌である、（11)に記載の方法。
[0052] (13) 前記白色腐朽菌がコリオラス (Coriolus)属である、（12)に記載の方法。
[0053] (14) 前記微生物が、内因性もしくは外因性リグニン分解酵素をコードする DNAまた は cDNAを発現可能な状態で含む、（1)に記載の方法。
[0054] (15) 前記リグニン分解酵素が、マンガンペルォキシダーゼ、リグニンペルォキシダー ゼまたはラッカーゼである、（14)に記載の方法。
[0055] (16) 複数の異なるセルロース分解酵素遺伝子および/または複数の異なるへミセル ロース分解酵素遺伝子の各転写産物の全部またはその一部に対して実質的に相補 的なアンチセンス DNA断片を任意の順序で連結した合成 DNA断片を作製し、該合 成 DNA断片を発現制御配列と作動可能に連結した発現ベクターを作製し、該発現 ベクターで、リグニン分解性のある微生物を形質転換して形質転換微生物を作製し、 セルロース分解性および/またはへミセルロース分解性を抑制した該微生物をリグノ セルロース材料と接触させて該材料中のリグニンを分解し、リグニン分解した該材料 から繊維成分を得ることを含む、（1)に記載の方法。
[0056] (17)前記セルロース分解酵素遺伝子が少なくとも 6種類である、および/または、前記 へミセルロース分解酵素が少なくとも 4種類である、（1)または (16)に記載の方法。
[0057] (18) 前記繊維成分がパルプまたはセルロースである、（1)に記載の方法。
[0058] (19) 前記有用物質が紙パルプである、（1)に記載の方法。
[0059] (20) 前記紙パルプが、前記繊維成分から化学パルプ化法、機械パルプ化法または セミケミカルパルプ化法により製造される、（19)に記載の方法。
[0060] (21) 前記有用物質が糖類である、（1)に記載の方法。
[0061] (22) 前記糖類が、前記繊維成分を酵素により糖化することによって製造される、 (21) に記載の方法。
[0062] (23) 前記酵素がセルラーゼおよびへミセルラーゼである、（22)に記載の方法。
[0063] (24) 前記繊維成分を糖化し、有用物質であるバイオマスエタノールを製造する、 (1 )に記載の方法。
[0064] <定義 >
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
[0065] 「リグノセルロース材料」という用語は、構造性多糖のセルロース及びへミセルロース と芳香族化合物の重合体のリグニンとから構成されるリグノセルロースを多量に含む 植物性材料、例えば木材、ノくガス、牧草 (例えばオーチャードグラス及びチモシ一)な どの材料を意味する。ここでバガスとは、さとうきび力 糖汁を搾ったあとのカスを指す
[0066] 「繊維成分」という用語は、リグノセルロースからリグニンを化学的に除去または機械 的に切断して得られる繊維状成分、具体的にはセルロースまたはパルプ繊維を意味 する。この繊維状成分はセルロースとへミセルロースを主成分とする。
[0067] 「パルプ」という用語は、木材その他の植物から機械的または化学的処理によって抽 出したセルロース繊維の集合体を意味し、製造方法によって機械パルプと化学パル プに、また用途によって製紙パルプと溶解パルプに分類される。
[0068] 「セルロース分解酵素」とレ、う用語は、セルロースを分解する酵素を意味する。
[0069] 「へミセルロース分解酵素」という用語は、へミセルロースを構成する成分を分解す る酵素を意味し、キシラナーゼ、マンナナーゼなどが含まれる。
[0070] 「リグニン分解性のある微生物」という用語は、リグニン分解酵素を含む微生物を指 す。この微生物においては、内因性または外因性のリグニン分解酵素をコードする遺 伝子が、該微生物のゲノム上力、あるいはその細胞内に含まれる自律複製可能なプ ラスミドなどのベクター上に、発現可能に組み込まれている。微生物には、細菌類、 真菌類、担子菌類、酵母類などが含まれる。特に担子菌の 1種である白色腐朽菌は、 リグニン分解酵素であるリグニンペルォキシダーゼを含むことが知られており、好まし い微生物の 1つである。
[0071] 「セルロース分解酵素の発現が抑制されている」という用語は、セルロース分解酵素 遺伝子の発現が抑制されるために、該酵素遺伝子の翻訳が阻害され、結果としてセ ルロース分解酵素の産生が起こらなレ、かまたは起こり難レ、状態を意味する。
[0072] 「へミセルロース分解酵素の発現が抑制されている」という用語は、へミセルロース 分解酵素遺伝子について、セルロース分解酵素と同様の意味で、へミセルロース分 解酵素の産生が起こらなレ、かまたは起こり難レ、状態を意味する。
[0073] 「転写産物」とレ、う用語は、セルロース分解酵素遺伝子をコードする mRNAまたはプ レ mRNAを意味する。ここでプレ mRNAは、スプライシングされる前の mRNA前駆体を 指す。
[0074] 「アンチセンス DNA」という用語は、セルロース分解酵素遺伝子の転写産物である m RNAの全部又はその一部に対して実質的に相補的な配列を含む DNAであって、該 アンチセンス DNAの転写産物であるアンチセンス RNAが細胞内で、それと相補的とな るセルロース分解酵素遺伝子の mRNAと結合し、それによつてセルロース分解酵素遺 伝子の発現を抑制し翻訳を阻害する DNAを意味する。
[0075] 「発現制御配歹' とレ、う用語は、遺伝子の発現を制御する配列を指す。発現制御配 列は例えばプロモーター、ェンハンサー配列などを含み、好ましくはプロモーター配 列である。
発明の効果
[0076] 本発明により、リグニン分解性があるかつセルロースおよび/またはへミセルロース 分解力が抑制された微生物を用いて木材チップを処理し、っレ、でパルプを製造した 際、機械パルプの製造においては収率低下という従来技術の問題点を解消し、エネ ルギ一の削減と同時に紙力強度の向上が可能となる。また化学パルプの製造におい ても収率や紙力強度の低下を抑制することが可能となる。また一方リグノセルロース 材料の糖化にぉレ、て、糖の著しレ、低下を伴わずにリグニンを除去することができるた め、糖の収率向上が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0077] 以下において本発明をさらに具体的に説明するが、本明細書は本願の優先権の 基礎である日本国特許出願 2004-235539号の明細書に記載される内容を包含するも のとする。
[0078] 本発明は、リグノセルロース材料から繊維成分を取り出して有用な物質を製造する 方法において、複数のセルロース分解酵素および/またはへミセルロース分解酵素 の発現が抑制されたかつリグニン分解力のある微生物を該リグノセルロース材料と接 触させること、および該材料力 繊維成分を得ることを含む方法を提供する。
[0079] 本発明の特徴は、リグノセルロース材料力 複数のセルロース分解酵素の発現およ び/またはへミセルロース分解酵素の発現が抑制されたかつリグニン分解力のある微 生物によって予め処理されることにある。これによつて、セルロースおよび/またはへミ セルロースの酵素的分解を抑制もしくは阻害する一方で、リグニンが酵素的に分解さ れる。その結果、セルロースおよび/またはへミセルロースの収率がより向上するとい う利点が達成される。
[0080] <リグニン分解活性をもつ微生物 >
本発明で使用される微生物は、リグニンを分解する酵素を発現可能に含む。リグ二 ン分解酵素の例は、マンガンペルォキシダーゼ、リグニンペルォキシダーゼ、ラッカ ーゼまたはフエノールォキシダーゼである（欧州特許出願公開第 1029922号、 PCT/J P03/02057) oこのような酵素遺伝子は、微生物が固有にもつ天然型遺伝子でもよい し、あるいは微生物が本来もっていないため遺伝子組換え技術によって細胞内に発 現可能に導入された外来性遺伝子であってもよい。
[0081] 天然型遺伝子を含む微生物には、例えば担子菌（Basidiomycetes)、例えば木材腐 朽菌類など、とりわけ白色腐朽菌が含まれる。例えば、白色腐朽菌の 1種であるコリオ ラス (Coriolus)属、例えばァラゲ力ワラタケ (Coriolus hirsutus)など、は固有にリグニン ペルォキシダーゼを有している。本発明で使用可能なァラゲ力ワラタケの菌株は、例 えば独立行政法人製品評価技術基盤機構生物資源遺伝部門 (NBRC；東京、 日本） 力 IFO04917として分譲可能な株、 NTGIII-55株（FERM P-14046)、 OJI—1078株（ FERM BP-4210), NTGIII-55株 (FERM P-14046)などを含む (特開 2004— 173688号 公報、特開平 07— 274958号公報)。またマンガンペルォキシダーゼを産生する微生 物の例は、担子菌の 1種であるファネロカエテ（Phanerochaete)に属する菌、例えばフ ァネロカエテ ·ソルディダ（Phanerochaete sordida)、例えば YK- 624株（ATCC 90872) が含まれる (特開 2002— 069881号公報)。
[0082] 白色腐朽菌の培養は、好気的条件下で振とう培養によって行なうのが好ましい。培 養液の pHは 3〜8であり、さらに好ましくは 4〜6である。培養温度は 10〜45°C、好ま しくは 25〜35°Cである。培養時間は、通常：!〜 10日間、好ましくは 7〜10日間であ る。培地は、通常の菌類のなどに使用される培地を使用できるが、 MnSO、 MnClな
4 2 どのマンガン (Π)イオンを 0.01〜100mM、好ましくは 0.1〜lmMの量で培地に加える 必要がある。培地には、必要に応じて炭素源あるいは窒素源を添加する。炭素源とし ては、グルコース、フルクトース、マルトース、サッカロースなどが含まれる。窒素源に は、肉エキス、ペプトン、ダルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アン モニゥム、酒石酸アンモニゥム塩、尿素、 L—ァスパラギンなどが例示される。さらに 必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩などの無 機塩類や、イノシトール、ビタミン B塩酸塩、ビォチンなどのビタミン類を添カ卩すること
1
ができる。
[0083] リグニン分解酵素遺伝子を生来保有していなレ、か、あるいは該遺伝子を保有して レ、るが該酵素の活性が弱い微生物については、外来性のリグニン分解酵素遺伝子 を発現可能に導入することによって、リグニン分解力のある微生物に変換することが できる。微生物の例は、限定されないが、担子菌、真菌類、酵母類などを含む菌類、 細菌類などを含む。好ましい微生物は、担子菌および真菌類、特に担子菌類、好ま しくは白色腐朽菌である。マンガンペルォキシダーゼ、リグニンペルォキシダーゼ、ラ ッカーゼまたはフエノールォキシダーゼなどのリグニン分解酵素の遺伝子に関する公 知の配列情報を文献や GenBankなどのデータバンクから入手し、その配列に基いて 約 15〜30塩基長のプライマーを作製し、該遺伝子を含む微生物のゲノム DNAを铸型 にしたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を行い、 目的の酵素遺伝子を増幅することができ る。あるいは、周知の方法によって微生物細胞から取得したリグニン分解酵素遺伝子 をコ一ドする mRNAから、または市販のもしくは周知の方法で作製された cDNAライブ ラリー力 、周知の cDNAクローニング法によって該酵素をコードする cDNAを作製す ることができる。得られたゲノム DNAまたは cDNAを、プロモーター、ェンハンサーなど の適する発現制御配列に作動可能に連結した DNA断片を作製し、これをベクターの 適当な制限部位間に適切な方向で揷入する。ベクターはさらに、選択マーカー、複 製開始点、ターミネータ一、リボゾーム結合部位、ポリ Aシグナルなど、必要に応じて ポリリンカ一、を含むことができる。得られた発現ベクターで微生物宿主細胞を形質 転換して、リグニン分解酵素遺伝子を含む微生物を作製することができる。
