EA031865B1

EA031865B1 - Способ и устройство для ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров

Info

Publication number: EA031865B1
Application number: EA201691992A
Authority: EA
Inventors: Бертус Нордам; Михаэл Петрус Йозеф Беркхаут; Йосеф Йоханнес Мария Хофместер
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2019-03-29
Also published as: BR112016021866A2; EA201691992A1; KR20160143714A; US10087475B2; MY171571A; AU2015202952A1; CA2942989A1; WO2015075277A1; UA119867C2; MX2016012798A; CN106164284A; EP3126510A1; AU2015202952B2; US20190345525A1; US20170183698A1; JP2017512467A

Abstract

Изобретение относится к способу приготовления сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающему следующие этапы: (а) необязательно, предварительной обработки лигноцеллюлозного материала; (b) необязательно, промывания необязательно подвергнутого предварительной обработке лигноцеллюлозного материала; (c) ферментативного гидролиза необязательно промытого и/или необязательно подвергнутого предварительной обработке лигноцеллюлозного материала в гидролитическом реакторе с применением ферментной композиции, содержащей по меньшей мере две целлюлазы; и (d) необязательно, извлечения сахарного продукта; где во время ферментативного гидролиза кислородсодержащий газ добавляют в лигноцеллюлозный материал в гидролитический реактор, и где часть кислородсодержащего газа, добавленного к лигноцеллюлозному материалу, является газом, происходящим из свободного пространства реактора, предпочтительно в часть времени ферментативного гидролиза меньше кислорода добавляют в лигноцеллюлозный материал по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза или предпочтительно в часть времени ферментативного гидролиза не добавляют кислород в лигноцеллюлозный материал.

Description

Изобретение относится к устройству и способу для ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров.

Предшествующий уровень техники

Лигноцеллюлозный растительный материал, также называемый сырьевым материалом, является возобновляемым источником энергии в форме сахаров, которые можно превратить в ценные продукты, например сахара или биотопливо, такое как биоэтанол. Во время этого процесса (лигно- или геми-)целлюлоза, присутствующая в исходном сырье, таком как пшеничная солома, кукурузная солома, рисовая шелуха и т.д., превращается в восстанавливающие сахара посредством (геми)целлюлолитических ферментов, которые затем при желании превращаются в ценные продукты, такие как этанол, посредством таких микроорганизмов, как дрожжи, бактерии и грибы.

Поскольку (геми)целлюлоза является кристаллической и заключена в сеть лигнина, превращение в восстанавливающие сахара является в целом медленным и неполным. Как правило, ферментативный гидролиз необработанного сырьевого материала дает меньше 20% от теоретического количества сахаров. При использовании химической и термофизической предварительной обработки (геми)целлюлоза становится более доступной для (геми)целлюлолитических ферментов и, таким образом, превращения проходят быстрее и с более высоким выходом.

Типичный выход этанола из глюкозы, полученной из предварительно обработанной кукурузной соломы, составляет 40 галлонов этанола на 1000 кг сухой кукурузной соломы (Badger, P., Ethanol from cellulose: a general review, Trends in new crops and new uses, 2002, J. Janick and A. Whipkey (eds.) ASHS Press, Alexandria, VA) (Этанол из целлюлозы: общий обзор; направления в новых сельскохозяйственных культурах и новых видах применения)) или 0,3 г этанола на 1 г сырьевого материала. Максимальный выход этанола на основе целлюлозы составляет примерно 90%.

Целлюлолитические ферменты, большинство из которых вырабатываются такими видами, как Trichoderma, Humicola и Aspergillus, применяются в промышленности для превращения предварительно обработанного сырьевого материала в затор, содержащий нерастворимую (геми)целлюлозу, восстанавливающие сахара, полученные из нее, и лигнин. Термостабильные целлюлолитические ферменты, полученные из Rasamsonia, применяются для деградации лигноцеллюлозного сырьевого материала, и эти ферменты известны своей термостабильностью, см. WO 2007/091231. Полученный затор применяют в ферментации, во время которой восстанавливающие сахара превращаются в дрожжевую биомассу (клетки), диоксид углерода и этанол. Этанол, полученный таким способом, называется биоэтанолом.

Общее получение сахаров из предварительно обработанного лигноцеллюлозного сырьевого материала, гидролиз, также называемый ожижением, предварительным осахариванием или осахариванием, как правило, происходит во время процесса, занимающего от 6 до 168 ч (Kumar, S. Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526) при повышенных температурах от 45 до 50°C и в нестерильных условиях. Во время этого гидролиза присутствующая целлюлоза частично (как правило, от 30 до 95% в зависимости от активности фермента и условий гидролиза) превращается в восстанавливающие сахара. В случае ингибирования ферментов соединениями, присутствующими в предварительно обработанном исходном материале, и высвобождающимися сахарами и для минимизации термической инактивации этот период повышенной температуры как можно сильнее сокращают.

Ферментацию после гидролиза проводят на отдельной, предпочтительно анаэробной стадии способа, в том же самом или в другом сосуде, температуру которого доводят до 30-33°C (мезофильный процесс) для обеспечения роста и продукции этанола микробной биомассой, обычно дрожжами. Во время этого процесса ферментации оставшийся (геми)целлюлозный материал превращается в восстанавливающие сахара ферментами, уже присутствующими с этапа гидролиза, в то время как продуцируется микробная биомасса и этанол. Ферментацию заканчивают, как только (геми)целлюлозный материал превращается в ферментируемые сахара, а все ферментируемые сахара превращаются в этанол и диоксид углерода микробными клетками. Это может занимать до 6 дней. В целом, общее время процесса гидролиза и ферментации может составлять до 13 дней.

Полученный таким способом ферментированный затор состоит из не-ферментируемых сахаров, негидролизуемого (геми)целлюлозного материала, лигнина, микробных клеток (чаще всего дрожжевых клеток), воды, этанола, растворенного диоксида углерода. Во время последующих этапов этанол отделяют дистилляцией от затора и подвергают дополнительной очистке. Оставшуюся твердую суспензию сушат и применяют, например, в качестве горючей смеси, фертилизатора или корма для крупного рогатого скота.

WO 2010/080407 предлагает обработку целлюлозного материала целлюлазной композицией в анаэробных условиях. Удаление или исключение активных форм кислорода может улучшать производительность системы ферментов, гидролизующих целлюлозу. Гидролиз целлюлозного материала, например лигноцеллюлозы ферментной композицией, может снижаться из-за окислительного повреждения компонентов ферментной композиции и/или окисления целлюлозного материала, например, молекулярным кислородом.

- 1 031865

WO 2009/046538 раскрывает способ обработки растительных материалов - сырья лигноцеллюлозы для высвобождения ферментируемых сахаров с применением способа ферментативного гидролиза для обработки материалов, выполняемого под вакуумом, и производящего богатый сахаром технологический поток, включающий сниженные количества летучих соединений, ингибирующих ферментацию сахаров, таких как фурфураль и уксусная кислота. Помимо удаления летучих ингибирующих соединений, другие удаляемые соединения и/или молекулы включают азот, кислород, аргон и диоксид углерода.

С каждой загрузкой сырьевого материала добавляют ферменты для максимизации выхода и скорости высвобождения ферментируемых сахаров из предварительно обработанного лигноцеллюлозного сырьевого материала в определенное время процесса. В целом затраты на продукцию ферментов, сырьевой материал и выход этанола и капиталовложения являются основными факторами стоимости в общих затратах на производство (Kumar, S. Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526). К настоящему времени снижение применения ферментов достигается путем использования ферментных продуктов из одного или из множества микробных источников (WO 2008/008793) с более широкой и/или высокой (удельной) гидролитической активностью, чье применение нацелено на снижение потребности в ферментах, более высокие скорости превращения и/или более высокий выход превращения, и таким образом, на общее снижение затрат на производство биоэтанола. Это требует больших инвестиций в исследования и разработку этих ферментных продуктов. В случае, когда ферментный продукт состоит из ферментов из множества микробных источников, требуются большие инвестиции для получения каждого единственного ферментного соединения.

Таким образом, необходимо улучшить вышеуказанный способ, включающий гидролиз и ферментацию.

Изложение сущности изобретения

Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение устройства и способа, в котором этап гидролиза проводят в усовершенствованных условиях. Другой задачей изобретения является обеспечение устройства и способа, включающего гидролиз со сниженным временем процесса. Другой задачей изобретения является обеспечение устройства и способа, где дозировка фермента может быть уменьшена, а при этом выход полезного продукта гидролиза поддерживается на том же самом уровне или даже повышается. Другой задачей является обеспечение устройства и способа, включающего гидролиз, где условия процесса гидролиза являются оптимизированными. Еще одной задачей изобретения является обеспечение устройства и способа, включающего гидролиз, где выход полезного продукта гидролиза повышается при использовании той же самой дозировки фермента. Одна или несколько из этих задач решаются в соответствии с изобретением.

Настоящее изобретение обеспечивает способ получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии:

(a) необязательно, предварительная обработка лигноцеллюлозного материала;

(b) необязательно, промывание необязательно подвергнутого предварительной обработке лигноцеллюлозного материала;

(c) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно подвергнутого предварительной обработке лигноцеллюлозного материала в гидролитическом реакторе с применением ферментной композиции, содержащей по меньшей мере две целлюлазы; и (d) необязательно, извлечение сахарного продукта, где во время ферментативного гидролиза кислородсодержащий газ добавляют в лигноцеллюлозный материал в гидролитическом реакторе, и где часть кислородсодержащего газа, добавленного к лигноцеллюлозному материалу, является газом, происходящим из свободного пространства реактора. Предпочтительно часть времени ферментативного гидролиза меньше кислорода добавляется в лигноцеллюлозный материал по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза или предпочтительно часть времени ферментативного гидролиза не добавляют кислород в лигноцеллюлозный материал.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения продукта ферментации из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие этапы:

(c) ферментативный гидролиз необязательно промытого и/или необязательно подвергнутого предварительной обработке лигноцеллюлозного материала в гидролитическом реакторе с применением ферментной композиции, содержащей по меньшей мере две целлюлазы;

(d) ферментация гидролизованного лигноцеллюлозного материала для получения продукта ферментации и (e) необязательно, извлечение продукта ферментации, где во время ферментативного гидролиза кислородсодержащий газ добавляют в лигноцеллюлозный материал в гидролитическом реакторе, и где часть кислородсодержащего газа, добавленного к лигноцеллюлозному материалу, является газом, происходящим из свободного пространства реактора. Предпочтительно часть времени ферментативного гидролиза меньше кислорода добавляется в лигноцеллюлозный

- 2 031865 материал по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза или предпочтительно часть времени ферментативного гидролиза не добавляют кислород в лигноцеллюлозный материал.

В соответствии с другим аспектом изобретения обеспечивается устройство, пригодное для проведения способа ферментативного гидролиза из настоящего изобретения. Устройство в соответствии с изобретением включает:

(a) реактор или сосуд реактора объемом по меньшей мере 1 м³, включающий средства для введения газа, предпочтительно распределитель газа, для введения газа в реактор;

(b) необязательно, средства для перемешивания содержимого реактора;

(c) газовый насос для введения газа в реактор;

(d) рециркуляционный трубопровод для рециркуляции газа из свободного пространства реактора;

(e) выпускную систему для удаления газа из реактора;

(f) подвод газа для введения свежего газа в реактор;

(g) средства, предпочтительно клапан, для контроля отношения между рециркулирующим газом и свежим газом.

В целом, это устройство вполне пригодно для введения газа, такого как воздух, в жидкую реакционную смесь, такую как при ферментативном гидролизе биомассы, предпочтительно имеющую содержащие сухого вещества на этапе гидролиза 10 мас.% или больше, предпочтительно 14 мас.% или больше и еще более предпочтительно от 14 до 33 мас.%.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения часть времени, в течение которой добавляется меньше кислорода, или предпочтительно не добавляется кислород, составляет от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения часть времени, в течение которой добавляется больше кислорода, составляет от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза. Более предпочтительно часть времени, в течение которой добавляется больше кислорода, составляет:

(a) от 12 до 50%, предпочтительно от 20 до 40%, где кислород добавляют во второй половине времени ферментативного гидролиза;

(b) от 2 до 30%, предпочтительно от 4 до 25% и более предпочтительно от 5 до 20% от общего времени ферментативного гидролиза, где кислород добавляют в первой половине времени ферментативного гидролиза; или (c) комбинацию а и b.

Предпочтительно концентрация кислорода в жидкой фазе гидролиза в ту часть времени, когда добавляют кислород, больше по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз концентрации кислорода в ту часть времени, когда добавляют меньше кислорода, или не добавляют кислород.

В одном варианте осуществления концентрация кислорода в жидкой фазе гидролиза за все время ферментативного гидролиза является низкой.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, в ту часть времени, когда добавляют кислород, концентрация кислорода в жидкой фазе, где лигноцеллюлозный материал присутствует во время ферментативного гидролиза, составляет по меньшей мере 0,001 моль/м³, предпочтительно по меньшей мере 0,002 моль/м³, наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,003 моль/м³ и еще более предпочтительно больше 0,01 моль/м³, например больше 0,02 или 0,03 моль/м³. В реакторах объемом меньше 1 м³ значения РК ниже 0,01 или 0,02 моль/м³ достигаются при медленном перемешивании. Активное смешивание или перемешивание в таком масштабе вводит часть газовой фазы из свободного пространства в реакционную жидкость. Например, взбалтывание или перемешивание может создать воронку, которая вводит кислород в жидкость. В целом, продувка свободного пространства кислородом (например, в форме воздуха) в комбинации с (активным) взбалтыванием или перемешиванием вводит достаточное количество кислорода в целлюлозный материал в гидролитическом реакторе для реакторов размером от 100 л до 1 м³. В большем масштабе, например, в реакторе 50 м³ или больше, например 100 м³, для активного перемешивания требуется так много энергии, что с экономической точки зрения это неприменимо в промышленных рабочих процессах. В целом, в больших реакторах взбалтывание или перемешивание без введения воздуха или кислорода приводит к значениям РК меньше 0,01 моль/м³.

В другом предпочтительном варианте осуществления во время добавления кислорода (в той части времени, когда добавляют кислород) концентрация кислорода в жидкой фазе, где лигноцеллюлозный материал присутствует во время ферментативного гидролиза, предпочтительно составляет самое большее 80% от концентрации насыщения кислорода в условиях реакции гидролиза, более предпочтительно самое большее 0,12 моль/м³, еще более предпочтительно самое большее 0,09 моль/м³, еще более предпочтительно самое большее 0,06 моль/м³, еще более предпочтительно самое большее 0,045 моль/м³ и наиболее предпочтительно самое большее 0,03 моль/м³. В одном варианте осуществления концентрация

- 3 031865 кислорода составляет 0 моль/м³, поскольку потребление кислорода является более высоким, чем скорость переноса кислорода. Температура и давление оказывают влияние на РК. Предпочтительные и примерные значения моль/м³, приведенные выше, относятся к нормальному атмосферному давлению и к температуре около 62°С. Специалист в данной области техники может определить благоприятные значения РК на основе предшествующих учений.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения кислород потребляется в количестве, соответствующем от 20 до 5000 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале. Предпочтительно кислород потребляется в количестве, соответствующем от 22 до 4500 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, от 24 до 4000 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, от 26 до 3500 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, от 28 до 3000 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале. Кислород добавляют после предварительной обработки и до и/или во время ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 30 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, более предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 40 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, и наиболее предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 50 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале. Весь кислород, который добавляют в систему, переносится в жидкость и используется для гидролиза. Это количество можно контролировать путем измерения и контроля количества воздуха, приносимого в систему.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения реактор для ферментативного гидролиза имеет объем 1 м³ или больше. Предпочтительно реактор имеет объем по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 300, по меньшей мере 400, по меньшей мере 500, по меньшей мере 600, по меньшей мере 700, по меньшей мере 800, по меньшей мере 900, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 1500, по меньшей мере 2000, по меньшей мере 2500 м³. В целом, реактор должен быть меньше 3000 или 5000 м³. Можно использовать несколько реакторов. Реакторы, используемые в способах из настоящего изобретения, могут иметь один и тот же объем, но также могут иметь различные объемы. Продолжительность ферментативного гидролиза в представленном способе предпочтительно составляет от 5 до 150 ч.

В соответствии с другим предпочтительным аспектом изобретения ферментную композицию получают из грибов предпочтительно микроорганизма рода Rasamsonia, либо ферментная композиция включает фермент грибов, предпочтительно фермент Rasamsonia. В соответствии с другим предпочтительным аспектом настоящего изобретения содержание сухого вещества на этапе гидролиза (с) составляет 10 мас.% или больше, предпочтительно 14 мас.% или больше и еще более предпочтительно от 14 до 33 мас.%. Ферментативный гидролиз предпочтительно осуществляют в реакторе для периодического культивирования, периодического культивирования с подпиткой и/или непрерывного культивирования. Предпочтительно кислород, который вводят в настоящем способе, является кислородсодержащим газом, таким как воздух. Меньшее количество кислорода, добавляемое или присутствующее в лигноцеллюлозном материале в части времени ферментативного гидролиза, означает, что по меньшей мере на 50% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 70% меньше, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% меньше кислорода (выраженного в моль кислорода/м³), вводится, например, форме пузырьков, или присутствует, чем добавляется или присутствует в другую часть времени ферментативного гидролиза, когда добавляют кислород.

В предпочтительном варианте осуществления кислород добавляют в форме (газовых) пузырьков.

Неожиданно, в соответствии с настоящим изобретением путем добавления кислорода можно достичь многих преимуществ для способа, включая оптимальные температурные условия, снижение времени процесса, снижение дозировки фермента, повторное применение ферментов, высокий выход и другие усовершенствования процесса, что приводит к снижению затрат.

В одном варианте осуществления используемая стабильная ферментная композиция сохраняет активность в течение 30 ч или больше. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, гидролиз предпочтительно проводят при температуре 40°C или больше, более предпочтительно при температуре 50°C или больше и наиболее предпочтительно при температуре 55°С или больше. Способ из настоящего изобретения далее иллюстрирован более подробно.

- 4 031865

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - влияние продувки азотом или воздухом через 10% кКС сырьевой материал перед гидролизом на общее количество глюкозы (г/л), высвобожденное смесью ТЕС-210.

Фиг. 2 - глюкоза, вырабатываемая в примере 2. 1 = Эксперимент 1: без аэрирования, 2 = эксперимент 2: непрерывное аэрирование, 3 = эксперимент 3: аэрирование начиная с 72 ч и до конца.

Фиг. 3 - влияние времени аэрирования на глюкозу, вырабатываемую при ферментативном гидролизе, — = без аэрирования, ··· = аэрирование между временем гидролиза составляет 0 и 100 ч, - - - аэрирование между временем гидролиза составляет 0 и 7 ч и---= аэрирование между временем гидролиза составляет 72 и 100 ч.

Фиг. 4 - влияние времени аэрирования на глюкозу, вырабатываемую во время ферментативного гидролиза в эксперименте 1 = аэрирование между временем гидролиза составляет 0 и 100 ч) и 2 ((□ = аэрирование между временем гидролиза составляет 72 и 100 ч).

Фиг. 5 - влияние времени аэрирования на глюкозу, выработанную при ферментативном гидролизе, —— аэрирование между временем гидролиза составляет 72 и 100 ч и —·— аэрирование между временем гидролиза составляет 0 и 7 ч.

Фиг. 6 - схематическая конструкция для возможного варианта устройства из настоящего изобретения.

Подробное описание изобретения

На протяжении описания и формулы изобретения слова содержать и включать и их варианты, такие как содержит, содержащий, включает и включающий должны интерпретироваться как включающие. То есть, эти слова предназначены для выражения возможного включения других элементов или целых чисел, не перечисленных специально, где это следует из контекста. Термины, приведенные в единственном числе, также включают и множественное число. В качестве примера, элемент может означать один элемент или более одного элемента.

В контексте настоящего изобретения термины усовершенствованный, повышенный, сниженный применяются для указания, что настоящее изобретение демонстрирует преимущество по сравнению с той же самой ситуацией, процессом или условиями процесса, за исключением отсутствия добавления дополнительного кислорода. В контексте настоящего изобретения измеренный в тех же самых условиях или анализированный в тех же самых условиях и т.д. означает, что способ из настоящего изобретения и тот же самый способ без (или с меньшим количеством) добавления кислорода проводят в тех же самых условиях (за исключением добавления кислорода), и что результаты представленного способа, по сравнению со способом без (или с меньшим количеством) добавления кислорода, измеряют в тех же самых условиях, предпочтительно с применением одного и того же анализа и/или методологии, более предпочтительно в одном и том же или в параллельном эксперименте. Условия гидролиза являются, например, такими условиями.

