UA119867C2 - Способи одержання цукрового продукту і продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу та обладнання для їх здійснення - Google Patents

Способи одержання цукрового продукту і продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу та обладнання для їх здійснення Download PDF

Info

Publication number
UA119867C2
UA119867C2 UAA201611072A UAA201611072A UA119867C2 UA 119867 C2 UA119867 C2 UA 119867C2 UA A201611072 A UAA201611072 A UA A201611072A UA A201611072 A UAA201611072 A UA A201611072A UA 119867 C2 UA119867 C2 UA 119867C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
oxygen
hydrolysis
reactor
gas
lignocellulosic material
Prior art date
Application number
UAA201611072A
Other languages
English (en)
Inventor
Бертус Нордам
Міхаель Петрус Йозеф Беркхаут
Михаель Петрус Йозеф Беркхаут
Йосеф Йоханнес Марія Хофместер
Йосеф Йоханнес Мария Хофместер
Original Assignee
Дсм Айпі Асетс Б.В.
ДСМ АйПи АСЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дсм Айпі Асетс Б.В., ДСМ АйПи АСЕТС Б.В. filed Critical Дсм Айпі Асетс Б.В.
Publication of UA119867C2 publication Critical patent/UA119867C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/06—Means for pre-treatment of biological substances by chemical means or hydrolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C3/00—Pulping cellulose-containing materials
    • D21C3/22—Other features of pulping processes
    • D21C3/26—Multistage processes
    • D21C3/263—Multistage processes at least one stage being in presence of oxygen
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Винахід стосується способів одержання цукрового продукту та продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу та обладнання для їх здійснення. Цукровий продукт одержують ферментативним гідролізом лігноцелюлозного матеріалу в гідролітичному реакторі із застосуванням ферментної композиції, яка містить щонайменше дві целюлази. При цьому під час гідролізу у лігноцелюлозний матеріал подають газ, що містить кисень, частиною якого є газ, що міститься у вільному просторі реактора, а рівень розчиненого кисню в ході процесу контролюють рециркуляцією газу з вільного простору реактора і введенням газу, який містить кисень, в реактор. Для одержання продукту ферментації цукровий продукт гідролізу лігноцелюлозного матеріалу піддають ферментації. Обладнання включає реактор з засобами введення та випуску газу, рециркуляційним трубопроводом, газовим насосом, засобами введення свіжого газу та контролю співвідношення між рециркуляційним та свіжим газом.

Description

Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Винахід відноситься до обладнання й способу для ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу й ферментації цукрів.
Попередній рівень техніки
Лігпоцелюлозний рослинний матеріал, який також називається сировинним матеріалом, є поновлюваним джерелом енергії у формі цукрів, які можна перетворити на корисні продукти, наприклад, цукри або біопаливо, таке як біоетанол. Під час цього процесу (лігно- або гемі- )целюлоза, присутня у вихідній сировині, такій як пшенична солома, кукурудзяна солома, лушпайки рису тощо, перетворюється на відновлюючі цукри за допомогою (гемі)целюлолітичних ферментів, які потім за бажання перетворюються на корисні продукти, такі як етанол, за допомогою таких мікроорганізмів, як дріжджі, бактерії й гриби.
Оскільки (гемі)уцелюлоза є кристалічною й укладена в мережі лігніну, перетворення на відновлюючі цукри, є в цілому повільним і неповним. Як правило, ферментативний гідроліз необробленого сировинного матеріалу дає менше 20 95 від теоретичної кількості цукрів. За умови використання хімічної й термо-фізичної попередньої обробки (гемі)целюлоза стає більш доступною для (гемі)целюлолітичних ферментів, і таким чином, перетворення проходять швидше й з більш високим виходом.
Типовий вихід етанолу із глюкози, отриманої з попередньо обробленої кукурудзяної соломи, становить 40 галонів етанолу на 1000 кг сухої кукурудзяної соломи (Ваддег, Р, "ЕШВапої! їот сейшШо5е: а депега! геміем, Ттепав5 іп пем/у стор5 апа пем/ ибев", 2002, 9. ЧапісК апа А. М/пірКкеу (ед5.) АЗН5 Ргез5, АІехапагіа, МА) ("Етанол із целюлози: загальний огляд; напрямок в нових сільськогосподарських культурах і нових видах застосування") або 0,3 г етанолу на г сировинного матеріалу. Максимальний вихід етанолу на основі целюлози становить приблизно 90 Фр.
Целюлолітичні ферменти, більшість із яких виробляються такими видами, як Тгісподегта,
Нитісоїа і Абрегодй5, застосовуються в промисловості для перетворення попередньо обробленого сировинного матеріалу на сусло, яке містить нерозчинну (гемі)целюлозу, відновлюючі цукри, отримані з неї та лігнін. Термостабільні целюлолітичні ферменти, отримані з
Казатзхопіа, застосовуються для деградації лігноцелюлозного сировинного матеріалу і ці
Зо ферменти відомі своєю термостабільністю, див. УМО 2007/091231. Отримане сусло застосовують у ферментації, під час якої відновлюючі цукри, перетворюються на дріжджову біомасу (клітини), диоксид вуглецю й етанол. Етанол, отриманий таким способом, називається біоетанолом.
Загальне одержання цукрів з попередньо обробленого лігпоцелюлозного сировинного матеріалу є гідролізом, який також називається зрідженням, попереднім оцукрюванням або оцукрюванням, як правило, відбувається під час процесу, що триває від 6 до 168 годин (Кипаг,
З. Спет. Епа. Тесппої. 32 (2009) 517-526) за підвищених температур від 45 до 50С і за нестерильних умов. Під час цього гідролізу присутня целюлоза частково (як правило, від 30 до 95 95, залежно від активності ферменту й умов гідролізу) перетворюється на відновлюючі цукри.
У випадку інгібування ферментів сполуками, які присутні в попередньо обробленому вихідному матеріалі, і які вивільняються цукрами, і для мінімізації термічної інактивації, цей період підвищеної температури якнайсильніше скорочують.
Ферментацію після гідролізу проводять на окремій, бажано анаеробній стадії способу, у тому ж самому або в іншому посуді, температуру якого доводять до 30-33 "С (мезофільний процес) для забезпечення росту й продукції етанолу мікробною біомасою, зазвичай дріжджами.
Під час цього процесу ферментації, решта (гемі)уцелюлозного матеріалу перетворюється на відновлюючі цукри, ферментами, уже присутніми з етапу гідролізу, у той час як продукується мікробна біомаса й етанол. Ферментацію закінчують, як тільки (гемі)уцелюлозний матеріал перетворюється на ферментовані цукри, а всі ферментовані цукри перетворюються на етанол і диоксид вуглецю мікробними клітинами. Це може тривати до 6 днів. У цілому, загальний час процесу гідролізу й ферментації може становити до 13 днів.
Отримане таким способом ферментоване сусло складається з не-ферментованих цукрів, не-гідролізованого (гемі)целюлозного матеріалу, лігніну, мікробних клітин (найчастіше дріжджових клітин), води, етанолу, розчиненого диоксида вуглецю. Під час наступних етапів етанол відокремлюють дистиляцією з сусла й піддають додатковому очищенню. Тверду суспензію, що залишилася, висушують і застосовують, наприклад, як горючу суміш, фертилізатор або корм для великої рогатої худоби.
МО 2010/080407 пропонує обробку целюлозного матеріалу целюлазною композицією за анаеробних умов. Видалення або виключення активних форм кисню може поліпшувати бо продуктивність системи ферментів, які гідролізують целюлозу. Гідроліз целюлозного матеріалу,
наприклад, лігпоцелюлози ферментною композицією може знижуватися внаслідок окисного ушкодження компонентів ферментної композиції і/або окислення целюлозного матеріалу, наприклад, молекулярним киснем.
УМО 2009/046538 розкриває спосіб обробки рослинних матеріалів - сировини лігноцелюлози для вивільнення ферментованих цукрів із застосуванням способу ферментативного гідролізу для обробки матеріалів, який здійснюється під вакуумом, і який дає багатий на цукор технологічний потік, який включає знижені кількості летких сполук, таких як фурфураль і оцтова кислота, які інгібують ферментацію цукрів. Крім видалення летких інгібуючих сполук, видаляються інші сполуки і/або молекули, серед яких азот, кисень, аргон і диоксид вуглецю.
З кожним завантаженням сировинного матеріалу додають ферменти для максималізації виходу й швидкості вивільнення ферментованих цукрів з попередньо обробленого лігноцелюлозного сировинного матеріалу за певний час процесу. У цілому витрати на продукування ферментів, сировинний матеріал і вихід етанолу й капіталовкладення є основними факторами вартості в загальних витратах на виробництво (Китаг, 5. Спет. Епа.
ТесппоІ. 32 (2009) 517-526). До теперішнього часу зниження застосування ферментів досягається шляхом використання ферментних продуктів з одного або з багатьох мікробних джерел (МО 2008/008793) з більш широкою і/або високою (питомою) гідролітичною активністю, чиє застосування націлене на зниження потреби у ферментах, більш високі швидкості перетворення і/або більш високий вихід перетворення, і таким чином, на загальне зниження витрат на виробництво біоетанолу. Це вимагає більших інвестицій у дослідження й розробку цих ферментних продуктів. У випадку, коли ферментний продукт складається з ферментів з багатьох мікробних джерел, потрібні більші інвестиції для одержання кожної кнкретної ферментної сполуки.
Таким чином, необхідно поліпшити вищевказаний спосіб, який включає гідроліз і ферментацію.
Виклад сутності винаходу
Таким чином, завданням даного винаходу є забезпечення обладнання й способу, у якому етап гідролізу проводять за вдосконалених умов. Іншим завданням винаходу є забезпечення обладнання й способу, який передбачає гідроліз зі зниженим часом процесу. Іншим завданням
Ко) винаходу є забезпечення обладнання й способу, де доза ферменту може бути меншою, а вихід корисного продукту гідролізу при цьому підтримується на тому ж самому рівні або навіть підвищується. Іншим завданням є забезпечення обладнання й способу, який передбачає гідроліз, де умови процесу гідролізу є оптимізованими. Ще одним завданням винаходу є забезпечення обладнання й способу, який передбачає гідроліз, при якому вихід корисного продукту гідролізу підвищується за умови використання тих же самих доз ферменту. Одне або декілька із цих завдань вирішуються відповідно до винаходу.
Даний винахід пропонує спосіб одержання цукрового продукту з лігноцелюлозного матеріалу, який включає наступні стадії: (а) необов'язково, попередню обробку лігноцелюлозного матеріалу; (Б) необов'язково, промивання необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу; (с) ферментативний гідроліз необов'язково промитого і/або необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу в гідролітичному реакторі із застосуваннями ферментної композиції, яка містить щонайменше дві целюлази; і (4) необов'язково, видалення цукрового продукту; де під час ферментативного гідролізу у лігноцелюлозний матеріал у гідролітичному реакторі додають газ, який містить кисень, і де частина газу, який містить кисень, доданого до лігноцелюлозного матеріалу, є газом, джерелом походження якого є вільний простір реактора.
Бажано, протягом періоду часу ферментативного гідролізу в лігноцелюлозний матеріал подається менше кисню, у порівнянні з іншою частиною часу ферментативного гідролізу, або бажано протягом періоду часу ферментативного гідролізу кисень у лігноцелюлозний матеріал не подають.
Крім того, даний винахід забезпечує спосіб одержання продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу, який включає наступні етапи: (а) необов'язково, попередню обробку лігноцелюлозного матеріалу; (Б) необов'язково, промивання необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу; (с) ферментативний гідроліз необов'язково промитого і/або необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу в гідролітичному реакторі із застосуваннями бо ферментної композиції, яка містить щонайменше дві целюлази;
(4) ферментація гідролізованного лігноцелюлозного матеріалу для одержання продукту ферментації; і (є) необов'язково, видалення продукту ферментації; де під час ферментативного гідролізу газ, який містить кисень подають у лігноцелюлозний матеріал у гідролітичному реакторі, і де частина газу, який містить кисень, доданого до лігноцелюлозного матеріалу, є газом, джерелом походження якого є вільний простір реактора.
Бажано, протягом періоду часу ферментативного гідролізу в лігноцелюлозний матеріал подається менше кисню, у порівнянні з іншою частиною часу ферментативного гідролізу, або бажано протягом періоду часу ферментативного гідролізу кисень у лігноцелюлозний матеріал не подають.
Відповідно до іншого аспекту винаходу забезпечується обладнання, придатне для проведення способу ферментативного гідролізу запропонованого даним винаходом.
Обладнання відповідно до винаходу включає: (а) реактор або посудину реактора об'ємом щонайменше 1 м3, що включає засоби для введення газу, бажано розподільник газу, для введення газу в реактор; (Б) необов'язково, засоби для перемішування вмісту реактора; (с) газовий насос для введення газу в реактор; (а) рециркуляційний трубопровід для рециркуляції газу з вільного простору реактора; (є) випускну систему для видалення газу з реактора; (Ї) підведення газу для введення свіжого газу в реактор; (д) засоби, бажано клапани, для контролю співвідношення рециркулюючого і свіжого газу.
У цілому, це обладнання цілююм придатне для введення газу, такого як повітря, у рідку реакційну суміш, таку як при ферментативному гідролізі біомаси, яка на етапі гідролізу бажано містить 10 мас. 95 або більше сухої речовини, бажано 14 мас. 95 або більше, і ще краще від 14 до 33 мас. 95.
Відповідно до кращого варіанта здійснення винаходу, період часу, протягом якого подається менше кисню, або бажано кисень не подається, становить від 10 до 80 95, бажано від 20 до 80 95, краще від 30 до 80 95 і найкраще від 40 до 80 9о від загального часу ферментативного гідролізу.
Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу, період часу, протягом якого подається більше кисню, становить від 2 до 80 95, бажано від 4 до 60 95, краще від 8 до 50 95, і найкраще від 10 до 50 95 від загального часу ферментативного гідролізу. Бажано, період часу, протягом якого подається більше кисню, становить (а) від 12 до 5095, бажано від 20 до 4095, де кисень подають у другій половині часу ферментативного гідролізу; (Б) від 2 до 30 95, бажано від 4 до 2595, і краще від 5 до 2095 від загального часу ферментативного гідролізу, де кисень подають у першій половині часу ферментативного гідролізу; або (с) комбінацію "а" і "р".
Бажано, концентрація кисню в рідкій фазі гідролізу, протягом тієї частини часу, коли подають кисень, є більшою щонайменше в 2 рази, бажано щонайменше в 4 рази, краще щонайменше в 10 разів, від концентрації кисню протягом тієї частини часу, коли додають менше кисню, або кисню не подають.
В одному варіанті здійснення концентрація кисню в рідкій фазі гідролізу за весь час ферментативного гідролізу є низкою.
Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу, протягом тієї частини часу, коли подають кисень, концентрація кисню в рідкій фазі, де лігноцелюлозний матеріал присутній під час ферментативного гідролізу, становить щонайменше 0,001 моль/м3, бажано щонайменше 0,002 моль/м3, і найкраще щонайменше 0,003 моль/м", і ще краще більше 0,01 моль/му,
БО наприклад, більше 0,02 моль/м3 або 0,03 моль/м3. У реакторах об'ємом менше 1 м3 значення РК нижче 0,01 моль/м? або 0,02 моль/м" досягаються при повільному перемішуванні. Активне змішування або перемішування в такому масштабі переводить частину газової фази з вільного простору в реакційну рідину. Наприклад, збовтування або перемішування може створити лійку, яка вводить кисень у рідину. У цілому, продування вільного простору киснем (наприклад, у формі повітря) у комбінації з (активним) збовтуванням або перемішуванням уводить достатню кількість кисню в целюлозний матеріал у гідролітичному реакторі для реакторів розміром від 100 літрів до 1 м3. У білошому масштабі, наприклад, у реакторі 50 м3 або більше, наприклад, 100 м3, для активного перемішування потрібно так багато енергії, що з економічної точки зору це не може бути застосовнеаним в промислових робочих процесах. У цілому, у більших реакторах збовтування або перемішування без уведення повітря або кисню приводить до значень РК менше 0,01 моль/м3.
В іншому кращому варіанті здійснення під час додавання кисню (протягом тієї частини часу, коли подають кисень) концентрація кисню в рідкій фазі, де лігноцелюлозний матеріал присутній під час ферментативного гідролізу, бажано становить щонайбільше 80 95 від концентрації насичення кисню за умов реакції гідролізу, бажано щонайбільше 0,12 моль/м3, ще краще щонайбільше 0,09 моль/м3, ще краще щонайбільше 0,06 моль/м3, ще краще щонайбільше 0,045 моль/м3 і найкраще щонайбільше 0,03 моль/м3. В одному варіанті здійснення концентрація кисню становить 0 моль/м3, оскільки споживання кисню є більш високим, ніж швидкість переносу кисню. Температура й тиск впливають на РК. Кращі й приблизні значення моль/м", наведені вище, відносяться до нормального атмосферного тиску й до температури близько 6276.
Фахівець у даній галузі техніки може визначити позитивні значення РК на основі попередніх знань.
Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу, кисень споживається в кількості, яка відповідає від 20 до 5000 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі. Бажано, кисень споживається в кількості, яка відповідає від 22 до 4500 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від 24 до 4000 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від 26 до 3500 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від 28 до 3000 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі. Кисень подають після попередньої обробки й до і або під час ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу, бажано, у кількості, яка відповідає щонайменше 30 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, краще в кількості, яка відповідає щонайменше 40 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, і найкраще в кількості, яка відповідає щонайменше 50 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі Увесь кисень, який подають у систему, переноситься в рідину й використовується для гідролізу. Цю кількість можна контролювати шляхом вимірювання й контролю кількості повітря, привнесеного в систему.
Зо Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу, реактор для ферментативного гідролізу має об'єм 1 м3 або більше. Бажано, реактор має об'єм щонайменше 1 му, щонайменше 2 м3, щонайменше 3 м3, щонайменше 4 му, щонайменше 5 м3, щонайменше 6 м3, щонайменше 7 м3, щонайменше 8 му, щонайменше 9 м3, щонайменше 10 м3, щонайменше 15 м3, щонайменше 20 м3, щонайменше 25 м3, щонайменше 30 м3, щонайменше 35 му, щонайменше 40 му, щонайменше 45 му, щонайменше 50 м3, щонайменше 60 м3, щонайменше 70 м3, щонайменше 75 мі, щонайменше 80 му, щонайменше 90 м3, щонайменше 100 м3, щонайменше 200 му, щонайменше 300 м3, щонайменше 400 м3, щонайменше 500 м, щонайменше 600 му, щонайменше 700 м", щонайменше 800 м, щонайменше 900 м3, щонайменше 1000 му, щонайменше 1500 м3, щонайменше 2000 му, щонайменше 2500 м3. У цілому, реактор повинен бути меншим 3000 му або 5000 м3. Можна використовувати кілька реакторів. Реактори, які використовуються в способах запропонованих даним винаходом, можуть мати той самий об'єм, але також можуть мати різні об'єми. Тривалість ферментативного гідролізу в представленому способі бажано становить від 5 до 150 годин.
Відповідно до іншого кращого аспекту винаходу, ферментну композицію одержують із грибів, бажано, мікроорганізму роду Казатвзопіа, або ферментна композиція містить фермент грибів, бажано фермент Казатзопіа. Відповідно до іншого кращого аспекту даного винаходу, вміст сухої речовини на етапі гідролізу (с) становить 10 мас. 95 або більше, бажано 14 мас. 95 або більше і ще краще від 14 до 33 мас. 95. Ферментативний гідроліз бажано здійснюють у реакторі для періодичного культивування, періодичного культивування з підживленням і/або безперервного культивування. Бажано, кисень, який уводять відповідно до даного способу, є газом, що містить кисень, таким як повітря. Менша кількість кисню, що подається або присутня в лігноцелюлозному матеріалі протягом періоду часу ферментативного гідролізу, означає, що кисню (вираженого в моль кисню/мУ), уводиться, наприклад, формі бульбашок, або він є присутнім, щонайменше на 5095 менше, бажано щонайменше на 7095 менше, найкраще, щонайменше на 90 95 менше, ніж подається або є присутнім протягом іншої частини часу ферментативного гідролізу, коли подають кисень.
У кращому варіанті здійснення кисень подають у формі бульбашок (газу).
Несподівано, відповідно до даного винаходу, шляхом додавання кисню можна досягти багатьох переваг для способу, включаючи оптимальні температурні умови, зниження часу процесу, зниження дозування ферменту, повторне застосування ферментів, високий вихід та інші вдосконалення процесу, що приводить до зниження витрат.
В одному варіанті здійснення використовується стабільна ферментна композиція, яка зберігає активність протягом 30 годин або більше. Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення, гідроліз бажано проводять за температури 40 "С або більше, краще, за температури 50 "С або більше, і найкраще за температури 55 "С або більше. Спосіб запропонований даним винаходом далі проілюстрований більш докладно.
Короткий опис фігур
Фіг. 1. Вплив продування азотом або повітрям через 10 95 кККС сировинний матеріал перед гідролізом, на загальну кількість глюкози (г/л), вивільнену сумішшю ТЕС-210.
Фіг. 2. Глюкоза, отримана в Прикладі 2.1 - Експеримент 1: без аерації, 2 - Експеримент 2: безперервна аерація, З - Експеримент 3: аерація починаючи з 72 години і до кінця.
Фіг. 3. Вплив часу аерації на глюкозу, отриману при ферментативному гідролізі, --- - без аерації, еве - аерація протягом часу гідролізу між 0 ї 100 годинами, ---- - аерація протягом часу гідролізу між 0 ії 7 годинами і -- -- -- - аерація протягом часу гідролізу між 72 і 100 годинами.
Фіг. 4. Вплив часу аерації на глюкозу, отриману під час ферментативного гідролізу в експерименті 1 (ш - аерація протягом часу гідролізу між 0 і 100 годин) і 2 (о - аерація протягом часу гідролізу між 72 і 100 годин).
Фіг. 5. Вплив часу аерації на глюкозу, вироблену при ферментативному гідролізі, --я- аерація протягом часу гідролізу між 72 і 100 годин, і --е- аерація протягом часу гідролізу між 0 і 7 годин.
Фіг. 6. Схематична конструкція для можливого варіанта обладнання запропонована даним винаходом.
Докладний опис винаходу
У всьому описі й формулі винаходу слова "містить" і "включає" та їх варіанти, такі як "який містить", "утримує", "включає" і "який включає" повинні інтерпретуватися, що як включаючі.
Тобто, ці слова призначені для вираження можливого включення інших елементів або цілих чисел, не перерахованих спеціально, де це випливає з контексту. Терміни, наведені в однині, також включають і множину. Як приклад, "елемент" може означати один елемент або більше одного елемента.
У контексті даного винаходу терміни "удосконалений", "підвищений", "знижений" застосовуються як такі, що вказують, що даний винахід є кращим у порівнянні з тієї ж самою ситуацією, процесом або умовами процесу, за винятком відсутності додавання додаткового кисню. У контексті даного винаходу "визначений за тих же саме умов" або "проаналізований за тих же саме умов" тощо, означає, що спосіб запропонований даним винаходом й той же самий спосіб без (або з меншою кількістю) додавання кисню проводять за тих же саме умов (за винятком додавання кисню), і що результати представленого способу, у порівнянні зі способом без (або з меншою кількістю) додавання кисню, вимірюють за тих же саме умов, бажано із застосуванням того самого аналізу і/або методології, краще, у тому самому або в паралельному експерименті. Умови гідролізу є, наприклад, такими ж умовами.
У попередньому рівні техніки пропонується поліпшення гідролізу целюлолітичного матеріалу із застосуванням анаеробних (МО 2010/080407) або вакуумних (МО 2009/046538) умов під час ферментативного гідролізу. У способах з обох документів рівень кисню знижували. Було несподівано встановлено, що гідроліз запропонований даним винаходом демонструє результати з погляду поліпшення продуктивності реакції, що дає більш високі кількості (відновлюючих) цукрових продуктів і/або бажаних продуктів ферментації у ферментації після гідролізу, у порівнянні зі способом, у якому не подають кисню. У цілому, підвищення перетворення глюкози становить від 5 до 15 мас. 95, або навіть до 25 мас. 95.