[0084] 形質転換は、塩化カルシウム/ PEG法、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレク トロポーレシヨン法、プロトプラスト法、スフエロプラスト法、リポフエクシヨン法などの一 般的方法から適宜選択して行うことができる。なお、微生物細胞からのプロトプラスト の形成については、細胞壁分解酵素、例えばリゾチームを微生物と接触させる従来 法で行うことができる。
[0085] リグニン分解酵素の能力を高めるためにセロビォヒドロラーゼほたは II遺伝子プロモ 一ター領域などの異種のプロモーター領域を白色腐朽菌に遺伝子組換え法によつ て導入することもできる（欧州特許出願公開第 1029922号、 PCT/JP03/02057)。
[0086] <セルロースおよび/またはへミセルロース分解活性が抑制されたリグニン分解性微 生物 >
本発明で使用される微生物としては、リグニン分解酵素を含むが、セルロース分解 酵素および/またはへミセルロース分解酵素を含まなレ、かまたはセルロース分解酵素 活性および/またはへミセルロース分解酵素活性が極度に抑制された微生物が好ま しい。しかし、実際にリグノセルロース材料、例えば木材、竹、綿、リンター、トウモロコ シ穂軸、バガス、ビール柏、わら類、もみ殻などの農産廃棄物、あるいは古新聞、雑 誌、段ボール、オフィス古紙、パルプ及び製紙メーカーから排出される廃パルプなど を微生物で処理する場合、環境に有害な作用を及ぼすような微生物の使用が規制さ れている。このため、リグノセルロース材料のリグニン分解に使用可能な微生物として 、上記の方法によってリグニン分解活性を外因的に導入された安全性の保障された 微生物およびリグニン分解活性を内因的に有する安全性の保障された微生物が、本 発明で使用可能な微生物の候補である。このような微生物のなかで、担子菌、とりわ け白色腐朽菌が好ましい。しかし、担子菌類は一般に複数のセルロース分解酵素活 性および/または複数のへミセルロース分解酵素活性を含むため、リグノセルロース 材料を処理する際にセルロースおよび/またはへミセルロースの分解を引き起こし、そ の結果、セルロースおよび/またはへミセルロースの収率を下げるという欠点を有して いる。このために、リグニンの分解力を増強しつつ、かつセルロースおよび/またはへ ミセルロースの分解を極度に抑制した微生物が作製できれば、本発明の目的を達成 できることになる。
[0087] 本発明で使用可能な微生物は、リグニン分解酵素遺伝子を保有する微生物におい て、内因性の複数のセルロース分解酵素および/または複数のへミセルロース分解 酵素の発現が抑制されるように遺伝子操作される。そのような発現抑制のための方法 として、本発明では、内因性のセルロース分解酵素遺伝子および/またはへミセルロ ース分解酵素遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス RNAによる方法が使用さ れる。
[0088] <アンチセンス RNA法 >
セルロース分解酵素遺伝子には、以下のものに限定されないが、エンドダルカナー ゼ（以下、 EGともレ、う）、セロビォヒドロラーゼ 1(以下、 CBH Iともいう)、セロビォヒドロラ ーゼ II (以下、 CBH IIともレ、う)、セロビオースデヒドロゲナーゼ、およびそれらのァイソ ザィムからなる酵素をコードする遺伝子が含まれる。ここでアイソザィムとは、異なる一 次構造をもつが類似の触媒作用を有する酵素群を指す。アイソザィムの例には、ェ ンドグルカナーゼ 61、エンドグルカナーゼ 5、エンドグルカナーゼ 12、エンドグルカナ ーゼ 17、エンドグルカナーゼ 45、エンドグルカナーゼ 9、セロビォヒドロラーゼ Iなどが 含まれる（M. Sandgrenら， J. Mol. Biol. 308: 295-310， 2001) ; A.V. Wymelenbergら， Appl. Environ. Microbiol. 68: 5765-5768， 2002)。
[0089] へミセルロース分解酵素遺伝子には、以下のものに限定されないが、キシラナーゼ 、マンナナーゼおよびそれらのアイソザィムをコードする遺伝子が含まれる。アイソザ ィムの例には、キシラナーゼファミリー 10、ファミリー 11などが含まれる。より具体的に は、へミセルロース分解酵素遺伝子には、例えばキシラナーゼ I、キシラナーゼ II、マ ンナナーゼ I、およびマンナナーゼ IIからなる酵素をコードしている遺伝子などが含ま れる。
[0090] セルロースあるいはへミセルロース分解酵素遺伝子の配列は、文献や GenBank等 のデータバンクなどから入手可能である。例えば、 GenBankからの入手可能な情報と して、エンドグルカナーゼ 61遺伝子は受託番号 AY094489、エンドグルカナーゼ 5遺 伝子は受託番号 AB125597、エンドグルカナーゼ 12遺伝子は受託番号 AAD02275、 セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子は受託番号 AAC50004、セロビォヒドロラーゼ I- 27遺伝子は受託番号 BAD16575、セロビォヒドロラーゼ II遺伝子は受託番号 AAB329 42としてそれぞれ登録された配列情報を利用することができる。
[0091] あるいは、微生物に内在するセルロースあるいはへミセルロース分解酵素遺伝子の 配列が不明の場合には、微生物細胞から公知の手法で作製したゲノムライブラリーも しくは cDNAライブラリ一中の目的の DNAを铸型にして、エンドダルカナーゼ、セロビ ォヒドロラーゼ I、セロビォヒドロラーゼ II、セロビオースデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ 、マンナナーゼの 6種類の酵素遺伝子の公知の配列に基いて作製された順方向お よび逆方向プライマーを用いて PCRを行レ、、遺伝子増幅された目的遺伝子について 、 Sanger法 (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977))などの公知の配列決定法を 用いて酵素遺伝子の配列を決定することができる。
[0092] アンチセンス RNAによる方法としては、複数の内因性セルロースおよび/または複数 のへミセルロース分解酵素遺伝子のすべてまたは一部の発現を同時に抑制するた めに、各遺伝子の転写産物である mRNAの全部またはその一部に対して相補的なァ ンチセンス DNA断片の各々を任意の順序で連結した合成 DNA断片を作製し、微生 物宿主細胞内に導入することを含む。導入された合成 DNA断片の転写産物であるァ ンチセンス RNAが微生物細胞内に存在した場合、相補的となるセルロース分解酵素 遺伝子あるいはへミセルロース分解酵素遺伝子の mRNAと結合し、それによつてセル ロース分解酵素遺伝子および/またはへミセルロース分解酵素遺伝子の発現が抑制 され翻訳が阻害される。 [0093] 連結されるアンチセンス DNA断片間には、リンカ一配列が存在してもよレ、。リンカ一 配列の長さは好ましくは約 20塩基以下、さらに好ましくは約 10塩基以下である力 場 合により 20塩基を超えてもよい。リンカ一配列は、アンチセンス DNA断片同士を連結 するための配列であり、セルロース分解酵素遺伝子あるいはへミセルロース分解酵素 遺伝子の転写の阻害に影響を与えない限り任意に選択可能な配列である。リンカ一 配列の例は、制限酵素認識配列である。制限酵素認識配列は、アンチセンス DNA断 片の切断および連結に好都合な配列であり、任意の制限酵素を認識する配列でよ レヽ。制限酵素認識配列は、例えば BamH I、 EcoR I、 Bgl II、 Hae III、 Hind III、 Hpa I、 Pst Iなどの酵素によって認識される配列でよぐパリンドロームおよび非パリンドロー ムのいずれの配列型もとることができる。
[0094] セルロース分解酵素遺伝子は、セルロースを分解し得る酵素の遺伝子であれば特 に限定されなレ、が、予めリグノセル口ース材料を処理する微生物がもつセル口ース分 解力を抑制する配列をもつものであればいずれのものでもよい。例えば、セロビオー スデヒドロゲナーゼ遺伝子、 CBHI遺伝子、 CBHII遺伝子及び EG遺伝子が好ましい。 また、へミセルロース分解酵素遺伝子は、へミセルロースを分解し得る酵素の遺伝子 であれば特に限定されないが、リグノセルロース材料を前処理する微生物がもつへミ セルロース分解力を抑制する配列をもつものであればいずれのものでもよい。例えば
、キシラナーゼ遺伝子、マンナナーゼ遺伝子が例示される。本発明では、これらの遺 伝子を 2種以上、好ましくは 3種以上、さらに好ましくは 4種以上、特に好ましくは上記 の 4種の他にアイソザィムをコードする遺伝子も含めて 6種以上、組み合わせることに より、セルロースおよび/またはへミセルロース分解性の抑制を強めた株を得ることが できる。
[0095] また、アンチセンス RNAが mRNAと結合して二本鎖を形成し、それが mRNAのタンパ ク質への翻訳を阻害する限り、アンチセンス DNA配列に 1又は複数の、好ましくは 1も しくは数個の、欠失、置換又は付加等の変異が含まれていてもよいし、あるいはアン チセンス DNAは、天然型に対応するアンチセンス DNA配列と比べて約 90%以上、好 ましくは約 95%以上、さらに好ましくは約 98%以上の相同性もしくは同一性を有して レ、てもよい。このような変異は、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット 変異法などの周知の部位特異的突然変異技術（例えば Short protocols In Molecular Biology, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc.)を用いて実施できる。
[0096] 上記の合成 DNA断片を構成する各アンチセンス DNA断片の配列の長さは、本発明 のいずれかのセルロース分解酵素遺伝子および/またはへミセルロース分解酵素遺 伝子の発現を抑制し得る長さであれば適宜設定可能であり、セルロース分解酵素遺 伝子および/またはへミセルロース分解酵素遺伝子のゲノムヌクレオチド配列または 成熟ヌクレオチド配列と等しい長さである必要は必ずしもなぐ該配列の一部、例え ばゲノム上のセルロース分解酵素遺伝子配列の複数のェキソンのうちの 1つのェキソ ン配列、または該ェキソン配列の少なくとも 30塩基 (もしくは塩基対）、少なくとも 50塩 基 (もしくは塩基対）、好ましくは少なくとも 100塩基 (もしくは塩基対）、より好ましくは 少なくとも 200塩基 (もしくは塩基対)からなる断片であってもよい。