В предшествующем уровне техники предлагается улучшение гидролиза целлюлолитического материала с применением анаэробных (WO 2010/080407) или вакуумных (WO 2009/046538) условий во время ферментативного гидролиза. В способах из обоих документов уровень кислорода снижали. Было неожиданно установлено, что гидролиз из настоящего изобретения показывает результаты с точки зрения улучшения продуктивности реакции, которая дает более высокие количества (восстанавливающих) сахарных продуктов и/или желаемых продуктов ферментации в ферментации после гидролиза, по сравнению со способом, в котором не добавляют кислорода. В целом, повышение превращения глюкозы составляет от 5 до 15 мас.% или даже до 25 мас.%.

Кислород можно добавлять несколькими способами. Например, кислород может быть добавлен в виде газообразного кислорода, обогащенного кислородом газа, такого как обогащенный кислородом воздух, или воздуха (пример газа, содержащего кислород). Кислород можно добавлять непрерывно или периодически. Добавление кислорода означает, что кислород добавляют в жидкую фазу (содержащую лигноцеллюлозный материал) в гидролитический реактор, а не то, что кислород присутствует в свободном пространстве реактора над жидкой фазой (в комбинации с медленным перемешиванием или без перемешивания), где кислород должен диффундировать из свободного пространства в жидкую фазу. Таким образом, предпочтительно кислород добавляют в виде пузырьков, наиболее предпочтительно маленьких пузырьков. В одном варианте осуществления пузырьки имеют диаметр по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 1, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2, по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 3, по меньшей мере 3,5, по меньшей мере 4, по меньшей мере 4,5, по меньшей мере 5 мм. В одном варианте осуществления пузырьки имеют диаметр от 0,5 до 500 мм, предпочтительно от 0,5 до 400 мм, от 0,5 до 300 мм, от 0,5 до 200 мм, от 0,5 до 100 мм.

В случае если фермент может повреждаться при наличии или при добавлении кислорода, можно применять более умеренную подачу кислорода. В этом случае может быть найден баланс между улучшенной выработкой глюкозы и производительностью фермента. Добавление кислорода в целлюлолитический материал можно проводить при ферментативном гидролизе. В случае добавления кислорода в газообразной форме, кислородсодержащий газ можно вводить, например вдувать, в жидкое содержимое гидролитического реактора из целлюлолитического материала. В другом варианте осуществления изо

- 5 031865 бретения кислородсодержащий газ вводят в жидкий поток целлюлолитического материала, который поступает в гидролитический реактор. В другом варианте осуществления изобретения кислородсодержащий газ вводят вместе с целлюлолитическим материалом, который поступает в гидролитический реактор, или с частью жидкого содержимого реактора, которое проходит внешнюю петлю реактора. В большинстве случаев добавление кислорода до поступления в гидролитический реактор не является достаточным, и добавление кислорода можно осуществлять также во время гидролиза. В другом варианте осуществления изобретения газовую фазу, присутствующую в верхней части реактора (свободном пространстве), непрерывно или периодически обновляют кислородсодержащим газом. В последнем случае необходимо (активное) взбалтывание или перемешивание для прохода кислорода в виде пузырьков и/или посредством диффузии в жидкое содержимое реактора, предпочтительно в комбинации с избыточным давлением в реакторе. В целом, продувание свободного пространства воздухом в комбинации с (активным) взбалтыванием или перемешиванием может обеспечивать достаточное введение кислорода в целлюлолитический материал в гидролитическом реакторе для реакторов размером от 100 л до 1 м³. При большем масштабе, например, в реакторе 50 м³ или больше, например 100 м³, требуется так много энергии для активного перемешивания, что с экономической точки зрения это неприменимо в промышленных операционных процессах.

В соответствии с настоящим изобретением кислород можно добавлять в течение части стадии гидролиза. Добавление кислорода в течение только части гидролиза можно выполнить, например, в случае, если происходит окислительное повреждение фермента(ов). В случае, если присутствие кислорода в содержимом гидролитического реактора или сахарные продукты или гидролизат, образующийся на этапе гидролиза, может влиять или нарушать последующий этап ферментации, добавление кислорода можно выполнять на протяжении процесса гидролиза, за исключением последней части гидролиза, и таким образом, кислород (большая часть) потребляется до того, как гидролизуемая биомасса поступает в ферментационный реактор. Предпочтительно кислород, предпочтительно в форме (газовых) пузырьков, добавляют, по меньшей мере, в последней части этапа гидролиза.

Авторы изобретения выдвинули гипотезу, что в первой части стадии (ферментативного) гидролиза аморфные полисахариды гидролизуются до сахаров, таких как глюкоза, и что во второй части стадии гидролиза оставшиеся кристаллические полисахариды превращаются в сахара. Аморфные полисахариды, например, превращаются в олигосахариды эндоглюконазами, при этом впоследствии олигосахариды могут превращаться целлобиогидролазой и бета-глюкозидазой (БГ) в сахара. В соответствии с представленной гипотезой, аморфные полисахариды располагаются на внешней стороне полисахаридов или полисахаридных комплексов, в то время как кристаллические полисахариды располагаются относительно больше внутри полисахаридов или полисахаридных комплексов, присутствующих в лигноцеллюлозном материале. Таким образом, превращение кристаллических полисахаридов может продолжаться, даже когда большинство аморфных полипептидов гидролизовано. В частности, добавление кислорода является благоприятным при гидролизе кристаллических полисахаридов, например при деградации полисахаридов до олигосахаридов. В соответствии с этой гипотезой, добавление кислорода особенно полезно во второй части стадии гидролиза. В целом, более короткое время добавления кислорода (или более короткая вторая часть гидролиза) требуется в случае относительно низких количеств кристаллических полисахаридов в лигноцеллюлозном материале, по сравнению с гидролизом лигноцеллюлозного материала, в котором присутствуют относительно более высокие количества кристаллических полисахаридов. Авторы изобретения также предположили, что добавление кислорода является благоприятным для гидролиза кристаллических полисахаридов. Таким образом, добавление кислорода очень полезно, особенно в фазе, когда кристаллические полисахариды атакуются ферментами. Вне этой фазы может быть более эффективным отсутствие добавления кислорода. Таким образом, подача кислорода может начинаться только во второй части или второй половине гидролиза. В конце гидролиза, когда большинство кристаллических полисахаридов деградировано, добавление кислорода предпочтительно прекращают. В последней части второй части или второй половины гидролиза большинство полисахаридов превращается в олигосахариды, которые при последующем разрушении на сахара меньшего размера больше не требуют кислорода. Таким образом, предпочтительно меньше кислорода, по сравнению с добавлением кислорода во время части процесса с аэрацией, добавляют в лигноцеллюлозный материал в конце процесса гидролиза, или предпочтительно не добавляют кислород в лигноцеллюлозный материал в конце процесса гидролиза. Эта гипотеза дается лишь для возможного пояснения эффекта, отмечаемого авторами изобретения, но настоящее изобретение не зависит от правильности этого предположения.

Кристаллическая структура глюканов может быть открыта литической полисахаридмонооксигеназой (LPMO). LPMO более подробно описаны ниже (их также называют РМО)). Этот тип фермента открывает структуру путем окисления гликозидных связей и обеспечения их доступности для других целлюлолитических ферментов для последующего гидролиза олигосахаридов в глюкозу.

Большинство известных LPMO образуют альдоновые кислоты, т.е. продукты, окисленные в С1 положении терминального сахара в участке расщепления. Эта окисленная глюкозная единица высвобождается в виде глюконовой кислоты при гидролизе. Кроме того, отмечено окисление С4 и С6 невосстанавливающей глюкозной единицы в участке расщепления. Например, Т. Isaksen et. al. (выше) со

- 6 031865 общали об окислении С4 положения не-восстанавливающего концевого компонента, приводящем к образованию кето-сахара в С4 положении, который находится в равновесии с присоединенным к тому же атому С4 диолом в водном растворе. Авторы настоящего изобретения предположили, что гидролизованные продукты окисления, например, такие как глюконовая кислота, являются мерой активности применяемой LPMO в гидролизе лигноцеллюлозы.

Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что оптимальный гидролиз лигноцеллюлозы (превращение более 70% глюканов) может быть достигнут при потреблении кислорода в количестве, соответствующем от 20 до 5000 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале после предварительной обработки и до и/или во время ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала, предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 30 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, более предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 40 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, и наиболее предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 50 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, кислород потребляется в количестве, соответствующем от 20 до 5000 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале. Предпочтительно кислород потребляется в количестве, соответствующем от 22 до 4500 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, от 24 до 4000 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, от 26 до 3500 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, от 28 до 3000 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале. Кислород добавляют после предварительной обработки и до и/или во время ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала, предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 30 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, более предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 40 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, и наиболее предпочтительно в количестве, соответствующем по меньшей мере 50 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале. Весь кислород, который добавляют в систему, переносится в жидкость и используется для гидролиза. Это количество можно контролировать путем измерения и контроля количества воздуха, вводимого в систему.

Окисление лигноцеллюлозного материала посредством LPMO приводит к окисленным полисахаридам, которые при гидролизе гидролизуются, среди прочего, в глюкозу и окисленные глюкозные единицы, такие как глюкуроновая кислота или диол. Как правило, 1 молекула кислорода (O₂) дает 1 моль продукта окисления. Необходимо понять, что оптимальный гидролиз лигноцеллюлозы может быть достигнут только при оптимальном гидролизе (кристаллической) целлюлозы и целло-олигосахаридов. Этот оптимальный гидролиза при воздействии LPMO приводит к образованию гидролизованного продукта окисления, такого как глюконовая кислота. Отсутствие окисления означает менее эффективный гидролиз (кристаллического) глюкана. Однако слишком высокие уровни окисления приведут к более высоким уровням продуктов, таких как глюконовая кислота, и будут осуществляться за счет глюкозы, и таким образом, выход глюкозы по (исходному) глюкану снизится.

Авторы настоящего изобретения также отметили, что аэрирование во время процесса ферментативного гидролиза в начале процесса гидролиза приводит к повышению выработки глюкозы при гидролизе.

На фиг. 3 показан эффект аэрирования. По сравнению с не-аэрированным гидролизом (показан на кривой без аэрирования) аэрирование в начале процесса гидролиза (показано в виде кривой аэрирование 0-7 ч) приводит к немедленному повышению выработки глюкозы, и, например, уже спустя 24 гидролиза было установлено, что выработка глюкозы соответствует продукции глюкозы без аэрирования за 69 ч гидролиза в идентичных условиях (за исключением аэрирования). По сравнению с гидролизом без аэрирования, аэрирование в последней части процесса гидролиза (показано кривой аэрирование 72-100 ч) приводит к немедленному повышению выработки глюкозы после аэрирования, и, например, уже спустя 24 ч после начала аэрирования (72 ч) в процессе гидролиза достигается 30% повышение выработки глюкозы, по сравнению с выработкой глюкозы без аэрирования в идентичных условиях (за исключением аэрирования). Авторы настоящего изобретения считают, что с применением аэрирования в начале, а также в последней части процесса гидролиза (с периодом без аэрирования между интервалами с аэрированием) можно повысить выработку глюкозы, что приводит к повышению выработки глюкозы, которое больше одного из двух отдельных повышений. Настоящее разъяснение приводится для того, чтобы руководствуясь им специалист в данной области техники мог подобрать подходящих условий для представленного процесса гидролиза.

Несколько примеров частичного аэрирования во время процесса ферментативного гидролиза приведены в примерах для демонстрации благоприятного эффекта настоящего изобретения. Этот благоприятный эффект выявлен для нескольких субстратов или видов исходного сырья ,и таким образом, считается присутствующим при гидролизе всех видов субстратов или исходного сырья.

- 7 031865

Некоторые примеры ферментных композиций для процесса ферментативного гидролиза приведены в примерах для демонстрации полезного эффекта настоящего изобретения. Этот полезный эффект был установлен для некоторых ферментных композиций и, таким образом, признан присутствующим для всех видов гидролизующих ферментных композиций.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения часть времени, где добавляется меньше или предпочтительно не добавляется кислорода, составляет от 10 до 80%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 80% и наиболее предпочтительно от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения часть времени, когда добавляется больше кислорода, составляет от 2 до 80%, предпочтительно от 4 до 60%, более предпочтительно от 8 до 50% и наиболее предпочтительно от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза. В целом, концентрация кислорода в жидкой фазе в часть времени, когда добавляют кислород, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз превышает концентрацию кислорода в жидкой фазе в часть времени, когда добавляют меньше или не добавляют кислорода.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения в часть времени, когда кислород добавляют в жидкую фазу (путем аэрирования или добавления кислорода), концентрация кислорода (РК) в жидкой фазе, где присутствует лигноцеллюлозный материал во время ферментативного гидролиза, составляет по меньшей мере 0,001, предпочтительно по меньшей мере 0,002, более предпочтительно по меньшей мере 0,003 и еще более предпочтительно больше 0,01 моль/м³, например больше 0,02 или 0,03 моль/м³. В реакторах объемом меньше 1 м³ значения РК ниже 0,01 или 0,02 моль/м³ достигаются путем медленного перемешивания. Интенсивное перемешивание или взбалтывание в таком масштабе вводит часть газовой фазы из свободного пространства в реакционную жидкость. Например, перемешивание или взбалтывание может создать воронку, вводящую кислород в жидкость. В целом, продувка свободного пространства воздухом в комбинации с (интенсивным) перемешиванием или взбалтыванием обеспечивает введение достаточного количества кислорода в целлюлозный материал в гидролитическом реакторе для реакторов размером от 100 л до 1 м³. В большем объеме, например в реакторе объемом 50 м³ или больше, например 100 м³, требуется так много энергии для интенсивного перемешивания, что с экономической точки зрения это неприменимо в промышленном операционном процессе. В целом, в больших реакторах перемешивание или взбалтывание без введения воздуха или кислорода приводит к значениям РК меньше 0,01 моль/м³.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения при генерации или продукции кислорода концентрация кислорода в жидкой фазе (аэрирование или добавление кислорода), где присутствует лигноцеллюлозный материал во время ферментативного гидролиза, составляет в часть времени, когда добавляют кислород, предпочтительно самое большее 80% от концентрации насыщения кислорода в условиях реакции гидролиза, более предпочтительно самое большее 0,12, еще более предпочтительно самое большее 0,09, еще более предпочтительно самое большее 0,06, еще более предпочтительно самое большее 0,045 и наиболее предпочтительно самое большее 0,03 моль/м³. В одном варианте осуществления концентрация кислорода составляет 0 моль/м³, поскольку потребление кислорода выше скорости переноса кислорода. Температура и давление оказывают влияние на РК. Предпочтительные и примерные значения в моль/м³, приведенные выше, относятся к нормальному атмосферному давлению и температуре около 62°С. Специалист в данной области техники сможет подобрать подходящие значения РК на основе представленных учений.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация кислорода в жидкой фазе, где присутствует лигноцеллюлозный материал во время ферментативного гидролиза, составляет в часть времени, когда добавляют меньше или не добавляют кислорода меньше 0,02, предпочтительно меньше 0,01, более предпочтительно меньше 0,005 и наиболее предпочтительно меньше 0,001 моль/м³.

Добавление кислорода в форме воздуха или другого кислородсодержащего газа в соответствии с изобретением можно также применять, по меньшей мере, для частичного перемешивания или взбалтывания содержимого гидролитического реактора. Представленный способ из настоящего изобретения демонстрирует в особенности преимущества пилотного или промышленного масштаба. Предпочтительно гидролитический реактор имеет объем 1 м³ или больше, предпочтительно больше 10 м³ и наиболее предпочтительно 50 м³ или больше. Как правило, гидролитический реактор должен быть меньше 3000 м³ или 5000 м³. Авторы настоящего изобретения предположили, что особенно при крупномасштабном производстве недостаточно кислорода, доступного для гидролиза, что может быть обусловлено ограничениями переноса кислорода в реакторе, например, в целлюлолитической биомассе. В экспериментах в лабораторном масштабе эта недостаточность кислорода может играть менее важную роль. Отношение поверхностной площади (или площади контакта с кислородом содержимого реактора) к объему реактора является более благоприятным для экспериментов в маленьком масштабе, чем для крупномасштабных экспериментов. Далее, перемешивание в экспериментах в маленьком масштабе относительно легче перемешивания в крупном масштабе. Во время этих экспериментов в маленьком масштабе также быстрее происходит транспорт кислорода из свободного пространства гидролитического реактора, по сравнению с крупномасштабными экспериментами. Эта теория является единственной, дающей возможное объясне

- 8 031865 ние эффекту, отмеченному авторами настоящего изобретения, и настоящее изобретение не опровергает и не оспаривает правильность этой теории. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, добавление кислорода можно применять, по меньшей мере, для частичного контроля процесса гидролиза.

В соответствии с другим аспектом изобретения обеспечивается устройство, пригодное для ферментативного гидролиза согласно настоящему изобретению. Устройство в соответствии с настоящим изобретением включает:

На фиг. 6 схематически показан один вариант воплощения устройства настоящего изобретения.

Предпочтительно способ настоящего изобретения осуществляют в устройстве настоящего изобретения. Предпочтительно, по меньшей мере, в течение части времени способ настоящего изобретения осуществляют в представленном устройстве, и газ, вводимый в реактор, является кислородсодержащим газом. Газ, вводимый в подвод газа, предпочтительно является кислородсодержащим газом и более предпочтительно воздухом. В способе из изобретения кислород потребляется, и рециркулирующий газ содержит меньше кислорода, чем газ, введенный в реактор. С помощью средств, предпочтительно клапана, для контроля отношения между рециркулирующим газом и свежим газом кислород можно вводить в реактор точно в необходимом количестве для реакции ферментативного гидролиза. Уровень кислорода в газе, вводимом в реактор, можно контролировать между уровнем кислорода в свободном пространстве и уровнем кислорода в подводе газа. В случае, если в подводе газа не вводится газа, только рециркулирующий газ будет вводиться в реактор. Потребление кислорода во время ферментативного гидролиза приводит, в последнем случае, к снижению содержания кислорода, присутствующего в устройстве, пока, наконец, кислород не будет полностью отсутствовать.

В случае, если мало рециркулирующего газа, по сравнению со свежим вводимым газом через подвод газа, уровень кислорода в газе, присутствующем в устройстве, будет близок к уровню кислорода в свежем вводимом газе. В случае, когда свежим вводимым газом является воздух, уровень кислорода в реакторе можно предпочтительно контролировать путем выбора подходящего отношения между свежим вводимым воздухом и рециркулирующим газом.

Сохранение уровня кислорода на выбранном значении может быть обеспечено путем введения того же самого количества свежего кислорода через подвод газа, как количество кислорода, которое потребляется во время гидролиза в реакторе.

Распределитель газа обеспечивает введение газа в реактор. Газовый насос обеспечивает необходимое давление для введения газа в реактор через распределитель. Путем выбора давления можно контролировать количество газа, вводимое через распределитель. Газ можно применять для введения кислорода в реактор, а также для перемешивания содержимого реактора в реакторе. Распределитель газа может иметь, например, форсунки или отверстия для введения газа в содержимое реактора. Как правило, диаметр отверстий в распределителе составляет по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 1, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2, по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 3, по меньшей мере 3,5, по меньшей мере 4, по меньшей мере 4,5, по меньшей мере 5 мм. В одном варианте осуществления диаметр отверстий в распределителе составляет от 0,5 мм до 500 мм, предпочтительно от 0,5 до 400 мм, от 0,5 до 300 мм, от 0,5 до 200 мм, от 0,5 до 100 мм.

Необязательно, также можно применять мешалку для перемешивания содержимого реактора. В случае применения мешалки в реакторе можно применять все мешалки, известные в данной области техники, например якорного типа, лопастного типа, пропеллерного типа и т.д. В случае применения мешалки можно применять одну или несколько мешалок. Каждое лопастное колесо может иметь, например, 2-4 или более лопастей, лопасти лопастного колеса мешалки могут быть вертикальными лопастями или наклонными лопастями, вертикальными и наклонными по отношению к оси мешалки.

Необязательно, (циркулирующий) поток жидкости можно применять для управления трубкой Вентури для ввода кислородсодержащего газа в жидкость. Эта система циркуляции потока жидкости обеспечивает циркуляцию (части) жидкого содержимого реактора, а именно гидролизата или лигноцеллюлозного материала.

В целом, целлюлазные композиции, которые применяются для гидролиза лигноцеллюлозного материала, содержат несколько целлюлаз, включая GH61. GH61 обладает способностью к гидролизу кристаллической целлюлозы до целлюлозных полимеров, которые могут быть далее гидролизованы в глюкозу другими целлюлазами. Кислород необходим для реакции гидролиза, катализируемой GH61, и в ре

- 9 031865 зультате глюкозная единица на восстанавливающем конце гидролизуемого целлюлозного полимера окисляется в остаток глюконовой кислоты. Этот остаток глюконовой кислоты высвобождается по мере дальнейшего прохождения гидролиза. Необходимо понять, что ограниченная активность GH61 может привести к лишь частичному гидролизу кристаллической целлюлозы, в то время как, с другой стороны, избыточный гидролиз приводит к высоким концентрациям глюконовой кислоты и к снижению высвобождения глюкозы из целлюлозного сырьевого материала. Таким образом, активность GH61 предпочтительно контролируют для оптимального результата. Одним способом подачи кислорода во время гидролиза является добавление кислорода в форме кислородсодержащего газа, такого как воздух. В соответствии с настоящим изобретением, кислород добавляется и присутствует, и таким образом, уровень кислорода при гидролизе точно контролируется устройством, описанным в настоящей заявке.