Кисень можна додавати декількома способами. Наприклад, кисень може бути доданий у вигляді газоподібного кисню, збагаченого киснем газу, такого як збагачене киснем повітря, або повітря (приклад газу, що містить кисень). Кисень можна додавати безперервно або періодично. "Додавання" кисню означає, що кисень подають у рідку фазу (яка містить лігноцелюлозний матеріал) у гідролітичний реактор, а не те, що кисень є присутнім у вільному просторі реактора над рідкою фазою (у комбінації з повільним перемішуванням або без перемішування), де кисень повинен дифундувати з вільного простору в рідку фазу. Таким чином, бажано, кисень подають у вигляді бульбашок, найкраще, дрібних бульбашок. В одному варіанті здійснення бульбашки мають діаметр щонайменше 0,5 мм, щонайменше 1 мм, щонайменше 1,5 мм, щонайменше 2 мм, щонайменше 2,5 мм, щонайменше З мм, щонайменше 3, мм, щонайменше 4 мм, бо щонайменше 4,5 мм, щонайменше 5 мм. В одному варіанті здійснення бульбашки мають діаметр від 0,5 мм до 500 мм, бажано від 0,5 до 400 мм, від 0,5 до 300 мм, від 0,5 до 200 мм, від 0,5 до 100 мм.
У випадку якщо фермент може бути пошкодженим у присутності або при додаванні кисню, можна застосовувати більш помірну подачу кисню. У цьому випадку може бути знайдений баланс між поліпшеним виробленням глюкози й продуктивністю ферменту. Додавання кисню в целюлолітичний матеріал можна проводити при ферментативному гідролізі У випадку додавання кисню в газоподібній формі, газ, який містить кисень можна вводити, наприклад, продувати, крізь рідкий вміст гідролітичного реактора із целюлолітичного матеріалу. В іншому варіанті здійснення винаходу газ, який містить кисень, уводять у рідкий потік целюлолітичного матеріалу, який надходить до гідролітичного реактора. В іншому варіанті здійснення винаходу газ, який містить кисень, уводять разом із целюлолітичним матеріалом, який надходить до гідролітичного реактора або із частиною рідкого вмісту реактора, який проходить зовнішню петлю реактора. У більшості випадків додавання кисню до моменту надходження до гідролітичного реактора не є достатнім, і додавання кисню можна здійснювати також під час гідролізу. В іншому варіанті здійснення винаходу, газову фазу присутню у верхній частині реактора (вільному просторі), безперервно або періодично поновляють газом, який містить кисень. В останньому випадку необхідно (активне) збовтування або перемішування для проходження кисню у вигляді бульбашок і/або за допомогою дифузії в рідкий уміст реактора, бажано в комбінації з надлишковим тиском у реакторі. У цілому, продування вільного простору повітрям у комбінації з (активним) збовтуванням або перемішуванням може забезпечувати достатнє введення кисню в целюлолітичний матеріал у гідролітичному реакторі для реакторів розміром від 100 літрів до 1 м3. При більшому масштабі, наприклад, у реакторі 50 м3 або більше, наприклад, 100 м3, потрібно так багато енергії для активного перемішування, що з економічної точки зору це не є доцільним в промислових операційних процесах.
Відповідно до даного винаходу, кисень можна додавати протягом частини стадії гідролізу.
Додавання кисню протягом тільки частини гідролізу можна виконати, наприклад, у випадку, якщо відбувається окисне пошкодження ферменту(ів). У випадку, якщо присутність кисню у вмісті гідролітичного реактора або цукрові продукти або гідролізат, який утворився на етапі гідролізу, може впливати або порушувати наступний етап ферментації, додавання кисню можна
Зо виконувати протягом процесу гідролізу, за винятком останньої частини гідролізу, і таким чином, кисень (більша частина) споживається до того, як гідролізована біомаса надходить до ферментаційного реактора. Бажано, кисень, бажано у формі бульбашок (газу), подають щонайменше в останній частині етапу гідролізу.
Автори винаходу висунули гіпотезу, що в першій частині стадії (ферментативного) гідролізу аморфні полісахариди гідролізуються до цукрів, таких як глюкоза, і що в другій частині стадії гідролізу, решта кристалічних полісахаридів перетворюються на цукри. Аморфні полісахариди, наприклад, перетворюються на олігосахариди ендоглюконазами, при цьому згодом олігосахариди можуть перетворюватися целобіогідролазою і бета-глюкозидазою (БГ) на цукри.
Відповідно до представленої гіпотези, аморфні полісахариди розташовуються на зовнішній стороні полісахаридів або полісахаридних комплексів, у той час як кристалічний полісахариди розташовуються порівняно більше всередині полісахаридів або полісахаридних комплексів, присутніх у лігноцелюлозному матеріалі Таким чином, перетворення кристалічних полісахаридів може тривати, навіть коли більшість аморфних поліпептидів гідролізовано.
Зокрема, додавання кисню є сприятливим при гідролізі кристалічних полісахаридів, наприклад, при деградації полісахаридів до олігосахаридів. Відповідно до цієї гіпотези, додавання кисню є особливо корисним протягом другої частини стадії гідролізу. У цілому, більш короткий час додавання кисню (або більш коротка друга частина гідролізу) потрібна у випадку відносно низьких кількостей кристалічних полісахаридів у лігноцелюлозному матеріалі, у порівнянні з гідролізом лігноцелюлозного матеріалу, у якому присутні відносно більш високі кількості кристалічних полісахаридів. Автори винаходу також припустили, що додавання кисню є позитивним для гідролізу кристалічних полісахаридів. Таким чином, додавання кисню є дуже корисним, особливо у фазі, коли кристалічні полісахариди атакуються ферментами. Поза цією фазою може бути більш ефективною відсутність додавання кисню. Таким чином, подача кисню може починатися тільки в другій частині або другій половині гідролізу. Наприкінці гідролізу, коли більшість кристалічних полісахаридів деградоване, додавання кисню бажано припиняють. В останній частині другої частини або другої половини гідролізу більшість полісахаридів перетворюється на олігосахариди, які при наступнім руйнуванні на цукри меншого розміру більше не вимагають кисню. Таким чином, бажано кисню до лігноцелюлозного матеріалу подають менше, у порівнянні з додаванням кисню протягом частини процесу з аерацією, бо наприкінці процесу гідролізу, або кисню до лігноцелюлозного матеріалу наприкінці процесу гідролізу бажано не подають. Ця гіпотеза приводиться лише для можливого пояснення ефекту, який спостерігається авторами винаходу, але даний винахід не залежить від правильності цього припущення.
Кристалічна структура глюканів може бути відкрита літичною полісахарид-монооксигеназою (ГРМО). І РМО більш докладно описані нижче (їх також називають РМО). Цей тип ферменту відкриває структуру шляхом окислення глікозидних зв'язків і забезпечення їх доступності для інших целюлолітичних ферментів для наступного гідролізу олігосахаридів у глюкозу.
Більшість відомих ГРМО утворюють альдонові кислоти, тобто продукти, окислені в С1 положенні термінального цукру в ділянці розщеплення. Ця окислена глюкозна одиниця вивільняється у вигляді глюконової кислоти при гідролізі. Крім того, відзначено окислення Са і
Сб невідновлюючої глюкозної одиниці, на ділянці розщеплення. Наприклад, Т. Ізакзхеп еї. аї. (вище) повідомляли про окислення С4 положення невідновлюючого кінцевого компонента, приводить до утворення кето-цукру в С4 положенні, який перебуває в рівновазі із приєднаним до того ж атому С4 діолом у водному розчині. Автори даного винаходу припустили, що гідролізовані продукти окислення, наприклад, такі як глюконова кислота, є мірою активності застосованої І РМО у гідролізі лігноцелюлози.
Автори даного винаходу несподівано встановили, що оптимальний гідроліз лігноцелюлози (перетворення більше 70 95 глюканів) може бути досягнуте при споживанні кисню в кількості, яка відповідає від 20 до 5000 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі після попередньої обробки й до і/або під час ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу, бажано в кількості, яка відповідає щонайменше 30 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, краще у кількості, яка відповідає щонайменше 40 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, і найкраще в кількості, яка відповідає щонайменше 50 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі.
Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу, кисень споживається в кількості, яка відповідає від 20 до 5000 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі. Бажано, кисень споживається в кількості, яка відповідає від 22 до 4500 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від
Зо 24 до 4000 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від 26 до 3500 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від 28 до 3000 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі. Кисень подають після попередньої обробки до і/або під час ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу, бажано в кількості, яка відповідає щонайменше 30 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, краще в кількості, яка відповідає щонайменше 40 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі чи найкраще в кількості, яка відповідає щонайменше 50 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі Увесь кисень, який додають у систему, переноситься в рідину й використовується для гідролізу. Цю кількість можна контролювати шляхом вимірювання й контролю кількості повітря, що вводиться в систему.
Окислення лігпоцелюлозного матеріалу за допомогою !РМО призводить до окислених полісахаридів, які при гідролізі гідролізуються, серед іншого, у глюкозу й окислені глюкозні одиниці, такі як глюкуронова кислота або діол. Як правило, 1 молекула кисню (Ог) дає один моль продукту окислення. Необхідно розуміти, що оптимальний гідроліз лігноцелюлози може бути досягнуто тільки при оптимальному гідролізі (кристалічної целюлози й цело- олігосахаридів. Цей оптимальний гідроліз при впливі ГРМО приводить до утворення гідролізованного продукту окислення, такого як глюконова кислота. Відсутність окислення означає менш ефективний гідроліз (кристалічного) глюкану. Однак занадто високі рівні окислення приведуть до більш високих рівнів продуктів, таких як глюконова кислота, і будуть здійснюватися за рахунок глюкози, і таким чином, вихід глюкози за (вихідним) глюканом знизиться.
Автори даного винаходу також відзначили, що аерація під час процесу ферментативного гідролізу на початку процесу гідролізу призводить до підвищення утворення глюкози при гідролізі.
На Фігурі З показаний ефект аерації. У порівнянні з гідролізом "без аерації" (показаний на кривій "без аерації"), аерація на початку процесу гідролізу (показано у вигляді кривої "аерація 0- 7 годин") приводить до негайного підвищення вироблення глюкози, і наприклад, уже через 24 години гідролізу було встановлено, що вироблення глюкози відповідає продукції глюкози без бо аерації за 69 годин гідролізу за ідентичних умов (за винятком аерації). У порівнянні з гідролізом без аерації, аерація в останній частині процесу гідролізу (показано кривою "аерація 72-100 годин) приводить до негайного підвищення вироблення глюкози після аерації, і наприклад, уже через 24 години після початку аерації (72 години) у процесі гідролізу досягається 30 95 підвищення вироблення глюкози, у порівнянні з виробленням глюкози без аерації за ідентичних умов (за винятком аерації). Автори даного винаходу вважають, що із застосуванням аерації на початку, а також в останній частині процесу гідролізу (з періодом без аерації між інтервалами з аераціями) можна підвищити вироблення глюкози, що призводить до підвищення вироблення глюкози, яке є більшим від одного із двох окремих підвищень. Дане роз'яснення приводиться для того, щоб керуючись ним фахівець у даній галузі техніки міг підібрати відповідні умови для представленого процесу гідролізу.
Кілька прикладів часткової аерації під час процесу ферментативного гідролізу наведені в
Прикладах для демонстрації позитивного ефекту даного винаходу. Цей позитивний ефект виявлений для декількох субстратів або видів вихідної сировини, і таким чином, вважається присутнім при гідролізі всіх видів субстратів або вихідної сировини.
Деякі приклади ферментних композицій для процесу ферментативного гідролізу наведені в
Прикладах для демонстрації корисного ефекту даного винаходу. Цей корисний ефект був установлений для деяких ферментних композицій, і таким чином, визнаний присутнім для всіх видів гідролізованих ферментних композицій.
Відповідно до кращого варіанта здійснення винаходу, період часу, коли кисню подається менше, або бажано кисню не подається, становить від 10 до 80 95, бажано від 20 до 80 95, краще від З0 до 80 905, і найкраще від 40 до 80 95 від загального часу ферментативного гідролізу.
Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу, період часу, коли подається більше кисню, становить від 2 до 80 95, бажано від 4 до 60 95, краще від 8 до 50 95, і найкраще від 10 до 50 95 від загального часу ферментативного гідролізу. У цілому, концентрація кисню в рідкій фазі протягом періоду часу, коли подають кисень, щонайменше в 2 рази, бажано щонайменше в 4 рази, краще щонайменше в 10 разів перевищує концентрацію кисню в рідкій фазі протягом періоду часу, коли кисню додають менше або не додають.
В іншому кращому варіанті здійснення винаходу протягом періоду часу, коли кисень подають у рідку фазу (шляхом аерації або додавання кисню), концентрація кисню (РК) у рідкій
Зо фазі, де присутній лігноцелюлозний матеріал під час ферментативного гідролізу, становить щонайменше 0,001 моль/м3, бажано щонайменше 0,002 моль/мУ, краще щонайменше 0,003 моль/м3 і ще краще більше 0,01 моль/м3, наприклад, більше 0,02 моль/м3 або 0,03 моль/м3. У реакторах об'ємом менше 1 му значення РК нижче 0,01 моль/м7 або 0,02 моль/м3 досягаються шляхом повільного перемішування. Інтенсивне перемішування або збовтування в такому масштабі переводить частину газової фази з вільного простору в реакційну рідину. Наприклад, перемішування або збовтування може створити лійку, яка переводить кисень у рідину. У цілому, продування вільного простору повітрям у комбінації з (інтенсивним) перемішуванням або збовтуванням забезпечує введення достатньої кількості кисню в целюлозний матеріал у гідролітичному реакторі для реакторів розміром від 100 літрів до 1 м3. У більшому об'ємі, наприклад, у реакторі об'ємом 50 м? або більше, наприклад, 100 м3У, потрібно так багато енергії для інтенсивного перемішування, що з економічної точки зору це не може застосуватись в промисловому операційному процесі. У цілому, у більших реакторах перемішування або збовтування без уведення повітря або кисню приводить до значень РК менше 0,01 моль/м3.
В іншому кращому варіанті здійснення винаходу при генерації або продукуванні кисню концентрація кисню в рідкій фазі (аерація або додавання кисню), в якій присутній лігноцелюлозний матеріал під час ферментативного гідролізу, становить протягом періоду часу, коли подають кисень, бажано щонайбільше 80 95 від концентрації насичення кисню за умов реакції гідролізу, краще щонайбільше 0,12 моль/м3, ще краще щонайбільше 0,09 моль/му, ще краще щонайбільше 0,06 моль/м", ще краще щонайбільше 0,045 моль/м" і найкраще щонайбільше 0,03 моль/м?. В одному варіанті здійснення концентрація кисню становить 0 моль/м3, оскільки споживання кисню швидше від швидкості перенесення кисню. Температура й тиск впливають на РК. Кращі й приблизні значення в моль/му, наведені вище, відносяться до нормального атмосферного тиску й температури близько 62 "С. Фахівець у даній галузі техніки зможе підібрати відповідні значення РК на основі представлених знань.
В іншому кращому варіанті здійснення винаходу концентрація кисню в рідкій фазі, в якій присутній лігноцелюлозний матеріал під час ферментативного гідролізу, становить протягом періоду часу, коли додають менше або не додають кисню, менше 0,02 моль/му, бажано менше 0,01 моль/м3, краще менше 0,005 моль/м"У, і найкраще менше 0,001 моль/м3.
Додавання кисню у формі повітря або іншого газу, який містить кисень відповідно до 60 винаходу можна також застосовувати для щонайменше часткового перемішування або збовтування вмісту гідролітичного реактора. Представлений Спосіб запропонований даним винаходом, особливо демонструє переваги пілотного або промислового масштабу. Бажано, гідролітичний реактор має об'єм 1 му або більше, бажано більше 10 м3 і найкраще 50 м3 або більше. Як правило, гідролітичний реактор повинен бути меншим від 3000 м3 або 5000 му3.
Автори даного винаходу припустили, що особливо при великомасштабному виробництві недостатньо кисню, доступного для гідролізу, що може бути зумовлене обмеженнями перенесення кисню в реакторі, наприклад, у целюлолітичній біомасі. В експериментах у лабораторному масштабі ця нестача кисню може відіграти менш важливу роль. Співвідношення площі поверхні (або площі контакту з киснем вмісту реактора) до об'єму реактора є більш придатним для експериментів у маленькому масштабі, ніж для великомасштабних експериментів. Далі, перемішування в експериментах у маленькому масштабі є відносно легшим від перемішування у великому масштабі. Під час цих експериментів у маленькому масштабі також швидше відбувається транспорт кисню з вільного простору гідролітичного реактора, у порівнянні з великомасштабними експериментами. Ця теорія є єдиною, яка дає можливе пояснення ефекту, відзначеному авторами даного винаходу, і даний винахід не спростовує й не заперечує правильність цієї теорії. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу, додавання кисню можна застосовувати для щонайменше часткового контролю процесу гідролізу.
Відповідно до іншого аспекту винаходу, забезпечується обладнання, придатне для ферментативного гідролізу відповідно до даного винаходу. Обладнання запропоноване даним винаходом включає: (а) реактор або посудина реактора об'ємом щонайменше 1 м3, яка включає засоби для введення газу, бажано розподільник газу, для введення газу в реактор; (Б) необов'язково, засоби для перемішування вмісту реактора; (с) газовий насос для введення газу в реактор; (а) рециркуляційний трубопровід для рециркуляції газу з вільного простору реактора; (є) випускну систему для видалення газу з реактора; (І) підведення газу для введення свіжого газу в реактор; (4) засоби, бажано клапан, для контролю співвідношення рециркулюючого і свіжого газу.
На Фігурі 6 схематично показаний один варіант втілення обладнання даного винаходу.
Бажано, Спосіб запропонований даним винаходом, здійснюють в обладнанні даного винаходу. Бажано, щонайменше протягом періоду часу Спосіб запропонований даним винаходом, здійснюють у представленому обладнанні, і газ, який вводиться в реактор, є газом, який містить кисень. Газ, що вводиться шляхом підведення газу, бажано є газом, який містить кисень, і бажано, повітрям. У способі, запропонованому даним винаходом, кисень споживається, і рециркулюючий газ містить менше кисню, ніж газ, уведений у реактор. За допомогою засобів, бажано клапана, для контролю співвідношення рециркулюючого і свіжого газу, кисень можна вводити в реактор точно в необхідній кількості для реакції ферментативного гідролізу. Рівень кисню в газі, що вводиться в реактор, можна контролювати між рівнем кисню у вільному просторі й рівнем кисню в підведеному газу. У випадку, якщо підведення газу не відбувається, в реактор буде вводитися тільки рециркулюючий газ. Споживання кисню під час ферментативного гідролізу приводить, в останньому випадку, до зниження вмісту кисню, присутнього в обладнанні, поки, нарешті, кисень не буде повністю відсутній.
У випадку, якщо рециркулюючого газу мало, у порівнянні зі свіжим газом, який вводиться через підведення газу, рівень кисню в газі, який присутній в обладнанні, буде близьким до рівня кисню у свіжому газі, що вводиться. У випадку, коли свіжим газом, який вводиться, є повітря, рівень кисню ов реакторі бажано можна контролювати шляхом підбору відповідного співвідношення між свіжим, повітрям, що вводиться, і рециркулюючим газом.
Збереження рівня кисню на обраному значенні може бути забезпечене шляхом уведення тієї ж самої кількості свіжого кисню через підведення газу, що і кількість кисню, яка споживається під час гідролізу в реакторі.
Розподільник газу забезпечує введення газу в реактор. Газовий насос забезпечує необхідний тиск для введення газу в реактор через розподільник. Шляхом вибору тиску можна контролювати кількість газу, що вводиться через розподільник. Газ можна застосовувати для введення кисню в реактор, а також для перемішування вмісту реактора в реакторі. Розподільник газу може мати, наприклад, форсунки або отвори для введення газу у вміст реактора. Як правило, діаметр отворів у розподільнику становить щонайменше 0,5 мм, щонайменше 1 мм, щонайменше 1,5 мм, щонайменше 2 мм, щонайменше 2,5 мм, щонайменше З мм, щонайменше 3,5 мм, щонайменше 4 мм, щонайменше 4,5 мм, щонайменше 5 мм. В одному варіанті здійснення діаметр отворів у розподільнику становить від 0,5 мм до 500 мм, бажано від 0,5 до 400 мм, від 0,5 до 300 мм, від 0,5 до 200 мм, від 0,5 до 100 мм.
Необов'язково, також можна застосовувати мішалку для перемішування вмісту реактора. У випадку застосування мішалки в реакторі, можна застосовувати всі мішалки, відомі в даній галузі техніки, наприклад, якірного типу, лопатевого типу, пропелерного типу тощо. У випадку застосування мішалки можна застосовувати одну або кілька мішалок. Кожне лопатеве колесо може мати, наприклад, 2, 3, 4 або більш лопатей, лопаті лопатевого колеса мішалки можуть бути вертикальними лопатями або похилими лопатями, вертикальними й похилими відносно осі мішалки.
Необов'язково, потік рідини (циркулюючий) можна застосовувати для керування трубкою
Вентури для подавання в рідину газу, який містить кисень. Ця система циркуляції потоку рідини забезпечує циркуляцію (частини) рідкого вмісту реактора, а саме гідролізата або лігноцелюлозного матеріалу.
У цілому, целюлазні композиції, які застосовуються для гідролізу лігноцелюлозного матеріалу, містять кілька целюлаз, включаючи (Нбї1. СНб1ї має здатність до гідролізу кристалічної целюлози до целюлозних полімерів, які можуть бути далі гідролізовані в глюкозу іншими целюлазами. Кисень необхідний для реакції гідролізу, каталізованої СНО, і в результаті глюкозна одиниця на відновлюючому кінці гідролізованого целюлозного полімеру окислюється до залишку глюконової кислоти. Цей залишок глюконової кислоти вивільняється в процесі подальшого проходження гідролізу. Необхідно розуміти, що обмежена активність СОНЄЇ може привести до лише часткового гідролізу кристалічної целюлози, у той час як, з іншого боку, надлишковий гідроліз призводить до високих концентрацій глюконової кислоти й до зниження вивільнення глюкози із целюлозного сировинного матеріалу. Таким чином, активність зНб1 бажано контролюють для оптимального результату. Одним способом подачі кисню під час гідролізу є додавання кисню у формі газу, який містить кисень, такого як повітря. Відповідно до даного винаходу, кисень подається і присутній, таким чином, що рівень кисню при гідролізі точно контролюється обладнанням, описаним у дані заявці.
Запропонований даним винаходом, контроль кількості кисню, який подавати в гідролізат, має дуже велике значення. Крім того, потрібно виключити локальні високі концентрації кисню в
Зо лігноцелюлозному матеріалі (гідролізаті) у гідролітичному реакторі для обмеження втрати ферментативної активності через вплив кисню на целюлази. Це здійснюють шляхом забезпечення належного змішування рідини з киснем і контролю необхідної концентрації кисню в реакторі. При циркуляції газу від верхньої частини посудини (вільного простору реактора) до системи введення газу, такої як розподільник на дні, увесь присутній у вільному просторі на початку кисень споживається дуже швидко. Це споживання відбувається, серед іншого, внаслідок окислення присутнього лігніну й дії ЗНЄ1. Після моменту споживання кисню газ над гідролізатом містить головним чином азот і диоксид вуглецю. Рециркуляція вихідного газу (який містить мало, або зовсім не містить кисню) може забезпечувати достатнє перемішування в реакторі у випадку, якщо газ рециркулює через обладнання введення газу, таке як розподільник, яке "покриває" більшу частину дна й містить маленькі отвори для утворення маленьких бульбашок. "Покриває" означає, що маленькі бульбашки газу утворюються й присутні в більшій частині або частці вмісту реактора на дні, і таким чином, не тільки в обмеженій частині площі дна. Розмір отворів бажано становить менше 1 см у діаметрі.