[0097] アンチセンス DNAの調製及び該配列を利用する方法については、当業者に公知の 常法に従って実施することができる。具体的には、セルロース分解酵素遺伝子のアン チセンス DNAは、セルロース分解酵素遺伝子の少なくとも 1つのェキソン領域を含む DNAが得られるように PCR法にて増幅を行ったり、セルロース分解酵素遺伝子を適当 な制限酵素で消化して得ることができる。また、セルロース分解酵素遺伝子の cDNA からも取得可能である。 目的の cDNAは cDNAライブラリーを既知の手法で作製した のち、該酵素遺伝子のユニーク配列に基くプライマー対を用いた PCR法によって目 的の cDNAを増幅することができる。さらには、このアンチセンス DNAは、セルロース 分解酵素遺伝子の塩基配列情報 (上記)をもとにして人工的に作られた合成 DNAであ つてもよレ、。上記方法は、へミセルロース分解酵素遺伝子についても同様である。
[0098] PCR法にっレ、ては、具体的には、セルロースまたはへミセルロース分解酵素遺伝子 のゲノム配列（ェキソン配歹 1J、イントロン配歹 IJ、 5'非翻訳領域または 3'非翻訳領域)ま たは cDNA配列に基いて約 15塩基以上、好ましくは約 15〜約 30塩基、さらに好まし くは約 15〜約 25塩基のセンスおよびアンチセンスプライマーを合成し、ゲノム DNAを 鎳型にして PCR反応を行うことによって例えばェキソン領域を含む DNA配列を増幅 することができる。 PCR反応条件については、例えば、 F.S. Ausbelら， Short Protocols in Molecular Biology, 3片及， Aし ompendium of Methods from urrent Protocols in M olecular Biology (1995年)， John Wiley & Sons, Inc.の丄 ΰ早 The Polymerase Chain R eaction"等に記載の条件を使用することができる。 PCRの反応条件は、例えば DNAの 変性（例えば 94°C、 15〜30秒）、プライマーのアニーリング（例えば 55°C、 30秒〜 1分） および伸長反応 (例えば、 72°C、 30秒〜 10分)を 1サイクルとして通常 25〜40サイクノレ である。また PCRには、 Taqポリメラーゼ、 Pf iポリメラーゼなどの市販の耐熱性ポリメラ ーゼが DNA合成酵素として使用される。
[0099] 上記の手法で合成されたアンチセンス DNAの 2種類以上、好ましくは 3種類以上、 さらに好ましくは 4種類以上、特に好ましくは 6種類以上をアンチセンスの方向に結合 する。結合の方法は直接、あるいはリンカ一を介して結合することができる。アンチセ ンス DNAは種々の活性をもつセルロースまたはへミセルロース分解酵素あるいはそ のァイソザィムの遺伝子によってコードされる mRNA配列に相補的な配列を有する。 本発明においては、できる限り多くの種類のアンチセンス DNAを結合することが好ま しぐ 6種類以上、例えば、エンドダルカナーゼ 61、エンドダルカナーゼ 5、エンドダル カナーゼ 12、セロビォヒドロラーゼ I、セロビォヒドロラーゼ II、セロビオースデヒドロゲナ ーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼからなる酵素の mRNAに相補的なアンチセンス D NA類が挙げられる。また各種のアンチセンス DNAの配列の順番は特に制限がなぐ 任意の順番でよいが、セルロース分解活性の高い順番、そしてへミセルロース分解 活性の高い順番に、プロモーターなどの発現制御配列に隣接して 5'側から配置する こともできる。
[0100] アンチセンス RNAが生成され得るように結合するには、発現制御配列例えばプロモ 一ター配列を有する DNA断片の下流にアンチセンスの方向（逆向き方向）にアンチ センス RNAをコードする DNAを結合し、プロモーターの作動により mRNAに転写させ ればよい。得られる mRNAは、上記酵素遺伝子の塩基配列のアンチセンス RNAであ る。
[0101] プロモーターとしては、プロモーターの作用を有する遺伝子断片であれば特に限定 されることなく、あらゆる遺伝子のプロモーターを使用することができる。例えばセロビ オースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、 GPD (グリセルアルデヒド- 3-リン酸 デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、 ras遺伝子プロモーターなどが挙げられる。こ れらのプロモーターは、 GenBankに登録される配列、文献記載の配列等に基づいて 周知のゲノムクローニング、 PCR法、 DNA合成などによって得ることができる。あるい は、寄託されている遺伝子については、分譲請求により入手可能なものを利用するこ とがでさる。
[0102] プロモーター配列を含む遺伝子とセルロース分解酵素遺伝子又は該遺伝子のアン チセンス RNAをコードする DNAは、必要に応じて制限部位の導入、平滑末端化また は付着末端化後、適当な DNAリガーゼを用いて連結することができる。クローニング 、連結反応、 PCR等を含む組換え DNA技術は、例えば、 J. Sambrook et al., Molecula r Cloning, A Laboratory Manual, second Edition,し old Spring Harbor Laooratory P ress, 1989及び F. S. Ausbelら (上記)に記載されるものを利用することができる。
[0103] ベクターの種類は特に限定されないが、このベクターによって形質転換される宿主 の種類に応じて選択される。ベクターとしては、原核または真核生物宿主細胞におい て自律複製可能または染色体中に相同組換え可能なベクターを使用することができ る。ベクターの例は、 pUCベースプラスミド (例えば pUC19)、 pBluescript(Stratagene), YIp5(ATCC 37061)などを含むプラスミド、ファージ、ウィルス、コスミドなどである。ベ クタ一は、選択マーカー、複製開始点、ターミネータ一、ポリリンカ一、ェンハンサー、 リボゾーム結合部位などを適宜含むことができる。細菌、真菌、酵母、動物、植物など の原核および真核生物用の種々のベクターが市販されている力あるいは文献等に 記載されており、これらを利用して本発明のセルロース分解酵素遺伝子類の複数の アンチセンス RNAをコードする連結 DNA又は組換え DNAをベクターに導入することが できる。
[0104] ベクターへの DNA導入は、例えば、 J. Sambrookら（上記）に記載される技術を使用 して実施することができる。例えば、ユニバーサルベクター、ポリリンカ一導入べクタ 一などのベクターを使用することによって、特定の部位に、例えばプロモーター、アン チセンス DNAおよびターミネータ一を含むカセットを該ベクターに組み込むことができ る。なお、アンチセンス RNAをコードする DNA又は組換え DNAをベクターに導入する にあたっては、上述のように、転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンス R NAが生成するように導入する。得られた組換え DNAを環状のまま形質転換に用いる ことも可能である。また他の生物由来の遺伝子を同時に形質転換することを避けるた めに、必要な領域のみを切り出して形質転換に供することも可能である。
[0105] 上記ベクターもしくは DNA断片を用いた形質転換を行レ、、セルロース分解力を抑制 した微生物を調製する。ここで宿主細胞は、担子菌、真菌類、酵母類を含む菌類だ けではな 他の真核細胞（動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、藻類など）や原核細胞 (細菌、藍藻など）であっても、本発明のセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンス R NAをコードする DNAの発現においてプロモーター活性を発揮できるならば、いずれ の宿主細胞も使用可能である。このうち、好ましい宿主細胞は、リグニン分解力を有 する担子菌、更に好ましくは白色腐朽菌、特に好ましくはコリオラス属、例えばァラゲ 力ワラタケである。例えば、具体的には、後述の実施例に記載されているァラゲ力ワラ タケのオノレニチン力ルバモイルトランスフェラーゼ活性を欠損している栄養要求性変 異株 OJI-1078 (FERM BP-4210)などを宿主として使用できる。
[0106] 形質転換法としては、塩ィヒカルシウム/ PEG法、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法 、エレクト口ポーレシヨン法、プロトプラスト法、スフエロプラスト法、リポフエクシヨン法、 ァグロバタテリゥム法などを例示できるが、これらに限定されなレ、。
[0107] <リグノセルロース材料からの繊維成分の製造 >
本発明の実施形態によると、本発明の方法は、少なくとも 4種類の異なるセルロース 分解酵素遺伝子の各転写産物の全部またはその一部に対して実質的に相補的なァ ンチセンス DNA断片を任意の順序で連結した合成 DNA断片を作製し、該合成 DNA 断片を発現制御配列と作動可能に連結した発現ベクターを作製し、該発現ベクター で、リグニン分解性のある微生物を形質転換して形質転換微生物を作製し、セル口 ース分解力を抑制した該微生物を該リグノセルロース材料と接触させて該材料中のリ グニンを分解し、リグニン分解した該材料から繊維成分を得ることを含む。
[0108] もう一つの本発明の実施形態によると、本発明の方法は、少なくとも 1種類の異なる へミセルロース分解酵素遺伝子の各転写産物の全部またはその一部に対して実質 的に相補的な合成アンチセンス DNA断片を作製し、該合成 DNA断片を発現制御配 歹 1Jと作動可能に連結した発現ベクターを作製し、該発現べクタ一で、リグニン分解性 のある微生物を形質転換して形質転換微生物を作製し、へミセルロース分解性を抑 制した該微生物を該リグノセルロース材料と接触させて該材料中のリグニンを分解し 、リグニン分解した該材料力 繊維成分を得ることを含む。
[0109] また、より好ましい実施形態は、上記と同様なアンチセンス法により、 4種以上のセ ルロース分解酵素遺伝子と 1種以上のへミセルロース分解酵素遺伝子の発現を同時 に抑制した形質転換微生物を作製し、セルロース及びへミセルロース分解性を抑制 した該微生物を該リグノセルロース材料と接触させて該材料中のリグニンを分解し、リ グニン分解した該材料から繊維成分を得る方法である。
[0110] 本明細書中で使用される「実質的に」という用語は、アンチセンス 1^八カ¾1^八と結 合して二本鎖を形成し、それカ¾1^八のタンパク質への翻訳を阻害する限り、アンチ センス DNA配列は、天然型に対応する配列と比べて 1もしくは複数の、好ましくは 1も しくは数個の、欠失、置換または付加等の変異が含まれていてもよいこと、あるいは 約 90%以上、約 95%以上もしくは約 98%以上の相同性を有すること、を意味する。 % 相同性 (または％同一性）は、ギャップを導入した配列アラインメント比較により決定さ れ得る全アミノ酸数に対する異なるアミノ酸数のパーセンテージである。％同一性は 、例えば公知の BLASTプログラムを用いて求めることができる。