В соответствии с настоящим изобретением контроль количества кислорода, подаваемого в гидролизат, имеет очень большое значение. Кроме того, нужно исключить локальные высокие концентрации кислорода в лигноцеллюлозном материале (гидролизате) в гидролитическом реакторе для ограничения потери ферментативной активности из-за влияния кислорода на целлюлазы. Это осуществляют путем обеспечения надлежащего смешивания жидкости с кислородом и контроля необходимой концентрации кислорода в реакторе. При циркуляции газа от верхней части сосуда (свободного пространства реактора) к системе введения газа, такой как распределитель на дне, весь кислород, присутствующий в свободном пространстве в начале, потребляется очень быстро. Это потребление происходит, среди прочего, из-за окисления присутствующего лигнина и действия GH61. После момента потребления кислорода газ над гидролизатом содержит главным образом азот и диоксид углерода. Рециркуляция выходящего газа (содержащего мало, или совсем не содержащего кислорода) может обеспечить достаточное перемешивание в реакторе в случае, если газ рециркулирует через устройство введения газа, такое как распределитель, которое покрывает большую часть дна и содержит маленькие отверстия для обеспечения маленьких пузырьков. Покрывает означает, что маленькие пузырьки газа вырабатываются и присутствуют в большей части или доле содержимого реактора на дне, и таким образом, не только в ограниченной части содержимого дна. Размер отверстий предпочтительно составляет меньше 1 см в диаметре.

Если малое количество кислорода, например, в форме воздуха подается в рециклирующий или рециркулирующий поток, концентрация кислорода в потоке рециркулирующего воздуха является низкой. Кислород, подаваемый в систему рециркуляции, может вводиться непосредственно в систему рециркуляции газа или может добавляться по отдельности от рециркулирующего газа в гидролизат. Таким образом, концентрация растворенного кислорода в реакторе и приток кислорода к жидкости в реакторе можно контролировать очень точно и на низких уровнях, и можно легко подводить до необходимой концентрации. Настоящее изобретение обеспечивает способ и устройство, которые предотвращают или ограничивают потерю ферментативной активности и в то же самое время обеспечивают подачу кислорода к гидролизату.

Способ из настоящего изобретения предпочтительно применяют в комбинации с использованием термостабильных ферментов.

Термостабильный фермент означает фермент, имеющий температурный оптимум 60°C или выше, например 70°C или выше, такой как 75°С или выше, например 80°C или выше, такой как 85°С или выше. Он может быть, например, выделен из термофильных микроорганизмов, или может быть сконструирован специалистом в данной области техники и искусственно синтезирован. В одном варианте осуществления полинуклеотиды могут быть выделены или получены из термофильных или термотолерантных мицелиальных грибов или выделены из не-термофильных или не-термотолерантных грибов, но являются термостабильными.

Термофильный гриб означает гриб, растущий при температуре 50°C или выше. Термотолерантный гриб означает гриб, растущий при температуре 45°С или выше, имеющий максимум около 50°C.

Примерами термофильных штаммов грибов являются Rasamsonia emersonii (ранее известный как Talaromyces emersoni; Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii и Rasamsonia emersonii применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке).

Подходящими термофильными или термотолерантными клетками грибов могут быть клетки Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus или Thielavia, предпочтительно клетки Rasamsonia emersonii. Предпочтительными термофильными или термотолерантными грибами являются Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus и Thielavia terrestris.

Термофильные грибы не ограничиваются специфическим таксономическим порядком, и все относятся к грибной ветви эволюции. Примерами являются Rhizomucor в мукоровых грибах, Myceliophthora в сордариевых грибах, и Talaromyces, Thermomyces и Thermoascus в эуроциевых грибах (Mouchacca 1997).

- 10 031865

Большинство видов Talaromyces являются мезофиллами, но исключением являются виды в группах Emersorii и Thermophila. Группа Emersonii включает Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces bacillisporus и Talaromyces leycettanus, все из которых хорошо растут при 40°C. Talaromyces bacillisporus является термотолерантным, Т. leycettanus является термотолерантным или термофильным, а Т. emersonii и Т. byssochlamydoides являются истинно термофильными (Stolk and Samson 1972). Единственный представитель группы Talaromyces Thermophila, T. thermophilus, быстро растет при 50°C (Evans and Stolk 1971; Evans 1971; Stolk and Samson 1972). Текущая классификация этих термофильных видов Talaromyces основана главным образом на фенотипических и физиологических характеристиках, таких как их способность к росту при температуре выше 40°C, окраска аскоспор, структура оболочки аска, и образование определенного типа анаморфа. Stolk and Samson (1972) установили, что члены группы Emersonii имеют анаморфы серий либо Paecilomyces (Т. byssochlamydoides и Т. leycettanus), либо Penicillium cylindrosporum (T emersonii и Т. bacillisporus). Позднее Pitt (1979) перенес виды, принадлежащие к виду Penicillium cylindrosporum, в род Geosmithia, на основании различных признаков, таких как образование конидий из терминальных пор вместо шейки, признака Penicillium и Paecilomyces. Из рода Geosmithia, только G. argillacea является термотолерантным, и Stolk et al. (1969) и Evans (1971) предположили связь с членами группы Talaromyces Emersonii. Филогенетическая связь термофильных видов Talaromyces в пределах Talaromyces и Trichocomaceae неизвестна. См. J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek 2012 Feb; 101(2): 403-21.

Rasamsonia является новым родом, содержащим термотолерантные и термофильные виды Talaromyces и Geosmithia (J. Houbraken et al., выше). На основе фенотипических, физиологических и молекулярных данных Houbraken et al предложили перенести виды Т. emersonii, Т. byssochlamydoides, Т. eburneus, G. argillacea и G. cylindrospora в род Rasamsonia. Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii и Rasamsonia emersonii применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке.

Предпочтительными термофильными грибами являются Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Thermomyces lenuginosus, Talaromyces thermophilus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus и Thermoascus aurantiacus.

Мицелиальные грибы включают все филаментные формы подотдела Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth et al., в Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8^th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK (Справочник грибов Бисби)). Мицелиальные грибы характеризуются мицелиальной стенкой, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других комплексных полисахаридов. Вегетативный рост осуществляется за счет гифального удлинения, а метаболизм углерода является облигатно аэробным. Штаммы мицелиальных грибов включают Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Trichoderma и Trichophyton, но не ограничиваются ими.

Некоторые штаммы мицелиальных грибов легко доступны по номеру коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (DSM), Центральное бюро грибных культур (CBS), и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований, Северный региональный исследовательский центр (NRRL). Примеры таких штаммов включают Aspergillus niger CBS 513,88, Aspergillus oryzae АТСС 20423, IFO 4177, АТСС 1011, АТСС 9576, ATCC14488-14491, АТСС 11601, АТСС12892, P. chrysogenum CBS 455,95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 393,64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 или АТСС 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 или АТСС 56765 или АТСС 26921, Aspergillus sojae ATCC 11906, Chrysosporium lucknowense Cl, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC44006 и их производные.

Преимуществом экспрессии и выработки ферментов (например, по меньшей мере двух, трех или четырех различных целлюлаз) в подходящем микроорганизме может быть высокий выход ферментной композиции, которую можно применять в способе настоящего изобретения.

В соответствии с изобретением, путем добавления кислорода можно достичь многих преимуществ способа, включая оптимальные температурные условия, уменьшение времени процесса, снижение дозировки фермента повторное применение ферментов и другие оптимизации процесса, что приводит к снижению затрат. Предпочтительно изобретение обеспечивает способ, в котором стадию гидролиза осуществляют в улучшенных условиях. Изобретение также обеспечивает способ, включающий гидролиз, имеющий уменьшенную продолжительность процесса. Далее, изобретение обеспечивает способ, где дозировка фермента может быть снижена, и в то же самое время выход полезного продукта гидролиза остается на том же самом уровне. Другим преимуществом изобретения является то, что представленный способ, включающий гидролиз, может приводить к оптимизированным условиям процесса. Другим пре

- 11 031865 имуществом изобретения является то, что выход полезного продукта способа, включающего гидролиз, повышается при той же самой дозировке фермента.

Стабильная ферментная композиция.

Стабильная ферментная композиция означает в настоящей заявке, что ферментная композиция сохраняет активность спустя 30 ч реакции гидролиза, предпочтительно по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% от исходной активности спустя 30 ч реакции гидролиза. Предпочтительно ферментная композиция сохраняет активность спустя 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ч реакции гидролиза.

В одном варианте осуществления ферментная композиция, используемая в способах из настоящего изобретения, получена из грибов, либо ферментная композиция, используемая в способах из настоящего изобретения, содержит фермент гриба. В одном варианте осуществления ферментная композиция получена из мицелиального гриба или ферментная композиция содержит фермент мицелиального гриба. Способы из изобретения предпочтительно применяют в комбинации с ферментными композициями, полученными из микроорганизма из рода Rasamsonia, или ферментная композиция содержит фермент из Rasamsonia.

Ферментная композиция может быть приготовлена путем ферментации подходящего субстрата с подходящим микроорганизмом, например Rasamsonia emersonii или Aspergillus niger, где ферментная композиция вырабатывается микроорганизмом. Микроорганизм может быть изменен для улучшения или получения целлюлазной композиции. Например, микроорганизм может быть подвергнут мутации посредством классических процедур улучшения штамма или путем методик рекомбинантной ДНК. Таким образом, микроорганизм, упомянутый в настоящей заявке, можно применять как таковой для получения целлюлазной композиции, или он может быть изменен для повышения продукции или для выработки измененной целлюлазной композиции, которая может включать гетерологичные целлюлазы, такие ферменты, которые не являются исходно продуцируемыми этим микроорганизмом. Предпочтительно гриб, более предпочтительно мицелиальный гриб применяют для получения целлюлазной композиции. Предпочтительно применяют термофильный или термотолерантный микроорганизм. Необязательно, применяют субстрат, который индуцирует экспрессию ферментов в ферментной композиции при получении ферментной композиции.

Ферментную композицию применяют для высвобождения сахаров из лигноцеллюлозы, которая включает полисахариды. Главными полисахаридами являются целлюлоза (глюканы), гемицеллюлозы (ксиланы, гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того, некоторая гемицеллюлоза может присутствовать в виде глюкоманнанов, например, в сырьевом материале из древесины. Ферментативный гидролиз этих полисахаридов до растворимых сахаров, включая мономеры и мультимеры, например глюкозу, целлобиозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, рибозу, галактуроновую кислоту, глюкуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы, осуществляется под действием различных ферментов, действующих согласованно. Сахарный продукт означает продукт ферментативного гидролиза сырьевого материала или лигноцеллюлозного материала. Сахарный продукт включает растворимые сахара, в том числе мономеры и мультимеры, предпочтительно включает глюкозу. Примерами других сахаров являются целлобиоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, фруктоза, манноза, рамноза, рибоза, галактуроновая кислота, глюкуроновая кислота и другие гексозы и пентозы. Сахарный продукт может применяться как таковой, или может быть подвергнут дополнительной обработке, например очищен.

Кроме того, пектины и другие пектиновые вещества, такие как арабинаны, могут составлять значительную часть сухой массы стенок типичной клетки из тканей недревесного растения (примерно от четверти до половины сухой массы может быть пектинами).

Целлюлоза является линейным полисахаридом, состоящим из глюкозных остатков, связанных β-1,4 связями. Линейная природа целлюлозных волокон, а также стехиометрия β-сцепленной глюкозы (относительно α) создает структуры, более склонные к связыванию водорода между цепями, чем высоко разветвленные α-сцепленные структуры крахмала. Таким образом, целлюлозные полимеры, как правило, являются менее растворимыми, и образуют более тесно связанные волокна, чем волокна, находящиеся в крахмале.

Ферменты, которые могут быть включены в стабильную ферментную композицию, используемую в настоящем изобретении, далее описаны более подробно.

Литические полисахаридные монооксигеназы, такие как GH61, эндоглюканазы (EG) и экзоцеллобиогидролазы (СВН), катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы в такие продукты, как целлоолигосахариды (целлобиоза в качестве основного продукта), в то время как бета-глюкозидазы (BG) превращают олигосахариды, главным образом целлобиозу и целлотриозу, в глюкозу.

Гемицеллюлоза является сложным полимером, и ее состав часто широко варьирует от организма к организму и от одного типа ткани к другому. Как правило, главным компонентом гемицеллюлозы является в-1,4-сцепленная ксилоза, сахар с пятью атомами углерода. Однако эта ксилоза часто разветвлена на 0-3 и/или 0-2 атоме ксилозы и может быть замещена со связями на арабинозу, галактозу, маннозу, глюкуроновую кислоту, галактуроновую кислоту или путем этерификации на уксусную кислоту (и этерифи

- 12 031865 кацией феруловой кислоты на арабинозу). Гемицеллюлоза может также содержать глюкан, который является общим термином для β-сцепленных сахаров с шестью углеродными атомами (таких как β(1,3)(1,4) глюканы и гетероглюканы, упомянутые ранее) и, кроме того, глюкоманнаны (в которых глюкоза и манноза присутствуют в линейном каркасе, связываясь с другими β-связями).

Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами, например α-Lарабинофуранозидазами, ферулоил- и ацетилксилан эстеразами, глюкуронидазами и β-ксилозидазами, катализируют гидролиз гемицеллюлоз.

Пектиновые вещества включают пектины, арабинаны, галактаны и арабиногалактаны. Пектины являются наиболее сложными полисахаридами в клеточной стенке растений. Они построены вокруг сердцевинной цепи из единиц а(1,4)-сцепленной D-галактуроновой кислоты, до некоторой степени вперемежку с L-рамнозой. В любой клеточной стенке имеется ряд структурных единиц, которые соответствуют этому описанию, и в целом считается, что в отдельной пектиновой молекуле сердцевинные цепи различных структурных единиц являются непрерывными с любыми другими.

Основными типами структурной единицы являются галактуронан (гомогалактуронан), который может быть замещен с метанолом на карбоксильной группе и ацетатом на O-2 и O-3; рамногалактуронан I (РГ I), в котором единицы галактуроновой кислоты чередуются с рамнозными единицами, несущими боковые цепи (1,4)-связанного галактана и (1,5)-связанного арабинана. Арабинановые боковые цепи могут присоединяться непосредственно к рамнозе или опосредованно через галактановые цепи; ксилогалактуронану, с отдельными ксилозильными единицами на 0-3 галактуроновой кислоте (тесно связанной с РГ I); и рамногалактуронану II (РГ II), особо сложной минорной единице, содержащей необычные сахара, например апиозу. РГ II единица может содержать два апиозильных остатка, которые при подходящих ионных условиях могут обратимо формировать сложные эфиры с боратом.

Композиция для применения в способе из настоящего изобретения имеет по меньшей мере две активности, хотя, как правило, композиция имеет более двух активностей, например три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или больше. Как правило, композиция из настоящего изобретения может содержать по меньшей мере две различных целлюлазы, или одну целлюлазу и по меньшей мере одну гемицеллюлазу. Композиция из настоящего изобретения может содержать целлюлазы, но не ксиланазы. Кроме того, композиция из настоящего изобретения может иметь вспомогательную ферментативную активность, т.е. дополнительную активность, которая напрямую или опосредованно приводит к деградации лигноцеллюлозы. Примеры таких вспомогательных активностей упомянуты в настоящей заявке.

Таким образом, композиция для применения в изобретении может содержать GH61, эндоглюканазную активность и/или целлобиогидролазную активность и/или бета-глюкозидазную активность. Композиция для применения в изобретении может содержать более одной ферментативной активности одного или нескольких из этих классов. Например, композиция для применения в настоящем изобретении может содержать две эндоглюканазных активности, например эндо-1,3(1,4)-в-глюканазную активность и эндов-1,4-глюканазную активность. Такая композиция может также включать одну или несколько ксиланазных активностей. Такая композиция может содержать вспомогательную ферментативную активность.

Композиция для применения в настоящем изобретении может быть получена из грибов, таких как мицелиальные грибы, такие как Rasamsonia, такие как Rasamsonia emersonii. В одном варианте осуществления основной набор (деградирующих целлюлозу) ферментативных активностей может быть получен из Rasamsonia emersonii. Rasamsonia emersonii может обеспечить высокоэффективный набор активностей, как показано в настоящей заявке, для гидролиза лигноцеллюлозного материала. Если необходимо, к высокоэффективному набору активностей может быть добавлены дополнительные ферментативные активности из других источников. Такие дополнительные активности могут быть получены из классических источников и/или обеспечены генетически модифицированными организмами.

Активности в композиции для применения в изобретении могут быть термостабильными. В настоящей заявке это означает, что активность имеет температурный оптимум около 60°C или выше, например около 70°C или выше, такой как около 75°С или выше, например около 80°C или выше, такой как 85°С или выше. Активности в композиции для применения в изобретении, как правило, не имеют один и тот же температурный оптимум, но, тем не менее, предпочтительно являются термостабильными.

Кроме того, активности ферментов в композиции для применения в изобретении могут работать при низком рН. Для целей этого изобретения, низкий рН означает рН около 5,5 или ниже, около 5 или ниже, около 4,9 или ниже, около 4,8 или ниже, около 4,7 или ниже, около 4,6 или ниже, около 4,5 или ниже, около 4,4 или ниже, около 4,3 или ниже, около 4,2 или ниже, около 4,1 или ниже, около 4,0 или ниже, около 3,9 или ниже, около 3,8 или ниже, около 3,7 или ниже, около 3,6 или ниже или около 3,5 или ниже.

Активности для композиции для применения в изобретения могут определяться комбинацией любых из вышеуказанных температурных оптимумов и значений рН.

Композиция, используемая в способе из настоящего изобретения, может включать, в дополнение к активностям, полученным из Rasamsonia, целлюлазу (например, полученную из иного источника, чем Rasamsonia) и/или гемицеллюлазу (например, полученную из иного источника, чем Rasamsonia) и/или

- 13 031865 пектиназу.

Ферментативная композиция для применения в настоящем изобретении может включать целлюлазу и/или гемицеллюлазу и/или пектиназу из иного источника, чем Rasamsonia.

Например, ферментативная композиция для применения в настоящем изобретении может включать бета-глюкозидазу (BG) из Aspergillus, такого как Aspergillus oryzae, такую как раскрыто в WO 02/095014, или гибридный белок, обладающий бета-глюкозидазной активностью, раскрытый в WO 2008/057637, или Aspergillus fumigatus, такой как раскрыт как SEQ ID NO:2 в WO 2005/047499 или SEQ ID NO:5 в WO 2014/130812, или вариант бета-глюкозидазы Aspergillus fumigatus, такой как раскрыт в WO 2012/044915, такой как со следующими заменами: F100D, S283G, N456E, F512Y (нумерация относительно SEQ ID NO: 5 из WO 2014/130812), или Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger или Aspergillus kawachi. В другом варианте осуществления бета-глюкозидаза получена из Penicillium, такого как Penicillium brasilianum, раскрытая как SEQ ID NO:2 в WO 2007/019442, или из Trichoderma, такого как Trichoderma reesei, такие, как описано в US 6022725, US 6982159, US 7045332, US 7,005,289, US 2006/0258554 US 2004/0102619. В одном варианте осуществления можно применять даже бактериальную бета-глюкозидазу. В другом варианте осуществления бета-глюкозидаза получена из Thielavia terrestris (WO 2011/035029) или Trichophaea saccata (WO 2007/019442).

Например, композиция для применения в настоящем изобретении может включать эндоглюканазу (ЭГ) из Trichoderma, такого как Trichoderma reesei; из Humicola, такого как штамм Humicola insolens; из Aspergillus, такого как Aspergillus aculeatus или Aspergillus kawachii; из Erwinia, такого как Erwinia carotovara; из Fusarium, такого как Fusarium oxysporum; из Thielavia, такого как Thielavia terrestris; из Humicola, такого как Humicola grisea var. thermoidea или Humicola insolens; из Melanocarpus, такого как Melanocarpus albomyces; из Neurospora, такого как Neurospora crassa; из Myceliophthora, такого как Myceliophthora thermophila; из Cladorrhinum, такого как Cladorrhinum foecundissimum и/или из Chrysosporium, такого как штамм Chrysosporium lucknowense. В одном варианте осуществления можно применять даже бактериальную эндоглюканазу, включая эндоглюканазу Acidothermus cellulolyticus (см. WO 91/05039; WO 93/15186; US 5275944; WO 96/02551; US 5536655, WO 00/70031, WO 05/093050); эндоглюканазу III из Thermobifida fusca (см. WO 05/093050) и эндоглюканазу V из Thermobifida fusca (см. WO 05/093050), но не ограничиваясь ими.