Якщо мала кількість кисню, наприклад, у формі повітря, подається в рециклюючий або рециркулюючий потік, концентрація кисню в потоці рециркулюючого повітря є низькою. Кисень, який подається в систему рециркуляції, може вводитися безпосередньо в систему рециркуляції газу, або може додаватися окремо від рециркулюючого газу в гідролізат. Таким чином, концентрація розчиненого кисню в реакторі й надходження кисню до рідини в реакторі можна контролювати дуже точно й на низьких рівнях, і можна легко підводити до необхідної концентрації. Даний винахід забезпечує спосіб і обладнання, які запобігають або обмежують втрату ферментативної активності і в той же саме час забезпечують подачу кисню до гідролізату.
Спосіб запропонований даним винаходом бажано застосовують у комбінації з використанням термостабільних ферментів. "Термостабільний" фермент означає фермент, який має температурний оптимум 60 "С або вище, наприклад, 70 "С або вище, такий як 75 "С або вище, наприклад, 80 "С або вище, такий як 85 С або вище. Він може бути, наприклад, виділений з термофільних мікроорганізмів, або може бути сконструйований фахівцем у даній галузі техніки й штучно синтезований. В одному варіанті здійснення полінуклеотиди можуть бути виділені або отримані з термофільних або термотолерантних міцеліальних грибів, або виділені з не-термофільних або не- термотолерантних грибів, але є термостабільними. "Термофільний гриб" означає гриб, який росте за температури 50"С або вище. "Термотолерантний" гриб означає гриб, який росте за температури 45 "С або вище та має максимум близько 50 "С.
Прикладом термофільних штамів грибів є Казатбхопіа етегзопії (раніше відомий як
Таіаготусе5 етегвопі; Таіаготусе5 етегзопії, РепісйШіит деобтіїйіа етегзопії і Казатзопіа етегзопії, які в даний заявці застосовуються як взаємозамінні).
Придатними термофільними або термотолерантними клітинами грибів можуть бути клітини
Нитісоїа, АпПіготисог, Мусеїїорпїпога, Назатвзопіа, Таіаготусе5, Ппептотусев5, Ппептоавсив або ТПпіеІама, бажано клітини Казатбзтопіа етегбопі. Кращими термофільними або термотолерантними грибами є Нитісоїа дгієеа маг. (ептоіїдеа, Нитісоїа Іапидіпоза,
Мусеїорпїйога Шепторпіа, Раршазрога ШепторНійа, Назатвопіа Бузбзоспіатуадоідев,
Вазатвзопіа етегїзопії, Назатвзхопіа агодіПасеа, Назатзтопіа еритеап, Назатвзопіа Бгемівзіїрітава,
Вазатвхопіа суїїпагозрога, ВПіготисог ривіїйшв5, ННПіготисог тіейеї, Таіаготусе5 бБасійїзрогив,
Таіаготусе5 Ісусейапив5, Таіаготусе5 Шегпторпіїй5, Тпептотусе5 Іепидіпози5, Пегтоавсив сгизіасеи5, Тпептоазсиз (Шегторпйи5 Тпептоазсиз ашигапійасиз і Тпієїаміа їеггевігів.
Термофільні гриби не обмежуються специфічним таксономічним порядком, і всі еволюційно відносяться до царства грибів. Прикладами є КПіготисог з мукорових грибів, Мусеїйорпївога з сордарієвих грибів і Таіаготусе5, Тпегтоптусез і Тпептоазсиз із еуроцієвих грибів (Моиспасса 1997). Більшість видів Таіаготусе5 є мезофілами, але виключенням є види в групах Етегзогії і
Тпепторпйа. Група Етегзопії включає Таіаготусе5 етегзопії, Таіаготусе5 Буззоспіатуадоідев,
Таіаготусе5 бБасіййєроги5 і Таіаготусе5 Іеусейапи5, усі з яких добре ростуть при 40 с.
Таіаготусе5 Басіййєроги5 є термотолерантним, Т. Іеусенапи5 є термотолерантним або термофільним, а Т. етегзопії і Т. руззоспіатудоіде5 є справжніми термофільними (500ІК апа затв5оп 1972). Єдиний представник групи Таіаготусе5 ТПпегторпйа, Т. (Фепторпййн5 швидко росте при 50 С (Емап5 апа (ІК 1971; Емап5 1971; ІК апа Затзоп 1972). Поточна класифікація цих термофільних видів Таіаготусе5 заснована головним чином на фенотипових і фізіологічних характеристиках, таких як їхня здатність до росту за температури вище 40 "с,
Зо забарвлення аскоспор, структура оболонки аска, і утворення певного типу анаморфа. 0ЇК апа
Затвзоп (1972) установили, що члени групи Етегзопії мають анаморфи серій або Раесйотусе5 (Т. Бубзоспіатуйдоіде5 і Т. Ієусенапив), або Репісіййшт суїїпадгоброгит (Т. етегзопії і Т. расіїййзроги5). Пізніше РІК (1979) переніс види, які належать до виду Репісійшт суїїпагозрогит, у рід сСеозтійїпіа, виходячи з різних ознак, таких як утворення конідій з термінальних пор замість шийки, ознаки Репісіййшт і Раесібптусе5. З роду СеозтіШіа, тільки (с. агудшШасеа є термотолерантним, і 500ЇК еї аіІ. (1969) і Емап5 (1971) припустили зв'язок зі членами групи
Таіаготусе5 Етегзопії. Філогенетичний зв'язок термофільних видів Таіаготусе5 у межах
Таіаготусез і Тгіспосотасеає невідомий. Див. У). Ноцибгакеп, Апіопіє мап І ееимепрпоек 2012 Ребр; 101(2): 403-21.
Казатвзопіа є новим родом, який включає термотолерантні й термофільні види Таіаготусев5 і Сеозтіїйіа (9). Ношибгакеп еї аіЇ, вище). На основі фенотипових, фізіологічних і молекулярних даних, НошбгакКеп еї а! запропонували перенести види Т. етегзопії, Т. Буззоспіатуаоіаев, Т. еригпецйз, о. агуйасеа і 0. суїпагозрога у рід Казатвзопіа. Таіаготусе5 етегзопії, Репісйит деозтіШіа етегвопії і Казатбвопіа етегв5опі, які в даний заявці застосовуються як взаємозамінні.
Кращими термофільними грибами є Казатвзопіа Буззоспіатуадоіде5, Казатзопіа етегзопії,
Тпептотусев Іепидіпобив5, Таіаготусе5 Шепторпйй5, Пептоабсив сгпивіасеи5, Пептоавсив
ІШепторпійиз ії Тпегтоазсив аигапііасив. "Міцеліальні гриби" включають усі філаментні форми підвідділу Ейтусоїа і Оотусоїа (як визначено Нам/к5могій еї аї., в "Аіпзугогій апа Візбуз Оісійопагу ої Те ГРипаді, 8!" еайіоп, 1995,
САВ Іпіегпайіопа!Ї, Опімегейу Рге55, Сатбгіаде, ОК ("Довідник грибів Бісбі")). Міцеліальні гриби характеризуються міцеліальною стінкою, утвореною з хітину, целюлози, глюкану, хітозану, манану та інших комплексних полісахаридів. Вегетативний ріст здійснюється за рахунок гіфального видовження, а метаболізм вуглецю є облігатно аеробним. Штами міцеліальних грибів включають Астетопішт, Адагісив5, Аврегайи5, Айцгеобавідіит, Веаиймагіа, Серпаіозрогіит,
Сепрогпіорвзі5, СПНаєїотішт раесіотусев5, СНгузовзропййт, Сіамісерх, СоспіороЇшв5, Соргіпив,
Стуріососсив, Суаїйпив, ЕтегісеїМа, Епаоїйпіа, Епдоїніа тисог, Ріїїразідійт, Ризагпит, Сеозтіїніа,
Сіїосіадішт, Нитісоїа, Мадпаропйе, Мисог, Мусеїорпійога, Мугоїпесішт, МеосаїЇїтавіїх,
Мешгозрога, Раесіотусев, Репісійит, Ріготусез, Рапегоснавєїе, Рівигоїш5, Родозрога, Ругісшагніа, 60 Вазатзопіа, ВНіготисог, ВПігорив, 5суїайдійт, З5сНігорпуйшт, еіадопозрога, Таіаготусев,
Тпептоазсив, ТПептотусев, ТПівіаміа, Тоїуросіадіит, Ттатеїе5 ріеигоїш5, Тгісподегта і
Тиїспорнуйоп, але не обмежуються ними.
Деякі штами міцеліальних грибів легко доступні за номером колекцій культур, таких як
Американська колекція типових культур (АТСС), Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур (ОМ), Центральне бюро грибних культур (СВ5), і Колекція патентованих культур
Служби сільськогосподарських досліджень, Північний регіональний дослідний центр (МКК).
Приклади таких штамів включають Азрегдійи5 підег СВ5 513,88, АзрегодіПи5 огулае АТСС 20423,
ІРО 4177, АТО 1011, АТОС 9576, АТОС14488-14491, АТОС 11601, АТОС12892, Р. спгуводепит
СвВ5 455,95, Репісіййшт сййпит АТСС 38065, Репісійит спгузодепит Рг, Таіаготусе5 етегзопії
СВ 393,64, Асгетопішт спгузходепит АТСС 36225 або АТСС 48272, Тгісподегта геезеі АТОС 26921 або АТСС 56765 або АТСС 26921, Аврегойи5 зо|дае АТСС11906, Спгузозрогішт
ІнсКпомжепзе С1, Сага 27К, МКМ Е-3500-О0, АТОС44006 та їх похідні.
Перевагою експресії й вироблення ферментів (наприклад, щонайменше двох, трьох або чотирьох різних целюлаз) у придатному мікроорганізмі може бути високий вихід ферментної композиції, яку можна застосовувати в способі запропонованому даним винаходом.
Відповідно до винаходу, шляхом додавання кисню можна досягти багатьох переваг способу, включаючи оптимальні температурні умови, зменшення часу процесу, зниження дозування ферменту, повторне застосування ферментів та інші оптимізації процесу, що призводить до зниження витрат. Бажано, винахід забезпечує спосіб, у якому стадію гідролізу здійснюють за поліпшених умов. Винахід також забезпечує спосіб, який включає гідроліз, що має зменшену тривалість процесу. Далі, винахід забезпечує спосіб, де дозування ферменту може бути знижчим, і в той же саме час, вихід корисного продукту гідролізу залишається на тому ж самому рівні. ІНШОЮ перевагою винаходу є те, що представлений спосіб, який включає гідроліз, може призводити до оптимізованих умов процесу. Іншою перевагою винаходу є те, що вихід корисного продукту способу, який передбачає гідроліз, підвищується за тієї ж самої дози ферменту.
Стабільна ферментна композиція
Стабільна ферментна композиція означає в даний заявці, що ферментна композиція зберігає активність через 30 годин реакції гідролізу, бажано щонайменше на 10 95, 20 95, ЗО Об, 4О Зо, 50 Зо, 60 бо, 65 90, 70 9, 75 Зо, 80 95 85 9о, 90 9, 95 965, 96 9, 97 о, 98 95, 99 90 або 100 95 від вихідної активності через 30 годин реакції гідролізу. Бажано, ферментна композиція зберігає активність через 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 годин реакції гідролізу.
В одному варіанті здійснення ферментна композиція, яка використовується в способах запропонованих даним винаходом, отримана із грибів, або ферментна композиція, яка використовується в способах запропонованих даним винаходом, містить фермент гриба. В одному варіанті здійснення ферментна композиція отримана з міцеліального гриба, або ферментна композиція містить фермент міцеліального гриба. Способи запропоновані винаходом бажано застосовують у комбінації з ферментними композиціями, отриманими з мікроорганізму з роду Казатвзопіа, або ферментна композиція містить фермент із Казатвзопіа.
Ферментна композиція може бути приготовлена шляхом ферментації відповідного субстрату з придатним мікроорганізмом, наприклад, Казатбвопіа ептегеопії або АзрегойШив5 підег, де ферментна композиція виробляється мікроорганізмом. Мікроорганізм може бути змінений для поліпшення або одержання целюлазної композиції. Наприклад, мікроорганізм може зазнавати мутації за допомогою класичних процедур поліпшення штаму або шляхом методик рекомбінантної ДНК. Таким чином, мікроорганізм, згаданий у даний заявці, можна застосовувати як такий для одержання целюлазної композиції, або він може бути змінений для підвищення продукування або для вироблення зміненої целюлазної композиції, яка може включати гетерологічні целюлази, такі ферменти, які не продукуються цим мікроорганізмом початково. Бажано гриб, краще міцеліальний гриб застосовують для одержання целюлазної композиції. Бажано застосовують термофільний або термотолерантний мікроорганізм.
Необов'язково, застосовують субстрат, який індукує експресію ферментів у ферментній композиції при одержанні ферментної композиції.
Ферментну композицію застосовують для вивільнення цукрів з лігноцелюлози, яка включає полісахариди. Головними полісахаридами є целюлоза (глюкани), геміцелюлози (ксилани, гетероксилани й ксилоглюкани). Крім того, деяка геміцелюлоза може бути присутньою у вигляді глюкомананів, наприклад, у сировинному матеріалі з деревини. Ферментативний гідроліз цих полісахаридів до розчинних цукрів, включаючи мономери й мультимери, наприклад, глюкозу, целобіозу, ксилозу, арабінозу, галактозу, фруктозу, манозу, рамнозу, рибозу, галактуронову бо кислоту, глюкуронову кислоту та інші гексози й пентози, здійснюється під дією різних ферментів,
що діють узгоджено. "Цукровий продукт" означає продукт ферментативного гідролізу сировинного матеріалу або лігноцелюлозного матеріалу. Цукровий продукт включає розчинні цукри, у тому числі мономери й мультимери, бажано включає глюкозу. Прикладами інших цукрів є целобіоза, ксилоза, арабіноза, галактоза, фруктоза, маноза, рамноза, рибоза, галактуронова кислота, глюкуронова кислота та інші сгексози й пентози. Цукровий продукт може застосовуватися як такий, або може бути піддадуть додатковій обробці, наприклад, очищенню.
Крім того, пектини й інші пектинові речовини, такі як арабінани, можуть становити значну частину сухої маси стінок типової клітини із тканин не деревної рослини (приблизно від чверті до половини сухої маси може бути пектинами).
Целюлоза є лінійним полісахаридом, який складається із глюкозних залишків, зв'язаних р- 1,4 зв'язками. Лінійна природа целюлозних волокон, а також стехіометрія рД-зчепленої глюкози (відносно а) створює структури, більш схильні до зв'язування водню між ланцюгами, ніж високо розгалужені а-зчеплені структури крохмалю. Таким чином, целюлозні полімери, як правило, є менш розчинними, і утворюють більш тісно зв'язані волокна, ніж волокна, з яких складається крохмаль.
Ферменти, які можуть бути включені в стабільну ферментну композицію, яка використовується в даному винаході, далі описані більш докладно.
Літичні полісахаридні монооксигенази, такі як СНбї, ендоглюканази (ЕС) і екзо- целобіогідролази (СВН), каталізують гідроліз нерозчинної целюлози в такі продукти, як целоолігосахариди (целобіоза як основний продукт), у той час як бета-глюкозидази (ВО) перетворюють олігосахариди, головним чином целобіозу й целотриозу, на глюкозу.
Геміцелюлоза є складним полімером, і її сполука часто широко варіює від організму до організму, і від одного типу тканини до іншого. Як правило, головним компонентом геміцелюлози є р-1, 4-зчеплена ксилоза, цукор з п'ятьома атомами вуглецю. Однак ця ксилоза часто розгалужена на 0-3 і/або 0-2 атомі ксилози, і може бути заміщена зі зв'язками на арабінозу, галактозу, манозу, глюкуронову кислоту, галактуронову кислоту, або шляхом етерифікації на оцтову кислоту (і етерифікацією ферулової кислоти на арабінозу).
Геміцелюлоза може також містити глюкан, який є загальним терміном для р-зчеплених цукрів із шістьма вуглецевими атомами (таких як ВД-(1,3)(1,4) глюкани й гетероглюкани, згадані раніше) і
Зо крім того, глюкоманани (у яких глюкоза й маноза присутні в лінійному каркасі, зв'язуючись із іншими р-зв'язками).
Ксиланази разом Кк! іншими допоміжними ферментами, наприклад, а-І- арабінофуранозидазами, ферулоїл- і ацетилксилан естеразами, глюкуронідазами й р- ксилозидазами каталізують гідроліз геміцелюлоз.
Пектинові речовини включають пектини, арабінани, галактани й арабіногалактани. Пектини є найбільш складними полісахаридами в клітинній стінці рослин. Вони побудовані навколо серцевинного ланцюга з одиниць а(1,4)-зчепленої Ю-галактуронової кислоти, певною мірою упереміж з І -рамнозою. У будь-якій клітинній стінці є ряд структурних одиниць, які відповідають цьому опису, і в цілому вважається, що в окремій пектиновій молекулі серцевинні ланцюги різних структурних одиниць є неперервними з будь-якими іншими.
Основними типами структурної одиниці є: галактуронан (гомогалактуронан), який може бути заміщений метанолом на карбоксильній групі й ацетатом на 0-2 і 0-3; рамногалактуронан (РГІ), у якому одиниці галактуронової кислоти чергуються з рамнозними одиницями, які несуть бічні ланцюги (1,4)-зв'язаного галактану й (1,5)-зв'язаного арабінану. Арабінанові бічні ланцюги можуть приєднуватися безпосередньо до рамнози або опосередковано через галактанові ланцюги; ксилогалактуронану, з окремими ксилозильними одиницями на 0-3 галактуроновій кислоті (тісно зв'язаній із РГІ); Її рамногалактуронану ЇЇ (РГІЇ), особливо складній мінорній одиниці, яка містить незвичайні цукри, наприклад, апіозу. РПІЇ одиниця може містити два апіозильних залишки, які за відповідних іонних умов можуть зворотньо формувати складні ефіри з боратом.
Композиція для застосування в способі запропонованому даним винаходом має щонайменше дві активності, хоча, як правило, композиція має більше двох активностей, наприклад, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або більше. Як правило, композиція, запропонована даним винаходом, може містити щонайменше дві різні целюлази, або одну целюлазу й щонайменше одну геміцелюлазу. Композиція, запропонована даним винаходом, може містити целюлази, але не ксиланази. Крім того, композиція, запропонована даним винаходом, може мати допоміжну ферментативну активність, тобто додаткову активність, яка прямо або опосередковано приводить до деградації лігноцелюлози. Приклади таких допоміжних активностей згадані в даний заявці.
Таким чином, композиція для застосування згідно винаходу може містити СН, ендоглюканазну активність і/або целобіогідролазну активність і/або бета-глюкозидазну активність. Композиція для застосування згідно винаходу може містити більше однієї ферментативної активності одного або декількох із цих класів. Наприклад, композиція для застосування згідно даного винаходу може містити дві ендоглюканазних активності, наприклад, ендо-1,3(1,4)-ВД-глюканазну активність і ендо-В-1,4-глюканазну активність. Така композиція може також включати одну або декілька ксиланазних активностей. Така композиція може містити допоміжну ферментативну активність.
Композиція для застосування згідно даного винаходу може бути отримана із грибів, таких як міцеліальних гриби, такі як Казатвопіа, такі як Казатзопіа етегзопії. В одному варіанті здійснення основний набір ферментативних активностей (які деградують целюлозу) може бути отриманий з Казатвзопіа етегзопії. Казатвзопіа етегзопії може забезпечити високоефективний набір активностей, як показано в даний заявці, для гідролізу лігноцелюлозного матеріалу. Якщо необхідно, до високоефективного набору активностей може бути додані додаткові ферментативні активності з інших джерел. Такі додаткові активності можуть бути отримані із класичних джерел і/або забезпечені генетично модифікованими організмами.
Активності в композиції для застосування згідно винаходу можуть бути термостабільними. У даний заявці це означає, що активність має температурний оптимум близько 60 "С або вище, наприклад, близько 70 "С або вище, такий як близько 75 "С або вище, наприклад, близько 80 С або вище, такий як 85 "С або вище. Активності в композиції для застосування згідно винаходу, як правило, не мають того самого температурного оптимума, проте, бажано є термостабільними.
Крім того, активності ферментів у композиції для застосування згідно винаходу можуть працювати при низькому рН. Для цілей цього винаходу, низьким рН називають рН близько 5,5 або нижче, близько 5 або нижче, близько 4,9 або нижче, близько 4,8 або нижче, близько 4,7 або нижче, близько 4,6 або нижче, близько 4,5 або нижче, близько 4,4 або нижче, близько 4,3 або нижче, близько 4,2 або нижче, близько 4,1 або нижче, близько 4,0 або нижче, близько 3,9 або нижче, близько 3,8 або нижче, близько 3,7 або нижче, близько 3,6 або нижче, або близько 3,5 або нижче.
Зо Активності композиції для застосування згідно винаходу можуть визначатися комбінацією будь-яких з поміж вищевказаних температурних оптимумів і значень рн.
Композиція, яка використовується в способі запропонованому даним винаходом, може включати, на додачу до активностей, отриманих з Казатвзопіа, целюлазу (наприклад, отриману з іншого джерела, ніж Казатвзопіа) і/або геміцелюлазу (наприклад, отриману з іншого джерела, ніж Казатзопіа), і/або пектиназу.
Ферментативна композиція для застосування згідно даного винаходу може включати целюлазу і/або геміцелюлазу і/або пектиназу з іншого джерела, ніж Казатвзопіа.
Наприклад, ферментативна композиція для застосування згідно даного винаходу може включати бета-глюкозидазу (ВС) з АзрегуйШив5, такого як Азрегоїи5 огулає, таку як розкрито в
МО 02/095014, або гібридний білок, який має бета-глюкозидазну активність, розкритий в УМО 2008/057637, або Азрегойи5 Титідагшв5, такий як розкритий як 5ХЕО ІЮ МО:2 в УМО 2005/047499 або 5ЕО ІЮО МО:5 в МО 2014/130812, або варіант бета-глюкозидази Азрегоїйїи5 ттідасив5, такий як розкритий в МО 2012/044915, такий як з наступними замінами: Е1000, 52830, М456Е, Е512У (нумерація відносно ЗЕО ІЮ МО: 5 з УМО 2014/130812), або Азрегойи5 асшеацив5, Азрегойи5 підег або Азрегодїїи5 Каугаспі. В іншому варіанті здійснення бета-глюкозидаза отримана з РепісійПшт, такого як Репісійшт Бгавзійапит, розкрита як 5ЕО ІЮ МО:2 в УМО 2007/019442, або з Тгісподегта, такого як Тгісподегта геезеї, такі, як описано в 05 6,022,725, 005 6,982,159, 05 7,045,332, 05 7,005,289, 5 2006/0258554 05 2004/0102619. В одному варіанті здійснення можна застосовувати навіть бактеріальну бета-глюкозидазу. В іншому варіанті здійснення бета- глюкозидаза отримана з ТПіеіаміа (еггевігіє (ММО 2011/035029) або Тгіспорпаєа 5ассаїа (МО 2007/019442).
Наприклад, композиція для застосування згідно даного винаходу може включати ендоглюканазу (ЕГ) з Тгісподегта, такого як Тгісподегта геезеї; з Нитісоїа, такого як штам
Нитісоїа іпзоЇепе5; з Азрегоїш5, такого як А5зрегойи5 асціеайи5 або АзрегдйШи5 Камаспії; з Егум/іпіа, такого як Егміпіа сагоїомага; з Ризагішт, такого як Ризагшт охузрогит; з ТПпіеіаміа, такого як
ТНпівіаміа (етевігіє; з Нитісоїа, такого як Нитісоїа дгізеа маг. (пегтоїдеа або Нитісоїа іпхоїепв; з
МеїІапосагрив, такого як МеІапосагри5 аІротусев5; з Меигозрога, такого як Меиго5рога сгазза; з
Мусеїїорпїйпога, такого як МусеїПорпїйтога (пегторпйа; з Сіадоггпіпит, такого як Сіадогпіпит тоесипаібвітит і/або з Спгузозрогішт, такого як штам Спгузозрогішт ІшсКкпомжмепзе. В одному бо варіанті здійснення можна застосовувати навіть бактеріальну ендоглюканазу, включаючи ендоглюканазу Асідоїегти»х сеїЇшіоїЇУйси5 (див. МО 91/05039; МО 93/15186; 05 5,275,944; МО 96/02551; 05 5,536,655, МО 00/70031, МУО 05/093050); ендоглюканазу ПІ з Тпеппобіїйда їти5са (див. МУО 05/093050); і ендоглюканазу М з Тпепторійда їТизса (див. МО 05/093050), але не обмежуючись ними.