[0111] 本発明で対象となるリグノセルロース材料は、木材、竹、綿、リンター、トウモロコシ 穂軸、ノくガス、ビール粕、わら類、もみ殻等の農産廃棄物、古新聞、雑誌、段ボール 、オフィス古紙、パルプ及び製紙メーカーから排出する廃パルプ等が挙げられる。本 発明においてはリグニン含量の高い木材および農産廃棄物等において特にその効 果を発揮する。
[0112] 紙の原料となるパルプを紙パルプの製造方法によって取り出す場合、木材を機械 的に 2〜3cm、厚さ約 5mmの大きさに小片化した木材チップが挙げられる。例えばマ ッ、スギ、モミ、トウヒ、ダグラスファー、ラジア一タパイン等の針葉樹及びブナ、カバ、 ハンノキ、力ェデ、ユーカリ、ポプラ、アカシア、ラワン、ゴム等の広葉樹を含む木材か ら得られ、パルプ等の原料として用いることができるものであればいずれの材種のチ ップをも用いることができる。
[0113] リグノセルロース材料はセルロースおよび/またはへミセルロース分解性を抑制した 微生物で処理される。セルロースおよび/またはへミセルロース分解性を抑制した微 生物が十分に生育するのであれば、リグノセルロース材料は前処理なくそのまま用い ることができる力 他の微生物を殺菌する前処理を実施した方がセルロースおよび/ またはへミセルロース分解性を抑制した微生物が生育しやすいのであれば、オートク レーブやスチーミング等により、セルロースおよび/またはへミセルロース材料を予め 処理することが好ましい。
[0114] リグノセルロース材料を、セルロースおよび/またはへミセルロース分解性を抑制し た微生物で処理する温度は 10〜60°Cが好ましぐさらに好ましくは 20〜35°Cである 。リグノセルロース材料中の水分は 20〜80%、好ましくは 30〜50%とするのがよレ、。 接種後リグノセルロース材料への空気供給量はセルロース分解力を抑制した微生物 が十分に生育可能であれば必要ないが、通常、対チップもしくはリグノセルロース材 料容積 1L当たりに供給する空気量は毎分 0.001〜1 L/ (い min) (以下、空気供給量 の単位 L/ (い min)を wmと称する）とするのがよぐ好ましくは、対チップもしくはリグノ セノレロース容積当たり 0.01 wm〜0.1 wmである。
[0115] セルロースおよび/またはへミセルロース分解性を抑制した微生物のリグノセルロー ス材料への接種量は、パルプ収率や紙力を軽減することがない限り、適宜設定する ことができる。例えば白色腐朽菌で処理する場合には、原料表面積 1平方 cm当り 0.0 1〜1,000,000個程度、特に好ましくは 0.1〜1, 000個のコロニーを生ずるように菌体を 噴霧、あるいは滴下し、該菌株の増殖に適した条件、すなわち適当な温度と pHに保 つことが好ましレ、。ァラゲ力ワラタケの場合、 0°C〜40°C、 pH4〜pH8の範囲が好ま しい。
[0116] セルロースおよび/またはへミセルロース分解性を抑制した微生物は、滅菌水ととも に粉砕し、リグノセルロース材料に対して植菌して培養することができる力 リグノセノレ ロース材料に培地を添加して処理してもよレ、。培地は、セルロースおよび/またはへミ セルロース分解力を抑制した微生物が生育できるのであればいずれの培地をも用い ることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、セロビオース、非晶性セルロー ス等を使用することができる。また、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、各種アミ ノ酸、大豆粕、コーンスティープリカ一、各種無機窒素などの窒素化合物を用いること 力 Sできる。さらに、必要に応じて、各種塩類やビタミン、ミネラル等を適宜カ卩えることが できる。
[0117] セルロースおよび/またはへミセルロース分解性を抑制した微生物によって処理し たリグノセルロース材料からは、繊維成分としてパルプまたはセルロース'へミセル口 ースを得ることができる。
[0118] <繊維成分からの有用物質の製造 >
本発明の方法においては、リグノセルロース材料から得られた繊維成分から有用物 質を製造する。繊維成分はセルロースまたはパルプ繊維からなり、本発明の有用物 質として、例えば、パルプ繊維から紙パルプを、またセルロース繊維から単糖類、多 糖類、オリゴ糖類などの糖類を製造することができる。
[0119] <紙パルプの製造 >
上記の方法によって得られた繊維成分は、紙パルプの製造のために使用すること ができる。
[0120] 本発明の微生物による処理を施された木材チップは、その後、機械的な処理による 機械パルプあるいは化学的な処理による化学パルプとして製紙用のパルプ原料とな る。
[0121] 化学パルプィヒ法は、アルカリなどの薬品を用いて化学的に木材繊維からセルロー ス以外の成分を分解'溶出して繊維を取り出す方法である。一方、機械パルプ化法 は、本方法で処理した木材チップを機械的に粉砕して繊維化する方法である。また、 セミケミカルパルプ化法は、機械パルプ化法と化学パルプィヒ法の中間的な方法であ つて、アルカリ薬品によりチップが軟ィ匕する程度まで蒸解した後にリファイナ一で繊維 化する方法である。本発明では、紙パルプの製造において、上記方法のいずれも使 用できる。
[0122] 機械パルプの一例としてはサーモメカニカルパルプ（TMP)、リファイナーグラウン ドパルプ (RGP)、ケミグラウンドパルプ（CGP)などが挙げられる。
[0123] 化学パルプを得るための蒸解法としては、クラフト蒸解、ポリサルファイド蒸解、ソー ダ蒸解、アルカリサルファイト蒸解等の公知の蒸解法を用いることができる力 パルプ 品質、エネルギー効率等を考慮すると、クラフト蒸解法が好適に用いられる。例えば 、木材をクラフト蒸解する場合、クラフト蒸解液の硫化度は 5〜75%、好ましくは 15〜 45%、有効アルカリ添力卩率は絶乾木材質量当たり 5〜30質量％、好ましくは 10〜2 5質量％、蒸解温度は 130〜： 170°Cである。
[0124] クラフト蒸解には、修正連続蒸解法（Modified Continuous Cooking)、拡大修 正連続蒸解法（Extended Modified Continuous Cooking)、全缶等温蒸解法 (Isothermal Cooking)、 Lo— Solids蒸角率法、スーノ ーノ ッテ^角率法、 Compact 蒸解法なども含む。
[0125] 本発明の微生物による処理を施された木材チップから得られる特にサーモメカ二力 ルパルプ（TMP)、リファイナーグラウンドパルプ（RGP)などの機械パルプにぉレ、ては 解繊エネルギーの減少や紙力の増加が認められた。また、クラフトパノレプゃサルファ イトパルプなどの化学パルプの製造においては蒸解性の向上や紙力の増加が得ら れる。
[0126] <糖類の製造 >
上記の方法によって得られた繊維成分は、直接あるいは乾燥させてからその後の 糖ィ匕反応に用いることができる。また、上記の菌処理と糖化反応を同時に行うこともで きる。さらに、物理的前処理および/または化学的前処理を菌処理の前後に施すこ とちできる。
[0127] 糖ィ匕反応においてセルラーゼの添力卩量はバイオマス lgに対し濾紙分解活性で 0.
01〜： 1000単位、特に好ましくは 0. 1〜： 100単位が経済的に効率が高く適している。 本発明で使用するセルラーゼとしては市販のセルラーゼがいずれも使用可能である 、例えば、トリコデノレマ (Tricoderma)属、ァスぺノレギノレス (Aspergillus)属、イノレぺッ クス (Irpex) j¾、セノレ口モナス (し ellulomonas)属、サ1 ~モモノスホフ、丄, hermomonospor a)属、クロストリディウム (Clostridium)属等由来のセルラーゼを使用できる。
[0128] セルラーゼを添カ卩した反応液を約 20〜 60°Cで約 0. 5〜 72時間撹拌あるレ、は静置 することにより、セルロースが加水分解されてセロオリゴ糖およびグルコースへ変換す る。また共存するへミセルロース分解酵素 (別名へミセルラーゼ)によって、へミセル口 ースからキシロオリゴ糖ゃキシロース、マンノース、ァラビノースなどの糖類に分解され る。以上の反応により、原料として用いるバイオマスにも依存する力 ノ ィォマスに存 在する多糖類の糖化率は、セルロース分解性を抑制したリグニン分解菌を用いて前 処理を施すことにより向上させることができる。
[0129] 本発明の方法によって得られる繊維成分はまた、上記のように糖ィ匕したのちアルコ ール (例えば、エタノール)などのバイオマスの原料としても使用できる。すなわち、ァ ルコール発酵菌 (例えば、酵母)の存在下で該繊維成分からの糖を原料にしてアルコ ールを製造することができる。エタノールは、燃料用、工業用および飲料用として、世 界的に需要が高い。
[0130] 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの 具体例に限定されないものとする。
実施例
[0131] [実施例 1]
a)アンチセンス鎖を発現するプロモーターを有するベクタープラスミドの調製 パルプ上でァラゲ力ワラタケを培養したときに酵素活性が高いセロビオースデヒドロ ゲナーゼ遺伝子プロモーター領域の増幅を行うため、ァラゲ力ワラタケのゲノム DNA を铸型にして、 5'- GAGGATCGCAACCGCG -3' (配列番号 1)に示すプライマーと 5' - GTTGCTGACATGGCAC-3' (配列番号 2)に示すプライマーを用いて PCR反応を 行った。得られた約 2.2kbの DNA断片は、 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen社製)を 用いてクローニングを行レ、、 pTACDHPを得た。プロモーター領域において翻訳開始 点の約 800 bp上流に、 Nmlサイトが存在したため、 pTACDHPを制限酵素 Nmlで消化 後、末端平滑化反応を行い、再度ライゲーシヨン反応を行った。このプラスミドは、制 限酵素 BamHI、制限酵素 ^Iで消化後、 pBluescriptll SK+プラスミドを制限酵素 Bam HIならびに制限酵素 1で消化したベクターに導入し、 pCDHPとした。
[0132] さらに pCDHPの下流にマンガンパーォキシダーゼ遺伝子（MnP)のイントロンを含む
3'末端領域 (0.8 kb)を導入するために、ァラゲ力ワラタケ由来 MnP遺伝子を含むブラ スミド pBSMPOGlを鍀型に、 5'— CACCATGGCCTTCCCGACCCTTC—3' (酉己歹 IJ番号 3)に示すプライマーと 5'- GCGGCCGCGGGTACTGTG -3' (配列番号 4)に示すプラ イマ一を用いて、 PCR反応を行った。得られた 0.8 kbの DNA断片は TOPO TA Clonin g Kitを用いてクローニングを行った後、得られたプラスミドを制限酵素 ^Ιと制限酵 素 Notlで消化した後、ァガロースゲル電気泳動により 0.8 kbの DNA断片を回収し、上 記プラスミド pCDHPを制限酵素 Nmlと制限酵素 Neilで消化したベクター PCDHPに導 入し、プラスミド pCDHP-Mnpterとした。