Например, композиция для применения в настоящем изобретении может включать целлобиогидролазу I из Aspergillus, такого как Aspergillus fumigatus, такую как Cel7А СВН I, раскрытую в SEQ ID NO:6 в WO 2011/057140 или SEQ ID NO:6 в WO 2014/130812, или из Trichoderma, такого как Trichoderma reesei.

Например, композиция для применения в изобретении может содержать целлобиогидролазу II из Aspergillus, такого как Aspergillus fumigatus, такую как SEQ ID NO:7 в WO 2014/130812, или из Trichoderma, такого как Trichoderma reesei, или из Thielavia, такого как Thielavia terrestris, такую как целлобиогидролаза II CEL6A из Thielavia terrestris.

Например, композиция для применения в настоящем изобретении может содержать полипептид GH61 (литическую полисахаридную монооксигеназу) из Thermoascus, такого как Thermoascus aurantiacus, такую как описано в WO 2005/074656 как SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:1 в WO2014/130812 и в WO 2010/065830; или из Thielavia, такого как Thielavia terrestris, такую как описано в WO 2005/074647 как SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO:4 в WO2014/130812 и в WO 2008/148131, и WO 2011/035027; или из Aspergillus, такого как Aspergillus fumigatus, такую как описано в WO 2010/138754 как SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO: 3 в WO2014/130812; или из Penicillium, такого как Penicillium emersonii, такую как описана как SEQ ID NO:2 в WO 2011/041397 или SEQ ID NO:2 в WO2014/130812. Другие подходящие полипептиды GH61 включают Trichoderma reesei (см. WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (см. WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (см. WO 2011/005867), Thermoascus sp. (см. WO 2011/039319), и Thermoascus crustaceous (см. WO 2011/041504), но не ограничиваются ими. В одном аспекте полипептид GH61 применяют в присутствии растворимого активирующего двухвалентного металлического катиона в соответствии с WO 2008/151043, например магния сульфат. В одном аспекте полипептид GH61 применяют в присутствии диоксидного соединения, бициклического соединения, гетероциклического соединения, азотсодержащего соединения, хинонового соединения, серосодержащего соединения, или жидкости, полученной из предварительно обработанного целлюлозного материала, такого как предварительно обработанная кукурузная солома.

Другие целлюлолитические ферменты, которые можно использовать в композиции для применения в изобретении, описаны, например, в WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5457046, US 5648263 и US 5686593.

Кроме того, примеры ксиланаз, применяемых в настоящем изобретении, включают ксиланазы из Aspergillus aculeatus (см. WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (см. WO 2006/078256), Penicillium pinophi

- 14 031865 lum (см. WO 2011/041405), Penicillium sp. (см. WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (см. WO 2009/079210) и Trichophaea saccata GH10 (CM. WO 2011/057083), но не ограничиваются ими. Примеры бета-ксилозидаз, применяемых в интегрированных процессах из настоящего изобретения, включают бета-ксилозидазы из Neurospora crassa и Trichoderma reesei, но не ограничиваются ими. Примеры ацетилксилан-эстераз, пригодных в настоящем изобретении, включают ацетилксилан-эстеразы из Aspergillus aculeatus (см. WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (см. WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (см. WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (см. WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum и Thielavia terrestris NRRL 8126 (см. WO 2009/042846), но не ограничиваются ими. Примеры ферулоил-эстераз (эстераз феруловой кислоты), пригодных в настоящем изобретении, включают ферулоил-эстеразы из Humicola insolens DSM 1800 (см. WO 2009/076122), Neosartoryafischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (см. WO 2009/127729), и Thielavia terrestris (см. WO 2010/053838 и WO 2010/065448), но не ограничиваются ими. Примеры арабинофуранозидаз, пригодных в настоящем изобретении, включают арабинофуранозидазы из Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (см. WO 2006/114094 и WO 2009/073383) и M. giganteus (см. WO 2006/114094), но не ограничиваются ими. Примеры альфа-глюкуронидаз, пригодных в настоящем изобретении, включают альфа-глюкуронидазы из Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (см. WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (см. WO 2009/068565) и Trichoderma reesei, но не ограничиваются ими.

Композиция для применения в настоящем изобретении может включать один, два, три, четыре или более классов целлюлазы, например одну, две, три или четыре, или все из GH61, эндоглюканазу (EG), одну или две экзо-целлобиогидролазы (СВН) и бета-глюкозидазу (BG). Композиция для применения в настоящем изобретении может содержать два или больше любых из этих классов целлюлазы.

Композиция из настоящего изобретения может включать активность иного типа целлюлазной активности и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, чем тот, который обеспечивается композицией для применения в способе из настоящего изобретения. Например, композиция из настоящего изобретения может включать один тип целлюлазной и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, обеспеченной композицией, как описано в настоящей заявке, и второй тип целлюлазной и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, обеспеченной дополнительной целлюлазой/гемицеллюлазой/пектиназой.

В настоящей заявке целлюлаза является полипептидом, способным к деградации или модификации целлюлозы. Полипептид, способный к деградации целлюлозы, является полипептидом, способным к катализу процесса разрушения целлюлозы на единицы меньшего размера, либо частично, например, на целлодекстрины, либо полностью на глюкозные мономеры. Целлюлаза в соответствии с настоящим изобретением может давать начало смешанной популяции целлодекстринов и глюкозных мономеров при контакте с целлюлазой. Такая деградация, как правило, происходит путем реакции гидролиза.

Литические полисахаридные монооксигеназы (LPMO) недавно классифицированы CAZy в семейство АА9 (Семейство вспомогательной активности 9) и или семейство АА10 (Семейство вспомогательной активности 10). Как упоминалось выше, литические полисахаридные монооксигеназы способны к открытию кристаллической глюкановой структуры. Литические полисахаридные монооксигеназы могут также влиять на цело-олигосахариды. Термины РМО и LPMO применяются взаимозаменяемо. Белки GH61 (семейства гликозил-гидролаз 61 или иногда обозначаемые как EGIV) являются кислородзависимыми полисахаридными монооксигеназами (РМО) в соответствии с последними литературными данными. Часто в литературе эти белки упоминаются как усиливающие активность целлюлаз на лигноцеллюлозных субстратах. GH61 исходно классифицировали как эндоглюканазу, на основе определения очень слабой эндо-1,4-3^-глюканазной активности у одного члена семейства. Термин GH61, как применяется в настоящей заявке, необходимо понимать как семейство ферментов, разделяющее общие части консервативной последовательности и укладку для классификации как семейство 61 из хорошо установленной системы классификации CAZY GH (http://www.cazy.org/GH61.html). Семейство гликозидгидролаз 61 является членом семейства гликозид-гидролаз ЕС 3.2.1. GH61 применяется в настоящей заявке как часть целлюлаз. СВМ33 (семейство 33 углевод-связывающего модуля) является литической полисахаридной монооксигеназой (см. Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, p. 26322642). CAZy недавно переклассифицировала СМВ33 в АА10 (Семейство вспомогательной активности 10).

В настоящей заявке гемицеллюлаза является полипептидом, способным к деградации или модификации гемицеллюлозы. Таким образом, гемицеллюлаза способна к деградации или модификации одного или более из ксилана, глюкуроноксилана, арабиноксилана, глюкоманнана и ксилогликана. Полипептид, способный к деградации гемицеллюлозы, является полипептидом, способным к катализу процесса разрушения гемицеллюлозы на полисахариды меньшего размера, либо частично, например на олигосахариды, или полностью на сахарные мономеры, например гексозные или пентозные сахарные мономеры. Гемицеллюлаза в соответствии с изобретением может давать начало смешанной популяции олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с гемицеллюлазой. Такая деградация, как правило, осуществляется путем реакции гидролиза.

- 15 031865

В настоящей заявке пектиназа является полипептидом, способным к деградации или модификации пектина. Полипептид, способный к деградации, является полипептидом, способным к катализу процесса разрушения пектина на единицы меньшего размера, либо частично, например, на олигосахариды, либо полностью на сахарные мономеры. Пектиназа в соответствии с изобретением может давать начало смешанной популяции олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с пектиназой. Такая деградация, как правило, осуществляется путем реакции гидролиза.

Соответственно композиция из настоящего изобретения может включать любую целлюлазу, например GH61, целлобиогидролазу, эндо-в-1,4-глюканазу, бета-глюкозидазу или в-(1,3)(1,4)-глюканазу.

Соответственно целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91) является любым полипептидом, способным к катализу гидролиза 1,4-в-Э-глюкозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, с высвобождением целлобиозы с концов цепи. Этот фермент может также обозначаться как целлюлозо 1,4-в-целлобиозидаза,

1.4- в-целлобиогидролаза, 1,4-3-О-глюкан целлобиогидролаза, авицелаза, экзо-1,4-3-Э-глюканаза, экзоцеллобиогидролаза или экзоглюканаза.

При этом эндо-в-1,4-глюканаза (ЕС 3.2.1.4) является полипептидом, способным к катализу эндогидролиза 1,4-в-Э-глюкозидных связей в целлюлозных, лихениновых или злаковых β-Ό-глюканах. Такой полипептид может также быть способен к гидролизу 1,4-связей в β-Ό-глюканах, также содержащих 1,3связи. Этот фермент может также обозначаться как целлюлаза, авицелаза, в-1,4-эндоглюкан-гидролаза, в-1,4-глюканаза, карбоксиметилцеллюлаза, целлюдекстриназа, эндо-1,4-в-Э-глюканаза, эндо-1.4-в-Эглюканогидролаза, эндо-1,4-в-глюканаза или эндоглюканаза.

При этом бета-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21) является любым полипептидом, способным к катализу гидролиза терминальных, не-восстанавливающих β-Ό-глюкозных остатков с высвобождением β-Όглюкозы. Такой полипептид может иметь широкую специфичность по отношению к β-Ό-глюкозидам, и может также гидролизовать одно или более из следующего: β-Ό-галактозид, a-L-арабинозид, β-Όксилозид или β-Ό-фукозид. Этот фермент может также обозначаться как амигдалаза, β-Ό-глюкозидглюкогидролаза, целлобиаза или гентобиаза.

При этом β-(1,3)(1,4)-глюканаза (ЕС 3.2.1.73) является любым полипептидом, способным к катализу гидролиза Щ^-Э-глюкозидных связей в β-Ό-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4-связи. Такой полипептид может действовать на лихениновые и злаковые β-Ό-глюканы, но не на β-Ό-глюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Этот фермент может также обозначаться как лихениназа, 1,3-1,4-β-D-глюкан-4глюканогидролаза, β-глюканаза, эндо-β-1,3-1,4-глюканаза, лихеназа или β-глюканаза смешанных связей. Альтернативой для этого типа фермента является ЕС 3.2.1.6, которая описана как эндо-1,3(4)-бетаглюканаза. Этот тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в бета-Э-глюканазе, когда глюкозный остаток, чья восстанавливающая группа вовлекается в связь, подвергающуюся гидролизу, сама замещается на С-3. Альтернативные наименования включают эндо-1,3-бета-глюканазу, ламинариназу, 1,3-(1,3;1,4)бета-Э-глюкан 3(4)-глюканогидролазу; субстраты включают ламинариновые, лихениновые и злаковые бета-Э-глюканы.

Композиция из настоящего изобретения может включать гемицеллюлазу, например эндоксиланазу, β-ксилозидазу, a-L-арабинофуранозидазу, α-Ό-глюкуронидазу, ацетилксилан-эстеразу, ферулоилэстеразу, кумароил-эстеразу, a-галактозидазу, β-галактозидазу, β-маннаназу, или β-маннозидазу.

При этом эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8) является любым полипептидом, способным к катализу эндогидролиза 1,4-β-D-ксилозидных связей в ксиланах. Этот фермент может также обозначаться как эндо-

1.4- β-D-ксиланаза или 1,4-β-D-ксилан-ксиланогидролаза. Альтернативной является ЕС 3.2.1.136, глюкуроноарабиноксилан-эндоксиланаза, фермент, способный к гидролизу 1,4-ксилозидных связей в глюкуроноарабиноксиланах.

При этом β-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37) является любым полипептидом, способным к катализу гидролиза 1,4-β-D-ксиланов, для удаления последовательных остатков Ό-ксилозы из не-восстанавливающих концов. Такие ферменты могут также гидролизовать ксилобиозу. Этот фермент может также обозначаться как ксилан-1,4-β-ксилозидаза, 1,4-β-Ό-ксилан-ксилогидролаза, экзо-1,4-β-ксилозидаза или ксилобиаза.

При этом a-L-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55) является любым полипептидом, способным к воздействию на a-L-арабинофуранозиды, a-L-арабинаны, содержащие (1,2) и/или (1,3)- и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Этот фермент может также обозначаться как a-Nарабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза.

При этом a-D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139) является любым полипептидом, способным к катализу реакции следующего вида: альфа-Э-глюкуронидаза + Н(2)О = спирт + Ό-глюкуронат. Этот фермент может также обозначаться как альфа-глюкуронидаза или альфа-глюкозидуроназа. Эти ферменты могут также гидролизовать 4-О-метилированную глюкуроновую кислоту, которая может также присутствовать в качестве заместителя в ксиланах. Альтернативой является ЕС 3.2.1.131, ксиалн-альфа-1,2глюкуронозидаза, которая катализирует гидролиз альфа-1,2-(4-О-метил)глюкуронозильных связей.

При этом ацетилксиланэстераза (ЕС 3.1.1.72) является любым полипептидом, способным к катализу деацилирования ксиланов и ксило-олигосахаридов. Такой полипептид может катализировать гидролиз

- 16 031865 ацетильных групп из полимерного ксилана, ацетилированной ксилозы, ацетилированной глюкозы, альфа-нафтил-ацетата или п-нитрофенил-ацетата, но как правило, не из триацетилглицерина. Такой полипептид, как правило, не действует на ацетилированный маннан или пектин.

При этом ферулоил-эстераза (ЕС 3.1.1.73) является полипептидом, способным к катализу реакции в виде: ферулоил-сахарид + Н(2)О = ферулат + сахарид. Сахарид может быть, например, олигосахаридом или полисахаридом. Он может, как правило, катализировать гидролиз 4-гидрокси-3метоксициннамоильной (ферулоильной) группы их этерифицированного сахара, который обычно является арабинозой в натуральных субстратах. Как правило, п-нитрофенил ацетат и метил-ферулат являются более плохими субстратами. Этот фермент может также обозначаться как циннамоил-эфир-гидролаза, феруловой кислоты эстераза или гидроксициннамоил-эстераза. Он может также обозначаться как гемицеллюлазный вспомогательный фермент, поскольку он может помогать ксиланазам и пектиназам разрушать гемицеллюлозу и пектин клеточной стенки растений.

При этом кумароилэстераза (ЕС 3.1.1.73) является любым полипептидом, способным к катализу реакции вида: кумароил-сахарид + Н(2)О = кумарат + сахарид. Сахарид может быть, например, олигосахаридом или полисахаридом. Этот фермент может также обозначаться как транс-4-кумароилэстераза, транс-п-кумароилэстераза, п-кумароилэстераза или эстераза п-кумаровой кислоты. Этот фермент также относится к ЕС 3.1.1.73, так что может также обозначаться как ферулоилэстераза.

При этом α-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22) является любым полипептидом, способным к катализу гидролиза терминальных, не-восстанавливающих a-D-галактозных остатков в a-D-галактозидах, включая галактозные олигосахариды, галактоманнаны, галактаны и арабиногалактаны. Такой полипептид может также быть способным к гидролизу a-D-фукозидов. Этот фермент может также обозначаться как мелибиаза.

При этом β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23) является любым полипептидом, способным к катализу гидролиза терминальных не-восстанавливающих β-Π-галактозных остатков в β-Π-галактозидах. Такой полипептид может также быть способным к гидролизу a-L-арабинозидов. Этот фермент может также быть обозначен как экзо-(1^4)-в^-галактаназа или лактаза.

При этом β-маннаназа (ЕС 3.2.1.78) является полипептидом, способным к катализу произвольного гидролиза 1,4-в-Э-маннозидных связей в маннанах, галактоманнанах и глюкоманнанах. Этот фермент может также быть обозначен как маннан-эндо-1,4-в-маннозидаза или эндо-1,4-маннаназа.

При этом β-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25) является любым полипептидом, способным к катализу гидролиза терминальных, не-восстанавливающих β-Ο-маннозных остатков в β-Э-маннозидах. Этот фермент может также обозначаться как маннаназа или манназа.

Композиция из настоящего изобретения может содержать любую пектиназу, например эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, бета-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинлиазу, пектатлиазу, альфарамнозидазу, экзогалактуроназу, экзополигалактуронат-лиазу, рамногалактуронан-гидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронан-цетилэстеразу, рамногалактуронангалактуроногидролазу, ксилогалактуроназу.

При этом эндополигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15) является любым полипептидом, способным к катализу произвольного гидролиза 1,4-а-О-галактозидуроновых связей в пектате и других галактуронанах. Этот фермент может также быть обозначен как полигалактуроназа пектиндеполимераза, пектиназа, эндополигалактуроназа, пектолаза, пектингидролаза, пектинполигалактуроназа, поли-а-1,4галактуронидглюканогидролаза, эндогалактуроназа, эндо-Э-галактуроназа или поли(1,4-а-Эгалактуронид)гликаногидролаза.

При этом пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11) является любым ферментом, способным к катализу реакции: пектин = n H₂O = n метанол + пектат. Фермент может также быть известен как пектинэстераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилэстеразза, пектаза, пектиноэстераза или пектинпектилгидролаза.

При этом эндогалактаназа (ЕС 3.2.1.89) является любым ферментом, способным к катализу эндогидролиза 1,4-β-D-галактозидных связей в арабиногалактанах. Фермент может также быть известен как арабиногалактан-эндо-1,4-β-галактозидаза, эндо-1,4-β-галактаназа, галактаназа, арабиногалактаназа или арабиногалактан-4-β-D-галактаногидролаза.

При этом пектинацетилэстераза определяется в настоящей заявке как фермент, который обладает ацетилэстеразной активностью, который катализирует деацетилирование ацетильных групп на гидроксильных группах GalUA остатков пектина.

При этом эндопектинлиаза (ЕС 4.2.2.10) является ферментом, способным к катализу элиминациоиного расщепления (1^4)-а-О-галактуронан-метилового эфира до получения олигосахаридов с 4-дезокси6-О-метил-а-О-галакт-4-енуронозильных групп на их не-восстанавливающих концах. Фермент может также быть известен как пектинлиаза, пектинтрансэлиминаза, эндопектинлиаза, полиметилгалактуроновая трансэлиминаза, пектинметилтрансэлиминаза, пектолиаза, ПЛ, ПНЛ или ПМГЛ или (1^4)-6-0метил-а-О-галактуронанлиаза.

- 17 031865

При этом пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2) является ферментом, способным к катализу элиминирующего расщепления (1^4)-а-Э-галактуронана с получением олигосахаридов с 4-дезокси-а-Э-галакт-4енуронозильных групп на их не-восстанавливающих концах. Этот фермент может также быть известен как полигалактуроновая трансэлиминаза, пектиновой кислоты трансэлиминаза, полигалактуронатлиаза, эндопектинметилтрансэлиминаза, пектаттрансэлиминаза, эндогалактуронаттрансэлиминаза, пектиновой кислоты лиаза, пектиновая лиаза, а-1,4-Э-эндополигалактуроновой кислоты лиаза, ПГА лиаза, ППаза-N, эндо-а-1,4-полигалактуроновой кислоты лиаза, полигалактуроновой кислоты лиаза, пектинтрансэлиминаза, полигалактуроновой кислоты транс-элиминаза или (1^4)-а-Э-галактуронан-лиаза.

При этом альфарамнозидаза (ЕС 3.2.1.40) является любым полипептидом, способным к катализу гидролиза терминальных не-восстанавливающих a-L-рамнозных остатков в a-L-рамнозидах или альтернативно в рамногалактуронане. Этот фермент может также быть известен как a-L-рамнозидаза Т, a-Lрамнозидаза N или a-L-рамнозида рамногидролаза.

При этом экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82) является любым полипептидом, способным к гидролизу пектиновой кислоты на не-восстанавливающем конце, с высвобождением дигалактуроната. Этот фермент может также быть известен как экзо-поли-а-галактуронозидаза, экзополигалактуронозидаза или экзополигалактуранозидаза.