Наприклад, композиція для застосування згідно даного винаходу може включати целобіогідролазу І з Азрегойи5, такого як Азрегойи5 їтідаги5, таку як СеІ7А СВН І, розкриту в
ЗЕО ІЮ МО:6 в УМО 2011/057140 або 5ЕО ІОЮ МО:6 в УМО 2014/130812, або з Тгісподепта, такого як Тгісподегта геезві.
Наприклад, композиція для застосування згідно винаходу може містити целобіогідролазу І! з
Аврегойи5, такого як Азрегуйи5 Типтідацшв5, таку як ЗЕО ІЮ МО:7 в МО 2014/130812, або з
Тіісподегпта, такого як Тгісподегта геезеї, або з Тпівіама, такого як ТпівїЇаміа (етебвігіє, таку як целобіогідролаза І! СЕЇ бА з ТпівЇаміа геггевігів.
Наприклад, композиція для застосування згідно даного винаходу може містити поліпептид
СНбІ (літичну полісахаридну монооксигеназу) з ТПпепгтоазси5, такого як Тпептоазси5 ашгапіасив, таку як описано в УМО 2005/074656 як 5ЕО ІЮО МО:2 і БЕО ІЮ МО:1 в М/О2014/130812 і в М/О 2010/065830; або з ТПпівеіаміа, такого як ТПіеіаміа (еггевігіх, таку як описано в УМО 2005/074647 як 5ЕО ІЮ МО: 8 або 5ЕО ІЮ МО:4 в ММО2014/130812 і в УМО 2008/148131, ії МО 2011/035027; або з Абврегоуйив5, такого як Аврегуйи5 їшптідайе, таку як описано в УМО 2010/138754 як ЗЕО ІЮ МО:2 або 5ЕО ІОЮО МО: З в УМО2014/130812; або з Репісійішт, такого як
Репісіййшт етегзопії, таку як описана як 5ЕО ІЮ МО:2 в УМО 2011/041397 або 5ЕО ІЮ МО:2 в
МО2014/130812. Інші придатні поліпептиди ЗНбЄЇ включають Тгісподегта геезеї (див. МО 2007/089290), Мусеїйорпїйога (Шепторийа (див. УМО 2009/085935, УМО 2009/085859, УМО 2009/085864, МО 2009/085868), РепісшШит ріпорпйшт (див. МО 2011/005867), Тпептоазсив 5р. (см. МО 2011/039319), і Тпеппоазси5 сгизіасеоив5 (див. ММО 2011/041504), але не обмежуються ними. В одному аспекті поліпептид ЗНб1 застосовують у присутності розчинного активуючого двовалентного металічного катіона, який відповідає М/О 2008/151043, наприклад, магнію сульфату. В одному аспекті поліпептид ЗНб1 застосовують у присутності диоксидної сполуки, біциклічної сполуки, гетероциклічної сполуки, азотовмісної сполуки, хінонової сполуки, сірковмісної сполуки, або рідини, отриманої з попередньо обробленого целюлозного матеріалу, такого як попередньо оброблена кукурудзяна солома.
Інші целюлолітичні ферменти, які можна використовувати в композиції для застосування згідно винаходу, описані, наприклад, в УМО 98/13465, УМО 98/015619, МО 98/015633, УМО 99/06574, МО 99/10481, МО 99/025847, МО 99/031255, МО 2002/101078, УМО 2003/027306, МО 2003/052054, МО 2003/052055, МО 2003/052056, МО 2003/052057, МО 2003/052118, МО 2004/016760, МО 2004/043980, МО 2004/048592, МО 2005/001065, МО 2005/028636, МО 2005/093050, МО 2005/093073, МО 2006/074005, МО 2006/117432, УМО 2007/071818, МО 2007/071820, УМО 2008/008070, УМО 2008/008793, 05 5,457,046, 05 5,648,263, і 05 5,686,593.
Крім того, приклади ксиланаз, які можуть бути застосовані у даному винаході, включають ксиланази з АвзрегудйШив асшіеайв5 (див. УМО 94/21785), АзрегуйШив їитідай5 (див. М/О 2006/078256), Репісіййшт ріпорпйшт (див. УМО 2011/041405), РепісшШіит 5р. (см. УМО 2010/126772), Тпівіаміа їеітевігіз МКК. 8126 (див. МО 2009/079210), і Тгіспорпнаєа зассага СНІО (див. УМО 2011/057083), але не обмежуються ними. Приклади бета-ксилозидаз, застосованих в інтегрованих процесах запропонованих даним винаходом, включають бета-ксилозидази з
Меийгозрога сгазза і Тгісподегта геезеї, але не обмежуються ними. Приклади ацетилксилан- естераз, придатних у даному винаході, включають ацетилксилан-естерази з АзрегушШив асціеат5 (див. МО 2010/108918), Спаеотішт діорозит, Спаеютіцт дгасіїе, Нитісоїа іпзоїеп5
ОМ 1800 (див. МО 2009/073709), Нуросгеа |есогіпа (див. УМО 2005/001036), Мусеїорніега
ІШепторпйа (див. М/О 2010/014880), Меигозрога сгазза, Рпаеозрпаєтіа подогит і ТпієЇаміа
Іеітевігіє МАК. 8126 (див. МО 2009/042846), але не обмежуються ними. Приклади ферулоїл- естераз (естераз ферулової кислоти), придатних у даному винаході, включають ферулоїл- естерази з Нитісоїа іп5оїеп5 ОМ 1800 (див. УМО 2009/076122), Меозагпогуа їїзспегі, Меигозрога сгазза, Репісйит аишигапідгізент (див. УМО 2009/127729), і ТПіеїіаміа іегевігіє (див. УМО 2010/053838 і УМО 2010/065448), але не обмежуються ними. Приклади арабінофуранозидаз, придатних у даному винаході, включають арабінофуранозидази з Азрегоуйи5 підег, Нитісоїа іпбоїеп5 ОМ 1800 (див. МО 2006/114094 і УМО 2009/073383) і М. дідапієн5 (див. УМО 2006/114094), але не обмежуються ними. Приклади альфа-глюкуронідаз, придатних у даному винаході, включають альфа-глюкуронідази з Абзрегдійи5 сіамай5, Абврегоїййи5 Титідашв,
АзрегоїНи5 підег, Азрегуйи5 їетеиб5, Нитісоїа іпбоЇїеп5 (див. УМО 2010/014706), РепісшШит ацгапііодгізгент (див. УМО 2009/068565) і Тгісподегта геезеї, але не обмежуються ними.
Композиція для застосування згідно даного винаходу може включати один, два, три, чотири або більше класів целюлази, наприклад, наприклад, одну, дві, три або чотири, або всі з поміж
СНО, ендоглюканазу (ЕС), одну або дві екзо-целобіогідролази (СВН) і бета-глюкозидазу (ВО).
Композиція для застосування згідно даного винаходу може містити два або більше будь-яких із цих класів целюлази.
Композиція запропонована даним винаходом може включати активність іншого типу целюлазної активності і/або геміцелюлазної активності і/або пектиназної активності, ніж той, який забезпечується композицією для застосування в способі запропонованому даним винаходом. Наприклад, композиція запропонована даним винаходом може включати один тип целюлазної і/або геміцелюлазної активності і/або пектиназної активності, забезпеченої композицією, яка описана в даний заявці, і другий тип целюлазної і/або геміцелюлазної активності і/або пектиназної активності, забезпеченої додатковою целюлазою/геміцелюлазою/ пектиназою.
У даній заявці целюлаза є поліпептидом, здатним до деградації або модифікації целюлози.
Поліпептид, здатний до деградації целюлози, є поліпептидом, здатним до каталізу процесу руйнування целюлози на одиниці меншого розміру, або частково, наприклад, на целодекстрини, або повністю на глюкозні мономери. Целюлаза, відповідно до даного винаходу, може давати початок змішаній популяції целодекстринів і глюкозних мономерів при контакті із целюлазою.
Така деградація, як правило, відбувається шляхом реакції гідролізу.
Літичні полісахаридні монооксигенази (ГРМО) нещодавно класифіковані Са?7у у родину АА9У (родина допоміжної активності 9) і або родину ААТО (родина допоміжної активності 10). Як згадувалося вище, літичні полісахаридні монооксигенази здатні до відкриття кристалічної глюканової структури. Літичні полісахаридні монооксигенази можуть також впливати на цело- олігосахариди. Терміни РМО і ГРМО застосовуються як взаємозамінні. Білки ЗНб1 (родини глікозил-гідролаз 61 або такі, що іноді позначаються як ЕСІМ) є кисень-залежними полісахаридними монооксигеназами (РМО) відповідно до останніх літературних даних. Часто в літературі ці білки згадуються як такі, що посилюють активність целюлаз на лігноцелюлозних субстратах. СНВ1 спочатку класифікували як ендоглюканазу, на основі визначення дуже слабкої ендо-1,4-8-д-глюканазної активності в одного члена родини. Термін "ОЗНб1", який
Зо використовується в даному описі, слід розуміти як родину ферментів, яка, згідно з усталеною системою класифікації САУ СН, об'єднує ферменти, які мають спільні ділянки консервативних послідовностей і переносів (пЕр/Лумли.сагу.огд/СЯНб1.піті). Родина глікозид-гідролаз 61 є членом родини глікозид-гідролаз ЄС 3.2.1. ЗНб1 застосовується в даний заявці як частина целюлаз. СВМЗ33 (родина 33 вуглевод-зв'язуючого модуля) є літичною полісахаридною монооксигеназою (див. Ізакзеп еї аї, доигпаї! ої Віоіодіса! Спетівігу, мої. 289, по. 5, рр. 2632- 2642). Са7у недавно перекласифікувала СМВЗЗ в ААТО (родина допоміжної активності 10).
У даній заявці геміцелюлаза є поліпептидом, здатним до деградації або модифікації геміцелюлози. Таким чином, геміцелюлаза здатна до деградації або модифікації одного або більше з поміж ксилану, глюкуроноксилану, арабіноксилану, глюкоманану й ксилоглікану.
Поліпептид, здатний до деградації геміцелюлози, є поліпептидом, здатним до каталізу процесу руйнування геміцелюлози на полісахариди меншого розміру, або частково, наприклад, на олігосахариди, або повністю на цукрові мономери, наприклад, гексозні або пентозні цукрові мономери. Геміцелюлаза відповідно до винаходу може давати початок змішаної популяції олігосахаридів і цукрових мономерів при контакті з геміцелюлазою. Така деградація, як правило, здійснюється шляхом реакції гідролізу.
У даній заявці пектиназа є поліпептидом, здатним до деградації або модифікації пектину.
Поліпептид, здатний до деградації, є поліпептидом, здатним до каталізу процесу руйнування пектину на одиниці меншого розміру, або частково, наприклад, на олігосахариди, або повністю на цукрові мономери. Пектиназа відповідно до винаходу може давати початок змішаній популяції олігосахаридів і цукрових мономерів при контакті з пектиназою. Така деградація, як правило, здійснюється шляхом реакції гідролізу.
Відповідно, композиція, запропонована даним винаходом, може включати будь-яку целюлазу, наприклад, СНЄ1, целобіогідролазу, ендо-В-1,4-глюканазу, бета-глюкозидазу або р- (1,941,4)-глюканазу.
Відповідно, целобіогідролаза (ЄС 3.2.1.91) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати гідроліз 1,4-В-ЮО-глюкозидних зв'язків у целюлозі або целотетраозі, з вивільненням целобіози з кінців ланцюга. Цей фермент може також позначатися як целюлозо 1,4-В-целобіозидаза, 1,4-рД- целобіогідролаза, 1,4-В-Ю-глюкан целобіогідролаза, авіцелаза, екзо-1,4-8-ЮО-глюканаза, екзоцелобіогідролаза або екзоглюканаза.
При цьому ендо-В-1,4-глюканаза (ЄС 3.2.1.4) є поліпептидом, здатним до каталізу ендогідроліза 1,4-В-Ю-глюкозидних зв'язків у целюлозних, ліхенінових або злакових В-0О- глюканах. Такий поліпептид може також бути здатний до гідролізу 1,4-зв'язків в В-Ю-глюканах, які також містять 1,3-зв'язки. Цей фермент може також позначатися як целюлаза, авіцелаза, р- 1,4-ендоглюкан-гідролаза, Д-1,4-глюканаза, карбоксиметилцелюлаза, целюдекстриназа, ендо- 1,4-8-О-глюканаза, ендо-1,4-8-ЮО-глюканогідролаза, ендо-1,4-ВД-глюканаза або ендоглюканаза.
При цьому бета-глюкозидаза (ЄС 3.2.1.21) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати гідроліз термінальних, невідновлюючих В-ЮО-глюкозних залишків з вивільненням В-ЮО-глюкози.
Такий поліпептид може мати широку специфічність стосовно В-ЮО-глюкозидів і може також гідролізувати один або більше з поміж наступних: ВД-ЮО-галактозид, ВД-І -арабінозид, В-Ю-ксилозид або В-Ю-фукозид. Цей фермент може також позначатися як амігдалаза, В-ЮО-глюкозид- глюкогідролаза, целобіаза або гентобіаза.
При цьому В-(1,3)(1,4)-глюканаза (ЄС 3.2.1.73) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати гідроліз 1,4-8-О-глюкозидних зв'язків в В-Ю-глюканах, що містять 1,3- і 1,4-зв'язки.
Такий поліпептид може діяти на ліхенінові й злакові В-Ю-глюкани, але не на В-ЮО-глюкани, які містять тільки 1,3- або 1,4-зв'язки. Цей фермент може також позначатися як ліхеніназа, 1,3-1,4-
В-О-глюкан-4-глюканогідролаза, Д-глюканаза, ендо-8В-1,3-1,4-глюканаза, ліхеназа або р- глюканаза змішаних зв'язків. Альтернативою для цього типу ферменту є ЄС 3.2.1.6, який описаний як ендо-1,3(4)-бета-глюканаза. Цей тип ферменту гідролізує 1,3- або 1,4- зв'язки в ІД-
О-глюканазі, коли глюкозний залишок, чия відновлююча група задіяна у зв'язку, що зазнає гідролізу, сама заміщається на С-3. Альтернативні назви включають ендо-1,3-бета-глюканазу, ламінариназу, 1,3-(1,3:1,4)-В8-Ю-глюкан 3(4)-глюканогідролазу; субстрати включають ламінаринові, ліхенінові й злакові В-Ю-глюкани.
Композиція, запропонована даним винаходом, може включати геміцелюлазу, наприклад, ендоксиланазу, ВрВ-ксилозидазу, «а-І-арабінофуранозидазу, с-ЮО-глюкуронідазу, ацетилксилан- естеразу, ферулоїл-естеразу, кумароїл-естеразу, а-галактозидазу, Д-галактозидазу, ВД-мананазу, або р-манозидазу.
При цьому ендоксиланаза (ЄС 3.2.1.8) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу ендогідроліза 1,4-8-Ю-ксилозидних зв'язків у ксиланах. Цей фермент може також позначатися як ендо-1,4-В8-О-ксиланаза або 1,4-8-О-ксилан-ксиланогідролаза. Альтернативною є ЄС 3.2.1.136, глюкуроноарабіноксилан-ендоксиланаза, фермент, здатний до гідролізу 1,4-ксилозидних зв'язків у глюкуроноарабіноксиланах.
При цьому ДВ-ксилозидаза (ЄС 3.2.1.37) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати гідроліз 1,4-В8-ЮО-ксиланів, для видалення послідовних залишків Ю-ксилози з невідновлюючих кінців. Такі ферменти можуть також гідролізувати ксилобиозу. Цей фермент може також позначатися як 0 ксилан-1,4-ВД-ксилозидаза, 1,4-8-О-ксилан-ксилогідролаза, екзо-1,4-р- ксилозидаза або ксилобіаза.
При цьому с-І -арабінофуранозидаза (ЄС 3.2.1.55) є будь-яким поліпептидом, здатним діяти на а-І-арабінофуранозиди, а-І-арабінани, які містять (1,2) і/або (1,3)- і/або (1,5)-зв'язки, арабіноксилани й арабіногалактани. Цей фермент може також позначатися яко а-М- арабінофуранозидаза, арабінофуранозидаза або арабінозидаза.
При цьому а-О-глюкуронідаза (ЄС 3.2.1.139) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізвати реакції наступного виду: а-Ю-глюкуронідаза ї Н(2)О - спирт я О-глюкуронат. Цей фермент може також позначатися як альфа-глюкуронідаза або альфа-глюкозидуроназа. Ці ферменти можуть також гідролізувати 4-О-метильовану глюкуронову кислоту, яка може також бути присутньою як замісник в ксиланах. Альтернативою є ЄС 3.2.1.131, ксилан-а-1,2-глюкуронозидаза, яка каталізує гідроліз альфа-1,2-(4-О-метил)глюкуронозильних зв'язків.
При цьому ацетилксиланестераза (ЄС 3.1.1.72) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу деацилювання ксиланів і ксило-олігосахаридів. Такий поліпептид може каталізувати гідроліз ацетильних груп з полімерного ксилану, ацетильованої ксилози, ацетильованої глюкози, альфа-нафтил-ацетату або п-нітрофеніл-ацетату, але як правило, не із триацетилгліцерину.
Такий поліпептид, як правило, не діє на ацетильований манан або пектин.
При цьому ферулоїл-естераза (ЄС 3.1.1.73) є поліпептидом, здатним до каталізу реакції у вигляді: ферулоїл-сахарид ї- Н(2О - ферулат жї- сахарид. Сахарид може бути, наприклад, олігосахаридом або полісахаридом. Він може, як правило, каталізувати гідроліз 3- метоксицинамоїльної (ферулоїльної) групи їх етерифікованого цукру, який звичайно є арабінозою в "натуральних" субстратах. Як правило, п-нітрофеніл ацетат і метил-ферулат є гіршими субстратами. Цей фермент може також позначатися як цинамоїл-ефір-гідролаза, ферулової кислоти естераза або гідроксицинамоїл-естераза. Він може також позначатися як геміцелюлазний допоміжний фермент, оскільки він може допомагати ксиланазам і пектиназам руйнувати геміцелюлозу й пектин клітинної стінки рослин.
При цьому кумароїлестераза (ЄС 3.1.1.73) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу реакції виду: кумароїл-сахарид ї- Н(2)О - кумарат ж сахарид. Сахарид може бути, наприклад, олігосахаридом або полісахаридом. Цей фермент може також позначатися як транс-4- кумароїлестераза, транс-п-кумароїлестераза, п-кумароїлестераза або естераза п-кумарової кислоти. Цей фермент також відноситься до ЄС 3.1.1.73, так що може також позначатися як ферулоїлестераза.
При цьому а-галактозидаза (ЄС 3.2.1.22) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати гідроліз термінальних, невідновлюючих а-Ю-галактозних залишків в «-ЮО-галактозидах, включаючи галактозні олігосахариди, галактоманани, галактани й арабіногалактани. Такий поліпептид може також бути здатним до гідролізу а-Ю-фукозидів. Цей фермент може також позначатися як мелибіаза.
При цьому В-галактозидаза (ЄС 3.2.1.23) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати гідроліз термінальних невідновлюючих В-Ю-галактозних залишків в В-ЮО-галактозидах. Такий поліпептид може також бути здатним до гідролізу с-І -арабінозидів. Цей фермент може також бути позначений як екзо-(1--4)-8-ЮО-галактаназа або лактаза.
При цьому В-мананаза (ЄС 3.2.1.786) є поліпептидом, здатним до каталізу довільного гідролізу 1,4-В8-Ю-манозидних зв'язків у мананах, галактомананах і глюкомананах. Цей фермент може також бути позначений як манан-ендо-1,4-В-манозидаза або ендо-1,4-мананаза.
При цьому В-манозидаза (ЄС 3.2.1.253 є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати гідроліз термінальних, невідновлюючих В-ЮО-манозних залишків в В-Ю-манозидах. Цей фермент може також позначатися як мананаза або маназа.
Композиція, запропонована даним винаходом, може містити будь-яку пектиназу, наприклад, ендополігалактуроназу, пектинметилестеразу, ендогалактаназу, бета-галактозидазу, пектинацетилестеразу, ендопектинліазу, пектатліазу, альфарамнозидазу, екзогалактуроназу, екзополігалактуронат-ліазу, рамногалактуронан-гідролазу, рамногалактуронанліазу, рамногалактуронан-цетилестеразу, рамногалактуронангалактуроногідролазу, ксилогалактуроназу.
Зо При цьому ендополігалактуроназа (ЄС 3.2.1.153 є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу довільного гідролізу 1,4-0-ЮО-галактозидуронових зв'язків у пектаті й інших галактуронанах. Цей фермент може також бути позначений як полігалактуроназа пектиндеполімераза, пектиназа, ендополігалактуроназа, пектолаза, пектингідролаза, пектинполігалактуроназа, полі-а-1,4-галактуронідглюканогідролаза, ендогалактуроназа, ендо-а- галактуроназа або полі(1,4-4-О-галактуронід)гліканогідролаза.
При цьому пектинметилестераза (ЄС 3.1.1.11) є будь-яким ферментом, здатним до каталізу реакції пектин - п Н2О-п метанол ж пектат. Фермент може також бути відомий як пектинестераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилестеразза, пектаза, пектиноестераза або пектинпектилгідролаза.
При цьому ендогалактаназа (ЄС 3.2.1.89) є будь-яким ферментом, здатним каталізувати ендогідроліз 1,4-8-ЮО-галактозидних зв'язків в арабіногалактанах. Фермент може також бути відомий як арабіногалактан-ендо-1,4-ВД-галактозидаза, ендо-1,4-Д-галактаназа, галактаназа, арабіногалактаназа або арабіногалактан-4-В-О-галактаногідролаза.
При цьому пектинацетилестераза визначається в даний заявці як фермент, який має ацетилестеразну активність, якийщо каталізує деацетилювання ацетильних груп на гідроксильних групах заіША залишків пектину.
При цьому ендопектинліаза (ЄС 4.2.2.10) є ферментом, здатним до каталізу елімінационного розщеплення (1--4)-4-ЮО-галактуронан-метилового ефіру до одержання олігосахаридів із 4-дезокси-6-О-метил-а-Ю-галакт-4-енуронозильних /- груп на їхніх невідновлюючих кінцях. Фермент може також бути відомий як пектинліаза, пектинтранселіміназа, ендопектинліаза, поліметилгалактуронова транселіміназа, пектинметилтранселіміназа, пектоліаза, ПЛ, ПНЛ або ПМГЛ або (1--4)-6-О-метил-а- 0- галактуронанліаза.
При цьому пектатліаза (ЄС 4.2.2.2) є ферментом, здатним каталізувати елімінуюче розщеплення (1--4)-40-Ю-галактуронана з одержанням олігосахаридів з 4-дезокси-с-галакт-4- енуронозильних груп на їхніх невідновлюючих кінцях. Цей фермент може також бути відомий як полігалактуронова транселіміназа, пектинової кислоти транселіміназа, полігалактуронатліаза, ендопектинметилтранселіміназа, пектаттранселіміназа, ендогалактуронаттранселіміназа, пектинової кислоти ліаза, пектинова ліаза, а-1,4-ЮО-ендополігалактуронової кислоти ліаза, ПГА 60 ліаза, ППаза-М, ендо-а-1,4-полігалактуронової кислоти ліаза, полігалактуронової кислоти ліаза,
пектинтранселіміназа, полігалактуронової кислоти транс-еліміназа або (1--4)-4-О-галактуронан- ліаза.
При цьому альфарамнозидаза (ЄС 3.2.1.40) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати гідроліз термінальних невідновлюючих с-І -рамнозних залишків в с-І -рамнозидах або альтернативно в рамногалактуронані. Цей фермент може також бути відомий як а-Ї- рамнозидаза Т, с-І -рамнозидаза М або с:- І -рамнозида рамногідролаза.