[0133] b)アンチセンス鎖発現プラスミドの調製
エンドグルカナーゼ 'ファミリー 61遺伝子（EG61)の DNA断片を増幅するため、チッ プ上で生育中のァラゲ力ワラタケから作成した cDNAライブラリーを铸型に、 A61NcoI N1： 5 ' -CATGCCATGGGTCATGTTCTCGTCTAC-3 ' (配列番号 5)に示すプライマ 一と A61NcoICl : 5，_CATGCCATGGATTCACCAGCCTTGAGC-3，（配列番号 6)に 示すプライマーを用いて PCRにより増幅し、 430bpの断片を TOPO TA Cloning Kitを 用いてクローニングを行レ、、得られたプラスミドを 5' - GTAAACGACGGCCAG- 3' (配 列番号 7)に示す M13フォワード (-20)プライマーを用いて解析を行い、 pCR-TOPO上 に存在する lacZ遺伝子（ β -ガラタトシダーゼ遺伝子）に対し、センス方向に挿入され ているクローンを選抜し、 pTA-EG61とした。
[0134] 次にセロビォヒドロラーゼ II遺伝子の第三ェクソン領域（620 bp)を増幅するために ゲノム DNAを铸型に、制限酵素サイトを付加した H3-Nco-CBH2F : 5，_cccaagcttCCA TGGATCTACCTGAGC-3， (配列番号 8)に示すプライマーと H2- CBH2R： 5， - gccgtc aacTCACTAGTGGCGAGAC-3 ' (配列番号 9)に示すプライマーを用いて PCRを行 つた。得られた DNA断片は制限酵素 mndiii、制限酵素 Hindiで消化し、挿入断片を 得た。この DNA断片を上記プラスミド pTA_EG61を制限酵素 Hindinならびに制限酵素 Hindiで消化したベクターに導入し、 pTA- CBHII-EG61とした。
[0135] 次にセロビォヒドロラーゼ 1-27遺伝子の第三ェクソン領域（750 bp)を増幅するため 、ゲノム DNAを铸型に、制限酵素サイトを付加した Sacl_CBH27F : 5' _ccgagctcCAAC GTCCTCGGCTG-3， (配列番号 10)に示すプライマーと Xba- Nco_CBH27R： 5， -gctc tagaCCATGGGTAGGTCGAG-3 ' (配列番号 11)に示すプライマーを用いて PCR法 にて増幅した。得られた DNA断片を制限酵素^ I、制限酵素 で消化し、揷入断 片を得た。この DNA断片を上記プラスミド pTA-CBHII-EG61を制限酵素^ I、制限酵 素 1で消化したベクターに導入し、プラスミド pTA_CBHn_EG61_CBHIとした。
[0136] さらに、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子の 630 bpの DNA断片を増幅するため にゲノム DNAを铸型に、制限酵素サイトを付加した Sacl-CDHfl : 5，_ccgagctcTCTTT ACTGGTACCCCAAC-3 ' (配列番号 12)に示すプライマーと Sacl- CDHrl : 5' - ccgag ctcGTTGATCGACGGGTTGTC_3' (配列番号 13)に示すプライマーを用いて PCR法 にて増幅した。得られた DNA断片は制限酵素^ Iで消化し、揷入 DNA断片を得た。 この DNA断片を上記プラスミド pTA-CBHII-EG61_CBHIを^ Iで消化したベクターに 導入し、得られたプラスミドを配列番号 11に示すプライマーと配列番号 12に示すブラ イマ一を用いて PCRを行い約 1.4kbの DNA断片が増幅されるクローンを選抜し、 pTA- CBHII— EG61— CDH—CBHIとした。
[0137] さらに、エンドグルカナーゼ.ファミリー 5遺伝子（EG5)の 500 bpの DNA断片を取得す るため、チップ上で生育しているァラゲ力ワラタケから作成した cDNAライブラリーを铸 型に、 sac-EG5f2： 5， -ccgagctcGGCAGAAGCTTGCCGCTGA_3，（配列番号 14)に示 すプライマーと xho-EG5r2： 5， -ccgctcgagGCCTGCTGCATCTCGCAGA_3，（配列番 号 15)に示すプライマーを用いて PCRを行レ、、 DNA断片を増幅した。得られた DNA断 片は TOPO TA Cloning Kitを用いてクローニングを行い、 M13プライマーによる解析 の結果、 βガラクトシダーゼ遺伝子とセンス方向に挿入されているクローンを pTA-EG 5とした。
[0138] また、エンドグルカナーゼ.ファミリー 12遺伝子（EG12)の 500 bpの DNA断片を取得す るため、チップ上で生育しているァラゲ力ワラタケから作成した cDNAライブラリーを铸 型に xho-EG12fl : 5，-ccgctcgagGAAGAGCTTCACGAACATCCAG- 3' (配列番号 16 )に示すプライマーと Xba— EG12rl : 5，_gctctagaACATGTTTCGTCTCCCTAGTTGA TA-3' (配列番号 17)に示すプライマーを用いて PCR法にて増幅した。得られた断片 は制限酵素 1ならびに制限酵素 1で消化後、上記で得られたプラスミド pTA-E G5を制限酵素 Xi^Iならびに制限酵素 1で消化したベクターに導入し、 pTA-EG5- EG12とした。
[0139] EG5と EG12を含む DNA断片を調製するために kpn- EG5f: 5' - ggggtaccGGCAGAAG CTTGCCGCTGA- 3' (配列番号 18)に示すプライマーと kpn-EG12r: 5' - ggggtaccACA TGTTTCGTCTCCCTAGTTGATA-3' (配列番号 19)に示すプライマーを用いて PCR を行った。得られた DNA断片を制限酵素 Kmiで消化し、両端に Kmiサイトを持つ約 1 kbの断片を得た。この断片を 4種類のセルロース分解酵素遺伝子断片を持つプラスミ ド pTA-CBHII-EG61_CDH-CBHIの CDH遺伝子部位に存在する Kmlサイトに導入し 、 6種の遺伝子断片が同方向に連結した DNA配列をもつプラスミド pTA_CBHII_EG61 - EG5- EG12-CDH- CBHIを調製した。
[0140] 次に CDH遺伝子プロモーター領域を含むプラスミド pCDHP-Mnpterにセルロース分 解酵素遺伝子の DNA断片をアンチセンス方向に揷入する操作を行った。上記プラス ミドから 6種類のセルロース分解関連酵素遺伝子の DNA断片を含む領域を増幅する ため、 H3_Nco-CBH2F： 5 ' -cccaagcttCCATGGATCTACCTGAGC-3 ' (配列番号 20) に示すプライマーと Xba-Nco_CBH27R： 5 ' -gctctagaCCATGGGTAGGTCGAG-3 ' ( 配列番号 21)に示すプライマーを用いて上記プラスミド pTA-CBHII-EG61-EG5-EGl 2-CDH-CBHIを铸型に PCR反応を行い、約 3.4kbの DNA断片を得た。得られた DNA 断片は ^Ιで消化後、 pCDHP-Mnpterのプロモーター領域と Μηρ遺伝子 3 '末端領 域の連結部位の teiサイトにセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターに対 してアンチセンス方向に挿入した。プロモーター領域の下流には順に CBHI_27、 CD H、 EG12、 EG5、 EG61、 CBHII遺伝子断片が連結している（配列番号 34)。以上の操 作により、 CDH遺伝子のプロモーターにより 6種類のセルロース分解酵素遺伝子断片 のアンチセンス RNAが転写される、アンチセンス鎖発現プラスミド pCDHP-T6とした。
[0141] [実施例 2]
ァラゲ力ワラタケの形質転換
a)—核菌糸体培養
直径 6mm前後のガラスビーズを約 30個入れた 500 ml容三角フラスコに SMY培地（シ ユークロース 1 %、麦芽エキス 1 %、酵母エキス 0.4 %) 100 mlを分注して滅菌後、ァラゲ 力ワラタケ OJI-1078株の平板寒天培地から直径 5mmの寒天片をコルクボーラ一で打 ち抜き SMY培地に植菌し、 28 °Cで 7日間静置培養した（前培養）。ただし、菌糸を細 分化するために、 1日に 1〜2回振り混ぜた。次に、 1L容の三角フラスコに SMY培地 2 00 mlを分注し、さらに回転子を入れ、滅菌後、前培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径 3 0 μ πι)で濾集し、全量を植菌し、 28 °Cで培養した。なお、スターラーで 1日 2時間程 度撹拌することにより菌糸を細分化した。この培養を 4日間行った。
[0142] b)プロトプラストの調製 上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径 30 μ πι)で濾集し、浸透圧調節溶液 (0. 5 M MgSO 、 50mlマレイン酸バッファー（pH 5.6) )で洗浄した。次に、湿菌体 100 mg
4
あたり 1 mlの細胞壁分解酵素液に懸濁し、緩やかに振盪しながら 28°Cで 3時間インキ ュペートしてプロトプラストを遊離させた。細胞壁溶解酵素として、次の市販酵素製剤 を組み合わせて使用した。即ち、セルラーゼ 'オノズカ (cellulase ONOZUKA RS) (ャ クルト社製、東京、 日本） 5 mg、ャタラーゼ (Yatalase) (宝酒造社製、京都、 日本） 10 mgを上記浸透圧調節溶液 1 mgに溶解して酵素液として用いた。
[0143] c)プロトプラストの精製
上記酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径 30 μ m)で菌糸断片を除いた後、プロト プラストの回収率を高めるため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロトプラ ストを上記浸透圧調節溶液で 1回洗浄した。得られたプロトプラスト懸濁液を遠心分 離（l,000 X g、 5分間）し、上静を除去し、 4 mlの 1Mシユークロースを含む 20 mM MO PS緩衝液 (pH 6.3)で再懸濁後、遠心操作を繰り返し、上記 1Mシユークロース溶液で 2回洗浄した。沈殿物に 1Mソルビトールを含む 20 mM MES緩衝液 (pH 6.4)に 40 mM 塩化カルシウムを加えた溶液 500 μ ΐに懸濁し、プロトプラスト懸濁液とした。この懸濁 液を 4°Cで保存した。
[0144] プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて、直接検鏡により求めた。すべての遠心 操作はスウィングローターで 1,000 X g、 5分間、室温で行った。
[0145] d)形質転換