При этом экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.67) является полипептидом, способным к катализу: (1,4-a-Dгалактуронид)_п + H₂O = (1.4-аЮ-галактуронид)_м-| + D-галактуронат. Фермент может также быть известен как галактуран-1,4-а-галактуронидаза, экзополигалактуроназа, поли(галактуронат)гидролаза, экзо-Dгалактуроназа, экзо-Э-галактуронаназа, экзополиЮ-галактуроназа или поли(1,4-а-Эгалактуронид)галактуроногидролаза.

При этом экзополигалактуронатлиаза (ЕС 4.2.2.9) является полипептидом, способным к катализу элиминирующего расщепления 4-(4-дезокси-а-О-галакт-4-енуронозил)-О-галактуроната с восстанавливающего конца пектата, т.е. де-этерифицированного пектина. Этот фермент может быть известен как пектатдисахаридлиаза, пектатэкзолиаза, экзопектиновой кислоты трансэлиминаза, экзопектатлиаза, экзополигалактуроновой кислоты трансэлиминаза, ПКТЭ, экзо-ПКТЭ, экзо-ПГЛ или (1^4)-a-Dгалактуронана восстанавливающего конца дисахарид-лиаза.

При этом рамногалактуронангидролаза является полипептидом, способным к эндо-гидролизу связи между галактозилуроновой кислотой и рамнопиранозилом в строго чередующихся рамногалактуронановых структурах, состоящих из дисахарида [(1,2-альфа-Е-рамноил-(1,4)-альфа-галактозилуроновой кислоты)].

При этом рамногалактуронан-лиаза является любым полипептидом, способным к расщеплению связей а-Е-Рамн_р-(1^4)-а-Э-Гал_рА эндо-образом в рамногалактуронане путем бета-элиминации.

При этом рамногалактуронанацетилэстераза является любым полипептидом, катализирующим деацетилирование основного каркаса из чередующихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты в рамногалактуронане.

При этом рамногалактуронангалактуроногидролаза является полипептидом, способным к экзогидролизу галактуроновой кислоты с невосстанавливающего конца строго чередующихся рамногалактуронановых структур.

При этом ксилогалактуроназа является любым полипептидом, действующим на ксилогалактуронан путем расщепления каркаса из β-ксилозо-замещенной галактуроновой кислоты эндо-образом. Этот фермент может также быть известен как ксилогалактуронангидролаза.

При этом a-L-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55) является любым полипептидом, способным к воздействию на a-арабинофуранозиды, a-арабинаны, содержащие (1,2) и/или (1,3)- и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Этот фермент может также обозначаться как a-N-арабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза.

При этом эндоарабинаназа (ЕС 3.2.1.99) является любым полипептидом, способным к катализу эндогидролиза 1,5-а-арабинофуранозидных связей в 1,5-арабинанах. Фермент может также быть известен как эндоарабиназа, арабинанэндо-1,5-а-Е-арабинозидаза, эндо-1,5-а-Е-арабинаназа, эндо-а-1,5арабаназа, эндарабаназа или 1,5аШ-арабинан 1,5-а-Е-арабинаногидролаза.

Композиция из настоящего изобретения, как правило, содержит по меньшей мере одну целлюлазу и/или по меньшей мере одну гемицеллюлазу и/или по меньшей мере одну пектиназу (одна из которых является полипептидом в соответствии с настоящим изобретением). Композиция из настоящего изобретения может содержать GH61, целлобиогидролазу, эндоглюканазу и/или бета-глюкозидазу. Такая композиция может также содержать одну или несколько гемицеллюлаз и/или одну или несколько пектиназ.

Кроме того, одно или более (например, два, три, четыре или все) из амилазы, протеазы, липазы, лигниназы, гексозилтрансферазы, глюкуронидазы или экспанзина или индуцируемого целлюлозой белка или интегрирующего целлюлозу белка или подобного белка могут присутствовать в композиции из настоящего изобретения (они обозначаются как вспомогательные активности выше).

Протеаза включает ферменты, которые гидролизуют пептидные связи (пептидазы), а также фер

- 18 031865 менты, которые гидролизуют связи между пептидами и другими компонентами, такими как сахара (гликопептидазы). Многие протеазы характеризуются по ЕС 3.4, пригодны для применения в настоящем изобретении и включены посредством ссылки. Некоторые специфические типы протеаз включают цистеиновые протеазы, включая пепсин, папаин и сериновые протеазы, включая химотрипсин, карбоксипептидазы и металлоэндопептидазы.

Липаза включает ферменты, которые гидролизуют липиды, жирные кислоты и ацилглицериды, включая фосфоглицериды, липопротеины, диацилглицерины, и тому подобное. В растениях липиды применяются в качестве структурных компонентов для ограничения потери воды и инфекции патогенами. Эти липиды включают воски, полученные из жирных кислот, а также кутин и суберин.

Лигниназа включает ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать структуры лигниновых полимеров. Ферменты, которые могут разрушать лигнин, включают лигнин-пероксидазы, марганцевые пероксидазы, лакказы и ферулоил-эстеразы, а другие ферменты, описанные в данной области техники, известны как деполимеризующие или иным образом разрушающие лигниновые полимеры. Также включены ферменты, способные гидролизовать связи между гемицеллюлозными сахарами (особенно арабинозой) и лигнином. Лигниназы включают следующие группы ферментов: лигнин-пероксидазы (ЕС 1.11.1.14), марганцевые пероксидазы (ЕС 1.11.1.13), лакказы (ЕС 1.10.3.2) и ферулоил-эстеразы (ЕС 3.1.1.13), но не ограничиваются ими.

Гексозилтрансфераза (2,4,1-) включает ферменты, которые способны к катализу трансферазной реакции, но которые также катализируют реакцию гидролиза, например, целлюлозы и/или продуктов деградации целлюлозы. Примером гексозилтрансферазы, которую можно применять в настоящем изобретении, является β-глюканозилтрансфераза. Такой фермент может быть способен к катализу деградации (1,3)(1,4)глюкана и/или целлюлозы и/или продукта деградации целлюлозы.

Глюкуронидаза включает ферменты, которые катализируют гидролиз глюкуронозида, например β-глюкуронозида, с получением спирта. Многие глюкуронидазы охарактеризованы и могут быть пригодными для применения в настоящем изобретении, например β-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроно-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфоглюкозамин-глюкуродидаза (3.2.1.56), глицирризинат-β-глюкуронидаза (3.2.1.128) или a-D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139).

Композиция для применения в настоящем изобретении может включать экспанзин или экспанзинподобный белок, такой как сволленин (см. Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) или сволленин-подобный белок.

Экспанзины вовлечены в ослабление структуры клеточной стенки во время роста клеток растений. Экспанзины были предложены для разрушения водородных связей между целлюлозой и другими полисахаридами клеточной стенки без наличия гидролитической активности. Таким образом, предполагается, что они обеспечивают скольжение целлюлозных волокон и увеличение клеточной стенки. Сволленин, экспанзин-подобный белок, содержит N-концевой углевод-связывающего модуля семейства 1 домен (CBD) и С-концевой экспанзин-подобный домен. Для целей настоящего изобретения экспанзинподобный белок или сволленин-подобный белок может содержать один или оба таких домена и/или может разрушать структуру клеточных стенок (например, разрушая целлюлозную структуру), необязательно без продукции выявляемых количеств восстанавливающих сахаров.

Композиция для применения в настоящем изобретении может быть индуцируемым целлюлозой белком, например полипептидным продуктом cipl или cip2 гена или подобных генов (см. Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34). 31988-31997, 2003), целлюлозу/целлулосому интегрирующим белком, например полипептидным продуктом гена cipA или cipC, или скаффолдином или скаффолдин-подобным белком. Скаффолдины и целлюлозу интегрирующие белки являются мультифункциональными интегрирующим субъединицами, которые могут организовать целлюлолитические субъединицы в мультиферментный комплекс. Это осуществляется путем взаимодействия двух комплементарных классов доменов, т.е. домена когезии на скаффолдине и домена докерин на каждой ферментативной единице. Субъединица скаффолдина также несет домен, связывающий целлюлозу (СВМ), который опосредует прикрепление целлюлосомы к ее субстрату. Скаффолдин или белок, интегрирующий целлюлозу, для целей настоящего изобретения может включать оба таких домена.

Композиция для применения в настоящем изобретении может также включать каталазу. Термин каталаза означает перекись водорода: перекись водорода-оксидоредуктазу (ЕС 1.11.1.6 или ЕС 1.11.1.21), которая катализирует превращение двух перекисей водорода в кислород и две воды. Активность каталазы можно определить путем мониторинга деградации перекиси водорода при 240 нм на основе следующей реакции: 2Н₂О₂ 2Н₂О + О₂. Реакцию проводят в 50 мМ фосфатном буфере при рН 7,0 при 25°С с 10,3 мМ субстратом (H₂O₂) и примерно 100 единицами фермента на мл. Поглощение контролируют спектрофотометрически в пределах 16-24 с, что должно соответствовать снижению поглощения от 0,45 до 0,4. Одна единица каталазной активности может быть выражена в виде деградации 1 мкмоль Н2О2 в 1 мин при рН 7,0 и 25°С.

Композиция для применения в способе из настоящего изобретения может состоять из члена каждого класса ферментов, упомянутых выше, нескольких членов каждого класса ферментов или любой ком

- 19 031865 бинации этих классов ферментов и вспомогательных белков (т.е. белков, упомянутых в настоящей заявке, которые не обладают ферментативной активностью как таковой, но тем не менее способствуют деградации лигноцеллюлозы).

Композиция для применения в способе из настоящего изобретения может состоять из ферментов от (1) коммерческих поставщиков; (2) клонированных генов, экспрессирующих ферменты; (3) комплексного бульона (такого как полученный при росте микробного штамма в среде, где штаммы секретируют белки и ферменты в среду); (4) клеточных лизатов при выращивании штаммов, как в п.(3); и/или (5) растительного материала, экспрессирующего ферменты. Различные ферменты в композиции из настоящего изобретения могут быть получены из различных источников.

Ферменты могут быть получены экзогенным способом в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях или растениях, затем выделены и добавлены, например, в лигноцеллюлозный сырьевой материал. Альтернативно, ферменты получают, но не выделяют, и неочищенный бульон от ферментации клеточной массы, или растительный материал (такой, как кукурузная солома или пшеничная солома) и тому подобное можно добавить, например, к сырьевому материалу. Альтернативно, неочищенную клеточную массу или среду от производства ферментов или растительный материал можно обработать для предотвращения дальнейшего роста микроорганизмов (например, путем нагревания или добавления антимикробных агентов), затем добавить, например, к сырьевому материалу. Эти неочищенные смеси ферментов могут включать организм, продуцирующий фермент. Альтернативно, фермент может быть получен при ферментации, при которой применяется (предварительно обработанный) сырьевой материал (такой как кукурузная солома или пшеничная солома) для обеспечения питания организма, продуцирующего фермент(ы). Таким образом, растения, продуцирующие ферменты, могут сами служить в качестве лигноцеллюлозного сырьевого материала, и могут быть добавлены в лигноцеллюлозный сырьевой материал.

В применениях и способах, описанных в настоящей заявке, компоненты из композиций, описанных выше, могут быть обеспечены совместно (т.е. в единой композиции как таковой) или по отдельности или последовательно.

Таким образом, изобретение относится к способам, в которых применяют композицию, описанную выше, и к применению композиции в промышленных процессах.

В одном варианте осуществления ферментная композиция может быть цельным ферментационным бульоном, как описано ниже. Цельный ферментационный бульон может быть приготовлен при ферментации не-рекомбинантных и/или рекомбинантных мицелиальных грибов. В одном варианте осуществления мицелиальный грибок является рекомбинантным мицелиальным грибом, содержащим один или несколько генов, которые могут быть гомологичными или гетерологичными для мицелиальных грибов. В одном варианте осуществления мицелиальный гриб является рекомбинантным мицелиальным грибом, содержащим один или несколько генов, которые могут быть гомологичными или гетерологичными для мицелиального гриба, в котором один или несколько генов кодируют ферменты, которые могут разрушать целлюлозный субстрат. Цельный ферментационный бульон может содержать любые полипептиды или любую их комбинацию.

Предпочтительно ферментная композиция является цельным ферментационным бульоном, где цельные клетки являются убитыми. Цельный ферментационный бульон может содержать органическую кислоту (кислоты) (используемую для лизиса клеток), убитые клетки и/или клеточный детрит, и культуральную среду.

Как правило, мицелиальных грибы культивируют в среде для культивирования клеток, пригодной для получения фермента, способного к гидролизу целлюлозного субстрата. Культивирование осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углеводорода и азота и неорганические соли, с применением процедур, известных в данной области техники. Подходящие среды для культивирования, температурные диапазоны и другие условия, пригодные для роста и выработки целлюлазы и/или гемицеллюлазы и/или пектиназы, известны в данной области техники. Цельный ферментационный бульон можно приготовить путем выращивания мицелиальных грибов до стационарной фазы и выдерживания мицелиальных грибов в условиях ограничения углерода в течение периода времени, достаточного для экспрессии одной или нескольких целлюлаз и/или гемицеллюлаз и/или пектиназ. Как только ферменты, такие как целлюлазы и/или гемицеллюлазы и/или пектиназы, секретируются мицелиальными грибами в ферментационную среду, цельный ферментационный бульон можно использовать. Цельный ферментационный бульон из настоящего изобретения может содержать мицелиальные грибы. В некоторых вариантах осуществления цельный ферментационный бульон содержит не фракционированное содержимое ферментационных материалов, полученных к концу ферментации. Как правило, цельный ферментационный бульон содержит истощенную культуральную среду и клеточный детрит, присутствующий после выращивания мицелиальных грибов до насыщения, инкубации в условиях ограничения углерода для обеспечения синтеза белков (в частности, экспрессии целлюлаз и/или гемицеллюлаз и/или пектиназ). В некоторых вариантах осуществления цельный ферментационный бульон содержит истощенную среду для культивирования клеток, экстраклеточные ферменты и мицелиальные грибы. В некоторых вариантах осуществления мицелиальные грибы, присутствующие в цельном ферментационном бульоне, могут быть лизированы, пермеабилизированы или убиты с применением способов, известных в данной

- 20 031865 области техники для получения цельного ферментационного бульона с лизированными клетками. В одном варианте осуществления цельный ферментационный бульон является цельным ферментационным бульоном с убитыми клетками, где цельный ферментационный бульон содержит клетки мицелиальных грибов, являющиеся лизированными или убитыми. В некоторых вариантах осуществления клетки убивают посредством лизиса мицелиальных грибов посредством химической и/или рН обработки для получения цельного бульона с лизированными клетками мицелиальных грибов. В некоторых вариантах осуществления клетки убивают путем лизиса мицелиальных грибов посредством химической и/или рН обработки и подведения рН ферментационной смеси с убитыми клетками до подходящего значения рН. В одном варианте осуществления цельный ферментационный бульон содержит первый компонент из органической кислоты, содержащий органическую кислоту по меньшей мере с 1-5 атомами углерода и/или ее соль, и второй компонент из органической кислоты, содержащий органическую кислоту по меньшей мере с 6 или более атомами углерода и/или ее соль. В одном варианте осуществления первый компонент из органической кислоты является уксусной кислотой, муравьиной кислотой, пропионовой кислотой, ее солью или любой их комбинацией, а второй компонент из органической кислоты является бензойной кислотой, циклогексанкарбоновой кислотой, 4-метилвалериановой кислотой, фенилуксусной кислотой, ее солью, или любой их комбинацией.

Термин цельный ферментационный бульон, как применяется в настоящей заявке, означает препарат, полученный путем ферментации клеток, который не подвергается, или подвергается минимальному выделению и/или очистке. Например, получают цельный ферментационный бульон, где микробные культуры выращивают до насыщения, инкубируют в условиях ограничения углерода для обеспечения синтеза белков (например, экспрессии ферментов клетками-носителями) и секреции в среду культивирования клеток. Как правило, цельный ферментационный бульон является не фракционированным, и содержит истощенную среду для культивирования клеток, экстраклеточные ферменты и микробные, предпочтительно нежизнеспособные клетки.

При необходимости цельный ферментационный бульон можно фракционировать, и можно применять одно или более из фракционированного содержимого. Например, лизированные клетки и/или клеточный детрит можно удалить из цельного ферментационного бульона для получения композиции, не содержащей этих компонентов.

Цельный ферментационный бульон может дополнительно содержать консервант и/или антимикробный агент. Такие консерванты и/или агенты известны в данной области техники.

Цельный ферментационный бульон, как описано в настоящей заявке, как правило, является жидкостью, но может содержать нерастворимые компоненты, такие как лизированные клетки, клеточный детрит, компоненты культуральной среды, и/или нерастворимый фермент(ы). В некоторых вариантах осуществления нерастворимые компоненты могут быть удалены для осветления цельного ферментационного бульона.

В одном варианте осуществления цельный ферментационный бульон может быть дополнен одной или несколькими ферментативными активностями, которые не экспрессируются эндогенно, или экспрессируются на относительно низком уровне мицелиальными грибами, для улучшения деградации целлюлозного субстрата, например, до ферментируемых сахаров, таких как глюкоза или ксилоза. Дополнительный фермент(ы) может быть добавлен в виде добавки к цельному ферментационному бульону, а ферменты могут быть компонентом отдельного цельного ферментационного бульона, или могут быть очищены, или минимально извлечены и/или очищены.

В одном варианте осуществления цельный ферментационный бульон содержит цельный ферментационный бульон от ферментации рекомбинантных мицелиальных грибов, избыточно экспрессирующих один или несколько ферментов для улучшения деградации целлюлозного субстрата. Альтернативно, цельный ферментационный бульон может содержать смесь цельного ферментационного бульона от ферментации не-рекомбинантного мицелиального гриба и рекомбинантного мицелиального гриба, избыточно экспрессирующего один или несколько ферментов для улучшения деградации целлюлозного субстрата. В одном варианте осуществления цельный ферментационный бульон включает цельный ферментационный бульон от ферментации мицелиальных грибов, избыточно экспрессирующих бета-глюкозидазу. Альтернативно, цельный ферментационный бульон для применения в настоящих способах и реактивных композициях может содержать смесь цельного ферментационного бульона от ферментации нерекомбинантного мицелиального гриба и цельного ферментационного бульона от ферментации рекомбинантного мицелиального гриба, избыточно экспрессирующего бета-глюкозидазу.

Лигноцеллюлозный материал.

Лигноцеллюлозный материал в настоящей заявке включает любой лигноцеллюлозный и/или гемицеллюлозный материал. Лигноцеллюлозный материал, пригодный для применения в качестве сырьевого материала в настоящем изобретении, включает биомассу, например первичную биомассу и/или непервичную биомассу, коммерческую органику, строительный и городской мусор, твердые коммунальные отходы, макулатуру и садовые отходы. Общие формы биомассы включают деревья, кустарники и траву, пшеницу, пшеничную солому, сахарный тростник, тростниковую солому, тростниково-сахарную багассу, просо, мискантус, энергетический тростник, кукурузу, кукурузную солому, кукурузную шелуху,

- 21 031865 стержни кукурузных початков, стебли канолы, стебли сои, сахарное сорго, зерна кукурузы, включая волокна из зерен, продукты и субпродукты от помола зерен, таких как кукуруза, пшеница и ячмень (включая мокрый помол и сухой помол), часто обозначаемые как отруби или волокно, а также коммунальные твердые отходы, макулатуру и садовые отходы. Биомасса также может быть травянистым материалом, сельскохозяйственными отходами, отходами лесного хозяйства, коммунальными твердыми отходами, макулатурой, и бумажной массой и отходами от производства бумаги, но не ограничивается ими. Сельскохозяйственная биомасса включает ветви, кусты, тростник, кукурузу и кукурузную шелуху, энергетические культуры, лесоматериал, плоды, цветы, зерна, траву, травянистые культуры, листья, кору, хвою, бревна, корни, побеги, древесные культуры с короткой ротацией, кустарники, просо, деревья, овощи, кожуру плодов, лианы, жом сахарной свеклы, пшеничные отруби, шелуху овса, и твердую и мягкую древесину (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает органические отходы, образуемые в сельскохозяйственных процессах, включая земледелие и лесное хозяйство, в особенности включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может быть любой из вышеупомянутого, по отдельности или в комбинации, или их смесью.

Предварительная обработка.

Лигноцеллюлозный материал, используемый в настоящем изобретении, может быть промыт и/или подвергнут предварительной обработке. Сырьевой материал может быть необязательно подвергнут предварительной обработке с нагреванием, механической и/или химической модификацией, или любой комбинацией таких способов, для повышения доступности субстрата для ферментативного гидролиза и/или гидролиза гемицеллюлозы и/или солюбилизации гемицеллюлозы и/или целлюлозы и/или лигнина, любым способом, известным в данной области техники. В одном варианте осуществления предварительную обработку проводят, обрабатывая лигноцеллюлозу паром, горячей водой или разбавленной кислотой или разбавленным основанием.