При цьому екзогалактуроназа (ЄС 3.2.1.82) є будь-яким поліпептидом, здатним до гідролізу пектинової кислоти на невідновлюючому кінці, з вивільненням дигалактуроната. Цей фермент може також бути відомий як екзо-полі-д-галактуронозидаза, екзополігалактуронозидаза або екзополігалактуранозидаза.
При цьому екзогалактуроназа (ЄС 3.2.1.67) є поліпептидом, здатним до каталізу: (1,4-а-0- галактуронід)л-НгО - (1,4-а-О-галактуронід)п1-О-галактуронат. Фермент може також бути відомий як галактуран-1,4-с-галактуронідаза, екзополігалактуроназа, полі(галактуронат)- гідролазу, екзо-О-галактуроназа, екзо-О-галактуронаназа, екзополі-О-галактуроназа або полі(1,4-4-О-галактуронід)галактуроногідролаза.
При цьому екзополігалактуронатліаза (ЄС 4.2.2.9)у є поліпептидом, здатним каталізувати елімінуюче розщеплення 4-(4-дезокси-а-галакт-4-енуронозил)-О-галактуроната з відновлюючого кінця пектата, тобто де-етерифікованого пектину. Цей фермент може бути відомий як пектатдисахаридліаза, пектатекзоліаза, екзопектинової кислоти транселіміназа, екзопектатліаза, екзополігалактуронової кислоти транселіміназа, ПКТЕ, екзо-ПКТЕ, екзо-ПГЛ або (1-4)-а-О-галактуронана відновлюючого кінця дисахарид-ліаза.
При цьому рамногалактуронангідролаза є поліпептидом, здатним до ендо-гідролізу зв'язку між галактозилуроновою кислотою й рамнопіранозилом в розміщених строго почергово рамногалактуронанових структурах, які складаються із дисахариду |(1,2-0-І -рамноїл-(1,4)-а- галактозилуронової кислоти))|.
При цьому рамногалактуронан-ліаза є будь-яким поліпептидом, здатним до розщеплення зв'язків а-І -рамнео-(1--4)-4-Ю-галрА ендо-способом у рамногалактуронані шляхом В-елімінації.
При цьому рамногалактуронанацетилестераза є будь-яким поліпептидом, який каталізує деацетилювання основного каркаса із розміщених почергово залишків рамнози й
Зо галактуронової кислоти в рамногалактуронані.
При цьому рамногалактуронангалактуроногідролаза є поліпептидом, здатним до екзо- гідролізу галактуронової кислот з невідновлюючого кінця, розміщених строго почергово рамногалактуронанових структур.
При цьому ксилогалактуроназа є будь-яким поліпептидом, який діє на ксилогалактуронан шляхом розщеплення каркаса з рД-ксилозо-заміщеної галактуронової кислоти ендо-способом.
Цей фермент може також бути відомий як ксилогалактуронангідролаза.
При цьому а-І-арабінофуранозидаза (ЄС 3.2.1.553 є будь-яким поліпептидом, здатним впливати на са-арабінофуранозиди, а-арабінани, які містять (1,2) і/або (1,3)- і/або (1,5)-зв'язки, арабіноксилани й арабіногалактани. Цей фермент може також позначатися яко а-М- арабінофуранозидаза, арабінофуранозидаза або арабінозидаза.
При цьому ендоарабінаназа (ЄС 3.2.1.99) є будь-яким поліпептидом, здатним каталізувати ендогідроліз 1,5-4-арабінофуранозидних зв'язків в 1,5-4-арабінанах. Фермент може також бути відомий як ендоарабіназа, арабінанендо-1,5-с-І -арабінозидаза, ендо-1,5-а-І -арабінаназа, ендо- а-1,5-арабаназа, ендарабаназа або 1,5а-І -арабінан 1,5-с-І -арабінаногідролаза.
Композиція запропонована даним винаходом, як правило, містить щонайменше одну целюлазу і/або щонайменше одну геміцелюлазу і/або щонайменше одну пектиназу (одна з яких є поліпептидом запропонованим даним винаходом). Композиція, запропонована даним винаходом, може містити ЗНеЄ1, целобіогідролазу, ендоглюканазу і/або бета-глюкозидазу. Така композиція може також містити одну або декілька геміцелюлаз і/або одну або декілька пектиназ.
БО Крім того, одна або більше (наприклад, дві, три, чотири або всі) з поміж амілази, протеази, ліпази, лігнінази, гексозилтрансферази, глюкуронідази або експанзину або індукованого целюлозою білка або інтегруючого целюлозу білка або подібного білка можуть бути присутніми у композиції запропонованій даним винаходом (вони позначаються як допоміжні активності вище). "Протеаза" включає ферменти, які гідролізують пептидні зв'язки (пептидази), а також ферменти, які гідролізують зв'язки між пептидами й іншими компонентами, такими як цукри (глікопептидази). Багато протеаз охарактеризовані за ЄС 3.4, і придатні для застосування в даному винаході, і включені як посилання. Деякі специфічні типи протеаз включають цистеїнові протеази, включаючи пепсин, папаїн і серинові протеази, включаючи хімотрипсин, 60 карбоксипептидази й металоендопептидази.
"Ліпаза" включає ферменти, які гідролізують ліпіди, жирні кислоти й ацилгліцериди, включаючи фосфогліцериди, ліпопротеїни, диацилгліцерини тощо. У рослинах ліпіди застосовуються як структурні компоненти для обмеження втрат води й інфекції патогенами. Ці ліпіди включають воски, отримані з жирних кислот, а також кутин і суберин. "Лігніназа" включає ферменти, які можуть гідролізувати або руйнувати структури лігнінових полімерів. Ферменти, які можуть руйнувати лігнін, включають лігнін-пероксидази, марганцеві пероксидази, лаккази й ферулоїл-естерази, а інші ферменти, описані в даній галузі техніки, відомі як деполімеризуючі або такі, що іншим способом руйнують лігнінові полімери. Також включені ферменти, здатні гідролізовати зв'язки між геміцелюлозними цукрами (особливо арабінозою) і лігніном. Лігнінази включають наступні групи ферментів: лігнін- пероксидази (ЄС 1.11.1.14), марганцеві пероксидази (ЄС 1.11.1.13), лаккази (ЄС 1.10.3.2) і ферулоїл-естерази (ЄС 3.1.1.13), але не обмежуються ними. "Гексозилтрансфераза" (2,4,1-у включає ферменти, які здатні каталізувати трансферазну реакцію, але які також каталізують реакцію гідролізу, наприклад, целюлози і/або продуктів деградації целюлози. Прикладом гексозилтрансферази, яку можна застосовувати в даному винаході, є ДВ-глюканозилтрансфераза. Такий фермент може бути здатний каталізувати деградацію (1,3)(1,4)глюкану і/або целюлози і/або продукту деградації целюлози. "Глюкуронідаза" включає ферменти, які каталізують гідроліз глюкуронозида, наприклад, ВД- глюкуронозида, з одержанням спирту. Багато глюкуронідази охарактеризовані й можуть бути придатними для застосування згідно даного винаходу, наприклад, В-глюкуронідаза (ЄС 3.2.1.31), гіалуроно-глюкуронідаза (ЄС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфоглюкозамін- глюкуродидаза (3.2.1.56), гліцирризинат-В-глюкуронідаза (3.2.1.128) або а-О-глюкуронідаза (ЄС 3.2.1.139).
Композиція для застосування згідно даного винаходу може включати експанзин або експанзин-подібний білок, такий як своленін (див. ЗаІНеїто еї аї., Єиг. У. Віопет. 269, 4202-4211, 2002) або своленін-подібний білок.
Експанзини залучені в ослаблення структури клітинної стінки під час росту клітин рослин.
Експанзини були запропоновані для руйнування водневих зв'язків між целюлозою й іншими полісахаридами клітинної стінки без наявності гідролітичної активності. Таким чином,
Зо передбачається, що вони забезпечують ковзання целюлозних волокон і збільшення клітинної стінки. Своленін, експанзин-подібний білок, містить М-кінцевий вуглевод-зв'язуючого модуля родини 1 домен (СВО) і С-кінцевий експанзин-подібний домен. Для цілей даного винаходу експанзин-подібний білок або своленін- подібний білок може містити один або обидва таких домена і/або може руйнувати структуру клітинних стінок (наприклад, руйнуючи целюлозну структуру), необов'язково без продукування відновлюючих цукрів у детектованих кількостях.
Композиція для застосування згідно даного винаходу може бути індукованим целюлозою білком, наприклад, поліпептидним продуктом гена сірі! або сір?2 або подібних генів (див.
Еогетап еї аї., У. Віої. Спет. 278(34), 31988-31997, 2003), целюлозу/целулосому інтегруючим білком, наприклад, поліпептидним продуктом гена сірі або сірС, або скафолдином або скафолдинін- подібним білком. Скафолдиніни й інтегруючі целюлозу білки (є мультифункціональними інтегруючим субодиницями, які можуть організувати целюлолітичні субодиниці в мульти-ферментний комплекс. Це здійснюється шляхом взаємодії двох комплементарних класів доменів, тобто домена когезії на скафолдиніні й домена докерин на кожній ферментативній одиниці. Субодиниця скафолдиніну також несе домен, який зв'язує целюлозу (СВМ), який опосередковує прикріплення целюлосоми до її субстрату. Скафолдинін або білок, який інтегрує целюлозу, для цілей даного винаходу може включати обидва таких домена.
Композиція для застосування згідно даного винаходу може також включати каталазу. Термін "каталаза" означає перекис водню: перекис водню-оксидоредуктазу (ЄС 1.11.1.6 або ЄС 1.11.1.21), яка каталізує перетворення двох перекисів водню на кисень і дві води. Активність каталази можна визначити шляхом моніторингу деградації перекису водню при 240 нм на основі наступної реакції: 2Н2О2 - 2Н2О0--0». Реакцію проводять в 50 мМ фосфатному буфері при рН 7,0 при 25"С з 10,3 мМ субстратом (НгО2) і приблизно 100 одиницями ферменту на мл.
Поглинання контролюють спектрофотометрично в межах 16-24 секунд, що повинно відповідати зниженню поглинання від 0,45 до 0,4. Одна одиниця каталазної активності може бути виражена у вигляді деградації одного мікромоля НгО»5 за хвилину при рН 7,0 і 25 70.
Композиція для застосування в способі запропонованому даним винаходом може складатися зі члена кожного класу ферментів, згаданих вище, декількох членів кожного класу ферментів, або будь-якої комбінації цих класів ферментів і допоміжних білків (тобто білків,
згаданих у даний заявці, які не мають ферментативної активності як такої, проте сприяють деградації лігноцелюлози).
Композиція для застосування в способі запропонованому даним винаходом може складатися з ферментів від (1) комерційних постачальників; (2) клонованих генів, які експресують ферменти; (3) комплексного бульйону (такого, що отриманий при рості мікробного штаму в середовищі, де штами секретують білки й ферменти в середовище); (4) клітинних лізатів при вирощуванні штамів, як у пункті (3); і/або (5) рослинного матеріалу, який експресує ферменти. Різні ферменти в композиції запропонованій даним винаходом можуть бути отримані з різних джерел.
Ферменти можуть бути отримані екзогенним способом у мікроорганізмах, дріжджах, грибах, бактеріях або рослинах, потім виділені й додані, наприклад, у лігноцелюлозний сировинний матеріал. Альтернативно, ферменти одержують, але не виділяють, і неочищений бульйон від ферментації клітинної маси, або рослинний матеріал (такий, як кукурудзяна солома або пшенична солома) і таке інше можна додати, наприклад, до сировинного матеріалу.
Альтернативно, неочищену клітинну масу або середовище від виробництва ферментів, або рослинний матеріал можна обробити для запобігання подальшого росту мікроорганізмів (наприклад, шляхом нагрівання або додавання антимікробних агентів), потім додати, наприклад, до сировинного матеріалу. Ці неочищені суміші ферментів можуть включати організм, який продукує фермент. Альтернативно, фермент може бути отриманий при ферментації, при якій застосовується (попередньо оброблений) сировинний матеріал (такий, як кукурудзяна солома або пшенична солома) для забезпечення живлення організму, який продукує фермент(и). Таким чином, рослини, які продукують ферменти, можуть самі служити лігноцелюлозним сировинним матеріалом, і можуть бути додані в лігноцелюлозний сировинний матеріал.
У застосуваннях і способах, описаних у даній заявці, компоненти з композицій, описаних вище, можуть бути запропоновані разом (тобто у вигляді єдиної композиції як такої) або окремо або послідовно.
Таким чином, винахід відноситься до способів, у яких застосовують композицію, описану вище, і до застосування композиції в промислових процесах.
Зо В одному варіанті здійснення ферментна композиція може бути цільним ферментаційним бульйоном, як описано нижче. Цільний ферментаційний бульйон може бути приготовлений при ферментації не-рекомбінантних і/або рекомбінантних міцеліальних грибів. В одному варіанті здійснення міцеліальний грибок є рекомбінантним міцеліальним грибом, який містить один або кілька генів, які можуть бути гомологічними або гетерологічними для міцеліальних грибів. В одному варіанті здійснення міцеліальний гриб є рекомбінантним міцеліальним грибом, який містить один або кілька генів, які можуть бути гомологічними або гетерологічними для міцеліального гриба, у якому один або кілька генів кодують ферменти, які можуть руйнувати целюлозний субстрат. Цільний ферментаційний бульйон може містити будь-які поліпептиди або будь-яку їхню комбінацію.
Бажано, ферментна композиція є цільним ферментаційним бульйоном, де цілі клітини є мертвими. Цільний ферментаційний бульйон може містити органічну кислоту (кислоти) (яка використовується для лізису клітин), убиті клітини і/або клітинний детрит, і культуральне середовище.
Як правило, міцеліальні гриби культивують у середовищі для культивування клітин, придатному для одержання ферменту, здатного до гідролізу целюлозного субстрату.
Культивування здійснюють у придатному поживному середовищі, що містить джерело вуглеводню й азоту й неорганічні солі, із застосуванням процедур, відомих у даній галузі техніки. Відповідні середовища для культивування, температурні діапазони та інші умови, потрібні для росту й вироблення целюлази і/або геміцелюлази і/або пектинази, відомі в даній галузі техніки. Цільний ферментаційний бульйон можна приготувати шляхом вирощування міцеліальних грибів до стаціонарної фази й витримування міцеліальних грибів за умов обмеження вуглецю протягом періоду часу, достатнього для експресії однієї або декількох целюлаз і/або геміцелюлаз і/або пектиназ. Як тільки ферменти, такі як целюлази і/або геміцелюлази і/або пектинази, секретовані міцеліальними грибами у ферментаційне середовище, цільний ферментаційний бульйон можна використовувати. Цільний ферментаційний бульйон відповідно до даного винаходу може містити міцеліальні гриби. У деяких варіантах здійснення цільний ферментаційний бульйон містить не фракціонований вміст ферментаційних матеріалів, отриманих до кінця ферментації. Як правило, цільний ферментаційний бульйон містить виснажене культуральне середовище й клітинний детрит, бо присутній після вирощування міцеліальних грибів до насичення, інкубації за умов обмеження вуглецю для забезпечення синтезу білків (зокрема, експресії целюлаз і/або геміцелюлаз і/або пектиназ). У деяких варіантах здійснення цільний ферментаційний бульйон містить виснажене середовище для культивування клітин, екстраклітинні ферменти й міцеліальні гриби. У деяких варіантах здійснення, присутні в цільному ферментаційному бульйоні міцеліальні гриби можуть бути лізовані, пермеабілізовані або вбиті із застосуванням способів, відомих у даній галузі техніки для одержання цільного ферментаційного бульйону з лізованими клітинами. В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон є цільним ферментаційним бульйоном з убитими клітинами, де цільний ферментаційний бульйон містить клітини міцеліальних грибів, які є лізованими або вбитими. У деяких варіантах здійснення клітини вбивають за допомогою лізису міцеліальних грибів за допомогою хімічної і/або рН обробки для одержання цільного бульйону з лізованими клітинами міцеліальних грибів. У деяких варіантах здійснення клітини вбивають шляхом лізису міцеліальних грибів за допомогою хімічної і/або рН обробки й підведення рН ферментаційної суміші з убитими клітинами до відповідного значення рН. В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон містить перший компонент із органічної кислоти, що містить органічну кислоту щонайменше з 1-5 атомами вуглецю і/або її сіль, і другий компонент із органічної кислоти, що містить органічну кислоту щонайменше з 6 або більше атомами вуглецю і/або її сіль. В одному варіанті здійснення перший компонент із органічної кислоти є оцтовою кислотою, мурашиною кислотою, пропіонової кислотою, її сіллю, або будь-якою їхньою комбінацією, а другий компонент з поміж органічних кислот є бензойною кислотою, циклогексанкарбоновою кислотою, 4-метилвалеріановою кислотою, фенілоцтовою кислотою, її сіллю, або будь-якою їхньою комбінацією.
Термін "цільний ферментаційний бульйон", як він застосовується в даний заявці, означає препарат, отриманий шляхом ферментації клітин, який не зазнає, або до якого застосовують мінімальне виділення і/або очищення. Наприклад, одержують цільний ферментаційний бульйон, де мікробні культури вирощують до насичення, інкубують за умов обмеження вуглецю для забезпечення синтезу білків (наприклад, експресії ферментів клітинами-носіями) і секреції в середовище культивування клітин. Як правило, цільний ферментаційний бульйон є не фракціонованим, і містить виснажене середовище для культивування клітин, екстраклітинні ферменти, і мікробні, бажано нежиттєздатні клітини.
Зо За необхідності цільний ферментаційний бульйон можна фракціонувати, і можна застосовувати одне або більше із фракціонованого вмісту. Наприклад, лізовані клітини і/або клітинний детрит можна вилучити із цільного ферментаційного бульйону для одержання композиції, яка не містить цих компонентів.
Цільний ферментаційний бульйон може додатково містити консервант і/або антимікробний агент. Такі консерванти і/або агенти відомі в даній галузі техніки.
Цільний ферментаційний бульйон, як описано в даний заявці, як правило, є рідиною, але може містити нерозчинні компоненти, такі як лізовані клітини, клітинний детрит, компоненти культурального середовища, і/або нерозчинний фермент(и). У деяких варіантах здійснення нерозчинні компоненти можуть бути вилучені для освітлювання цільного ферментаційного бульйону.
В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон може бути доповнений однією або декількома ферментативними активностями, які не експресуються ендогенно, або експресуються на відносно низькому рівні міцеліальними грибами, для поліпшення деградації целюлозного субстрату, наприклад, до ферментованих цукрів, таких як глюкоза або ксилоза.
Додатковий фермент(и) може бути доданий у вигляді добавки до цільного ферментаційного бульйону, а ферменти можуть бути компонентом окремого цільного ферментаційного бульйону, або можуть бути очищені, або мінімально видалені і/або очищені.
В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон містить цільний ферментаційний бульйон від ферментації рекомбінантних міцеліальних грибів, які надлишково експресують один або кілька ферментів для поліпшення деградації целюлозного субстрату.
Альтернативно, цільний ферментаційний бульйон може містити суміш цільного ферментаційного бульйону від ферментації не-рекомбінантного міцеліального гриба й рекомбінантного міцеліального гриба, який надлишково експресує один або кілька ферментів для поліпшення деградації целюлозного субстрату. В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон включає цільний ферментаційний бульйон від ферментації міцеліальних грибів, які надлишково експресують бета-глюкозидазу. Альтернативно, цільний ферментаційний бульйон для застосування в даних способах і реактивних композиціях може містити суміш цільного ферментаційного бульйону від ферментації не-рекомбінантного міцеліального гриба й цільного ферментаційного бульйону від ферментації рекомбінантного бо міцеліального гриба, який надлишково експресує бета-глюкозидазу.
Лігпоцелюлозний матеріал
Лігноцелюлозний матеріал у даній заявці включає будь-який лігноцелюлозний (і/або геміцелюлозний матеріал. Лігноцелюлозний матеріал, придатний для застосування як сировинний матеріал в даному винаході, включає біомасу, наприклад, первинну біомасу і/або не-первинну біомасу, комерційну органіку, будівельне й міське сміття, тверді комунальні відходи, макулатуру й садові відходи. Загальні форми біомаси включають дерева, чагарники й траву, пшеницю, пшеничну солому, цукрову тростину, очеретяну солому, очеретяно-цукрову багассу, просо, міскантус, енергетичний очерет, кукурудзу, кукурудзяну солому, кукурудзяну лушпайку, качани кукурудзи, стебла каноли, стебла сої, цукрове сорго, зерна кукурудзи, включаючи волокна із зерен, продукти й субпродукти з розмеленого зерна, такого як кукурудза, пшениця і ячмінь (включаючи вологе мливо й сухий мливо), які часто називаються "висіками або волокном", а також комунальні тверді відходи, макулатуру й садові відходи. Біомаса також може бути трав'янистим матеріалом, сільськогосподарськими відходами, відходами лісового господарства, комунальними твердими відходами, макулатурою, і паперовою масою й відходами від виробництва паперу, але не обмежується ними. "Сільськогосподарська біомаса" включає гілки, кущі, очерет, кукурудзу й кукурудзяні лушпайки, енергетичні культури, лісоматеріал, плоди, квіти, зерно, траву, трав'янисті культури, листя, кору, хвою, колоди, коріння, пагони, деревні культури з короткою ротацією, чагарники, просо, дерева, городину, шкірку плодів, ліани, жом цукрового буряка, пшеничні висівки, лушпайки вівса, і тверду й м'яку деревину (не включаючи деревину зі шкідливими матеріалами). Крім того, сільськогосподарська біомаса включає органічні відходи, утворені в сільськогосподарських процесах, включаючи землеробство й лісове господарство, особливо включаючи деревні відходи лісового господарства. Сільськогосподарська біомаса може бути кожним з вищезгаданого, окремо або в комбінації, або їх сумішшю.
Попередня обробка
Лігпоцелюлозний матеріал, який використовується у даному винаході, може бути промитий і або зазнавати попередньої обробки. Сировинний матеріал може бути необов'язково піддано попередній обробці з нагріванням, механічній і/або хімічній модифікації, або будь-якою комбінації таких способів, для підвищення доступності субстрату для ферментативного гідролізу
Зо і/або гідролізу геміцелюлози і/або солюбілізації геміцелюлози і/або целюлози і/або лігніну, будь- яким способом, відомим у даній галузі техніки. В одному варіанті здійснення попередню обробку проводять, обробляючи лігноцелюлозу парою, гарячою водою або розбавленою кислотою або розбавленою основою.
В одному варіанті здійснення лігноцелюлозний матеріал піддають попередній обробці до іабо під час ферментативного гідролізу. Способи попередньої обробки відомі в даній галузі техніки й включають нагрівання, механічну, хімічну модифікацію, біологічну модифікацію, і будь- яку їх комбінацію, але не обмежуються ними. Попередню обробку, як правило, проводять для підвищення доступності лігноцелюлозного матеріалу для ферментативного гідролізу і/або гідролізу геміцелюлози і/або солюбілізації геміцелюлози і/або целюлози і/або лігніну, у лігноцелюлозному матеріалі. В одному варіанті здійснення попередня обробка включає обробку лігноцелюлозного матеріалу паром, обробку гарячою водою або обробку розбавленою кислотою або розбавленою основою. Приклади способів попередньої обробки включають обробку паром (наприклад, обробку при 100-260 "С, під тиском 7-45 бар, при нейтральному рН, протягом 1-10 хвилин), обробку розбавленою кислотою (наприклад, обробку з 0,1 - 5 95 Н25О4 іабо 50» і/або НМОз і/або НС, у присутності або за відсутності пари, при 120-200 "С, під тиском 2-15 бар, при кислому рН, протягом 2-30 хвилин), обробку органічним розчинником (наприклад, обробку 1-1,5 95 Н25О»Х у присутності органічного розчинника й пари, при 160-200 "С, під тиском 7-30 бар, при кислому рН, протягом 30-60 хвилин), обробку вапном (наприклад, обробку 0,1-2 95
Ммаон/Са(ОнН)»: у присутності води/пари при 60-160 "С, під тиском 1-10 бар, при лужному рН, протягом 60-4800 хвилин), АЕР обробку (наприклад, обробку 5-15 95 МНз, при 150-180 "С, під тиском 9-17 бар, при лужному рн, протягом 10-90 хвилин), АРЕХ обробку (наприклад, обробку з 215 95 МНз, при 60-140 "С, під тиском 8-20 бар, при лужному рН, протягом 5-30 хвилин), але не обмежуються ними.