約 106個/ 100 μ ΐのプロトプラスト懸濁液 100 μ ΐに対して、実施例 1で作製したプラ スミド PCDHP-T6を制限酵素 BamHIと Notlで切り出し、ァラゲ力ワラタケ DNA部分のみ をァガロースゲルから回収した DNA断片を 2 μ g添加した。さらに選択マーカーとして 、ァラゲ力ワラタケ由来のオノレニチン力ルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持す るプラスミド pUCRl (特開平 6-054691号公報； FERM BP-4201)を制限酵素 Sailで処 理し、ァラゲ力ワラタケ部分のみをァガロースゲルから回収し、 0.2 a g添加し 30分間 氷冷した。次に、液量に対して等量の PEG溶液（50 % PEG 3400を含む 20 mM MOPS 緩衝液 (PH6.4))を加え、 30分間氷冷した。次に、 0.5 Mシユークロースおよびロイシン を含む最小寒天培地 (寒天 1 %)に混合してシャーレに撒いた。上記シャーレを 28 °C で数日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに形質転換体から DNAを調製し、 目 的とするセルロース分解遺伝子のアンチセンス鎖発現プラスミド PCDHP-T6が組み込 まれていることを PCR法により確認した。
[0146] [実施例 3]
セルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体の選抜
前記形質転換法にて単離された形質転換体は酸素漂白後広葉樹パルプ (LOKP) ' ペプトン培地（LOKP 1 %、ポリペプトン 1 %、 KH PO 0.15 %、 MgSO 0.05 %、リン酸で p
2 4 4
H 5.0に調製）を 100 mlずつ含む 300 ml容三角フラスコに植菌し、 28 °C、 120卬 mで 振盪培養した。セロビォヒドロラーゼ I活性、セロビオースデヒドロゲナーゼ活性、 CMC 分解活性を経時的に測定した。その結果、培養 5日目において、セロビォヒドロラー ゼ I活性を 70%、セロビオースデヒドロゲナーゼ活性を 83 %、 CMC分解活性を 83 % 抑制された形質転換体を得ることができた。
[0147] [実施例 4]
セルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体で処理した木材チップからの機械パ ルプの製造
実施例 3により選抜したセルロース分解酵素活性を抑制した形質転換株をポテトデ キストロース寒天培地上で 28 °Cにて培養した後、 4°Cで保存した。このプレートから 直径 5mmのコルクボーラ一で打ち抜いた切片を 5つずつ、グルコース ·ペプトン培地（ グルコース 3 %、ポリペプトン 1 %、 KH PO 0.15 %、 MgSO 0.05 %、リン酸で pH 5.0に調
2 4 4
製）を 100 mlずつ含む 300 ml容三角フラスコに植菌し、 28°C、 100卬 mで 1週間振盪 培養した。培養後、菌体をろ別し、菌体に残存した培地を滅菌水で洗浄した。菌体は 滅菌水と共に、ワーリンダブレンダ一で 45秒間粉砕し、絶乾重量 1 kgのラジア一タパ インチップに対し、菌体の乾燥重量が 5 mgになるように植菌した。植菌後は菌が全体 に行き渡るようによく撹拌した。培養は 28 °Cで通気をしながら 2週間静置培養を行つ た。チップ含水率が 40〜65 %になるように随時飽和水蒸気を通気させた。通気する際 の通気量は対チップ当り、 0.01 wmになるように行った。
[0148] 菌処理後の木材チップをラボ用リファイナー (熊谷理機工業社製、東京、 日本)を用 いて叩解して、カナディアンスタンダードフリーネスを 200 mlとした後、パルプ物理用 試験用手抄きシートの調製は JIS試験法 (P8209)に準拠して、パルプ手抄きシートの 物理試験は Tappi法 T220 om_83に準拠して行った。使用電力量はワットメーター（Hi okidenki model 3133)と積分計（model 3141)を用いた。チップ収率測定は水分を含 んだ木材チップを容器に絶乾重量で 1 kg分取し、処理前後のチップ絶乾重量を測定 し、以下の式を用いてチップ収率を算出した。
[0149] チップ収率 = (処理後の絶乾重量) / (処理前の絶乾重量） X 100
結果を表 1に示す。
[0150] [比較例 1]
ァラゲ力ワラタケ野生株を用いた機械パルプの製造
実施例 4で、セルロース分解酵素活性を抑制した形質転換株の代わりにァラゲカヮ ラタケの野生株を用いた他は、同様の方法で実験を行った。結果を表 1に示す。
[0151] [比較例 2]
菌処理を行なわなレ、チップを用いた機械パルプの製造
実施例 4で、菌を接種することなしに同様に実験を行った。結果を表 1に示す。
[0152] [実施例 5]
セルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体により処理したチップのクラフトパル プの製造
実施例 4に準じてラジア一タパインの代わりにユーカリ材のチップ処理を行った後、 絶乾重量 400 gのチップを測りとりオートクレーブ内で液比 5、硫化度 30 %、有効アル カリ 15 % (Na 0として）となるように蒸解白液を加え、蒸解温度を 150 °Cから 165での 間で蒸解後のカッパ一価が 16になるようにクラフト蒸解を行った。クラフト蒸解終了後 、黒液を分離し、得られたチップを高濃度離解機によって解繊後、濾布で遠心脱水と 水洗浄を 3回繰り返した。次いでスクリーンにより、未蒸解の柏を分離し、遠心脱水し 蒸解未漂白パルプを得た。柏は 105 °Cで乾燥後絶乾重量を測定した。また未漂白パ ルプの一部を採って絶乾重量を測定し、チップからの収率 (精選収率）を求めた。ま たパルプのカッパ一価の測定を、 JIS P 8211に準じて行った。結果を表 2に示した。
[0153] 次にクラフト蒸解して得られたパルプに対して、 NaOHを 2.0質量％添カ卩し、酸素ガ スを注入し、 100 °C、酸素ゲージ圧 0.49 MPa(5 kgん m2)で 60分間処理を行った。 [0154] 続いて得られたパルプを下記に示すように、二酸化塩素処理 (D)—アルカリ抽出 処理 ）一過酸化水素処理 (P)—二酸化塩素処理 (D)の 4段漂白処理を行った。 最初の二酸化塩素処理 (D)は、パルプ濃度が 10質量％となるように調製し、二酸化 塩素を 0.4質量％添カ卩し、 70 °C、 40分間処理を行った。次いで、イオン交換水にて洗 浄、脱水後、パルプ濃度を 10質量％に調製し、苛性ソーダを 1質量％添加し、 70 °C、 90分間のアルカリ抽出処理 (E)を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、 パルプ濃度を 10質量％に調製し、過酸化水素 0.5質量％、苛性ソーダ 0.5質量％を順 次添加し、 70 °C、 120分間の過酸化水素処理（P)を行った。次いで、イオン交換水に て洗浄、脱水後、パルプ濃度を 10 %に調製し、二酸化塩素 0.25質量％を添加し、 70 °C、 180分間二酸化塩素処理 (D)を行った。最後にイオン交換水にて洗浄、脱水後 、JIS P 8123に準じた白色度 86.0 %の漂白パルプを得た。
[0155] 上記で得たパルプ濃度が 4質量％のパルプスラリーをリファイナ一によりフリーネス 力 S410 ml(CSF)となるように叩解した。パルプ物理試験用手抄きシートの調製は JIS試 験法（P8209)に準拠して、パルプ手抄きシートの物理試験は Tappi法 T220 om_83に 準拠して行った。結果を表 2に示す。
[0156] [比較例 3]
ァラゲ力ワラタケ野生株を用レ、たクラフトパルプの製造
実施例 5で、セルロース分解酵素活性を抑制した形質転換株の代わりにァラゲカヮ ラタケの野生株を用いた他は、同様の方法で実験を行った。結果を表 2に示す。
[0157] [比較例 4]
菌処理を行わないチップを用いたクラフトパルプの製造
実施例 5で、菌を接種することなしに同様に実験を行った。結果を表 2に示す。
[0158] [実施例 6]
セルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体によるリグノセルロース材料の処理 ノ ガス 1 gを 121 °Cで 20分間滅菌した後、ポリペプトン 10 g/L、酵母エキス 5 g/L 、 KH PO 1.5 g/L、 MgSO · 7Η Ο 0.5 g/L、チアミン _HC1 2 mg/Lの組成からなる
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培地と、実施例 3で得られた 6種類のセルロース分解関連遺伝子をアンチセンス方向 にタンデムに連結したセルラーゼ活性抑制リグニン分解菌の培養液を 3 ml加え、 30 °Cで 20日間静置した。
[0159] 10日後、バガスに対して 1.5質量0 /0となるように NaOHを加え、 70°C、 60分間処理し た。上記アルカリ抽出後、バガスを蒸留水で洗浄'脱水後、 105 °Cで一晩乾燥させ乾 燥重量から重量減少率を求め、また J. TAPPI 222に準拠してクラソンリグニン量を測 定し、クラソンリグニン減少率を求めた。結果を表 3に示す。
[0160] [比較例 5]
ァラゲ力ワラタケ野生株を用いたリグノセルロース材料の処理効果
実施例 6で、セルラーゼ活性抑制リグニン分解菌の代わりにァラゲ力ワラタケ野生 株を用いた他は同様に実験を行った。結果を表 3に示す。
[0161] [比較例 6]
原料バガスのクラソンリグニン量
実施例 6で、原料のバガスのクラソンリグニン量を測定した。結果を表 3に示す。
[0162] [実施例 7]
セルロース分解活性を抑制した形質転換体で処理したリグノセルロース材料の糖化 実施例 6で得られたアルカリ抽出後のリグノセルロース材料を 100 mlの酢酸緩衝液 ( pH 4)にカロえ、 0.5 gの市販のセルラーゼ（Trichoderma longibrachiatum起源）を添カロ して 50 °Cで 48時間攪拌することにより、リグノセルロース材料に含まれるセルロースを 糖化した。糖化後濾別し、濾液中の全糖濃度（グルコース換算）をフエノール硫酸法 により測定した。原料バガス 1 gからの収率を計算し、結果を表 4に示す。
[0163] [比較例 7]
ァラゲ力ワラタケ野生株で処理したリグノセルロース材料の糖ィ匕
実施例 7で、セルロース分解活性を抑制した形質転換体の代わりにァラゲ力ワラタ ケ野生株を用いた他は同様に実験を行った。結果を表 4に示す。
[0164] [比較例 8]
菌処理を行なわない場合のリグノセルロース材料の糖化
実施例 6， 7で、菌を接種せずに、実施例 6と同様の培地を加えて静置、アルカリ抽 出し、実施例 7と同様に糖化した。結果を表 4に示す。
[0165] [実施例 8] へミセルロース分解酵素遺伝子アンチセンス鎖発現プラスミドの調製 へミセルロース分解に関与するァラゲ力ワラタケのキシラナーゼ遺伝子 1の DNA断片 を増幅するため、木材チップ上で生育中のァラゲ力ワラタケから作成した cDNAライブ ラリーを铸型に、 chxynl-N: 5， -GGTCGAGGGTCTAGGCCC-3' (配列番号 22)に示 すプライマーと chxynl- C: 5， -GGCTCCTTGACCTCACGG-3' (配列番号 23)に示 すプライマーを用いて PCRにより増幅し、 450bpの断片を TOPO TA Cloning Kitを用 いてクローニングを行レ、、得られたプラスミドを配列番号 7に示す M13フォワード (-20) プライマーを用いて解析を行い、 pCR-TOPO上に存在する lacZ遺伝子（ -ガラタト シダーゼ遺伝子）に対し、センス方向に挿入されているクローンを選抜し、 pTA-Xynl とした。