В одном варианте осуществления лигноцеллюлозный материал подвергают предварительной обработке до и/или во время ферментативного гидролиза. Способы предварительной обработки известны в данной области техники и включают нагревание, механическую, химическую модификацию, биологическую модификацию, и любую их комбинацию, но не ограничиваются ими. Предварительную обработку, как правило, проводят для повышения доступности лигноцеллюлозного материала для ферментативного гидролиза и/или гидролиза гемицеллюлозы и/или солюбилизации гемицеллюлозы и/или целлюлозы и/или лигнина, в лигноцеллюлозном материале. В одном варианте осуществления предварительная обработка включает обработку лигноцеллюлозного материала паром, обработку горячей водой или обработку разбавленной кислотой или разбавленным основанием. Примеры способов предварительной обработки включают обработку паром (например, обработку при 100-260°C, под давлением 7-45 бар, при нейтральном рН, в течение 1-10 мин), обработку разбавленной кислотой (например, обработку с 0,1-5% H₂SO₄и/или SO₂ и/или HNO₃ и/или HCl, в присутствии или при отсутствии пара, при 120-200°C, под давлением 2-15 бар, при кислом рН, в течение 2-30 мин), обработку органическим растворителем (например, обработку 1-1,5% H₂SO₄ в присутствии органического растворителя и пара, при 160-200°C, под давлением 730 бар, при кислом рН, в течение 30-60 мин), обработку известью (например, обработку 0,1-2% NaOH/Ca(OH)₂ в присутствии воды/пара при 60-160°C, под давлением 1-10 бар, при щелочном рН, в течение 60-4800 мин), ARP обработку (например, обработку 5-15% NH₃, при 150-180°C, под давлением 917 бар, при щелочном рН, в течение 10-90 мин), AFEX обработку (например, обработку с >15% NH₃, при 60-140°C, под давлением 8-20 бар, при щелочном рН, в течение 5-30 мин), но не ограничиваются ими.

Этап промывания.

Необязательно, способ в соответствии с настоящим изобретением включает этап промывания. Необязательный этап промывания может применяться для удаления водорастворимых соединений, которые могут действовать в качестве ингибиторов для этапа ферментации. Этап промывания можно проводить обычным способом.

Лигноцеллюлозный материал может быть промыт. В одном варианте осуществления лигноцеллюлозный материал может быть промыт после предварительной обработки. Этап промывания можно применять для удаления водорастворимых соединений, которые могут действовать в качестве ингибиторов для этапа ферментации и/или гидролиза. Этап промывания можно проводить способом, известным специалистам в данной области техники. Вслед за промыванием, существуют другие способы детоксикации. Подвергнутый предварительной обработке лигноцеллюлозный материал может также быть подвергнут детоксикации любым (или комбинацией) из этих способов, которые включают отделение твердого вещества/жидкости, вакуумное упаривание, экстракцию, адсорбцию, нейтрализацию, избыточное известкование, добавление восстанавливающих агентов, добавление детоксицирующих ферментов, таких как лакказы или пероксидазы, добавление микроорганизмов, способных к детоксикации гидролизатов, но не ограничиваются ими.

Ферментативный гидролиз.

Ферментная композиция, используемая в способе из настоящего изобретения, может крайне эффективно гидролизовать лигноцеллюлозный материал, например кукурузную солому, пшеничную солому,

- 22 031865 тростниковую солому, и//или тростниково-сахарную багассу, которую можно затем превратить в полезный продукт, такой как этанол, биогаз, бутанол, молочная кислота, пластик, органическая кислота, растворитель, добавка к корму животных, фармацевтическое средство, витамин, аминокислота, фермент или химический сырьевой материал. Кроме того, промежуточные продукты от процесса после гидролиза, например молочную кислоту в качестве промежуточного продукта при производстве биогаза, можно применять в качестве стандартного блока для других материалов. Настоящее изобретение сопровождается примерами производства этанола, но они приводятся с целью иллюстрации, а не ограничения, также можно производить другие упомянутые полезные продукты.

Способ в соответствии с настоящим изобретением включает этап ферментативного гидролиза. Ферментативный гидролиз включает гидролиз с целью ожижения сырьевого материала, и гидролиз с целью высвобождения сахара из сырьевого материала, или то и другое, но не ограничивается ими. На этом этапе необязательно подвергнутый ферментативной обработке и необязательно промытый лигноцеллюлозный материал приводят в контакт с ферментативной композицией в соответствии с настоящим изобретением. В зависимости от лигноцеллюлозного материала и предварительной обработки, различные условия реакции, например температура, дозировка фермента, время реакции гидролиза и концентрация сухого вещества могут быть приспособлены специалистом в данной области техники для достижения необходимого превращения лигноцеллюлозы в сахар. Далее приведены некоторые указания.

В одном аспекте изобретения гидролиз проводят при температуре 45°С или выше, 50°C или выше, 55°С или выше, 60°C или выше, 65°С или выше, или 70°C или выше. Высокая температура при гидролизе имеет многие преимущества, которые включают работу при оптимальной температуре ферментной композиции, снижение риска (бактериальной) контаминации, снижение вязкости, меньшее количество необходимой для охлаждения воды, применение охлаждающей воды с более высокой температурой, повторное применение ферментов и т.д.

В другом аспекте изобретения количество добавленной ферментной композиции (также называемое дозировкой фермента или нагрузкой фермента) является низким. В одном варианте осуществления количество фермента составляет 6 мг белка/г массы сухого вещества или ниже, 5 мг белка/г массы сухого вещества или ниже, 4 мг белка/г массы сухого вещества или ниже, 3 мг белка/г массы сухого вещества или ниже, 2 мг белка/г массы сухого вещества или ниже, or 1 мг белка/г массы сухого вещества или ниже (выражено в виде белка, в мг белка на 1 г сухого вещества). В одном варианте осуществления количество фермента составляет 0,5 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,4 мг ферментной композиции/г массы сухого вещества или ниже, 0,3 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,25 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,20 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,18 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, 0,15 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже, или 0,10 мг фермента/г массы сухого вещества или ниже (выражено в виде всех целлюлазных ферментов в мг фермента на 1 г сухого вещества). Низкая дозировка фермента возможна, поскольку благодаря активности и стабильности ферментов можно повысить время реакции гидролиза.

В другом аспекте изобретения время реакции гидролиза составляет 5 ч или больше, 10 ч или больше, 20 ч или больше, 40 ч или больше, 50 ч или больше, 60 ч или больше, 70 ч или больше, 80 ч или больше, 90 ч или больше, 100 ч или больше, 120 ч или больше, 130 ч или больше. В другом аспекте время реакции гидролиза составляет от 5 до 150 ч, от 40 до 130 ч, от 50 до 120 ч, от 60 до 120 ч, от 60 до 110 ч, от 60 до 100 ч, от 70 до 100 ч, от 70 до 90 ч, или от 70 до 80 ч. Благодаря стабильности ферментной композиции, возможно более продолжительное время реакции гидролиза с соответствующими более высокими выходами сахаров.

Значение рН во время гидролиза может быть выбрано специалистом в данной области техники. В другом аспекте изобретения рН во время гидролиза может составлять от 3,0 до 6,4. Стабильные ферменты из настоящего изобретения могут иметь широкий диапазон рН до 2 единиц рН, до 3 единиц рН, до 5 единиц рН. Оптимальное значение рН может находиться в пределах рН от 2,0 до 8,0, от 3,0 до 8,0, от 3,5 до 7,0, от 3,5 до 6,0, от 3,5 до 5,0, от 3,5 до 4,5, от 4,0 до 4,5, или составляет около 4,2.

В другом аспекте изобретения этап гидролиза проводят, пока не высвободится до 70% или больше, 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше, 92% или больше, 95% или больше доступного сахара в лигноцеллюлозном материале.

Важно, что способ из настоящего изобретения можно проводить с применением высоких уровней сухого вещества (или лигноцеллюлозного материала) в реакции гидролиза. Таким образом, изобретение можно осуществлять с содержанием сухого вещества примерно 5 мас.% или больше, примерно 8 мас.% или больше, примерно 10 мас.% или больше, примерно 11 мас.% или больше, примерно 12 мас.% или больше, примерно 13 мас.% или больше, примерно 14 мас.% или больше, примерно 15 мас.% или больше, примерно 20 мас.% или больше, примерно 25 мас.% или больше, примерно 30 мас.% или больше, примерно 35 мас.% или больше, примерно 40 мас.% или больше. В другом варианте осуществления содержание сухого вещества на этапе гидролиза составляет 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 мас.% или больше, или от 14 до 33 мас.%. В другом варианте осуществления содержание сухого вещества в конце гидролиза составляет 5 мас.% или больше, 6 мас.% или больше, 7

- 23 031865 мас.% или больше, 8 мас.% или больше, 9 мас.% или больше, 10 мас.% или больше, 11 мас.% или больше, 12 мас.% или больше, 13 мас.% или больше, 14 мас.% или больше, 15 мас.% или больше, 16 мас.% или больше, 17 мас.% или больше, 18 мас.% или больше, 19 мас.% или больше, 20 мас.% или больше, 21 мас.% или больше, 22 мас.% или больше, 23 мас.% или больше, 24 мас.% или больше, 25 мас.% или больше, 26 мас.% или больше, 27 мас.% или больше, 28 мас.% или больше, 29 мас.% или больше, 30 мас.% или больше, 31 мас.% или больше, 32 мас.% или больше, 33 мас.% или больше, 34 мас.% или больше, 35 мас.% или больше, 36 мас.% или больше, 37 мас.% или больше, 38 мас.% или больше, или 39 мас.% или больше. В другом варианте осуществления содержание сухого вещества в конце ферментативного гидролиза составляет 5-40 мас.%, 6-40 мас.%, 7-40 мас.%, 8-40 мас.%, 9-40 мас.%, 10-40 мас.%, 11-40 мас.%, 12-40 мас.%, 13-40 мас.%, 14-40 мас.%, 15-40 мас.%, 16-40 мас.%, 17-40 мас.%, 18-40 мас.%,

19-40 мас.%, 20-40 мас.%, 21-40 мас.%, 22-40 мас.%, 23-40 мас.%, 24-40 мас.%, 25-40 мас.%, 26-40 мас.%,

27-40 мас.%, 28-40 мас.%, 29-40 мас.%, 30-40 мас.%, 31-40 мас.%, 32-40 мас.%, 33-40 мас.%, 34-40 мас.%,

35-40 мас.%, 36-40 мас.%, 37-40 мас.%, 38-40 мас.%, 39-40 мас.%.

Ферментация.

Способ в соответствии с настоящим изобретением включает этап ферментации. Таким образом, в другом аспекте изобретение включает на этапе ферментации процесс, при котором используют микроорганизмы для ферментации источника углерода, содержащего сахар(а), например глюкозу, L-арабинозу и/или ксилозу. Источник углерода может включать любой углеводный олиго- или полимер, содержащий L-арабинозные, ксилозные или глюкозные единицы, например, такие как лигноцеллюлоза, ксиланы, целлюлоза, крахмал, арабинан и тому подобное. Для высвобождения ксилозных или глюкозных единиц из таких углеводов, подходящие карбогидразы (такие как ксиланазы, глюканазы, амилазы и тому подобные) могут быть добавлены к ферментационной среде или могут продуцироваться модифицированной клеткой-носителем. В последнем случае модифицированная клетка-носитель может быть создана генноинженерными методами для продукции и экскреции таких карбогидраз. Дополнительным преимуществом применения олиго- и полимерных источников глюкозы является то, что они обеспечивают сохранение низкой (более низкой) концентрации свободной глюкозы при ферментации, например, путем применения лимитирующих скорость количеств углеводов. Это, в свою очередь, предотвращает репрессию систем, необходимых для метаболизма и транспорта не-глюкозных сахаров, таких как ксилоза. В предпочтительном способе модифицированные клетки-носители ферментируют как L-арабинозу (необязательно, ксилозу), так и глюкозу, предпочтительно одновременно; в этом случае предпочтительно применяют модифицированные клетки-носители, которые являются нечувствительными к подавлению глюкозы для предотвращения диауксического роста. В дополнение к источнику L-арабинозы, необязательно, ксилозы (и глюкозы) в качестве источника углерода, ферментационная среда дополнительно содержит подходящий ингредиент, необходимый для роста модифицированной клетки-носителя. Составы ферментационных сред для выращивания микроорганизмов, таких как дрожжи и мицелиальные грибы, хорошо известны в данной области техники.

Время ферментации может быть короче, чем при обычной ферментации в тех же условиях, где часть ферментативного гидролиза все еще должна происходить во время ферментации. В одном варианте осуществления время ферментации составляет 100 ч или меньше, 90 ч или меньше, 80 ч или меньше, 70 ч или меньше, или 60 ч или меньше, для сахарной композиции из 50 г/л глюкозы и соответствующих других сахаров из лигноцеллюлозного сырьевого материала (например, 50 г/л ксилозы, 35 г/л L-арабинозы и 10 г/л галактозы). Для более разбавленных сахарных композиций время ферментации может соответственно быть снижено.

Процесс ферментации может быть аэробным или анаэробным процессом ферментации. Анаэробный процесс ферментации определяется в настоящей заявке как процесс ферментации, проходящий при отсутствии кислорода, или в котором, по существу, не потребляется кислород, предпочтительно потребляется менее 5, 2,5 или 1 ммоль/л/ч, более предпочтительно 0 ммоль/л/ч (т.е. потребление кислорода не выявляется), и где органические молекулы служат в качестве доноров электронов и акцепторов электронов. При отсутствии кислорода НАДФ, продуцируемый при гликолизе и образовании биомассы, не может быть окислен посредством окислительного фосфорилирования. Для решения этой проблемы многие микроорганизмы применяют пируват или одно из его производных в качестве акцептора электрона и водорода, таким образом, регенерируя НАД'. Таким образом, в предпочтительном анаэробном процессе ферментации пируват применяют в качестве акцептора электрона (и водорода), и восстанавливают до таких продуктов ферментации, как этанол, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, аминокислота, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, бутанол, β-лактамные антибиотики и цефалоспорин. В предпочтительном варианте осуществления процесс ферментации является анаэробным. Анаэробный процесс является предпочтительным, поскольку он дешевле аэробного процесса: требуется меньше специального оборудования. Далее, предполагается, что анаэробные процессы дают более высокий выход, чем аэробные процессы. В аэробных условиях обычно выход биомассы выше, чем в анаэробных условиях. В результате обычно в аэробных условиях ожидаемый выход продукта ниже, чем в анаэробных условиях.

- 24 031865

В другом варианте осуществления процесс ферментации проводят в условиях ограничения кислорода. Более предпочтительно процесс ферментации является аэробным и осуществляется в условиях ограничения кислорода. Процесс ферментации с ограничением кислорода является процессом, в котором потребление кислорода ограничено переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и составом приходящего потока газа, а также действительным перемешиванием/свойствами массового переноса используемого оборудования для ферментации. Предпочтительно в процессе в условиях ограничения кислорода скорость потребления кислорода составляет по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6 и еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.

Процесс ферментации предпочтительно проходит при температуре, оптимальной для модифицированной клетки. Таким образом, для большинства дрожжевых или грибных клеток процесс ферментации проводят при температуре меньше 42, предпочтительно меньше 38°С. Для дрожжевых и грибных клетокносителей процесс ферментации предпочтительно проводят при температуре ниже 35, 33, 30 или 28°С и температуре выше 20, 22 или 25°С.

В одном варианте осуществления изобретения этап ферментации проводят с микроорганизмом, способным к ферментации по меньшей мере одного С5 сахара. В одном варианте осуществления процесс является процессом для получения этанола, где процесс включает этап, включающий ферментацию среды, содержащей сахар(а), с микроорганизмом, способным к ферментации по меньшей мере одного С5 сахара, где клетка-носитель способна к ферментации глюкозы, L-арабинозы и ксилозы в этанол. Микроорганизм может быть прокариотическим или эукариотическим организмом. Микроорганизм, используемый в процессе, может быть микроорганизмом, полученным посредством генной инженерии. Примерами подходящих организмов являются дрожжи, например Saccharomyces, например Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus или Saccharomyces uvarum, Hansenula, Issatchenkia, например Issatchenkia orientalis, Pichia, например Pichia stipites или Pichia pastoris, Kluyveromyces, например Kluyveromyces fagilis, Candida, например Candida pseudotropicalis или Candida acidothermophilum, Pachysolen, например Pachysolen tannophilus, или бактерии, например Lactobacillus, например Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, например Zymomonas mobilis, Clostridium, например Clostridium phytofermentans, Escherichia, например Е. coli, Klebsiella, например Klebsiella oxytoca. В одном варианте осуществления микроорганизмом, способным к ферментации по меньшей мере одного С5 сахара, являются дрожжи. В одном варианте осуществления дрожжи принадлежат к роду Saccharomyces, предпочтительно к виду Saccharomyces cerevisiae, в котором выполнены генетические модификации. Пример такого микроорганизма и его приготовление описано более подробно в WO 2008/041840 и в Европейской патентной заявке ЕР10160622.6, поданной 21 апреля 2010 г. В одном варианте осуществления процесс ферментации для получения этанола является анаэробным. Термин анаэробный уже определен в настоящей заявке. В другом предпочтительном варианте осуществления процесс ферментации для получения этанола является аэробным. В другом предпочтительном варианте осуществления процесс ферментации для получения этанола проводится в условиях ограничения кислорода, более предпочтительно в аэробных условиях и с ограничением кислорода. Условия с ограничением кислорода уже описаны выше.

В таком процессе объемная производительность этанола предпочтительно составляет по меньшей мере 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 или 10,0 г этанола на 1 л в 1 ч. Выход этанола по L-арабинозе и необязательно ксилозе и/или глюкозе в процессе предпочтительно составляет по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98%. Выход этанола в настоящей заявке определяется как процент от теоретического максимального выходя, который для глюкозы и L-арабинозы и необязательно для ксилозы составляет 0,51 г этанола на грамм глюкозы или ксилозы.

В одном аспекте процесс ферментации, приводящий к получению этанола, имеет несколько преимуществ, по сравнению с известными процессами ферментации для получения этанола:

возможны анаэробные процессы;

возможны также условия с ограничением кислорода; можно достичь более высоких выходов этанола и скоростей продукции этанола; используемый штамм может быть способен к применению L-арабинозы и необязательно ксилозы.

В качестве альтернативы для процессов ферментации, описанных выше, можно применять по меньшей мере две различных клетки, это означает, что процесс является процессом совместной ферментации. Все предпочтительные варианты процессов ферментации, как описано выше, также являются предпочтительными вариантами осуществления этих процессов совместной ферментации: идентичность продукта ферментации, идентичность источника L-арабинозы и источника ксилозы, условия ферментации (аэробные или анаэробные условия, условия ограничения кислорода, температура, при которой осуществляют процесс, производительность этанола, выход этанола).

Процесс ферментации можно проводить без какого-либо требования к подведению рН во время процесса. То есть, процесс является процессом, который можно проводить без добавления какой-либо кислоты (кислот) или основания (оснований). Однако это исключает этап предварительной обработки, где можно добавлять кислоту. Дело в том, что композиция из настоящего изобретения способна действо

- 25 031865 вать при низком рН, и таким образом, нет необходимости подводить рН предварительного обработанного кислотой сырьевого материала, чтобы обеспечить осахаривание или гидролиз. Соответственно способ из настоящего изобретения может быть безотходным способом с применением только органических продуктов без необходимости ввода неорганических химикатов.

Общее время реакции.

В соответствии с изобретением общее время реакции (или совместное время реакции этапа гидролиза и этапа ферментации) может быть снижено. В одном варианте осуществления общее время реакции составляет 300 ч или меньше, 200 ч или меньше, 150 ч или меньше, 140 ч или меньше, 130 ч или меньше, 120 ч или меньше, 110 ч или меньше, 100 ч или меньше, 90 ч или меньше, 80 ч или меньше, 75 ч или меньше, или примерно 72 ч при 90% выходе глюкозы. Соответственно можно достичь снижения общего времени при более низком выходе глюкозы.

Продукты ферментации.

Продукты ферментации, которые можно получить в соответствии с изобретением, включают аминокислоты, витамины, фармацевтические средства, добавки в корм животных, химикаты специального назначения, химические сырьевые материалы, пластики, растворители, топливо, или другие органические полимеры, молочную кислоты, и этанол, включая топливный этанол (термин этанол подразумевает включение этилового спирта или смесей этилового спирта и воды).

Специфические ценные продукты, которые могут быть произведены посредством способов из настоящего изобретения, включают биотопливо (включая биогаз, этанол и бутанол); молочную кислоту; 3гидроксипропионовую кислоту; акриловую кислоту; уксусную кислоту; 1,3-пропан-диол; этилен; глицерин; пластик; химикаты специального назначения; органическую кислоту, включая лимонную кислоту, янтарную кислоту и малеиновую кислоту; растворитель; добавку в корм животных; фармацевтическое средство, такое как β-лактамный антибиотик или цефалоспорин; витамин; аминокислоту, такую как лизин, метионин, триптофан, треонин и аспарагиновая кислота; фермент, такой как протеаза, целлюлаза, амилаза, глюканаза, лактаза, липаза, лиаза, оксидоредуктаза, трансфераза или ксиланаза; химический сырьевой материал; или добавку в корм животных, но не ограничиваются ими.