Етап промивання
Необов'язково, спосіб запропонований даним винаходом включає етап промивання.
Необов'язковий етап промивання може застосовуватися для видалення водорозчинних сполук, які можуть діяти як інгібітори на етапі ферментації. Етап промивання можна проводити звичайним способом.
Лігноцелюлозний матеріал може бути промитий. В одному варіанті здійснення бо лігноцелюлозний матеріал може бути промитий після попередньої обробки. Етап промивання можна застосовувати для видалення водорозчинних сполук, які можуть діяти як інгібітори на етапі ферментації і/або гідролізу. Етап промивання можна проводити способом, відомим фахівцям у даній галузі техніки. Слідом за промиванням, існують інші способи детоксикації.
Підданий попередній обробці лігноцелюлозний матеріал може також бути підданий детоксикації кожним (або комбінацією) із цих способів, які включають відділення твердої речовини/рідини, вакуумне випаровування, екстракцію, адсорбцію, нейтралізацію, надлишкове вапнування, додавання відновлюючих агентів, додавання детоксикуючих ферментів, таких як лаккази або пероксидази, додавання мікроорганізмів, здатних до детоксикації гідролізатів, але не обмежуючись ними.
Ферментативний гідроліз
Ферментна композиція, яка використовується в способі запропонованому даним винаходом, може дуже ефективно гідролізувати лігноцелюлозний матеріал, наприклад, кукурудзяну солому, пшеничну солому, очеретяну солому, і/або очеретяно-цукрову багасу, яку можна потім перетворити на корисний продукт, такий як етанол, біогаз, бутанол, молочна кислота, пластик, органічна кислота, розчинник, добавка до корму тварин, фармацевтичний засіб, вітамін, амінокислота, фермент або хімічний сировинний матеріал. Крім того, проміжні продукти від процесу після гідролізу, наприклад, молочну кислоту як проміжний продукт при виробництві біогазу, можна застосовувати як стандартний блок для інших матеріалів. Даний винахід супроводжується прикладами виробництва етанолу, але вони приводяться з метою ілюстрації, а не обмеження, також можна виробляти інші згадані корисні продукти.
Спосіб запропонований даним винаходом включає етап ферментативного гідролізу.
Ферментативний гідроліз включає гідроліз із метою зрідження сировинного матеріалу, і гідроліз із метою вивільнення цукру із сировинного матеріалу, або те й інше, але не обмежується ними.
На цьому етапі необов'язково підданий ферментативної обробці й необов'язково промитий лігноцелюлозний матеріал приводять у контакт із ферментативною композицією запропонованою даним винаходом. Залежно від лігноцелюлозного матеріалу й попередньої обробки, різні умови реакції, наприклад, температура, дозування ферменту, час реакції гідролізу й концентрація сухої речовини можуть бути адаптовані фахівцем у даній галузі техніки для досягнення необхідного перетворення лігноцелюлози на цукор. Далі наведені деякі
Зо вказівки.
В одному аспекті винаходу гідроліз проводять за температури 45 "С або вище, 50 "С або вище, 55"С або вище, 60 "С або вище, 65"С або вище, або 70"С або вище. Висока температура при гідролізі має багато переваг, які включають роботу за оптимальної температури ферментної композиції, зниження ризику (бактеріальної) контамінації, зниження в'язкості, меншу кількість необхідної для охолодження води, застосування охолодної води з більш високою температурою, повторне застосування ферментів тощо.
В іншому аспекті винаходу кількість доданої ферментної композиції (яка також називається дозою ферменту або навантаженням ферменту) є низькою. В одному варіанті здійснення кількість ферменту становить 6 мг білка/г маси сухої речовини або нижче, 5 мг білка/г маси сухої речовини або нижче, 4 мг білка/г маси сухої речовини або нижче, З мг білка/г маси сухої речовини або нижче, 2 мг білка/г маси сухої речовини або нижче, або 1 мг білка/г маси сухої речовини або нижче (виражена у вигляді білка, в мг білка на г сухої речовини). В одному варіанті здійснення кількість ферменту становить 0,5 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,4 мг ферментної композиції/г маси сухої речовини або нижче, 0,3 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,25 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,20 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,18 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,15 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, або 0,10 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче (виражена у вигляді всіх целюлазних ферментів у мг ферменту на г сухої речовини).
Низькі дози ферменту є можливими, оскільки завдяки активності й стабільності ферментів можна підвищити час реакції гідролізу.
В іншому аспекті винаходу час реакції гідролізу становить 5 годин або більше, 10 годин або більше, 20 годин або більше, 40 годин або більше, 50 годин або більше, 60 годин або більше, 70 годин або більше, 80 годин або більше, 90 годин або більше, 100 годин або більше, 120 годин або більше, 130 годин або більше. В іншому аспекті час реакції гідролізу становить від 5 до 150 годин, від 40 до 130 годин, від 50 до 120 годин, від 60 до 120 годин, від 60 до 110 годин, від 60 до 100 годин, від 70 до 100 годин, від 70 до 90 годин, або від 70 до 80 годин. Завдяки стабільності ферментної композиції можливим є більш тривалий час реакції гідролізу з відповідними більш високими виходами цукрів.
Значення рН під час гідролізу може бути обране фахівцем у даній галузі техніки. В іншому 60 аспекті винаходу рН під час гідролізу може становити від 3,0 до 6,4. Стабільні ферменти відповідно до даного винаходу можуть мати широкий діапазон рН до 2 одиниць рН, до З одиниць рН, до 5 одиниць рН. Оптимальне значення рН може перебувати в межах рН від 2,0 до 8,0, від 3,0 до 8,0, від 3,5 до 7,0, від 3,5 до 6,0, від 3,5 до 5,0, від 3,5 до 4,5, від 4,0 до 4,5, або становить близько 4,2.
В іншому аспекті винаходу етап гідролізу проводять, поки не вивільниться до 70 95 або більше, 80 95 або більше, 85 95 або більше, 90 95 або більше, 92 95 або більше, 95 95 або більше доступного цукру в лігноцелюлозному матеріалі.
Важливо, що спосіб запропонований даним винаходом можна проводити із застосуванням високих рівнів сухої речовини (або лігпоцелюлозного матеріалу) у реакції гідролізу. Таким чином, винахід можна здійснювати зі вмістом сухої речовини приблизно 5 мас. 95 або більше, приблизно 8 мас. 95 або більше, приблизно 10 мас. 95 або більше, приблизно 11 мас. 95 або більше, приблизно 12 мас. 95 або більше, приблизно 13 мас. 95 або більше, приблизно 14 мас. У або більше, приблизно 15 мас. 95 або більше, приблизно 20 мас. 95 або більше, приблизно 25 мас. 95 або більше, приблизно 30 мас. 95 або більше, приблизно 35 мас. 95 або більше, приблизно 40 мас. 95 або більше. В іншому варіанті здійснення, вміст сухої речовини на етапі гідролізу становить 14 мас. 95, 15 мас. 95, 16 мас. 95, 17 мас. 95, 18 мас. 95, 19 мас. бо, 20 мас. 95, 21 мас. 95, 22 мас. 90, 23 мас. 95, 24 маб. 95, 25 маб. 9о, 26 мас. 95, 27 мабс. 90, 28 мас. 9о, 29 мас. 95, 30 мас. 95, 31 мас. 95, 32 мас. 90, 33 мас. 95 або більше, або від 14 до 33 мас. 95. В іншому варіанті здійснення, вміст сухої речовини наприкінці гідролізу становить 5 мас. 95 або більше, 6 мас. 95 або більше, 7 мас. 95 або більше, 8 мас. 95 або більше, 9 мас. 95 або більше, 10 мас. 95 або більше, 11 мас. 95 або більше, 12 мас. 95 або більше, 13 мас. 95 або більше, 14 мас. У» або більше, 15 мас. 95 або більше, 16 мас. 95 або більше, 17 мас. 95 або більше, 18 мас. У» або більше, 19 мас. 956 або більше, 20 мас. 95 або більше, 21 мас. 95 або більше, 22 мас. У» або більше, 23 мас. 956 або більше, 24 мас. 95 або більше, 25 мас. 95 або більше, 26 мас. 96 або більше, 27 мас. 95 або більше, 28 мас. 95 або більше, 29 мас. 95 або більше, 30 мас. 95 або більше, 31 мас. 95 або більше, 32 мас. У5 або більше, 33 мас. 95 або більше, 34 мас. У» або більше, 35 мас. 95 або більше, 36 мас. 95 або більше, 37 мас. 95 або більше, 38 мас. 96 або більше, або 39 мас. 95 або більше. В іншому варіанті здійснення, вміст сухої речовини наприкінці ферментативного гідролізу становить 5 мас. 95 - 40 мас. 9о, 6 мас. 95 - 40 мас. 95, 7 мас. Фь - 40 мас. 95, 8 мас. 9 - 40 мас. 95, 9 маб. Фь - 40 мас. 95, 10 мас. Фо - 40 мас. 9, 11 мас. бо - 40 мас. 95, 12 маб. 95 - 40 маб. 95, 13 мас. 95 - 40 мас. 95, 14 мас. бо - 40 мас. 95, 15 мас. о - 40 мас. 90, 16 мас. 95 - 40 мас. 95, 17 мас. У5 - 40 мас. 95, 18 мас. бо - 40 мас. бо, 19 мас. о - 40 мас. 95, 20 мас. 95 - 40 мас. 95, 21 мас. 5 - 40 мас. 95, 22 мас. Фо - 40 маб. бо, 23 мас. Зо - 40 мас. 90, 24 мас. 95 - 40 маб. 95, 25 мас. 965 - 40 мас. 95, 26 мас. Фо - 40 маб. бо, 27 мас. о - 40 мас. 95, 28 мас. 965 - 40 мас. 95, 29 мас. 965 - 40 мас. 9Уо, 30 мас. 905 - 40 маб. Фо, З1 мас. о - 40 мас. 90, 32 мас. 95 - 40 мас. 95, 33 мас. 95 - 40 мас. 95, 34 мас. бо - 40 маб. бо, 35 мас. о - 40 мас. 9Уо, 36 мас. 95 - 40 мас. 95, 37 мас. 5 - 40 мас. 95, 38 мас. бо - 40 мас. бо, 39 мас. Фо - 40 мас. 95.
Ферментація
Спосіб запропонований даним винаходом включає етап ферментації. Таким чином, в іншому аспекті винахід включає на етапі ферментації процес, у якому використовують мікроорганізми для ферментації джерела вуглецю, яке містить цукор(и), наприклад, глюкозу, І -арабінозу і/або ксилозу. Джерело вуглецю може включати будь-який вуглеводний оліго- або полімер, який містить І -арабінозні, ксилозні або глюкозні одиниці, наприклад, такі як лігноцелюлоза, ксилани, целюлоза, крохмаль, арабінан тощо. Для вивільнення ксилозних або глюкозних одиниць із таких вуглеводів, придатні карбогидрази (такі, як ксиланази, глюканази, амілази та подібні до них) можуть бути додані до ферментаційного середовища, або можуть продукуватися модифікованою клітиною-носієм. В останньому випадку модифікована клітина-носій може бути створена генно-інженерними методами для продукування й екскреції таких карбогидраз.
Додатковою перевагою застосування оліго- і полімерних джерел глюкози є те, що вони забезпечують збереження низкої (більш низкої) концентрації вільної глюкози при ферментації, наприклад, шляхом застосування кількостей вуглеводів, що лімітують швидкість. Це, у свою чергу, запобігає репресії систем, необхідних для метаболізму й транспорту не-глюкозних цукрів, таких як ксилоза. У кращому способі модифіковані клітини-носії ферментують як І-арабінозу (необов'язково, ксилозу), так і глюкозу, бажано одночасної у цьому випадку бажано застосовують модифіковані клітини-носії, які є нечутливими до пригнічення глюкози для запобігання диауксичного росту. На додачу до джерела І -арабінози, необов'язково, ксилози (їі глюкози) як джерела вуглецю, ферментаційне середовище додатково містить придатний інгредієнт, необхідний для росту модифікованої клітини-носія. Сполуки ферментаційних середовищ для вирощування мікроорганізмів, таких як дріжджі й міцеліальні гриби, добре відомі в даній галузі техніки.
Час ферментації може бути коротшим, ніж при звичайній ферментації за тих же умов, де частина ферментативного гідролізу усе ще повинна відбуватися під час ферментації. В одному варіанті здійснення час ферментації становить 100 годин або менше, 90 годин або менше, 80 годин або менше, 70 годин або менше, або 60 годин або менше, для цукрової композиції з 50 г/л глюкози й відповідних інших цукрів з лігноцелюлозного сировинного матеріалу (наприклад, 50 г/л ксилози, 35 г/л І -арабінози й 10 г/л галактози). Для більш розбавлених цукрових композицій час ферментації може відповідно бути скорочено.
Процес ферментації може бути аеробним або анаєробним процесом ферментації.
Анаеробний процес ферментації визначається в даний заявці як процес ферментації, що проходить за відсутності кисню, або в якому власне не споживається кисень, бажано споживається менше 5, 2,5 або 1 ммоль/л/год., краще 0 ммоль/л/год. (тобто споживання кисню не виявляється), і де органічні молекули служать як донорами електронів, так і акцепторами електронів. За відсутності кисню НАДФ, продукований при гліколізі й утворенні біомаси, не може бути окисленим за допомогою окисного фосфорилювання. Для розв'язання цієї проблеми багато мікроорганізмів застосовують піруват або одне з його похідних як акцептор електрона й водню, таким чином, регенеруючи НАД". Таким чином, у кращому анаеробному процесі ферментації піруват використовують як акцептор електрона (і водню), і відновлюють до таких продуктів ферментації, як етанол, молочна кислота, З-гідроксипропіонова кислота, акрилова кислота, оцтова кислота, бурштинова кислота лимонна кислота, яблучна кислота, фумарова кислота, амінокислота, 1,3-пропандіол, етилен, гліцерин, бутанол, В-лактамні антибіотики й цефалоспорин. У кращому варіанті здійснення процес ферментації є анаеробним. Анаеробний процес є кращим, оскільки він дешевше аеробного процесу: потрібно менше спеціального устаткування. Далі, передбачається, що анаеробні процеси дають більш високий вихід, ніж аеробні процеси. За аеробних умов звичайно вихід біомаси вищий, ніж за анаеробних умов. У результаті звичайно за аеробних умов очікуваний вихід продукту нижчий, ніж за анаеробних умов.
В іншому варіанті здійснення процес ферментації проводять за умов обмеження кисню.
Зо Бажано, процес ферментації є аеробним і здійснюється за умов обмеження кисню. Процес ферментації з обмеженням кисню є процесом, у якому споживання кисню обмежене переносом кисню з газу в рідину. Ступінь обмеження кисню визначається кількістю й складом потоку газу, що надходить, а також даними щодо перемішування/властивостей масового перенесення використовуваного устаткування для ферментації. Бажано, у процесі за умов обмеження кисню швидкість споживання кисню становить щонайменше 5,5, краще щонайменше 6, і ще краще щонайменше 7 ммоль/л/год.
Процес ферментації бажано проходить за температури, оптимальної для модифікованої клітини. Таким чином, для більшості дріжджових або грибних клітин процес ферментації проводять за температури менше 42 "С, бажано менше 38 "С. Для дріжджових і грибних клітин- носіїв процес ферментації бажано проводять за температури нижче 35, 33, 30 або 28С,і температури вище 20, 22 або 25 76.
В одному варіанті здійснення винаходу етап ферментації проводять із мікроорганізмом, здатним до ферментації щонайменше одного С5 цукру. В одному варіанті здійснення процес є процесом для одержання етанолу, де процес включає етап, що передбачає ферментацію середовища, що містить цукор(а), з мікроорганізмом, здатним до ферментації щонайменше одного С5 цукру, де клітина-носій здатна до ферментації глюкози, І-арабінози й ксилози в етанол. Мікроорганізм може бути прокаріотичним або еукаріотичним організмом. Мікроорганізм, який використовується у процесі, може бути мікроорганізмом, отриманим за допомогою генної інженерії. Прикладами придатних організмів є дріжджі, наприклад, засспаготусев, наприклад,
Засспаготусев сегемізіае, Засспаготусе5 равіойапи5 або Засспаготусез умагит, Напзепиїа,
ІєзаїспепКіа, наприклад, і5заїспепкКіа огіепіай5, Ріспіа, наприклад, Ріспіа віїрйе5 або Ріспіа разіогізх, Кісумеготусе5, наприклад, Кінумеготусев5 Тадіїї5, Сапаїда, наприклад, Сапаїда рхецпдоїгорісаїї5 або Сапаїда асідоїтегторпіїшт, Распузоїеп, наприклад, Распузоїеп Таппорпйси5, або бактерії, наприклад, І асіобасіїйш5, наприклад, І асіобасіййн5 Іасії5, сеобасійи5, 7утотопав, наприклад, 7утотопах тобіїї5, Сіовігідішт, наприклад, Сіовігідічт рпуотепптепіапв, Езспегіспіа, наприклад, Е. соїї, КіерзіеІа, наприклад, Кіерзіейа охуїоса. В одному варіанті здійснення мікроорганізмом, здатним до ферментації щонайменше одного С5 цукру, є дріжджі. В одному варіанті здійснення дріжджі належать до роду Засспаготусев5, бажано до виду Засспаготусев сегемізіає, у якому виконані генетичні модифікації. Приклад такого мікроорганізму і його бо приготування описано більш докладно в УМО 2008/041840 і в Європейській патентній заявці
ЕР10160622.6, поданій 21 квітня 2010 року. В одному варіанті здійснення процес ферментації для одержання етанолу є анаеробним. Термін "анаеробний" уже визначений у даній заявці. В іншому кращому варіанті здійснення процес ферментації для одержання етанолу є аеробним. В іншому кращому варіанті здійснення процес ферментації для одержання етанолу проводиться за умов обмеження кисню, бажано за аеробних умов і з обмеженням кисню. Умови з обмеженням кисню вже описані вище.
У такому процесі об'ємна продуктивність етанолу бажано становить щонайменше 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 або 10,0 г етанолу на літр за годину. Вихід етанолу за І-арабінозою й необов'язково ксилозою і/або глюкозою в процесі бажано становить щонайменше 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 або 98 95. Вихід етанолу в даний заявці визначається як відсоток від теоретичного максимального виходу, який для глюкози й І-арабінози й необов'язково для ксилози становить 0,51 грам етанолу на грам глюкози або ксилози.
В одному аспекті процес ферментації, який призводить до одержання етанолу, має кілька переваг, у порівнянні з відомими процесами ферментації для одержання етанолу: - можливість анаеробних процесів; - можливість також умов з обмеженням кисню; - можливість досягати більш високих виходів етанолу й швидкостей продукування етанолу; - використовуваний штам може бути здатний використовувати І-арабінозу й необов'язково ксилозу.
Як альтернатива для процесів ферментації описаних вище, можна застосовувати щонайменше дві різні клітини, це означає, що процес є процесом спільної ферментації. Усі кращі варіанти процесів ферментації, як описано вище, також є кращими варіантами здійснення цих процесів спільної ферментації: ідентичність продукту ферментації, ідентичність джерела І - арабінози й джерела ксилози, умови ферментації (аеробні або анаеробні умови, умови обмеження кисню, температура, за якої здійснюють процес, продуктивність етанолу, вихід етанолу).
Процес ферментації можна проводити без якої-небудь вимоги до підведення рН під час процесу. Тобто, процес є процесом, який можна проводити без додавання якої-небудь кислоти (кислот) або основи (основ). Однак це виключає етап попередньої обробки, де можна додавати кислоту. Справа в тому, що композиція, запропонована даним винаходом, здатна діяти при низькому рН, і таким чином, немає необхідності доводити рН попередньо обробленого кислотою сировинного матеріалу, щоб забезпечити оцукрювання або гідроліз. Відповідно,
Спосіб запропонований даним винаходом, може бути безвідходним способом із застосуванням тільки органічних продуктів без необхідності введення неорганічних хімікатів.
Загальний час реакції
Відповідно до винаходу, загальний час реакції (або сукупний час реакції етапу гідролізу й етапу ферментації) може бути скорочено. В одному варіанті здійснення загальний час реакції становить 300 годин або менше, 200 годин або менше, 150 годин або менше, 140 годин або менше, 130 годин або менше, 120 годин або менше, 110 годин або менше, 100 годин або менше, 90 годин або менше, 80 годин або менше, 75 годин або менше, або приблизно 72 години при 90 95 виході глюкози. Відповідно, можна досягти скорочення загального часу при більш низькому виході глюкози.
Продукти ферментації
Продукти ферментації, які можна одержати відповідно до винаходу, включають амінокислоти, вітаміни, фармацевтичні засоби, добавки в корм тварин, хімікати спеціального призначення, хімічні сировинні матеріали, пластики, розчинники, паливо або інші органічні полімери, молочну кислоти і етанол, включаючи паливний етанол (терміном "етанол" позначають включення етилового спирту або сумішей етилового спирту й води).
Специфічні корисні продукти, які можуть бути вироблені за допомогою способів, запропонованих даним винаходом, включають біопаливо (включаючи біогаз, етанол і бутанол); молочну кислоту; З-гідроксипропіонову кислоту; акрилову кислоту; оцтову кислоту; 1,3- пропандіол; етилен; гліцерин; пластик; хімікати спеціального призначення; органічну кислоту, включаючи лимонну кислоту, бурштинову кислоту й малеинову кислоту; розчинник; добавку в корм тварин; фармацевтичний засіб, таке як р-лактамний антибіотик або цефалоспорин; вітамін; амінокислоту, таку як лізин, метіонін, триптофан, треонин і аспарагінову кислоту; фермент, такий як протеаза, целюлаза, амілаза, глюканаза, лактаза, ліпаза, ліаза, оксидоредуктаза, трансфераза або ксиланаза; хімічний сировинний матеріал; або добавку в корм тварин, але не обмежуючись ними.
Продукти ферментації, які можна одержати за допомогою способу, запропонованого даним бо винаходом, можуть бути будь-якою речовиною, отриманою ферментацією. Вони включають спирти (такі, як арабінитол, бутанол, етанол, гліцерин, метанол, 1,3-пропандіол, сорбітол і ксилітол); органічну кислоту (таку, як оцтова кислота, ацетонова кислота, адипінова кислота, аскорбінова кислота, акрилова кислота, лимонна кислота, 2,5-дикето-Ю-глюконова кислота, мурашина кислота, фумарова кислота, глукарова кислота, глюконова кислота, глюкуронова кислота, глутарова кислота, З-гідроксипропіонова кислота, ітаконова кислота, молочна кислота, малеїнова кислота, яблучна кислота, малонова кислота, щавлева кислота, щавелевооцтова кислота, пропіонова кислота, бурштинова кислота й ксилонова кислота); кетони (такі, як ацетон); амінокислоти (такі, як аспарагінова кислота, глутамінова кислота, гліцин, лізин, серин, триптофан і треонін); алкани (такі, як пентан, гексан, гептан, октан, нонан, декан, ундекан і додекан), циклоалкани (такі, як циклопентан, циклогексан, циклогептан і циклооктан), алкени (такі, як пентен, гексен, гептен і октен); і гази (такі, як метан, водень (Нг), диоксид вуглецю (СО?) і монооксид вуглецю (СО)), але не обмежуючись ними. Продукт ферментації може також бути білком, вітаміном, фармацевтичним засобом, добавкою в корм тварин, хімікатом спеціального призначення, хімічним сировинним матеріалом, пластиком, розчинником, етиленом, ферментом, таким як протеаза, целюлаза, амілаза, глюканаза, лактаза, ліпаза, ліаза, оксидоредуктаза, трансфераза або ксиланаза.