[0166] 次に、ァラゲ力ワラタケのキシラナーゼ遺伝子 2の DNA断片を増幅するために、上記 c DNAライブラリーから制限酵素サイトを付加した kpn-chxyn2-N: 5' _CATGGTACCG CTGTCGCGGTCTGGGG- 3，（配列番号 24)に示すプライマーと bam- chxyn2- C: 5，- CATGGATCCGCCGAGACCCAGGACGG-3 ' (配列番号 25)に示すプライマーを用 いて PCRにより増幅し、 480bpの断片を得た。得られた DNA断片を制限酵素 Kpnlと Ba mHIで消化し、挿入断片を得た。この DNA断片を上記プラスミド pTA-Xynlを制限酵 素 Kpnlと制限酵素 BamHIで消化したベクターに導入し、プラスミド pTA_Xyn2_Xynlを 得た。
[0167] さらに、ァラゲ力ワラタケのマンナナーゼ 1遺伝子の DNA断片を増幅するために、上 記 cDNAライブラリーから制限酵素サイトを付加した EV-Manl_N: 5 ' -CATGGATATC CAATGGGATCAGGAGCC-3 ' (配列番号 26)に示すプライマーと Xh-Manl- C: 5' - CATGCTCGAGGCCACCATACCCGACCC-3 ' (配列番号 27)に示すプライマーを 用いて PCRを行レ、、約 400bpの DNA断片を得た。得られた DNA断片は制限酵素 EcoR V、ならびに Xholにて消化し、揷入断片とした。この DNA断片を上記プラスミド pTA- X yn2-Xynlを制限酵素 EcoRV，ならびに Xholで消化したベクターに導入し、プラスミド p TA-Xyn2-Xyn 1 -Man 1を得た。
[0168] また、ァラゲ力ワラタケのマンナナーゼ 2遺伝子の DNA断片を増幅するために、上記 c DNAライブラリーから制限酵素サイトを付加した Xh-Man2-N: 5' _CATGCTCGAGCG CCCCAGAGTGGGGAC-3 ' (配列番号 28)に示すプライマーと Xb_Man2_C: 5，_CA TGTCTAGAGTTGGCCTTTGCCGCGG-3 ' (配列番号 29)に示すプライマーを用レヽ て PCRを行レ、、約 500bpの DNA断片を得た。得られた断片は制限酵素 XhoI、ならび に Xbalにて消ィ匕し、揷入断片とした。この DNA断片を上記プラスミド pTA_Xyn2-Xynl - Manlを制限酵素 XhoI、ならびに Xbalで消化したベクターに導入し、 4種のへミセル ロース分解遺伝子断片が同方向に連結した DNA配列をもつプラスミド pTA-Xyn2- Xy nl- Manl-Man2を得た。
[0169] 次に CDH遺伝子プロモーター領域を含むプラスミド pCDHP-Mnpterにへミセルロース 分解酵素遺伝子の DNA断片をアンチセンス方向に挿入する操作を行った。上記ブラ スミドから 4種類のへミセルロース分解関連酵素遺伝子の DNA断片を含む領域を増 幅するため、 Not- HT4- N: 5 ' -CATGGCGGCCGCCGCCCCAGAGTGGGGAC-3 ' ( 配列番号 30)に示すプライマーと Not-HT4-C: 5 ' -CATGGCGGCCGGTTGGCCTT TGCCGCGG-3' (配列番号 31)に示すプライマーを用いて上記プラスミド pTA- Xyn2 -Xynl-Manl-Man2を铸型に PCR反応を行い、約 1.9kbの DNA断片を得た。得られた DNA断片は で消化後、 pCDHP-Mnpterのプロモーター領域と Mnp遺伝子 3'末 端領域の連結部位の サイトにセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター に対してアンチセンス方向に挿入されているクローンを選抜した。以上の操作により プロモーター領域の下流には順に Man2、 Manl, Xynl、 Xyn2遺伝子断片が連結して いる。これにより、 CDH遺伝子プロモーターにより 4種類のへミセルロース分解酵素遺 伝子断片のアンチセンス RNAが転写される、アンチセンス鎖発現プラスミド pCDHP_H CT4とした。
[0170] [実施例 9]
ァラゲ力ワラタケの形質転換
実施例 2に準じてァラゲ力ワラタケにへミセルロース分解酵素遺伝子アンチセンス鎖 発現遺伝子を用いて形質転換を行い、 目的とする抑制遺伝子 PCDHP-HCT4が組み 込まれていることを PCR法により確認した。
[0171] [実施例 10]
へミセルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体の選抜 実施例 9にて単離された形質転換体は実施例 3に準じて培養を行い、 30 °C、 120 r pmで振盪培養し、経時的にサンプリングを行レ、、キシラナーゼ活性ならびにマンナナ ーゼ活性を測定した。酵素活性はクェン酸ナトリウム緩衝液 (pH 4.5)を用いて行った 。エンド- β -1，4_D-キシラナーゼ活性はシグマ社製カバキシランを 1%となるように溶 解し、 50°Cで 5分間反応させることにより遊離する還元糖量を DNS法を用いて測定し た。また、またエンド- j3 _l,4-D -マンナナーゼ活性は 0.5%イナゴマメガラタトマンナ ン溶液中、 50°Cで 5分間反応させ、遊離する還元糖量を DNS法により測定した。その 結果、培養 5日目において、上記で得られた形質転換株のキシラナーゼ活性は宿主 細胞に比べ 40%まで、またマンナナーゼ活性にっレ、ては 20%まで抑制された。
[0172] [実施例 11]
へミセルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体で処理した木材チップからの機 械パルプの製造
実施例 10により選抜したへミセルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体を実 施例 4に準じて菌処理を行い、機械パルプを製造した。結果を表 1に示す。
[0173] [実施例 12]
へミセルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体により処理したチップのクラフト パルプの製造
実施例 9により選抜した形質転換体を用いて、実施例 5に準じてユーカリ材のチッ プ処理を行い、クラフトパノレプを調製し、パルプ収率や物理的影響について評価した 。結果を表 2に示す。
[0174] [実施例 13]
へミセルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体によるリグノセルロース材料の処 理
実施例 9により得られた形質転換体を用いて、実施例 6に準じてリグノセルロース材 料としてバガスに対して菌処理を行レ、、クラソンリグニン量を測定し、クラソンリグニン 減少率を求めた。結果を表 3に示す。
[0175] [実施例 14]
へミセルロース分解活性を抑制した形質転換体で処理したリグノセルロースの糖化 実施例 13で得られたアルカリ抽出後のリグノセルロース材料を実施例 7に準じた方 法で市販のセルラーゼ製剤で酵素処理し、リグノセルロースを糖化した。結果を表 4 に示す。
[0176] [実施例 15]
セルロース分解酵素遺伝子ならびにへミセルロース分解酵素遺伝子を含むアンチセ ンス鎖発現プラスミドの作製
キシラナーゼ 1遺伝子（Xynl)の 450 bpの DNA断片を取得するため、チップ上で生 育しているァラゲ力ワラタケから作成した cDNAライブラリーを铸型に、配列番号 22に 示すプライマーと配列番号 23に示すプライマーを用いて PCRを行い、 DNA断片を増 幅した。得られた DNA断片は TOPO TA Cloning Kitを用いてクローニングを行い、 M 13プライマーによる解析の結果、 βガラクトシダーゼ遺伝子とセンス方向に挿入され ているクローンを pTA-Xynlとした。
[0177] また、マンナナーゼ 2遺伝子（Man2)の 500 bpの DNA断片を取得するため、チップ上 で生育しているァラゲ力ワラタケから作成した cDNAライブラリーを铸型に配列番号 28 に示すプライマーと配列番号 29に示すプライマーを用いて PCR法にて増幅した。得 られた断片は制限酵素 1ならびに制限酵素 ¾1で消化後、上記で得られたプラス ミド PTA-EG5を制限酵素 1ならびに制限酵素 1で消化したベクターに導入し、 p TA-Xynl- Man2とした。
[0178] ここで Xynlと Man2を含む DNA断片を調製するために kpn- Xynlf: 5' - ggggtaccGTCG AGGGTCTAGGCCC-3' (配列番号 32)に示すプライマーと kpn- Man2r : 5，- ggggtacc GTTGGCCTTTGCCGCGG-3 ' (配列番号 33)に示すプライマーを用いて pTA-Xynl _Man2に対して PCRを行った。得られた DNA断片を制限酵素 Kpnlにて消化し、両末 端に Kpnlサイトを有する約 lkbpの断片を得た。この DNA断片を 4種類のセルロース分 解酵素遺伝子断片を持つプラスミド PTA-CBHII-EG61-CDH-CBHIの CDH遺伝子部 位に存在する Kpnlサイトに導入し、 6種の DNA断片が同方向に連結されたプラスミド p TA-CBHII-FG61-Xynl-Man2- CDH-CBHIを調製した。
[0179] 次に CDH遺伝子プロモーター領域を含むプラスミド pCDHP-Mnpterにセルロースな らびにへミセルロース分解酵素遺伝子の DNA断片をアンチセンス方向に挿入する操 作を行った。上記プラスミドから 6種類の酵素遺伝子の DNA断片を含む領域を増幅 するため、配列番号 20に示すプライマーと配列番号 21に示すプライマーを用いて上 記プラスミド PTA-CBHII-EG61- Xynl-Man2- CDH-CBHIを鎳型に PCR反応を行レヽ、 約 3.4kbの DNA断片を得た。得られた DNA断片は Nmlで消化後、 pCDHP-Mnpterの プロモーター領域と Mnp遺伝子 3'末端領域の連結部位の Nmlサイトにセロビオース デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターに対してアンチセンス方向に揷入した。プロモ 一ター領域の下流には順に CBHI-27、 CDH、 EG12、 Xynl、 Man2、 CBHII遺伝子断 片が連結している。以上の操作により、 CDH遺伝子のプロモーターにより 6種類のセ ルロースならびにへミセルロース分解酵素遺伝子断片のアンチセンス RNAが転写さ れる、アンチセンス鎖発現プラスミド PCDHP-MT6とした。
[0180] [実施例 16]
抑制遺伝子の存在確認
実施例 2に準じて実施例 15で作製したセルロース分解酵素遺伝子ならびにへミセ ルロース分解酵素遺伝子が一本の転写産物として生産されるアンチセンス鎖発現遺 伝子を用いて形質転換を行い、 目的とする抑制遺伝子 PCDHP-MT4が組み込まれて レ、ることを PCR法により確認した。
[0181] [実施例 17]
セルロースならびにへミセルロースの分解酵素活性を抑制した形質転換体の選抜 実施例 3および実施例 10に示す方法に準じて、セルロース分解酵素ならびにへミセ ルロース分解酵素を経時的に測定した。