Продукты ферментации, которые можно получить посредством способом из настоящего изобретения, могут быть любым веществом, полученным ферментацией. Они включают спирты (такие, как арабинитол, бутанол, этанол, глицерин, метанол, 1,3-пропандиол, сорбитол и ксилитол); органическую кислоту (такую, как уксусная кислота, ацетоновая кислота, адипиновая кислота, аскорбиновая кислота, акриловая кислота, лимонная кислота, 2,5-дикето-О-глюконовая кислота, муравьиная кислота, фумаровая кислота, глукаровая кислота, глюконовая кислота, глюкуроновая кислота, глутаровая кислота, 3гидроксипропионовая кислота, итаконовая кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, щавелевая кислота, щавелевоуксусная кислота, пропионовая кислота, янтарная кислота и ксилоновая кислота); кетоны (такие, как ацетон); аминокислоты (такие, как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, глицин, лизин, серии, триптофан и треонин); алканы (такие, как пентан, гексан, гептан, октан, нонан, декан, ундекан и додекан), циклоалканы (такие, как циклопентан, циклогексан, циклогептан и циклооктан), алкены (такие, как пентен, гексен, гептен и октен); и газы (такие, как метан, водород (H₂), диоксид углерода (CO₂) и монооксид углерода (СО)), но не ограничиваются ими. Продукт ферментации может также быть белком, витамином, фармацевтическим средством, добавкой в корм животных, химикатом специального назначения, химическим сырьевым материалом, пластиком, растворителем, этиленом, ферментом, таким как протеаза, целлюлаза, амилаза, глюканаза, лактаза, липаза, лиаза, оксидоредуктаза, трансфераза или ксиланаза.

Отделение продукта ферментации.

Способ в соответствии с настоящим изобретением необязательно включает выделение продукта ферментации. Продукт ферментации может быть отделен от ферментационного бульона любым известным способом. Таким образом, для каждого продукта специалист в данной области техники может выбрать подходящую методику отделения. Например, этанол может быть отделен от дрожжевого ферментационного бульона путем дистилляции, например дистилляции паром/вакуумной дистилляции обычным способом.

Некоторые варианты осуществления изобретения далее описаны более подробно, но без ограничения каким-либо образом объема настоящего изобретения.

Применение термостабильных ферментов в оптимальных температурных условиях.

В одном варианте осуществления изобретение относится к применению термостабильных ферментов, таких как целлюлолитические ферменты из Rasamsonia, для получения восстанавливающих сахаров из предварительно обработанного лигноцеллюлозного сырьевого материала при продукции этанола, но не ограничиваясь ей. Целлюлолитические ферменты из Rasamsonia, применяемые на предварительно обработанном лигноцеллюлозном сырьевом материале, показали максимальные скорости превращения при температуре в диапазоне от 50 до 70°C. Фермент остается активным в этих условиях в течение 14 суток и больше без полной потери активности.

С применением оптимальных температурных условий можно высвободить максимальное количест

- 26 031865 во восстанавливающих сахаров из сырьевого материала (полный гидролиз) с наикратчайшим возможным временем гидролиза. Таким способом достигается 100% превращение целлюлозы в глюкозы менее чем за 5 дней.

Теоретический максимальный выход (Yps max в граммах продукта на грамм глюкозы) для ферментационного продукта может быть получен из учебника по биохимии. Для этанола 1 моль глюкозы (180 г) дает в соответствии с нормальным путем ферментации в виде гликолиза по меньшей мере 2 моль этанола (=2x46= 92 г этанола). Теоретический максимальный выход этанола по глюкозе, таким образом, составляет 92/180=0,511 г этанола/г глюкозы.

Для бутанола (М.м. 74 г/моль) или изобутанола теоретический максимальный выход составляет 1 моль бутанола на 1 моль глюкозы. Таким образом, Yps max для (изо)бутанола составляет = 74/180=0,411 г (изо)бутанола/г глюкозы.

Для молочной кислоты выход ферментации для гомомолочнокислой ферментации составляет 2 моль молочной кислоты (М.м. = 90 г/моль) на 1 моль глюкозы. В соответствии с этой стехиометрией, Yps max = 1 г молочной кислоты/г глюкозы.

Для других продуктов ферментации можно провести подобные расчеты.

Снижение затрат, достигаемое с применением целлюлолитических ферментов из Rasamsonia, обеспечивает уменьшение общего времени процесса.

Компенсация низкой дозировки фермента с увеличением времени гидролиза с применением ферментов Rasamsonia.

Благодаря высокой стабильности стабильных ферментов, активность не исчезает со временем, хотя высвобождается меньше Сахаров в ходе гидролиза. Можно снизить дозировку фермента и продлить применение фермента путем увеличения времени гидролиза для получения сходных уровней высвобождающихся восстанавливающих сахаров. Например, 0,175 мл фермента/г сухого вещества сырьевого материала приводит к высвобождению примерно 90% от теоретического максимума восстанавливающих сахаров из предварительно обработанного сырьевого материала за 72 ч. При использовании 0,075 мл фермента/г сухого вещества сырьевого материала примерно 90% превращение от теоретического максимума достигается в пределах 120 ч. Результаты показывают, что благодаря стабильности ферментативной активности, снижение дозировки фермента можно компенсировать путем увеличения времени гидролиза для получения одного и того же количества восстанавливающих сахаров. То же самое справедливо для гидролиза предварительно обработанного сырьевого материала при содержании сухого вещества выше 10%, что показывает компенсаторный эффект удлинения времени гидролиза при 15% сухого вещества сырьевого материала.

Снижение затрат на производство, достигаемое путем применения целлюлолитических ферментов, таких как Rasamsonia, приводит к необходимой сниженной дозировке фермента, обеспечивая сходный выход при гидролитическом превращении.

Снижение риска контаминации со стабильными ферментами.

В общем способе превращения лигноцеллюлозного материала в этанол этапы способа предпочтительно осуществляют в септических условиях для снижения затрат на производство. Таким образом, возможна контаминация и рост контаминирующих микроорганизмов, что может привести к нежелательным побочным эффектам, таким как выработка молочной кислоты, муравьиной кислоты и уксусной кислоты, потери выхода этанола на субстрате, выработка токсинов и экстрацеллюлярных полисахаридов, что может оказывать значительное влияние на затраты на производство. Высокая температура процесса и/или короткое время процесса ограничивает риск контаминации при гидролизе и ферментации. Термостабильные ферменты, такие как из Rasamsonia, способны к гидролизу лигноцеллюлозного сырьевого материала при температурах выше 60°C. При этих температурах риск контаминации микроорганизмами, вызывающими нежелательные побочные эффекты, является слабым или почти нулевым.

Во время этапа ферментации, при котором образуется этанол, температура, как правило, составляет от 30 до 37°С и предпочтительно не повышается из-за потерь продукции. При использовании как можно более короткого времени ферментации риски и эффекты контаминации и/или роста контаминантов как можно более снижаются. Со стабильными ферментами, такими как из Rasamsonia, можно применять как можно более короткое время ферментации (см. описание выше), и таким образом, риски контаминации и/или роста контаминантов как можно больше снижаются. Таким образом, снижение затрат на производство, достигаемое с применением термостабильных целлюлолитических ферментов из Rasamsonia, приводит к снижению риска нарушений процесса из-за контаминации.

Стабильные ферменты позволяют снизить затраты на охлаждение и повышают производительность выработки этанола.

На первом этапе после термической обработки необходимо охладить предварительно обработанный сырьевой материал до температур, где ферменты имеют оптимальную активность. В большом масштабе это, как правило, выполняют путем добавления (охлажденной) воды, которая, помимо снижения температуры, снижает содержание сухого вещества. С применением термостабильных ферментов, таких как из Rasamsonia, можно достичь снижения затрат на производство благодаря тому, что (i) требуется меньшее

- 27 031865 охлаждение предварительно обработанного сырьевого материала, поскольку более высокие температуры допускаются при гидролизе, и (ii) добавляют меньше воды, что повышает содержание сухого вещества при гидролизе и ферментации, и таким образом, повышает производственный потенциал для этанола (количество, произведенное в единицу времени по объему) для завода по производству этанола. Кроме того, с применением термостабильных ферментов в соответствии с настоящим изобретением, таких как из Rasamsonia, можно достичь снижения затрат на производство путем применения охлаждающей воды, имеющей более высокую температуру, чем вода, используемая в способе с не-термостабильным ферментом.

Повторное использование ферментов после гидролиза со стабильными ферментами.

В конце гидролиза активность ферментов становится низкой, поскольку высвобождается мало восстанавливающих сахаров из-за превращения почти всей целлюлозы. Однако количество присутствующей ферментативной активности мало снижается, предположительно, главным образом из-за абсорбции ферментов на субстрате. С помощью применения отделения твердого вещества от жидкости, такого как центрифугирование, фильтрация, осаждение с декантацией и т.д., можно выделить 60% или больше, например 70% ферментативной активности в растворе, и повторно применить для гидролиза нового предварительно обработанного лигноцеллюлозного сырьевого материала при последующем гидролизе.

Далее, после разделения твердого вещества и жидкости фермент в растворе можно отделить от раствора, содержащего восстанавливающие сахара и другие продукты гидролиза от ферментативной активности. Это отделение можно выполнить путем (ультра- и микро)фильтрации, центрифугирования, осаждения с декантацией, седиментации, с первой абсорбцией фермента на носителе любого вида, или без нее, но не ограничиваясь ими.

Например, после гидролиза предварительно обработанного сырьевого материала с ферментативной нагрузкой 0,175 мл/г сухого вещества сырьевого материала в течение 20 ч, высвобождается 50% от теоретического максимального количества восстанавливающих сахаров, а после того же гидролиза в течение 72 ч высвобождается 90% от теоретического максимального количества восстанавливающих сахаров. Путем центрифугирования и ультрафильтрации извлекали 60-70% ферментативной активности в концентрате, в то время как фильтрат содержал более 80% высвобожденных восстанавливающих сахаров. Путем повторного применения концентрата, как такового или после дополнительной очистки и/или концентрирования, дозировку фермента во время следующего этапа гидролиза можно снизить от 60 до 70%. Снижение затрат, достигаемое с этими стабильными целлюлолитическими ферментами, такими как из Rasamsonia, обеспечивается таким способом за счет снижения необходимой дозировки фермента.

Повторное использование ферментов после гидролиза в комбинации с продукцией ферментов и повторным использованием дрожжевых клеток со стабильными ферментами

Способ, включающий повторное применение ферментов после гидролиза, как описано выше, можно объединить с повторным применением микроорганизмов, вырабатывающих этанол, после ферментации, и с применением фильтрата, содержащего восстанавливающие сахара, в качестве субстрата (очищенного и/или концентрированного или разбавленного) в ферментации с выработкой фермента и в качестве субстрата для культивирования микроорганизма, вырабатывающего этанол.

Повторное применение ферментов после вакуумной дистилляции со стабильными ферментами.

Термостабильность ферментов, таких как из Rasamsonia, обеспечивает оставшуюся целлюлолитическую активность после гидролиза, ферментации и вакуумной дистилляции в отфильтрованной барде. Общая активность фермента снижается во время трех последующих этапов процесса. Таким образом, отфильтрованную барду, полученную после вакуумной дистилляции, можно повторно использовать в качестве источника ферментов для нового цикла процесса гидролиза-ферментации-дистилляции для превращения предварительно обработанной пшеничной соломы в этанол. Отфильтрованную барду можно применять в концентрированной или (не)разбавленной форме и/или очищенной с добавлением дополнительных ферментов, или без них.

Повторное применение ферментов в комбинации с добавлением ферментов после вакуумной дистилляции с термостабильными ферментами.

В оптимальном способе количество фермента, добавляемое в отфильтрованную барду перед ее повторным применением в новом цикле процесса, равно количеству активности, потерянной на трех последовательных этапах процесса из предыдущего цикла процесса. Таким способом предотвращается избыточная дозировка фермента, и таким образом, достигается наиболее эффективное применение фермента.

Далее, путем обеспечения высокой дозировки фермента в первом производственном цикле и добавления фермента, равного количеству активности, потерянной во время трех последовательных этапов процесса в следующих циклах процесса, можно достичь наиболее высоких возможных скоростей гидролиза в каждом цикле процесса, что приводит к короткому времени гидролиза меньше 48 ч в комбинации с наиболее эффективным применением ферментов.

Применение стабильных ферментов в смешанных системах.

За счет применения перемешивания во время гидролиза, ферменты чаще приходят в контакт с субстратами, что приводит к более эффективному применению каталитической активности. Это обеспечивает применение меньших дозировок ферментов и таким образом, к снижению затрат, если только сме

- 28 031865 шивание не оказывает отрицательного влияния на ферменты. Стабильные ферменты, такие как термостабильные ферменты из Rasamsonia, устойчивы и могут выдерживать условия (местные) высокого сдвига и температур, которые отмечаются в случае интенсивного перемешивания суспензий. Применение систем с перемешиванием, таким образом, является благоприятным, и приводит к уменьшению дозировки, и таким образом, к снижению затрат.

Изобретение далее описано посредством следующих примеров, которые не следует считать ограничивающими объем изобретения.

Примеры

Информация об эксперименте.

Штаммы.

Штамм Rasamsonia (Talaromyces) emersonii был депонирован в CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan 8, P.O. Box 85167, NL-3508 AD Утрехт, Нидерланды, в декабре 1964, с номером доступа CBS 393.64. Другие подходящие штаммы также можно использовать в представленных примерах для демонстрации эффекта и преимуществ изобретения. Например, ТЕС-101, ТЕС147, ТЕС-192, ТЕС-201 или ТЕС-210 являются подходящими штаммами Rasamsonia, описанными в WO 2011/000949.

Приготовление предварительно обработанного кислотой субстрата из кукурузной соломы.

Предварительно обработанную разбавленной кислотой кукурузную солому (кКС) получали, как описано в Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105-108, p. 69-85. Использовали реактор для предварительной обработки в пилотном масштабе, работающий в условиях равновесного состояния 190°C, с продолжительностью пребывания 1 мин и эффективной концентрацией H₂SO₄1,45 мас.% в жидкой фазе.

Анализы для определения белка.

1. Общий белок.

ТХУ Биурет.

Способ является комбинацией осаждения белка с применением трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для удаления мешающих веществ и обеспечения определения концентрации белка с колориметрической биуретовой реакцией. В биуретовой реакции ион меди (II) восстанавливается до иона меди (I), который образует комплекс с азотами и углеродами пептидных связей в щелочном растворе. Фиолетовая окраска указывает на присутствие белков. Интенсивность окраски, и, следовательно, поглощение при 546 нм, прямо пропорциональны концентрации белка, в соответствии с законом Ламберта-Бера. Калибровку проводили с применением БСА (бычьего сывороточного альбумина), и содержание белка выражали в грамм белка в виде эквивалента БСА/л или в мг белка в виде эквивалента БСА/мл. Содержание белка рассчитывали с применением стандартных протоколов, известных в данной области техники, путем построения кривой значений ОП₅₄₆ против концентрации образцов с известной концентрацией, с последующим расчетом концентрации неизвестных образцов, с применением уравнения, полученного из калибровочной кривой.

2. Индивидуальные белки с применением ПАГЭ.

Предварительная обработка образцов для ДСН-ПАГЭ.

На основе установленной концентрации белка в образцах, проводили следующую подготовку образцов. К 10 мкл образца добавляли 40 мкл воды MilliQ и 50 мкл ТХУ (20%) для пятикратного разбавления образца (~ 1 мг/мл) и осаждения белков. Спустя 1 ч инкубации на льду образцы центрифугировали (10 мин, 14000 об/мин). Осадок промывали 500 мкл ацетона и центрифугировали (10 мин, 14000 об/мин). Осадок обрабатывали, как описано ниже.

ДСН-ПАГЭ.

Осадок растворяли в 65 мкл воды MilliQ, 25 мкл NuPAGE™ LDS буфера для образцов (4х) Invitrogen и 10 мкл NuPAGE™ восстанавливающего агента для образцов (10х) Invitrogen. Перед этапом денатурации образец разбавляли в 5 раз с применением смеси MilliQ; NuPAGE™ LDS буфера для образцов и 10 мкл NuPAGE™ восстанавливающего агента для образцов в отношении 65:25:10. После смешивания образцы инкубировали в термомиксере в течение 10 мин при 70°C. Растворы образцов вносили на 4-12% Bis-Tris гель (NuPAGE™ BisTris, Invitrogen). На гель наносили образец маркера (10 мкл) M12 (Invitrogen). Электрофорез в гелях проводили при 200 В в течение 50 мин, с применением XCELL Surelock, с 600 мл разбавленного в 20 раз ДСН буфера во внешней буферной камере и 200 мл разбавленного в 20 раз ДСН буфера, содержащего 0,5 мл антиоксиданта (NuPAGE™ Invitrogen), во внутренней буферной камере. После электрофореза гель дважды промывали деминерализованной водой, фиксировали гели раствором 50% метанола/7% уксусной кислоты в течение 1 ч, и окрашивали Sypro Ruby (50 мл на гель) в течение ночи. Изображение получали с применением Typhoon 9200 (610 ВР 30, зеленый (532 нм), РМТ 600V, 100 мкм) после отмывания геля водой MilliQ.

Количественный анализ белка.

С применением сканера Typhoon определяли отношение между белковыми полосами дорожки с применением стандартных способов, известных в данной области техники. Образец наносили в трех по

- 29 031865 вторностях, и уровень яркости определяли с применением программы Image Quant. Значения выражали в виде процентного количества белка по отношению к общему белку, при расчете с применением уровня яркости избранной белковой полосы относительно общего уровня яркости всех белковых полос.

Расчет превращения глюканов.

Превращение глюканов (%) = (глюкоза (г/л) х 100 %)/(глюкан (фракция по сухому веществу)хСВ (г/кг)х 1,1), где глюкоза (г/л) = концентрация глюкозы в надосадочной жидкости после гидролиза;

глюкан (фракция по СВ) = содержание глюкана в субстрате перед предварительной обработкой;

СВ (г/кг) = содержание сухого вещества при гидролизе (например, 20% СВ = 200 г/кг);

1,1 = увеличение массы из-за встраивания воды при гидролизе.

Примерный расчет:

Глюкоза = 60 г/л

Глюкановая фракция = 0,40 (40% по сухому веществу)

СВ = 200 г/кг

Пример превращения глюкана = (60*100) / (0,4 х 200 х 1,1) = 68% превращение

Пример 1. Оценка влияния отсутствия кислорода во время гидролиза на целлюлолитическую активность целлюлазного ферментного коктейля.

Влияние отсутствия кислорода во время гидролиза на целлюлолитическую активность ферментного коктейля оценивали в соответствии с процедурами, описанными ниже. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой сырьевым материалом из кукурузной соломы (кКС) при конечной концентрации 10 мас.% СВ. Этот раствор сырьевого материала готовили путем разбавления концентрированного раствора сырьевого материала водой. Затем доводили рН до 4,5 с 4 М раствором NaOH. Удаление кислорода из сырьевого материала осуществляли в два этапа. Во-первых, раствор сырьевого материала дегазировали с применением ультразвука под вакуумом на ультразвуковой бане (Bransonic 5510E-DTH, установка: Degas) в течение 15 мин. На втором этапе кислород дополнительно удаляли посредством непрерывной продувки потоком азота через 500 мл раствор 10% СВ сырьевого материала в течение 3 ч. Перед продувкой раствора сырьевого материала поток азота пропускали через воду для насыщения водяным паром и предотвращения испарения воды из раствора сырьевого материала. Параллельно 500 мл той же самой серии 10 мас.% СВ кКС продували воздухом в качестве кислородсодержащего контрольного образца в подобных условиях с тем же самым протоколом.

Гидролиз с удалением кислорода (продувкой азотом) и насыщением кислородом (продувкой воздухом) в 10 мас.% растворах сырьевого материала кКС проводили в герметичных 30 мл центрифужных флаконах (Nalgene Oakridge) с общим реакционным объемом 10 мл. Флаконы, уже содержащие раствор целлюлазы, использованные для эксперимента с истощением кислорода, продували азотом до или во время заполнения их сырьевым материалом. Каждый гидролиз проводили в двух повторностях с 7,5 мг/г СВ целлюлазного ферментного коктейля, добавляемого в общем объеме не больше 375 мкл. ТЕС-210 ферментировали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO2011/000949.

Центрифужные флаконы, содержащие раствор сырьевого материала и фермента, помещали в инкубационную печь (печь для гибридизации Techne HB-1D) и инкубировали в течение 72 ч при 65°С при вращении на точке установки 3 (12 об/мин). После гидролиза образцы охлаждали на льду и немедленно 50 мкл каждой надосадочной жидкости разбавляли в 1450 мкл воды сорта I. Разбавленную надосадочную жидкость затем фильтровали (фильтр 0,45 мкм, Pall PN 454), и в фильтратах анализировали содержание сахара, как описано ниже.

Концентрации сахара в разбавленных образцах измеряли с применением ВЭЖХ, оснащенной колонкой Aminex HPX-87P (Biorad #1250098) путем элюции водой при 85°С и скорости потока 0,6 мл/мин, проводя количественный анализ путем интеграции глюкозных сигналов при детекции коэффициента преломления (КП), с калибровой стандартными растворами глюкозы.

Данные, представленные в табл. 1/фиг. 1, показывают, что количество глюкозы, высвободившееся из сырьевого материала при продувке азотом, меньше количества глюкозы, высвободившегося из сырьевого материала при продувке воздухом.

На основе этих результатов мы сделали вывод, что присутствие кислорода улучшает целлюлолитическую производительность целлюлазных смесей.

- 30 031865

Таблица 1

Влияние продувки азотом или воздухом через 10% кКС сырьевой материал перед гидролизом на общее количество высвобождающейся глюкозы

Целлюлазный коктейль	Продувка воздухом	ско	Продувка Nj	СКО
Среднее количество глюкозы (г/л)	Среднее количество глюкозы (г/л)
ТЕС-210	34,5	0,8	31,9	1,1

Пример 2. Влияние кислорода на целлюлолитическую активность целлюлазного ферментного коктейля при гидролизе лигноцеллюлозного сырьевого материала.

В этом примере показано влияние кислорода на целлюлолитическую активность ферментного коктейля при гидролизе лигноцеллюлозного сырьевого материала. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой сырьевым материалом из кукурузной соломы (кКС) при конечной концентрации 20 мас.% СВ. Этот раствор сырьевого материала готовили посредством разбавления концентрированного раствора сырьевого материала водой. Затем доводили рН до 4,5 с 10 мас.% раствором NH₄OH.

Г идролиз проводили в реакторе с перемешиванием, с контролем рН и температуры, с рабочим объемом 1 л. Каждый гидролиз проводили в двух повторностях с 2,5 мг/г СВ целлюлазного ферментного коктейля ТЕС-210. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO2011/000949.

Проводили следующие эксперименты.

1. 1 л 20% кКС, рН 4,5, температура 62°С, скорость мешалки 60 об/мин (это соответствует уровню РК <0,002 моль кислорода на м³), 2,5 мг/г СВ целлюлазного коктейля ТЕС-210, время инкубации 120 ч (контрольный эксперимент).

2. Как в эксперименте 1, но в начале гидролиза продувку воздухом раствора начинали до уровня растворенного кислорода 20% (это соответствует 0,03 моль кислорода/м³, при измерении с применением электрода РК (растворенного кислорода)). Этот уровень растворенного кислорода поддерживали на протяжении остального процесса гидролиза.

3. Как в эксперименте 1, но в 72 ч начинали продувку воздухом до уровня растворенного кислорода 20% (это соответствует 0,03 моль кислорода на м³, при измерении с применением электрода РК (растворенного кислорода)). Этот уровень растворенного кислорода поддерживали на протяжении остального процесса гидролиза.

После гидролиза образцы охлаждали на льду и немедленно 50 мкл каждой надосадочной жидкости разбавляли в 1450 мкл воды степени очистки I. Разбавленную надосадочную жидкость затем фильтровали (фильтр 0,45 мкм, Pall PN 454), и в фильтратах анализировали содержание сахара, как описано ниже.

Концентрации сахара в разбавленных образцах измеряли посредством ВЭЖХ, оснащенной колонкой Aminex HPX-87P (Biorad #1250098) путем элюции водой при 85°С и скорости потока 0,6 мл/мин, проводя количественный анализ путем интеграции глюкозных сигналов при детекции коэффициента преломления (КП), с калибровой стандартными растворами глюкозы.

Результаты, показанные на фиг. 2, ясно демонстрируют повышение продукции глюкозы в случае добавления воздуха. Кроме того, при добавлении воздуха в реакцию гидролиза во второй части времени отмечается превосходящая концентрация глюкозы, по сравнению с отсутствием добавления воздуха, или добавлением воздуха на всем этапе гидролиза.

Пример 3. Влияние частичной аэрации (по времени) на ферментативный гидролиз лигно целлюлозного сырьевого материала в пилотном масштабе.

В этом примере показано влияние концентрации растворенного кислорода на целлюлолитическую активность ферментного коктейля или композиции при гидролизе лигноцеллюлозного сырьевого материала в пилотном масштабе. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой сырьевым материалом из кукурузной соломы (кКС) при конечной концентрации 17,1 мас.% СВ. Этот раствор сырьевого материала готовили посредством разбавления концентрированной суспензии сырьевого материала водой. Доводили рН до 4,5 с 25 мас.% раствором NH4OH.

Ферментативный гидролиз проводили в 270-л реакторе пилотного масштаба при контроле рН и температуры в рабочем объеме 150 л. Растворенный кислород во время процесса контролировали путем регуляции скорости мешалки при определенном потоке воздуха и избыточном давлении. Ферментативный гидролиз проводили с дозировкой 2,5 мг (ТХУ белка)/г СВ ТЕС-210 целлюлазного ферментного коктейля. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO2011/000949.

Проводили следующие эксперименты.

Эксперимент 1.

Аэрирование от 0 до 120 ч: 150 л 17,1 кКС, рН 4,5, температура 62°С, избыточное давление 1 бар, поток воздуха 10 кг/ч в свободной пространстве, 2,5 мг ТСА/г СВ ТЕС-210 целлюлазного коктейля, время инкубации 120 ч в 270-л реакторе пилотного масштаба. Концентрацию растворенного кислорода (РК)

- 31 031865 реакционной смеси измеряли постоянно с применением РК электрода. РК контролировали на уровне 0,15-0,22 моль/м³ путем регуляции скорости мешалки.

Эксперимент 2.

Аэрирование от 72 до 120 ч: 150 л 17,1 кКС, рН 4,5, температура 62°С, дозировка фермента 2,5 мг ТХУ/г СВ ТЕС-210 целлюлазного коктейля, общее время инкубации 120 ч в 270 л реакторе пилотного масштаба. Концентрацию растворенного кислорода (РК) реакционной смеси измеряли постоянно с применением РК электрода. В течение первых 72 ч процесса применяли следующие установки: без избыточного давления, без потока воздуха в свободном пространстве, и контролировали РК на уровне 0,02-0,05 моль/м³ путем регуляции скорости мешалки. В течение последних 48 ч процесса применяли следующие установки: избыточное давление 1 бар, поток воздуха в свободном пространстве 10 кг/ч и контролировали РК на уровне 0,15-0,22 моль/м³ путем регуляции скорости мешалки.

Во время ферментативного гидролиза образцы отбирали каждый день для анализа углеводов (глюкозы, целлобиозы) путем ЯМР, и анализа вязкости и рН.

Анализ состава предварительно обработанной кукурузной соломы проводили путем химического гидролиза образца и определения моносахаридов посредством ЯМР.

Образцы, взятые во время ферментативного гидролиза, анализировали на содержание (олиго)сахаров, органических кислот и ингибиторов посредством проточного ЯМР.

Результаты представлены на фиг. 4 и показывают, что во время ферментативного гидролиза в эксперименте 2 с частичным аэрированием С = аэрирование во время гидролиза от 72 до 120 ч) вырабатывается больше глюкозы, чем во время ферментативного гидролиза в эксперименте 1 ( = аэрирование во время гидролиза от 0 до 120 ч).

Пример 4. Влияние времени подачи растворенного кислорода на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырьевого материала.

В этом примере показано влияние времени подачи растворенного кислорода на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырьевого материала. Реакции гидролиза проводили с предварительно обработанным кислотой сырьевым материалом из кукурузной соломы (кКС) при конечной концентрации 20 масс. СВ. Раствор сырьевого материала готовили путем разбавления концентрированной суспензии сырьевого материала водой. Доводили рН до 4,5 с 2,5 мас.% раствором NH4OH.

Ферментативный гидролиз проводили в 2-литровом реакторе с контролируемым рН и температурой, с рабочим объемом 1 л. Растворенный кислород во время процесса контролировали путем регуляции скорости мешалки и постоянного обновления свободного пространства свежим воздухом в случае повышения концентрации растворенного кислорода. Ферментативный гидролиз проводили при дозировке 1,5 мг (ТХУ белка)/г СВ ТЕС-210 целлюлазного ферментного коктейля. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO2011/000949.

Проводили следующие эксперименты.

Эксперимент 1.

Аэрирование от 0 до 7 ч: 1 л 20% кКС, рН 4,5, температура 62°С, 1,5 мг ТХУ/г СВ целлюлазного коктейля ТЕС-210, время инкубации 120 ч. Концентрацию растворенного кислорода (РК) реакционной смеси измеряли постоянно с применением РК электрода. РК контролировали на уровне > 0,05 моль/м³ во время первых 7 ч процесса гидролиза. От 7 до 120 ч времени гидролиза РК поддерживали на уровне < 0,02 моль/м³.

Эксперимент 2.

Аэрирование от 72 до 120 ч: 1 л 20% кКС, рН 4,5, температура 62°С, 1,5 мг ТХУ/г СВ целлюлазного коктейля ТЕС-210, время инкубации 120 ч. Концентрацию растворенного кислорода (РК) реакционной смеси измеряли постоянно с применением РК электрода. РК контролировали на уровне < 0,01 моль/м³ во время первых 72 ч процесса гидролиза. От 72 до 120 ч времени гидролиза РК поддерживали на уровне > 0,05 моль/м³.

Результаты представлены на фиг. 5, и ясно демонстрируют повышение скорости образования глюкозы при аэрировании реакционной смеси. Эксперимент 1, в котором проводили аэрирование от 0 до 7 ч, ясно показал повышение скорости образования глюкозы в течение первых 7 ч процесса, по сравнению с отсутствием аэрирования во время фазы процесса из эксперимента 2. Кроме того, эксперимент 2 показывает повышение скорости образования глюкозы от 72 до 120 ч, по сравнению с отсутствием аэрирования во время этого периода в эксперименте 1.

Пример 5. Влияние времени подачи растворенного кислорода на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырьевого материала.

Предварительно обработанную разбавленной кислотой кукурузную солому с содержанием сухого вещества 20 мас.% гидролизовали в реакторе с рабочим объемом 20 м³ и свободным пространством 2 м³

- 32 031865 (диаметр реактора 2,5 м, высота реактора 4,5 м). Смешивание в реакторе осуществляли посредством газа, рециркулирующего из свободного пространства к распределителю на дне реактора с потоком газа 100 м³/ч. Поток газа обеспечивали компрессором с применением подводимой мощности 50 Вт/м³. Гидролиз проводили с 2,5 мг/г СВ ТЕС-210 целлюлазного ферментного коктейля. В течение 120 ч в реакторе осуществляли гидролиз целлюлозы при 62°С, и формировалось примерно 1 г/л глюконовой кислоты. 1 г/л глюконовой кислоты в данном реакторе соответствует примерно 20 кг глюконовой кислоты или 102 моль или 0,85 моль/ч в случае времени процесса 120 ч. Потребность в кислороде можно удовлетворить путем подачи воздуха со скоростью 90 л/ч.

Поток рециркулирующего воздуха 100 м³/ч гораздо выше подаваемого количества свежего воздуха 90 л/ч, так что свежий вводимый воздух разбавляется примерно в 1000 раз. Разбавленный (свежий) воздух рециркулирует через гидролизат, обеспечивая перенос и потребление всего кислорода.

Выходящий поток газа соответствует входящему потоку газа (минус потребляемый кислород). Кислорода в потоке газа не превышает 0,01 моль/м³, что поддерживает низкую концентрацию кислорода в гидролизате, и в то же самое время транспортируется точно необходимое количество воздуха. Таким способом можно добавлять очень маленькие количества кислорода в систему и уровень кислорода можно контролировать очень точно, даже при очень низких концентрациях кислорода.

Пример 6. Влияние количества воздуха на гидролиз глюкана в лигноцеллюлозном сырьевом материале.

Ферментативный гидролиз проводили с применением предварительно обработанного кислотой сырьевого материала из кукурузной соломы (кКС) при концентрации 20 мас.% сухого вещества (СВ). Раствор сырьевого материала готовили путем разбавления концентрированной суспензии сырьевого материала водой. Доводили рН до 4,5 с 25 мас.% раствором NH4OH. Ферментативный гидролиз проводили в масштабе 1 кг с применением 1,5-литрового реактора. Поддерживали рН 4,5 и температуру 62°С. Растворенный кислород во время процесса контролировали посредством рециркуляции газа в свободном пространстве и добавления свежего воздуха (содержащего 20-21% кислорода).

Перед добавлением фермента обеспечивали рециркуляцию газа в свободном пространстве при потоке газа 3 л/ч с применением перистальтического насоса и распределителя. Благодаря тому, что сырьевой материал потребляет кислород посредством химической реакции, уровень РК достигал 0% РК в пределах одного часа, приводя к анаэробному сырьевому материалу и полному истощению кислорода в свободном пространстве. Полученный инертный газ в свободном пространстве (свободный от кислорода) использовали во время всего гидролиза в качестве газа-носителя для вводимого свежего воздуха.

Затем целлюлазный ферментный коктейль ТЕС-210 добавляли к сырьевому материалу в дозе 3,75 мг (ТХУ белка)/г СВ. ТЕС-210 получали в соответствии с процедурами инокуляции и ферментации, описанными в WO2011/000949. Общее время гидролиза составило 120 ч.

Свежий воздух вводили в рециркуляционную линию инертного газа свободного пространства во время всего процесса гидролиза с потоком свежего воздуха 0-3-6-12-24 или 48 мл на 1 кг реакционной смеси в 1 ч соответственно, начиная сразу после добавления фермента. РК измеряли постоянно во всех экспериментах. Образцы отбирали в начале и в конце эксперимента для анализа глюкозы посредством ВЭЖХ.

Параллельный эксперимент проводили во встряхиваемом флаконе для определения максимального уровня гидролиза глюканов. Этот максимальный гидролиз определяли путем инкубации сырьевого материала с очень высокой дозировкой фермента (50 мг (ТХУ белка)/г СВ) при схожих условиях (рН, температура и СВ) при избытке кислородсодержащего воздуха свободного пространства. Определение РК в каждом эксперименте постоянно показывало 0,0% РК. Это можно объяснить прямым потреблением кислорода после его переноса из потока кислородсодержащего рециркулирующего газа в жидкую фазу в реакторе.

Результаты представлены в табл. 2, и ясно демонстрируют корреляцию между повышением образования глюкозы и повышением введения кислородсодержащего свежего воздуха.

Таблица 2

Влияние добавления свежего воздуха (кислорода) на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырьевого материала, определяемый по продукции глюкозы

Поток свежего воздуха (мл/кг/час)	0		6	12	24	48
Глюкоза (в г/л) в начале (t=0 ч)	14	14	12	12	15	14
Глюкоза (в г/л) в конце (t=120 ч)	46	50	55	54	56	59

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения сахарного продукта из лигноцеллюлозного материала, включающий следующую стадию:

(с) ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного материала в реакторе для гидролиза с применением ферментной композиции, содержащей по меньшей мере две целлюлазы, где во время ферментативного гидролиза кислородсодержащий газ добавляют в лигноцеллюлозный материал в реакторе для гидролиза, часть кислородсодержащего газа, добавленного к лигноцеллюлозному материалу, является газом, происходящим из свободного пространства реактора, и где уровень растворенного кислорода в ходе процесса контролируется рециркуляцией газа из свободного пространства реактора и введением кислородсодержащего газа в реактор для гидролиза.
2. Способ получения продукта ферментации из лигноцеллюлозного материала, включающий следующие стадии:

(c) ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного материала в реакторе для гидролиза с применением ферментной композиции, содержащей по меньшей мере две целлюлазы;

(d) ферментация гидролизованного лигноцеллюлозного материала для получения продукта ферментации;

где во время ферментативного гидролиза кислородсодержащий газ добавляют в лигноцеллюлозный материал в реакторе для гидролиза, часть кислородсодержащего газа, добавленного к лигноцеллюлозному материалу, является газом, происходящим из свободного пространства реактора, и где уровень растворенного кислорода в ходе процесса контролируется рециркуляцией газа из свободного пространства реактора и введением кислородсодержащего газа в реактор для гидролиза.
3. Способ по п.1, включающий извлечение сахарного продукта.
4. Способ по п.2, включающий извлечение продукта ферментации.
5. Способ по любому из пп.1-4, включающий предварительную обработку лигноцеллюлозного материала.
6. Способ по любому из пп.1-5, включающий промывание лигноцеллюлозного материала или подвергнутого предварительной обработке лигноцеллюлозного материала.
7. Способ по любому из пп.1-6, где в течение части времени ферментативного гидролиза меньше кислорода добавляют в лигноцеллюлозный материал по сравнению с другой частью времени ферментативного гидролиза.
8. Способ по любому из пп.1-7, где в течение части времени ферментативного гидролиза не добавляют кислород в лигноцеллюлозный материал.
9. Способ по п.7 или 8, где часть времени, когда добавляют меньше или предпочтительно не добавляют кислород, составляет от 10 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
10. Способ по п.9, где часть времени, когда добавляют меньше или предпочтительно не добавляют кислород, составляет от 20 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
11. Способ по п.9 или 10, где часть времени, когда добавляют меньше или предпочтительно не добавляют кислород, составляет от 30 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
12. Способ по пп.9-11, где часть времени, когда добавляют меньше или предпочтительно не добавляют кислород, составляет от 40 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
13. Способ по п.7 или 8, где другая часть времени, когда добавляют больше кислорода, составляет от 2 до 80% от общего времени ферментативного гидролиза.
14. Способ по п.13, где другая часть времени, когда добавляют больше кислорода, составляет от 4 до 60% от общего времени ферментативного гидролиза.
15. Способ по п.13 или 14, где другая часть времени, когда добавляют больше кислорода, составляет от 8 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза.
16. Способ по пп.13-15, где другая часть времени, когда добавляют больше кислорода, составляет от 10 до 50% от общего времени ферментативного гидролиза.
17. Способ по любому из пп.13-16, где другая часть времени, когда добавляют больше кислорода, составляет:

(a) от 12 до 50%, когда кислород добавляют во вторую половину времени ферментативного гидролиза;

(b) от 2 до 30% от общего времени ферментативного гидролиза, когда кислород добавляют в первую половину времени ферментативного гидролиза.
18. Способ по любому из пп.1-17, где кислород используют в количестве, соответствующем от 20 до 5000 ммоль молекулярного кислорода на 1 кг глюкана, присутствующего в лигноцеллюлозном материале, и где кислород добавляют во время ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала.
19. Способ по любому из пп.1-18, где кислород добавляют в форме пузырьков.
20. Способ по любому из пп.1-19, где реактор для ферментативного гидролиза имеет объем 1 м³ или больше.

- 34 031865
21. Способ по п.20, где реактор для ферментативного гидролиза имеет объем 10 м³ или больше.
22. Способ по любому из пп.1-21, где гидролиз проводят при температуре 45°С или больше.
23. Способ по п.22, где гидролиз проводят при температуре 50°C или больше.
24. Способ по любому из пп.1-23, где ферментную композицию получают из грибов либо ферментная композиция содержит фермент грибов.
25. Способ по любому из пп.1-24, где содержание сухого вещества на этапе гидролиза (с) составляет 10 мас.%.
26. Способ по п.25, где содержание сухого вещества на этапе гидролиза (с) составляет от 14 до 33 мас.%.
27. Способ по любому из пп.1-26, где ферментативный гидролиз проводят в реакторе для периодического культивирования, периодического культивирования с подпиткой и/или непрерывного культивирования.
28. Способ по любому из пп.1-27, где кислород вводят в виде кислородсодержащего газа.
29. Способ по любому из пп.2-28, где ферментацию проводят с микроорганизмом, способным к ферментации по меньшей мере одного С5 сахара.
30. Устройство для осуществления способа по любому из пп.1-29, включающее:

(а) реактор или сосуд реактора объемом по меньшей мере 10 м³, включающий средства для введения газа для введения газа в реактор;

(c) газовый насос для введения газа в реактор;

(d) рециркуляционный трубопровод для рециркуляции газа из свободного пространства реактора;

(e) выпускную систему для удаления газа из реактора;

(f) подвод газа для введения свежего газа в реактор;

(g) средства для контроля соотношения между рециркулирующим газом и свежим газом.
31. Устройство по п.30, где средства для введения газа представляют собой распределители газа.
32. Устройство по любому из пп.30, 31, где устройство дополнительно содержит средства для перемешивания содержимого реактора.