Відділення продукту ферментації
Спосіб запропонований даним винаходом необов'язково включає виділення продукту ферментації. Продукт ферментації може бути відділений від ферментаційного бульйону будь- яким відомим способом. Таким чином, для кожного продукту фахівець у даній галузі техніки може вибрати придатну методику відділення. Наприклад, етанол може бути відділений від дріжджового ферментаційного бульйону шляхом дистиляції, наприклад, звичайним способом дистиляції паром/вакуумної дистиляції.
Деякі варіанти здійснення винаходу далі описані більш докладно, але без обмеження будь- яким чином обсягу даного винаходу.
Застосування термостабільних ферментів за оптимальних температурних умов
В одному варіанті здійснення винахід відноситься до застосування термостабільних ферментів, таких як целюлолітичні ферменти з Казатзхтопіа, для одержання відновлюючих цукрів з попередньо обробленого лігноцелюлозного сировинного матеріалу при продукуванні
Зо етанолу, але не обмежуючись ним. Целюлолітичні ферменти з Казатвзопіа, які застосовуються на попередньо обробленому лігноцелюлозном сировинному матеріалі, показали максимальні швидкості перетворення за температури в діапазоні від 50 до 70 "С. Фермент залишається активним за цих умов протягом 14 діб й більше без повної втрати активності.
ІЗ застосуванням оптимальних температурних умов із сировинного матеріалу можна вивільнити максимальну кількість відновлюючих цукрів (повний гідроліз) з найкоротшим можливим часом гідролізу. Таким способом досягається 100 95 перетворення целюлози на глюкозу менше ніж за 5 днів.
Теоретичний максимальний вихід (уро тах у грамах продукту на грам глюкози) для ферментаційного продукту може бути отриманий із підручника з біохімії. Для етанолу 1 моль глюкози (180 г) дає відповідно до нормального шляху ферментації у вигляді гліколізу щонайменше 2 молі етанолу (2 х 46-92 г етанолу). Теоретичний максимальний вихід етанолу за глюкозою, таким чином, становить 92/180-0,511 г етанолу/г глюкози.
Для бутанолу (М.м. 74 г/моль) або ізобутанолу теоретичний максимальний вихід становить 1 моль бутанолау на моль глюкози. Таким чином, Мр тах для (ізо)бутанолу становить - 74/180-0,411 г (ізо)бутанолу/г глюкози.
Для молочної кислоти вихід ферментації для гомомолочнокислої ферментації становить 2 молі молочної кислоти (М.м. - 90 г/моль) на моль глюкози. Відповідно до цієї стехіометрії, Хр тах-1 г молочної кислоти/г глюкози.
Для інших продуктів ферментації можна провести подібні розрахунки.
Зниження витрат, що досягається із застосуванням целюлолітичних ферментів з
Казатвзопіа, забезпечує зменшення загального часу процесу.
Компенсація низького дозування ферменту зі збільшенням часу гідролізу із застосуванням ферментів Казатзопіа
Завдяки високій стабільності стабільних ферментів, активність не зникає згодом, хоча вивільняється менше цукрів у ході гідролізу. Можна знизити дозування ферменту й продовжити застосування ферменту шляхом збільшення часу гідролізу для одержання подібних рівнів вивільнення відновлюючих цукрів. Наприклад, 0,175 мл ферменту/г сухої речовини сировинного матеріалу приводить до вивільнення приблизно 9095 від теоретичного максимуму відновлюючих цукрів, з попередньо обробленого сировинного матеріалу за 72 години. При бо використанні 0,075 мл ферменту/г сухої речовини сировинного матеріалу приблизно 90 95 перетворення від теоретичного максимуму досягають в межах 120 годин. Результати показують, що завдяки стабільності ферментативної активності, зниження дозування ферменту можна компенсувати шляхом збільшення часу гідролізу для одержання тієї самої кількості відновлюючих цукрів. Те ж саме справедливо для гідролізу попередньо обробленого сировинного матеріалу при вмісті сухої речовини вище 10 95, що показує компенсаторний ефект подовження часу гідролізу при 15 95 сухої речовини сировинного матеріалу.
Зниження витрат на виробництво, яке досягається шляхом застосування целюлолітичних ферментів, таких як Казатвзопіа, приводить до необхідного зниженого дозування ферменту, забезпечуючи подібний вихід при гідролітичному перетворенні.
Зниження ризику контамінації зі стабілоними ферментами
У загальному способі перетворення лігноцелюлозного матеріалу на етанол етапи способу бажано здійснюють за септичних умов для зниження витрат на виробництво. Таким чином, можлива контамінація й ріст контамінуючих мікроорганізмів, що може призвести до небажаних побічних ефектів, таких як вироблення молочної кислоти, мурашиної кислоти й оцтової кислоти, втрати виходу етанолу на субстраті, вироблення токсинів і екстрацелюлярних полісахаридів, що може значно впливати на витрати на виробництво. Висока температура процесу і/або короткий час процесу обмежує ризик контамінації при гідролізі й ферментації. Термостабільні ферменти, такі як отримані з Казатвопіа, здатні до гідролізу лігноцелюлозного сировинного матеріалу за температур вище 60 "С. За цих температур ризик контамінації мікроорганізмами, що викликають небажані побічні ефекти, є невисоким або майже нульовим.
Під час етапу ферментації, при якому утворюється етанол, температура, як правило, становить від 30 до 37 "С і бажано не підвищується через втрати продукції. При використанні як можна більш короткого часу ферментації ризики й ефекти контамінації і/або росту контамиінантів максимально знижуються. Зі стабільними ферментами, такими як отримані з
Вазатвзопіа, можна застосовувати як можна більш короткий час ферментації (див. опис вище), і таким чином, ризики контамінації і/або росту контамиінантів максимально знижуються. Таким чином, зниження витрат на виробництво, що досягається із застосуванням термостабільних целюлолітичних ферментів з Казатзопіа, призводить до зниження ризику порушень процесу через контамінацію.
Зо Стабільні ферменти дозволяють знизити витрати на охолодження й підвищують продуктивність вироблення етанолу
На першому етапі після термічної обробки необхідно охолодити попередньо оброблений сировинний матеріал до температур, за яких ферменти мають оптимальну активність. У великому масштабі це, як правило, виконують шляхом додавання (охолодженої) води, яка, крім
З5 зниження температури, знижує вміст сухої речовини. Із застосуванням термостабільних ферментів, таких як отримані з Назатвзопіа, можна досягти зниження витрат на виробництво завдяки тому, що (ї) потрібне менше охолодження попереднє обробленого сировинного матеріалу, оскільки більш високі температури допускаються при гідролізі, і (ї) додають менше води, що підвищує вміст сухої речовини при гідролізі й ферментації, і таким чином, підвищує виробничий потенціал для етанолу (кількість, вироблену за одиницю часу за об'ємом) для заводу з виробництва етанолу. Крім того, із застосуванням термостабільних ферментів запропонованих даним винаходом, таких як отримані з Казатзопіа, можна досягти зниження витрат на виробництво шляхом застосування охолодженої води, що має більш високу температуру, ніж вода, яка використовується в способі з не-термостабільним ферментом.
Повторне використання ферментів після гідролізу зі стабільними ферментами
Наприкінці гідролізу активність ферментів стає низькою, оскільки вивільняється мало відновлюючих цукрів, через перетворення майже всієї целюлози. Однак кількість присутньої ферментативної активності мало знижується, приблизно, головним чином через абсорбцію ферментів на субстраті. За допомогою застосування відділення твердої речовини від рідини, такого як центрифугування, фільтрація, осадження з декантацією тощо, можна виділити 60 9о або більше, наприклад, 70 95 ферментативної активності в розчині, і повторно застосувати для гідролізу нового попередньо обробленого лігпоцелюлозного сировинного матеріалу при наступному гідролізі.
Далі, після відділення твердої речовини й рідини фермент у розчині можна відокремити від розчину, який містить відновлюючі цукри й інші продукти гідролізу від ферментативної активності. Це відділення можна виконати шляхом (ультра- і мікро)фільтрації, центрифугування, осадження з декантацією, седиментації, з першою абсорбцією ферменту на носії будь-якого виду, або без неї, але не обмежуючись ними.
Наприклад, після гідролізу попередньо обробленого сировинного матеріалу з бо ферментативним навантаженням 0,175 мл/г сухої речовини сировинного матеріалу протягом 20 годин, вивільняється 50 95 від теоретичної максимальної кількості відновлюючих цукрів, а після того ж гідролізу протягом 72 годин вивільняється 90 95 від теоретичної максимальної кількості відновлюючих цукрів. Шляхом центрифугування й ультрафільтрації видаляли 60-70 9о ферментативної активності в концентраті, у той час як фільтрат містив більше 80 95 вивільнених відновлюючих цукрів. Шляхом повторного застосування концентрату, як такого, або після додаткового очищення і/або концентрування, дозування ферменту під час наступного етапу гідролізу можна знизити від 60 до 70 95. Зниження витрат, що досягається із цими стабільними целюлолітичними ферментами, такими як отримані з Казатвбзопіа, забезпечується таким способом за рахунок зниження необхідного дозування ферменту.
Повторне використання ферментів після гідролізу в комбінації із продукцією ферментів і повторним використанням дріжджових клітин зі стабільними ферментами
Спосіб, який передбачає повторне застосування ферментів після гідролізу, як описано вище, можна об'єднати з повторним застосуванням мікроорганізмів, що виробляють етанол, після ферментації та із застосуванням фільтрату, що містить відновлюючі цукри, як субстрат (очищений і/або концентрований або розбавленогоий) у ферментації з виробленням ферменту та як субстрат для культивування мікроорганізму, який виробляє етанол.
Повторне застосування ферментів після вакуумної дистиляції зі стабільними ферментами
Термостабільність ферментів, таких як отримані з Казатбзопіа, забезпечує залишкову целюлолітичну активність після гідролізу, ферментації й вакуумної дистиляції у відфільтрованій барді. Загальна активність ферменту знижується під час трьох наступних етапів процесу. Таким чином, відфільтровану барду, отриману після вакуумної дистиляції, можна повторно використовувати як джерело ферментів для нового циклу процесу гідролізу-ферментації- дистиляції для перетворення попередньо обробленої пшеничної соломи на етанол.
Відфільтровану барду можна застосовувати в концентрованій або (не)розбавленій формі і/або очищеною з додаванням додаткових ферментів або без них.
Повторне застосування ферментів у комбінації з додаванням ферментів після вакуумної дистиляції з термостабільними ферментами
В оптимальному способі кількість ферменту, що подається у відфільтровану барду перед її повторним застосуванням у новому циклі процесу, дорівнює кількості активності, втраченої на трьох послідовних етапах процесу з попереднього циклу процесу. Таким способом уникають надлишкового дозування ферменту, і таким чином, досягають найбільш ефективного застосування ферменту.
Далі, шляхом забезпечення високих доз ферменту в першому виробничому циклі й додавання ферменту, рівного кількості активності, втраченої під час трьох послідовних етапів процесу в наступних циклах процесу, можна досягти найбільш високих можливих швидкостей гідролізу в кожному циклі процесу, що призводить до короткого часу гідролізу, менше 48 годин у комбінації з найбільш ефективним застосуванням ферментів.
Застосування стабільних ферментів у змішаних системах
За рахунок застосування перемішування під час гідролізу, ферменти частіше приходять у контакт із субстратами, що призводить до більш ефективного застосування каталітичної активності. Це забезпечує застосування менших дозувань ферментів і таким чином, до зниження витрат, якщо тільки змішування не впливає негативно на ферменти. Стабільні ферменти, такі як термостабільні ферменти з Вазатвзопіа, є стійкими й можуть витримувати умови (місцеві) високого зміщення й температур, які відзначаються у випадку інтенсивного перемішування суспензій. Застосування систем з перемішуванням, таким чином, є придатним і приводить до зменшення дозування, і таким чином, до зниження витрат.
Винахід далі описаний за допомогою наступних прикладів, які не слід вважати як такі, що обмежують обсяг винаходу.
ПРИКЛАДИ
Інформація про експеримент
Штами
Штам Казатвзопіа (ТаЇіаготусев) етегзопії був депонований в СЕМТКААГ ВОКЕАО МООК
ЗСНІММЕЇ! СОЇ ТОВЕ5, ОррзаїаїІаап 8, Р.О. Вох 85167, МІ -3508 А Утрехт, Нідерланди, у грудні 1964, з номером доступу СВ5 393.64. Інші придатні штами також можна використовувати в представлених прикладах для демонстрації ефекту й переваг винаходу. Наприклад, ТЕС-101,
ТЕС-147, ТЕС-192, ТЕС-201 або ТЕС-210 є придатними штамами Казатзопіа, описаними в МО 2011/000949.
Приготування попереднє обробленого кислотою субстрату з кукурудзяної соломи
Попередньо оброблену розбавленою кислотою кукурудзяну солому (ККС) одержували, як бо описано в 5осопеїЇ, 0.9У., Арріїєй Віоспетізігу апа Віоїесппоіїоду (2003), моІ. 105-108, рр 69-85.
Зо
Використовували реактор для попередньої обробки в пілотному масштабі, що працює за умов рівноважного стану 190 "С, із тривалістю перебування 1 хв. і ефективною концентрацією Н25О4 1,45 мас. 95 у рідкій фазі.
Аналізи для визначення білка 1. Загальний білок
ТХО Біурет
Спосіб є комбінацією осадження білка із застосуванням трихлороцтової кислоти (ТХО) для видалення речовин, що заважають, і забезпечення визначення концентрації білка колориметричною біуретовою реакцією. У біуретовій реакції іон міді (Ії) відновлюється до іона міді (І), який утворює комплекс із азотами й вуглецями пептидних зв'язків у лужному розчині.
Фіолетове фарбування вказує на присутність білків. Інтенсивність забарвлення, і, отже, поглинання при 546 нм, прямо пропорційні концентрації білка, відповідно до закону Ламберта-
Бера. Калібрування проводили із застосуванням БСА (бичачого сироваткового альбуміну) і вміст білка виражали в грам білка у вигляді еквівалента БСА/л або в мг білка у вигляді еквівалента БСА/мл. Вміст білка розраховували із застосуванням стандартних протоколів, відомих у даній галузі техніки, шляхом побудови кривої значень ОП5ає проти концентрації зразків з відомою концентрацією, з наступним розрахунками концентрації невідомих зразків, із застосуванням рівняння, отриманого з калібрувальної кривої. 2. Індивідуальні білки із застосуванням ПАГЕ
Попередня обробка зразків для ДСН-ПАГЕ
На основі встановленої концентрації білка в зразках, проводили наступну підготовку зразків.
До 10 мкл зразка додавали 40 мкл води МіО і 50 мкл ТХО (2095) для п'ятиразового розбавлення зразка (- 1 мг/мл) і осадження білків. Через 1 годину інкубації на кризі зразки центрифугували (10 хвилин, 14000 об./хв.). Осад промивали 500 мкл ацетону й центрифугували (10 хвилин, 14000 об./хв.). Осад обробляли, як описано нижче.
ДСН-ПАГЕ
Осад розчиняли в 65 мкл води МіО, 25 мкл МИРАСЕ"М (05 буфера для зразків (4х)
Іпмігодеп і 10 мкл МИРАСЕ"М відновлюючого агента для зразків (10х) Іпмігодеп. Перед етапом денатурації зразок розбавляли в 5 разів із застосуванням суміші МІП; МиРАСЕ"М І О5 буфера для зразків і 10 мкл МиИРАСЕ"М відновлюючого агента для зразків у відношенні 65:25:10. Після змішування зразки інкубували в термоміксері протягом 10 хвилин при 70 "С. Розчини зразків вносили на 4-12 95 Вібв-Тгіз гель (МИРАСЕТМ Вівігі5, Іпмігодеп). На гель наносили зразок маркера (10 мкл) М12 (Іпмігодеп). Електрофорез у гелях проводили при 200 В протягом 50 хвилин, із застосуванням ХСЕЇ ЇЇ ЗигеоскК, з 600 мл розбавленого в 20 разів ДСН буфера в зовнішній буферній камері й 200 мл розбавленого в 20 разів ДСН буфера, що містить 0,5 мл антиоксиданту (МИРАСЕТ"М Іпмігодеп), у внутрішній буферній камері. Після електрофореза гель двічі промивали демінералізованою водою, фіксували гелі розчином 50 95 метанолу/7 905 оцтової кислоти протягом 1 години, і фарбували Зурго Кибу (50 мл на гель) протягом ночі. Зображення одержували із застосуванням Турпооп 9200 (610 ВР 30, Зелений (532 нм), РМТ бОО0М, 100 мікрон) після відмивання гелю водою МИШО).
Кількісний аналіз білка
Із застосуванням сканера Турпооп визначали співвідношення між білковими смугами доріжки із застосуванням стандартних способів, відомих у даній галузі техніки. Зразок наносили в трьох повторностях, і рівень яскравості визначали із застосуванням програми Ітаде Опцапі.
Значення виражали у вигляді процентної кількості білка відносно загального білка, при розрахунках із застосуванням рівня яскравості вибраної білкової смуги відносно загального рівня яскравості всіх білкових смуг.
Розрахунки перетворення глюканів:
Перетворення глюканів (95) хх (глюкоза (г/л) х 100 Фв)/ (глюкан (фракція за сухою речовиною) х СР (г/кг) х 1,1); де:
Глюкоза (г/л) - концентрація глюкози в надосадовій рідині після гідролізу.
Глюкан (фракція за СР) - вміст глюкану в субстраті перед попередньою обробкою.
СР (г/кг) - вміст сухої речовини при гідролізі (наприклад, 20 95 СР - 200 г/кг). 1,1 - збільшення маси через вбудовування води при гідролізі.
Зразок розрахунку:
Глюкоза - 60 г/л
Глюканова фракція - 0,40 (40 95 за сухою речовиною)
СР - 200 г/кг
Приклад перетворення глюкану - (607100) / (0,4 х 200 х 1,1) - 68 95 перетворення 60 Приклад 1
Оцінка впливу відсутності кисню під час гідролізу на целюлолітичну активність целюлазного ферментного коктейлю
Вплив відсутності кисню під час гідролізу на целюлолітичну активність ферментного коктейлю оцінювали відповідно до процедур, описаних нижче. Реакції гідролізу проводили з попередньо обробленим кислотою сировинним матеріалом з кукурудзяної соломи (кККС) при кінцевій концентрації 10 мас.9о СР. Цей розчин сировинного матеріалу готували шляхом розбавлення концентрованого розчину сировинного матеріалу водою. Потім доводили рН до 4,5 з 4М розчином Маон. Видалення кисню із сировинного матеріалу здійснювали у два етапи. По- перше, розчин сировинного матеріалу дегазували із застосуванням ультразвуку під вакуумом на ультразвуковій бані (Вгапзопіс 5510Е-ОТН, установка: Оедах) протягом 15 хвилин. На другому етапі кисень додатково видаляли за допомогою безперервного продування потоком азоту через 500 мл розчин 10 95 СР сировинного матеріалу протягом З годин. Перед продуванням розчину сировинного матеріалу потік азоту пропускали крізь воду для насичення водяною парою й запобігання випаровування води з розчину сировинного матеріалу. Паралельно 500 мл тієї ж самої серії 10 мас. 96 СР кККС продували повітрям як контрольний зразк, який містить кисень, за подібних умов відповідно до того ж протоколу.
Гідроліз із видаленням кисню (продуванням азотом) і насиченням киснем (продуванням повітрям) в 10 мас. 95 розчинах сировинного матеріалу ККС проводили в герметичних 30 мл центрифужних флаконах (МаЇдепе Оакгідде) із загальним реакційним об'ємом 10 мл. Флакони, які вже містять розчин целюлази, використані для експерименту з виснаженням кисню, продували азотом до або під час заповнення їх сировинним матеріалом. Кожний гідроліз проводили у двох повторностях з 7,5 мг/г СР целюлазного ферментного коктейлю, що подається в загальному об'ємі не більше 375 мкл. ТЕС-210 ферментували відповідно до процедур інокуляції й ферментації, описаними в М/О2011/000949.
Центрифужні флакони, які містять розчин сировинного матеріалу й ферменту, поміщали в інкубаційну піч (піч для гібридизації Тесппе НВ-10)) та інкубували протягом 72 годин при 65 С при обертанні на точці установки З (12 об./хв.). Після гідролізу зразки охолоджували на кризі й негайно 50 мкл кожної надосадової рідини розбавляли в 1450 мкл води сорту І. Розбавлену надосадову рідину потім фільтрували (фільтр 0,45 мкм, Раї! РМ 454), і у фільтратах аналізували
Зо вміст цукру, як описано нижче.
Концентрації цукру в розбавлених зразках вимірювали із застосуванням ВЕРХ, оснащеної колонкою Атіпех НРХ-87Р (Віогаа 41250098) шляхом елюції водою при 85 "С і швидкості потоку 0,6 мл/хв., проводячи кількісний аналіз шляхом інтеграції глюкозних сигналів при детекції коефіцієнта заломлення (КЗ), з калібруванням стандартними розчинами глюкози.
Дані, представлені в Таблиці 1/фігурі 1, показують, що кількість глюкози, яка вивільнилася із сировинного матеріалу при продуванні азотом, менша від кількості глюкози, яка вивільнився із сировинного матеріалу при продуванні повітрям.
На основі цих результатів ми зробили висновок, що присутність кисню поліпшує целюлолітичну продуктивність целюлазних сумішей.
Таблиця 1
Вплив продування азотом або повітрям крізь 10 95 кКС сировинний матеріал перед гідролізом на загальну кількість вивільненої глюкози коктейль
ТЕС2о | 77777355... 108 ї17771717171717171717171113191111111
Приклад 2
Вплив кисню на целюлолітичну активність целюлазного ферментного коктейлю при гідролізі лігноцелюлозного сировинного матеріалу
У цьому прикладі показаний вплив кисню на целюлолітичну активність ферментного коктейлю при гідролізі лігноцелюлозного сировинного матеріалу. Реакції гідролізу проводили з попередньо обробленим кислотою сировинним матеріалом з кукурудзяної соломи (кККС) при кінцевій концентрації 20 мас. 95 СР. Цей розчин сировинного матеріалу готували за допомогою розбавлення концентрованого розчину сировинного матеріалу водою. Потім доводили рН до 4,5 з 10 мас. 95 розчином МНАОН.
Гідроліз проводили в реакторі з перемішуванням, з контролем рн і температури, з робочим об'ємом 1 літр. Кожний гідроліз проводили у двох повторностях з 2,5 мг/г СР целюлазного ферментного коктейлю ТЕС-210. ТЕС-210 одержували відповідно до процедур інокуляції й ферментації, описаних в М/О2011/000949.
Проводили наступні експерименти: 1.1 літр 20 95 кКС, рН 4,5, температура 62 "С, швидкість мішалки 60 об./хв. (це відповідає рівню РК «0,002 моль кисню на му), 2,5 мг/г СР целюлазного коктейлю ТЕС-210, час інкубації 120 годин (контрольний експеримент). 2. Як в експерименті 1, але на початку гідролізу продування повітрям розчину починали до рівня розчиненого кисню 20 95 (це відповідає 0,03 моль кисню на му, при вимірюванні із застосуванням електрода РК (розчиненого кисню)). Цей рівень розчиненого кисню підтримували протягом решти процесу гідролізу.
З. Як в експерименті 1, але на 72 годину починали продування повітрям до рівня розчиненого кисню 2095 (це відповідає 0,03 моль кисню на м3, при вимірюванні із застосуванням електрода РК (розчиненого кисню)). Цей рівень розчиненого кисню підтримували протягом решти процесу гідролізу.
Після гідролізу зразки охолоджували на кризі й негайно 50 мкл кожної надосадової рідини розбавляли в 1450 мкл води ступеня очищення І. Розбавлену надосадову рідину потім фільтрували (фільтр 0,45 мкм, Раї! РМ 454), і у фільтратах аналізували вміст цукру, як описано нижче.