[0182] [実施例 18]
セルロースならびにへミセルロースの分解酵素活性を抑制した形質転換体で処理し た木材チップからの機械パルプの製造
実施例 17により選抜したセルラー巣分解酵素活性ならびにへミセルロース分解酵 素活性を抑制した形質転換体を実施例 4に準じて菌処理を行い、機械パルプを製造 した。結果を表 1に示す。
[0183] [実施例 19]
セルロースならびにへミセルロースの分解酵素活性を抑制した形質転換体で処理し た木材チップからのクラフトパルプの製造
実施例 17により選抜した形質転換体を用いて、実施例 5に準じてユーカリ材のチッ プ処理を行い、クラフトパノレプを調製し、パルプ収率や物理的影響について評価した 。結果を表 2に示す。
[0184] [実施例 20]
セルロース分解酵素活性ならびにへミセルロース分解酵素活性を抑制した形質転換 体によるリグノセルロース材料の処理
実施 17により得られた形質転換体を用いて、実施例 6に準じてリグノセルロース材 料としてバガスに対して菌処理を行い、クラソンリグニン量を測定し、クラソンリグニン 減少率を求めた。結果を表 3に示す。
[0185] [実施例 21]
セルロース分解酵素活性ならびにへミセルロース分解活性を抑制した形質転換体で 処理したリグノセルロースの糖化
実施例 20で得られたアルカリ抽出後のリグノセルロース材料を実施例 7に準じた方 法で市販のセルラーゼ製剤で酵素処理し、リグノセルロースを糖化した。結果を表 4 に示す。
[0186] 上記実施例の結果を以下に示す。
1]
Figure imgf000044_0001
表 1に示すようにセルロース分解酵素活性やへミセルロース分解酵素活性を抑制し た実施例 4、 11および 18の形質転換株は比較例 2の菌処理しない場合に比べて解繊 エネルギーを削減できた。比較例 1の野性株は比較例 2の菌処理をしなレ、場合と比 ベると解繊エネルギーは削減できるが、チップ収率も紙力（比引裂強さと比破裂強さ） も共に低下が大きかった。実施例 4、 11および 18の形質転換株は比較例 1に示す野 性株に比べて収率の減少を改善することができ、また、引き裂き強さ、破裂強さ共に 比較例 1の野性株より改善することができた。
[表 2]
Figure imgf000045_0001
表 2で示すように、形質転換体で処理した木材チップ（実施例 5、実施例 12、実施 例 19)、野性株で処理した木材チップ (比較例 3)をカッパ一価 16となるように蒸解し た際のパルプの精選収率は菌処理しなかった場合（比較例 4)に比べて、いずれも増 加し、粕率は減少した。また、いずれの菌処理 (実施例 5、実施例 12、実施例 19、比 較例 3)でも、処理しない場合 (比較例 4)に比べて、 目標フリーネスが 410 mlに達する までの PFIミルによる叩解の回転数を削減できた。
[表 3]
Figure imgf000045_0002
表 3の結果より、形質転換体で処理したバガス（実施例 6、実施例 13、実施例 20) の重量減少率は野性株（比較例 5)よりも最大で約 10%改善されてレ、た。また、リグ二 ンの減少率と重量減少率との比（LZW)の値は、セルロース分解活性を抑制した形 質転換体（実施例 6、実施例 13、実施例 20)の方が野性株（比較例 5)の L/Wの値 より高まっており、リグニン分解の選択性が高まっていた。
[表 4]
Figure imgf000046_0001
[0190] 表 4の結果より、野性株や形質転換体で処理したバガスを市販の糖化酵素で処理 して得た糖の収率（実施例 7、実施例 14、実施例 21、比較例 7)は菌処理しない場合 (比較例 8)に比べて向上していた。セルロース分解酵素活性ならびにへミセルロース 分解酵素活性を抑制した形質転換体で処理したバガスからの糖の収率（実施例 7、 実施例 14、実施例 21)は野性株処理バガスからの糖収率（比較例 7)より最大 7%収 率が向上していた。
産業上の利用可能性
[0191] 本発明により得られたリグニン分解菌のセルロース分解酵素活性および/またはへ ミセルロース分解酵素活性を抑制した形質転換体を用いて木材チップに接種し、通 気、保温することにより、パルプの収率低下や紙力の低下の少ない方法で、木材中 のリグニンを分解し、機械パルプの製造工程では、大量に電力エネルギーを消費す る叩解エネルギーを削減することが収率低下を伴わずにできる。また、化学パルプの 製造工程では、蒸解性の向上と収率増加が可能となり、紙パルプ製造工程上有利な 方法を提供するものである。
[0192] またリグノセルロース材料から糖類を製造し、糖類を発酵原料として燃料用アルコ ールゃ乳酸などの化成品原料を製造する際に、糖化を阻害するリグニンをリグニン 分解微生物により除去することにより、糖ィ匕の効率を高め、セルロース分解酵素活性 および/またはへミセルロース分解酵素活性を抑制することによって、糖類の収率を 高めることが可能となる。
[0193] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト 配列番号 1:プライマ 配列番号 2:プライマ 配列番号 3:プライマ 配列番号 4:プライマ 配列番号 5:プライマ 配列番号 6:プライマ 配列番号 7:プライマ 配列番号 8:プライマ 配列番号 9:プライマ 配列番号 10 プライマ 配列番号 11 プライマ 配列番号 12 プライマ 配列番号 13 プライマ 配列番号 14 プライマ 配列番号 15 プライマ 配列番号 16 プライマ 配列番号 17 プライマ 配列番号 18 プライマ 配列番号 19 プライマ 配列番号 20 プライマ 配列番号 21 プライマ 配列番号 22 プライマ 配列番号 23 プライマ 配列番号 24 プライマ 配列番号 25 プライマ 配列番号 26 プライマ 配列番号 27:プライマー 配列番号 28:プライマー 配列番号 29:プライマー 配列番号 30:プライマー 配列番号 31:プライマー 配列番号 32:プライマー 配列番号 33:プライマー 配列番号 34：アンチセンス DNA

Claims

請求の範囲
[1] リグノセルロース材料から繊維成分を取り出して該繊維成分から有用物質を製造す る方法にぉレ、て、複数のセルロース分解酵素遺伝子および/または複数のへミセルロ ース分解酵素遺伝子の発現が抑制されたかつリグニン分解性のある微生物を該リグ ノセルロース材料と接触させること、および該材料から繊維成分を得ることを含む上 記方法。
[2] 前記微生物が、複数のセルロース分解酵素遺伝子および/または複数のへミセル ロース分解酵素遺伝子のうち、少なくとも 4種類の異なる酵素遺伝子の発現が抑制さ れているものである、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記微生物が、複数のセルロース分解酵素遺伝子および/または複数のへミセル ロース分解酵素遺伝子のうち、少なくとも 6種類の異なる酵素遺伝子の発現が抑制さ れているものである、請求項 2に記載の方法。
[4] 前記微生物が、複数のセルロース分解酵素遺伝子および/または複数のへミセル ロース分解酵素遺伝子の各転写産物の全部またはその一部に対して相補的なアン チセンス DNA断片、あるいは該アンチセンス DNA断片のヌクレオチド配列と 90%以上 の相同性を有するその変異体、の各々を任意の順序で連結した合成 DNA断片を含 む、請求項 1に記載の方法。
[5] 前記アンチセンス DNA断片の各々がリンカ一を介して連結されている、請求項 4に 記載の方法。
[6] 前記微生物が、前記合成 DNA断片を含む発現ベクターで形質転換されたものであ る、請求項 4に記載の方法。
[7] 前記発現ベクターにおいて、前記合成 DNA断片が発現制御配列と作動可能に連 結されている、請求項 6に記載の方法。
[8] 前記複数のセルロース分解酵素遺伝子力 エンドグノレカナーゼ、セロビォヒドロラ ーゼ I、セロビォヒドロラーゼ II、およびセロビオースデヒドロゲナーゼ、ならびにそれら のァイソザィムから選択される酵素をコードしている遺伝子であり、また前記複数のへ ミセルロース分解酵素遺伝子が、キシラナーゼおよびマンナナーゼ、ならびにそれら のァイソザィムから選択される酵素をコードしてレ、る遺伝子である、請求項 1に記載の 方法。
[9] 前記複数のセルロース分解酵素遺伝子力 エンドグノレカナーゼ 61、エンドダルカナ ーゼ 5、エンドグルカナーゼ 12、セロビォヒドロラーゼ I、セロビォヒドロラーゼ II、および セロビオースデヒドロゲナーゼからなる酵素をコードしている遺伝子であり、また前記 複数のへミセルロース分解酵素遺伝子が、キシラナーゼ I、キシラナーゼ II、マンナナ ーゼ I、およびマンナナーゼ IIからなる酵素をコードしている遺伝子である、請求項 8 に記載の方法。
[10] 前記発現制御配列が、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子もしくはダリセルアル デヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの配列である、請求項 7に記載 の方法。
[11] 前記微生物が担子菌である、請求項 1に記載の方法。
[12] 前記担子菌が白色腐朽菌である、請求項 11に記載の方法。
[13] 前記白色腐朽菌がコリオラス (Coriolus)属である、請求項 12に記載の方法。
[14] 前記微生物が、内因性もしくは外因性リグニン分解酵素をコードする DNAまたは cD
NAを発現可能な状態で含む、請求項 1に記載の方法。
[15] 前記リグニン分解酵素が、マンガンペルォキシダーゼ、リグニンペルォキシダーゼ またはラッカーゼである、請求項 14に記載の方法。
[16] 複数の異なるセルロース分解酵素遺伝子および/または複数の異なるへミセルロー ス分解酵素遺伝子の各転写産物の全部またはその一部に対して実質的に相補的な アンチセンス DNA断片を任意の順序で連結した合成 DNA断片を作製し、該合成 DN A断片を発現制御配列と作動可能に連結した発現ベクターを作製し、該発現べクタ 一で、リグニン分解性のある微生物を形質転換して形質転換微生物を作製し、セル ロース分解性および/またはへミセルロース分解性を抑制した該微生物をリグノセル ロース材料と接触させて該材料中のリグニンを分解し、リグニン分解した該材料から 繊維成分を得ることを含む、請求項 1に記載の方法。
[17] 前記セルロース分解酵素遺伝子が少なくとも 6種類である、および/または、前記へミ セルロース分解酵素が少なくとも 4種類である、請求項 1または 16に記載の方法。
[18] 前記繊維成分がパルプまたはセルロースである、請求項 1に記載の方法。 前記有用物質が紙パルプである、請求項 1に記載の方法。
前記紙パルプが、前記繊維成分から化学パルプ化法、機械パルプ化法またはセミ ケミカルパルプ化法により製造される、請求項 19に記載の方法。
前記有用物質が糖類である、請求項 1に記載の方法。
前記糖類が、前記繊維成分を酵素により糖化することによって製造される、請求項 2 1に記載の方法。
前記酵素がセルラーゼおよびへミセルラーゼである、請求項 22に記載の方法。 前記繊維成分を糖化し、有用物質であるバイオマスエタノールを製造する、請求項 1に記載の方法。
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