Концентрації цукру в розбавлених зразках вимірювали за допомогою ВЕРХ, оснащеною колонкою Атіпех НРХ-87Р (Віогаа 41250098) шляхом елюції водою при 85 "С і швидкості потоку 0,6 мл/хв., проводячи кількісний аналіз шляхом інтеграції глюкозних сигналів при детекції коефіцієнта заломлення (КЗ), з калібруванням стандартними розчинами глюкози.
Результати, показані на Фігурі 2, ясно демонструють підвищення продукції глюкози у випадку додавання повітря. Крім того, при додаванні повітря в реакцію гідролізу в другій частині часу відзначається переважаюча концентрація глюкози, у порівнянні з відсутністю додавання повітря, або додаванням повітря протягом всього гідролізу.
Приклад З
Вплив часткової аерації (за часом) на ферментативний гідроліз лігноцелюлозного сировинного матеріалу в пілотному масштабі
Зо У цьому прикладі показаний вплив концентрації розчиненого кисню на целюлолітичну активність ферментного коктейлю або композиції при гідролізі лігноцелюлозного сировинного матеріалу в пілотному масштабі. Реакції гідролізу проводили з попередньо обробленим кислотою сировинним матеріалом з кукурудзяної соломи (ККС) при кінцевій концентрації 17,1 мас.бо СР. Цей розчин сировинного матеріалу готували за допомогою розбавлення концентрованої суспензії сировинного матеріалу водою. Доводили рН до 4,5 з 25 маб. Фо розчином МНАОН.
Ферментативний гідроліз проводили в 270 л реакторі пілотного масштабу при контролі рН і температури в робочому об'ємі 150 літрів. Розчинений кисень під час процесу контролювали шляхом регуляції швидкості мішалки при певному потоці повітря й надлишковому тиску.
Ферментативний гідроліз проводили з дозуванням 2,5 мг (ТХО білка)/г СР ТЕС-210 целюлазного ферментного коктейлю. ТЕС-210 одержували відповідно до процедур інокуляції й ферментації, описаними в М/О2011/000949.
Проводили наступні експерименти.
Експеримент 1
Аерація від 0 до 120 годин: 150 л 17,1 кКС, рН 4,5, температура 62 "С, надлишковий тиск 1 бар, потік повітря 10 кг/год. у вільній просторі, 2,5 мг ТСА/г СР ТЕС-210 целюлазного коктейлю, час інкубації 120 годин в 270 л реакторі пілотного масштабу. Концентрацію розчиненого кисню (РК) реакційної суміші вимірювали постійно із застосуванням РК електрода. РК контролювали на рівні 0,15-0,22 моль/м" шляхом регуляції швидкості мішалки.
Експеримент 2
Аерація від 72 до 120 годин: 150 л 17,1 кКС, рН 4,5, температура 62 "С, дозування ферменту 2,5 мг ТХО/г СР ТЕС-210 целюлазного коктейлю, загальний час інкубації 120 годин в 270 л реакторі пілотного масштабу. Концентрацію розчиненого кисню (РК) реакційної суміші вимірювали постійно із застосуванням РК електрода. Протягом перших 72 годин процесу застосовували наступні установки: без надлишкового тиску, без потоку повітря у вільному просторі, і контролювали РК на рівні 0,02-0,05 моль/м3 шляхом регуляції швидкості мішалки.
Протягом останніх 48 годин процесу застосовували наступні установки: надлишковий тиск 1 бар, потік повітря у вільному просторі 10 кг/год., і контролювали РК на рівні 0,15-0,22 моль/м3 шляхом регуляції швидкості мішалки.
Під час ферментативного гідролізу зразки відбирали щодня для аналізу вуглеводів (глюкози, целобіози) шляхом ЯМР, і аналізу в'язкості й рн.
Аналіз складу попередньо обробленої кукурудзяної соломи проводили шляхом хімічного гідролізу зразка й визначення моносахаридів за допомогою ЯМР.
Зразки, узяті під час ферментативного гідролізу, аналізували на вміст (оліго)цукрів, органічних кислот і інгібіторів за допомогою проточного ЯМР.
Результати представлено на фігурі 4 і показують, що під час ферментативного гідролізу в експерименті 2 із частковим аераціям (о - аерація під час гідролізу від 72 до 120 годин) виробляється більше глюкози, ніж під час ферментативного гідролізу в експерименті 1 (ш - аерація під час гідролізу від О до 120 годин).
Приклад 4
Вплив часу подачі розчиненого кисню на ферментативний гідроліз лігноцелюлозного сировинного матеріалу
У цьому прикладі показаний вплив часу подачі розчиненого кисню на ферментативний гідроліз лігноцелюлозного сировинного матеріалу. Реакції гідролізу проводили з попередньо обробленим кислотою сировинним матеріалом з кукурудзяної соломи (кКС) при кінцевій концентрації 20 мас. СР. Розчин сировинного матеріалу готували шляхом розбавлення концентрованої суспензії сировинного матеріалу водою. Доводили рН до 4,5 з 2,5 маб. Фо розчином МНАОН.
Ферментативний гідроліз проводили в 2 літровому реакторі з контрольованим рН і температурою, з робочим об'ємом 1 літр. Розчинений кисень під час процесу контролювали шляхом регуляції швидкості мішалки й постійного відновлення вільного простору свіжим повітрям у випадку підвищення концентрації розчиненого кисню. Ферментативний гідроліз проводили при дозуванні 1,5 мг (ТХО білка)у/г СР ТЕС-210 целюлазного ферментного коктейлю.
ТЕС-210 одержували відповідно до процедур інокуляції й ферментації, описаними в
МО2011/000949.
Проводили наступні експерименти.
Експеримент 1. Аерація від 0 до 7 годин: 1 літр 20 95 кКС, рН 4,5, температура 62 "С, 1,5 мг
ТХО/г СР целюлазного коктейлю ТЕС-210, час інкубації 120 годин. Концентрацію розчиненого
Зо кисню (РК) реакційної суміші вимірювали постійно із застосуванням РК електрода. РК контролювали на рівні 20,05 моль/м" під час перших 7 годин процесу гідролізу. Від 7 до 120 годин часу гідролізу РК підтримували на рівні «0,02 моль/м3.
Експеримент 2. Аерація від 72 до 120 годин: 1 літр 20 95 кКС, рН 4,5, температура 62 "С, 1,5 мг ТХО/г СР целюлазного коктейлю ТЕС-210, час інкубації 120 годин. Концентрацію розчиненого кисню (РК) реакційної суміші вимірювали постійно із застосуванням РК електрода.
РК контролювали на рівні «0,01 моль/м7 під час перших 72 годин процесу гідролізу. Від 72 до 120 годин часу гідролізу РК підтримували на рівні »0,05 моль/м3.
Під час ферментативного гідролізу зразки відбирали щодня для аналізу вуглеводів (глюкози, целобіози) шляхом ЯМР, і аналізу в'язкості й рН.
Аналіз складу попередньо обробленої кукурудзяної соломи проводили шляхом хімічного гідролізу зразка й визначення моносахаридів за допомогою ЯМР.
Результати представлено на Фігурі 5, і ясно демонструють підвищення швидкості утворення глюкози при аерації реакційної суміші. Експеримент 1, у якому проводили аерацію від 0 до 7 години, ясно показав підвищення швидкості утворення глюкози протягом перших 7 годин процесу, у порівнянні з відсутністю аерації під час фази процесу з Експерименту 2. Крім того,
Експеримент 2 показує підвищення швидкості утворення глюкози від 72 до 120 годин, у порівнянні з відсутністю аерації під час цього періоду в Експерименті 1.
Приклад 5
Вплив часу подачі розчиненого кисню на ферментативний гідроліз лігноцелюлозного сировинного матеріалу
Попередньо оброблену розбавленою кислотою кукурудзяну солому зі вмістом сухої речовини 20 мас. 95 гідролізували в реакторі з робочим об'ємом 20 м: і вільним простором 2 м3 (діаметр реактора 2,5 м, висота реактора 4,5 м). Змішування в реакторі здійснювали за допомогою газу, який рециркулює з вільного простору до розподільника на дні реактора з потоком газу 100 мз/годину. Потік газу забезпечували компресором із застосуванням підведеної потужності 50 Вт/м3. Гідроліз проводили з 2,5 мг/г СР ТЕС-210 целюлазного ферментного коктейлю. Протягом 120 годин у реакторі здійснювали гідроліз целюлози при 62 С, і формувалося приблизно 1 г/л глюконової кислоти. 1 г/л глюконової кислоти в даному реакторі відповідає приблизно 20 кг глюконової кислоти або 102 моль або 0,85 моль/годину у випадку часу процесу 120 годин. Потребу в кисні можна задовольнити шляхом подачі повітря зі швидкістю 90 л/годину.
Потік рециркулюючого повітря 100 мзЗ/годину набагато вище від кількості поданого свіжого повітря 90 л/годину, так що свіже повітря, що вводиться, розбавляється приблизно в 1000 разів.
Розбавлене (свіже) повітря рециркулює крізь гідролізат, забезпечуючи перенесення і споживання всього кисню.
Вихідний потік газу відповідає вхідному потоку газу (мінус спожитий кисень). Вміст кисню в потоці газу не перевищує 0,01 моль/м3, що підтримує низьку концентрацію кисню в гідролізаті, і в той же саме час транспортується точно необхідна кількість повітря. Таким способом можна додавати дуже маленькі кількості кисню в систему, і рівень кисню можна контролювати дуже точно, навіть за дуже низьких концентрацій кисню.
Приклад 6
Вплив кількості повітря на гідроліз глюкану в лігноцелюлозному сировинному матеріалі
Ферментативний гідроліз проводили із застосуванням попередньо обробленого кислотою сировинного матеріалу з кукурудзяної соломи (кККС) при концентрації 20 мас. 9о сухої речовини (СР). Розчин сировинного матеріалу готували шляхом розбавлення концентрованої суспензії сировинного матеріалу водою. Доводили рН до 4,5 з 25 мас.95 розчином МНАОН.
Ферментативний гідроліз проводили в масштабі 1 кг із застосуванням 1,5 літрового реактора.
Підтримували рн 4,5 і температуру 62 "С. Розчинений кисень під час процесу контролювали за допомогою рециркуляції газу у вільному просторі й додавання свіжого повітря (що містить 20- 21 95 кисню).
Перед додаванням ферменту забезпечували рециркуляцію газу у вільному просторі при потоці газу З л/годину із застосуванням перистальтичного насоса й розподільника. Завдяки тому, що сировинний матеріал споживає кисень за допомогою хімічної реакції, рівень РК досягав 0 95 РК у межах однієї години, забезпечуючи анаеробний сировинний матеріал й повне виснаження кисню у вільному просторі. Отриманий інертний газ у вільному просторі (вільний від кисню) використовували під час усього гідролізу як газ-носій для свіжого повітря, що вводиться.
Потім целюлазний ферментний коктейль ТЕС-210 додавали до сировинного матеріалу в дозі 3,75 мг (ТХО білка) СР. ТЕС-210 одержували відповідно до процедур інокуляції й
Зо ферментації, описаними в УМО2011/000949. Загальний час гідролізу склав 120 годин.
Свіже повітря вводили в рециркуляційну лінію інертного газу вільного простору протягом усього процесу гідролізу з потоком свіжого повітря 0 - З - 6 - 12 - 24 або 48 мл на кг реакційної суміші на годину, відповідно, починаючи відразу після додавання ферменту. РК вимірювали постійно у всіх експериментах. Зразки відбирали на початку й наприкінці експерименту для аналізу глюкози за допомогою ВЕРХ.
Паралельний експеримент проводили у флаконі, що струшується, для визначення максимального рівня гідролізу глюканів. Цей максимальний гідроліз визначали шляхом інкубації сировинного матеріалу з дуже високим дозуванням ферменту (50 мг (ТХО білка)/г СР) за схожих умов (рН, температура й СР) при надлишку кисневмісного повітря вільного простору.
Визначення РК у кожному експерименті постійно показувало 0,0 96 РК. Це можна пояснити прямим споживанням кисню після його перенесення з потоку кисневмісного рециркулюючого газу в рідку фазу в реакторі.
Результати представлені в Таблиці 2 ясно демонструють кореляцію між підвищенням утворення глюкози й підвищенням уведення кисневмісного свіжого повітря.
Таблиця 2
Вплив додавання свіжого повітря (кисню) на ферментативний гідроліз лігіноцелюлозного сировинного матеріалу, визначений за продукцією глюкози
Потіксвіжогоповітря (мл/кглодина) | 0 | 3 | 6 | 712 | 24 | 48
Глюкоза (у г/л) на початку (1-0 год.)
Глюкоза (у г/л) наприкінці (-120 год.)

Claims (23)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб одержання цукрового продукту з лігноцелюлозного матеріалу, який включає стадію (с) ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу в гідролітичному реакторі із застосуванням ферментної композиції, яка містить щонайменше дві целюлази, з отриманням цукрового продукту; і де під час ферментативного гідролізу газ, який містить кисень, подають у лігноцелюлозний матеріал у гідролітичному реакторі, де частина газу, який містить кисень, доданого до лігноцелюлозного матеріалу, є газом, джерелом походження якого є вільний простір реактора; де рівень розчиненого кисню в ході процесу контролюють рециркуляцією газу з вільного простору реактора і введенням газу, який містить кисень, в реактор для гідролізу.
2. Спосіб одержання продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу, який включає стадії: (с) ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу в гідролітичному реакторі із застосуванням ферментної композиції, яка містить щонайменше дві целюлази з отриманням цукрового продукту; і (4) ферментації гідролізованого лігноцелюлозного матеріалу для одержання продукту ферментації; і де під час ферментативного гідролізу газ, який містить кисень, подають у лігноцелюлозний матеріал у гідролітичному реакторі, де частина газу, який містить кисень, доданого до лігноцелюлозного матеріалу, є газом, джерелом походження якого є вільний простір реактора, де рівень розчиненого кисню в ході процесу контролюють рециркуляцією газу з вільного простору реактора і введенням газу, який містить кисень в реактор для гідролізу.
3. Спосіб за будь-яким з пп. 1-2, який також включає стадію: (а) попередньої обробки лігноцелюлозного матеріалу.
4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-2, який також включає стадію: (б) промивання лігноцелюлозного матеріалу.
5. Спосіб за п. 3, який також включає стадію: (р) промивання підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу.
6. Спосіб за будь-яким з пп. 1, 3-5, який також включає стадію: Зо (а) вилучення цукрового продукту.
7. Спосіб за будь-яким з пп. 2-5, який також включає стадію: (є) вилучення продукту ферментації.
8. Спосіб за будь-яким з пп.1-7, в якому протягом частини часу ферментативного гідролізу в лігноцелюлозний матеріал подають менше кисню, у порівнянні з іншою частиною часу ферментативного гідролізу, або протягом частини часу ферментативного гідролізу кисень в лігноцелюлозний матеріал не додають.
9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що частина часу, протягом якої подають менше, або бажано не подають кисень, становить від 10 до 80 95, переважно від 20 до 80 95, краще від 30 до 80 95 і найкраще від 40 до 80 95 від загального часу ферментативного гідролізу.
10. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що інша частина часу, протягом якої подають більше кисню, становить від 2 до 80 95, переважно від 4 до 60 95, краще від 8 до 50 95, найкраще від 10 до 50 95 від загального часу ферментативного гідролізу.
11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що інша частина часу, протягом якої подають більше кисню, становить: (а) від 12 до 50 95, переважно від 20 до 40 9о, якщо кисень подають у другу половину часу ферментативного гідролізу; (Б) від 2 до 30 95, переважно від 4 до 25 95, краще від 5 до 20 95 від загального часу ферментативного гідролізу, якщо кисень подають у першу половину часу ферментативного гідролізу.
12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що кисень подають у формі бульбашок.
13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, який відрізняється тим, що ферментативний гідроліз здійснюють в реакторі об'ємом 1 му або більше.
14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, який відрізняється тим, що гідроліз проводять при температурі 45 "С або більше, переважно при температурі 50 "С або більше, краще при температурі 55 "С або більше.
15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, який відрізняється тим, що ферментну композицію отримують із грибів, переважно мікроорганізму з роду Назатвопіа, або ферментна композиція містить фермент грибів, переважно фермент із Назатвопіа.
16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-15, який відрізняється тим, що вміст сухої речовини на стадії гідролізу (с) становить 10 мас. 95 або більше, переважно 14 мас. 95 або більше, краще від 14 до 33 мас. Фо.
17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-16, який відрізняється тим, що ферментативний гідроліз проводять у реакторі для періодичного культивування, періодичного культивування з підживленням і/або безперервного культивування.
18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, який відрізняється тим, що кисень вводять у вигляді газу, який містить кисень, такого як повітря.
19. Спосіб за будь-яким з пп. 2-18, який відрізняється тим, що ферментацію проводять із мікроорганізмом, здатним до ферментації щонайменше одного С5 цукру.
20. Обладнання, для здійснення способу за будь-яким з пп. 1-19, яке включає: (а) реактор або корпус реактора об'ємом щонайменше 1 м3, що має засоби для введення газу, для введення газу в реактор; (с) газовий насос для введення газу в реактор; (4) рециркуляційний трубопровід для рециркуляції газу з вільного простору реактора; (є) випускну систему для видалення газу з реактора; (Ї) засіб для підведення газу для введення свіжого газу в реактор; (9) засіб для контролю співвідношення між рециркулюючим газом і свіжим газом.
21. Обладнання за п. 20, яке відрізняється тим, що засобом для введення газу в реактор є розподільник газу.
22. Обладнання за будь-яким з пп. 20-21, яке також містить: (р) засіб для перемішування вмісту реактора.
23. Обладнання за будь-яким з пп 20-22, яке відрізняється тим, що засобом для контролю співвідношення між рециркулюючим газом і свіжим газом (9) є клапан. 4 тура ординат чнт няно АНХ нка Кн УК АД АТ КАК яна ж ххкннна чання 1 ГІПОВІТряЯ в оазсет ха ин а и п а и дет
! п. пиши 0 ше нин нн 0 ше З п А: АННИ
Фіг. 1 І
UAA201611072A 2014-04-03 2015-01-29 Способи одержання цукрового продукту і продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу та обладнання для їх здійснення UA119867C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14163359 2014-04-03
EP14166545 2014-04-30
EP14166539 2014-04-30
PCT/EP2015/051839 WO2015075277A1 (en) 2014-04-03 2015-01-29 Process and apparatus for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119867C2 true UA119867C2 (uk) 2019-08-27

Family

ID=52469809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201611072A UA119867C2 (uk) 2014-04-03 2015-01-29 Способи одержання цукрового продукту і продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу та обладнання для їх здійснення

Country Status (13)

Country Link
US (2) US10087475B2 (uk)
EP (1) EP3126510A1 (uk)
JP (1) JP2017512467A (uk)
KR (1) KR20160143714A (uk)
CN (1) CN106164284A (uk)
AU (1) AU2015202952B2 (uk)
BR (1) BR112016021866A2 (uk)
CA (1) CA2942989A1 (uk)
EA (1) EA031865B1 (uk)
MX (1) MX2016012798A (uk)
MY (1) MY171571A (uk)
UA (1) UA119867C2 (uk)
WO (1) WO2015075277A1 (uk)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2888332C (en) 2012-11-09 2021-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EA032496B1 (ru) 2012-11-09 2019-06-28 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров
CN106164284A (zh) 2014-04-03 2016-11-23 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于木质纤维素材料的酶促水解和糖的发酵的方法和设备
EP3137619B1 (en) * 2014-04-30 2023-12-27 Versalis S.p.A. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016096971A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CA3215759A1 (en) 2015-11-24 2017-06-01 Poet Research, Inc. Using dissolved oxygen to inhibit lactic acid production during propagation of yeast and/or hydrolysis of lignocellulosic biomass
CN105567567A (zh) * 2016-02-03 2016-05-11 程雪娇 一种甘蔗渣培养基及其制备方法
WO2017201233A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Poet Research, Inc. Methods of removing one or more compounds from a lignocellulosic hydrolysate via gas stripping, and related systems
WO2018185071A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
GB201705768D0 (en) * 2017-04-10 2017-05-24 Kanu Ifeyinwa Rita Anaerobic digester
BR112020009540A2 (pt) 2017-11-16 2020-11-03 Poet Research, Inc. métodos para propagar micro-organismos para fermentação e métodos e sistemas relacionados
BR112020023198A2 (pt) * 2018-05-17 2021-02-09 Dsm Ip Assets B.V. processo para produção de um polipeptídeo
US11306113B2 (en) * 2019-11-13 2022-04-19 American Process International LLC Process for the production of cellulose, lignocellulosic sugars, lignosulfonate, and ethanol
US11118017B2 (en) 2019-11-13 2021-09-14 American Process International LLC Process for the production of bioproducts from lignocellulosic material
CN112401054A (zh) * 2020-11-18 2021-02-26 咸阳生物制造产业技术研究院 一种木质纤维素原料连续化处理方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3105581C2 (de) * 1981-02-16 1985-05-15 Otto Dr. 2300 Kiel Moebus Verfahren zur Fermentation von Kohlenhydraten unter Erzeugung von Äthanol und Biomasse
DE60136267D1 (de) * 2000-02-17 2008-12-04 Biogasol Ipr Aps Methode zur behandlung von lignin- und zellulosehaltigen stoffen
WO2002096833A2 (en) * 2001-05-25 2002-12-05 Bp Exploration Operating Company Limited Fischer-tropsch process
IES20060090A2 (en) 2006-02-10 2007-06-13 Nat Univ Ireland Talaromyces emersonii enzyme systems
US8968515B2 (en) * 2006-05-01 2015-03-03 Board Of Trustees Of Michigan State University Methods for pretreating biomass
WO2008008793A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Dyadic International Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
US8980599B2 (en) 2007-08-02 2015-03-17 Iogen Energy Corporation Method for the production of alcohol from a pretreated lignocellulosic feedstock
US20090098617A1 (en) 2007-10-10 2009-04-16 Murray Burke Enzymatic treatment under vacuum of lignocellulosic materials
MX2010004518A (es) * 2007-10-25 2010-07-29 Landmark Structures I Lp Sistema y metodo para la digestion anaerobica de biomasas.
CN102325889A (zh) 2008-12-19 2012-01-18 诺维信股份有限公司 增加纤维素材料水解的方法
CN102459582B (zh) 2009-05-29 2014-09-03 诺维信股份有限公司 用于增强纤维素材料降解或转化的方法
AU2010267983A1 (en) 2009-07-03 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Talaromyces strains and enzyme compositions
CN107435058A (zh) * 2010-08-06 2017-12-05 诺维信公司 降解或水解多糖的方法
WO2012061517A1 (en) 2010-11-02 2012-05-10 Novozymes, Inc. Methods of pretreating cellulosic material with a gh61 polypeptide
DK2748317T3 (en) 2011-08-22 2017-07-17 Codexis Inc GH61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance GH61 activity
WO2014072392A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EA032496B1 (ru) * 2012-11-09 2019-06-28 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров
US10407704B2 (en) 2013-02-21 2019-09-10 Novozymes A/S Methods of saccharifying and fermenting a cellulosic material
CN106164284A (zh) 2014-04-03 2016-11-23 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于木质纤维素材料的酶促水解和糖的发酵的方法和设备

Also Published As

Publication number Publication date
MY171571A (en) 2019-10-21
US20190345525A1 (en) 2019-11-14
KR20160143714A (ko) 2016-12-14
CA2942989A1 (en) 2015-05-28
BR112016021866A2 (pt) 2018-07-03
EA201691992A1 (ru) 2017-02-28
US20170183698A1 (en) 2017-06-29
CN106164284A (zh) 2016-11-23
EP3126510A1 (en) 2017-02-08
US10087475B2 (en) 2018-10-02
JP2017512467A (ja) 2017-05-25
EA031865B1 (ru) 2019-03-29
MX2016012798A (es) 2016-12-09
AU2015202952A1 (en) 2016-09-29
AU2015202952B2 (en) 2018-11-08
WO2015075277A1 (en) 2015-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11773420B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11427844B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
UA119867C2 (uk) Способи одержання цукрового продукту і продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу та обладнання для їх здійснення
ES2761448T3 (es) Procedimiento para hidrólisis enzimática de material lignocelulósico con adición de oxígeno
EA041359B1 (ru) Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров