CN108179139A - 纤维素分解酶组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生纤维素分解酶组合物的重组丝状真菌宿主细胞，以及产生和使用所述组合物的方法。

Description

纤维素分解酶组合物及其用途
本发明是基于申请日为2012年8月23日，申请号为“201280052443.4”(国际申请号为PCT/US2012/052163)，发明名称为“纤维素分解酶组合物及其用途”的专利申请的分案申请。
对于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
该发明是在由能源部授予的Cooperative Agreement DE-FC36-08GO18080下以政府支持完成的。政府在该发明中具有一定权利。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及产生纤维素分解酶组合物，产生所述纤维素分解酶组合物的的丝状真菌宿主细胞，以及产生和使用所述组合物的方法。
相关技术的描述
纤维素是葡萄糖通过β-1,4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，可以理想地避免燃烧或填埋材料，以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。
WO 2011/057140公开了一种烟曲霉纤维二糖水解酶I及其基因。WO 2011/057140公开了一种烟曲霉纤维二糖水解酶II及其基因。WO 2005/047499公开了一种烟曲霉β-葡糖苷酶及其基因。WO 2006/078256公开了烟曲霉GH10木聚糖酶。WO 2011/057140公开了一种烟曲霉β-木糖苷酶及其基因。WO 2011/041397公开了具有纤维素分解增强活性的青霉属种(Penicilllium sp.)GH61多肽及其基因。
在本领域中，需要新的纤维素分解酶组合，其可更有效地分解纤维素材料。
本发明提供了纤维素分解酶组合物，和产生和使用所述组合物的方法。
发明内容
本发明涉及酶组合物，其包含(i)烟曲霉(Aspergillus fumigatus)纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。
本发明亦涉及重组丝状真菌宿主细胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。
本发明亦涉及产生酶组合物的方法，其包括：(a)在有助于产生所述酶组合物的条件下培养本发明的丝状真菌宿主细胞；和任选地(b)回收所述酶组合物。
本发明亦涉及用于降解纤维素材料的工艺，其包括用本发明的酶组合物处理所述纤维素材料。
本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)用本发明的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
本发明进一步涉及发酵纤维素材料的工艺，其包括用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料经本发明的酶组合物糖化。
附图说明
图1显示质粒pJfyS139的限制性酶切图。
图2显示质粒pJfyS142的限制性酶切图。
图3显示质粒pJfyS144的限制性酶切图。
图4显示质粒pDM286的限制性酶切图。
图5显示质粒pDFng113-3的限制性酶切图。
图6显示质粒pSMai139的限制性酶切图。
图7显示质粒pSMai143的限制性酶切图。
图8显示质粒pSMai229的限制性酶切图。
图9显示质粒pAG57的限制性酶切图。
图10显示质粒pDFng124-1的限制性酶切图。
图11显示质粒pSaMe-AFGH10的限制性酶切图。
图12显示包含烟曲霉纤维二糖水解酶I；烟曲霉纤维二糖水解酶II；烟曲霉β-葡糖苷酶变体；具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽，烟曲霉木聚糖酶，和烟曲霉β-木糖苷酶的酶组合物(“酶组合物#1”)与包含棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)GH10木聚糖酶和里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶制备物(含有烟曲霉β-葡糖苷酶和桔橙(Thermoascus aurantiacus)嗜热子囊菌GH61A多肽))的共混物的酶组合物(“酶组合物#2”)对经预处理的玉米秸秆(PCS)的百分比转化率的比较。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01％TWEENTM 20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种(例如几种)可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，40℃每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
天冬氨酸蛋白酶：术语“天冬氨酸蛋白酶”意指使用天冬氨酸残基催化肽和蛋白中肽键的水解的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，其使用天冬氨酸残基来催化水解其酶底物。一般而言，其在活性位点具有两个高度保守的天冬氨酸，并在酸性pH具有最适活性(Szecsi,1992,Scand.J.Clin.Lab.In vest.Suppl.210:5–22)。就本发明而言，天冬氨酸蛋白酶活性根据由Aikawa等,2001,J.Biochem.129:791-794描述的方法确定。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷作为底物确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH 4.8，在含有0.01％20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH 5在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤包括剪接进行加工，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trends in Biotechnology15:160-167；Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why soefficient on crystalline cellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters 149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters 187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances 24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman 1号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman 1号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and AppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,PureAppl.Chem.59:257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解相比于未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃进行3-7日。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，形成具有多种多样的取代基的复杂分支结构。尽管纤维素通常是多形的，但存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook onBioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.；Wyman,1994,Bioresource Technology 50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25:695-719；Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion ofLignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume 65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，木素纤维素是一种植物细胞壁材料，包含木质素、纤维素和半纤维素的混合基质。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹子。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。
在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergentplant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，预处理使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码多肽的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外源的(即，来自不同基因)，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以配备用于引入特异性限制位点的接头，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances 24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH 5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶原先基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强木素纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH 5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
侧翼：术语“侧翼”意指在特定DNA序列、基因座或基因任一侧延伸的DNA序列。侧翼DNA紧密邻接着另一个DNA序列、基因座或基因，其即将整合入丝状真菌细胞的基因组。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽；其中所述片段酶活性。在一个方面，片段含有酶的成熟多肽的至少85％，例如至少90％或至少95％的氨基酸残基。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbialhemicellulases.Current Opinion In Microbiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的多变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃，或合适的pH，例如5.0或5.5进行测量。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
同源3’或5’区：术语“同源3’区”意指DNA片段，其与基因组中的区具有相同序列或具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性，且当与同源5’区组合时，可通过同源重组靶向整合一片DNA至基因组中的特定位点。术语“同源5’区”指DNA片段，其与基因组中的区具有相同序列，且当与同源3’区组合时，可通过同源重组靶向整合一片DNA至基因组中的特定位点。同源5’和3’区必须在基因组中相连，这意味着它们在同一染色体上，并彼此相距在200kb以内(within at least 200kb of one another)。
同源侧翼区：术语“同源侧翼区”意指DNA片段，其与基因组中的区相同或具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性，且位于紧接着胞外DNA靶向整合入的基因组中特定位点的上游或下游。
同源重复：术语“同源重复”意指在引入宿主细胞的重组DNA中重复至少两次的DNA片段，且其可通过同源重组协助DNA的丧失，即，将选择标志物插入两个同源重复之间。同源重复亦称为直接重复。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何适合于使用包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地与一种或多种或全部与其天然伴随的天然存在的成分脱离的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于自然界中所见的该物质而言经过了人工修饰的物质；或(4)任何通过相对于与其天然伴随的其他组分增加该物质的量(例如，在宿主细胞中重组产生；编码该物质的基因的多拷贝；使用比与编码该物质的基因天然伴随的启动子更强的启动子)而修饰的物质。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在50℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至26是信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering 10:1-6)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸27至532。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:4的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸20至454。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:6的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQID NO:6的氨基酸20至863。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:8的氨基酸1至25是信号肽的SignalP程序，青霉属种GH61多肽的成熟多肽是SEQID NO:8的氨基酸26至253。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:10的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:10的氨基酸17至364。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:12的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:12的氨基酸20至323。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:14的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶III的成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸20至397。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:16的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:20的氨基酸21至792。
在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:18的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸18至514。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:20的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:20的氨基酸19至471。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:22的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:22的氨基酸20至744。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:24的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:24的氨基酸20至229。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:26的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:26的氨基酸20至223。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:28的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶III的成熟多肽是SEQ ID NO:28的氨基酸17至347。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:30的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:30的氨基酸21至797。
在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至78编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,见上)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸79至1956或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:3的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸58至1700或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:5的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQID NO:5的核苷酸58至2580或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQID NO:7的核苷酸1至75编码信号肽的SignalP程序，青霉属种GH61多肽的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸76至832或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:9的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:9的核苷酸52至1145或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:11的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:11的核苷酸58至1400或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:13的核苷酸1至106编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶III的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:13的核苷酸107至1415或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:15的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-木糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:19的核苷酸61至2373或其cDNA序列。
在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:17的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:17的核苷酸52至1545或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:19的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:19的核苷酸55至1608或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:21的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:21的核苷酸58至2612或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:23的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQID NO:23的核苷酸58至749或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQID NO:25的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:25的核苷酸58至778或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:27的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶III的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:27的核苷酸49至1349或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:29的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-木糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:39的核苷酸61至2391或其cDNA序列。
中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在55℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
中等-高严格条件：术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在60℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不会存在于自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个(例如几个)调控序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下与对照水解相比较水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃，和pH，例如5.0或5.5历时1-7天，所述对照水解用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)进行。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选5.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选5.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有酶活性的片段。在一个方面，亚序列含有酶的成熟多肽编码序列的至少85％，例如至少90％，或至少95％的核苷酸。
枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶：术语“枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指与枯草杆菌蛋白酶具有类似的底物特异性的蛋白酶，其使用丝氨酸残基催化肽和蛋白中的肽键水解。枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(枯草蛋白酶)是丝氨酸蛋白酶，其表征为三个氨基酸天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体(triad)。这些催化性残基的排列与来自地衣芽孢杆菌的原型枯草杆菌蛋白酶相同(Siezen和Leunissen,1997,Protein Science 6:501-523)。枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性可使用100mM NaCl-100mM MOPS pH 7.0中的合成底物N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide，AAPF)(Bachem AG,Bubendorf,Switzerland)在50℃进行3小时然后测量405nm处的吸光度来确定。
靶向整合：术语“靶向整合”意指胞外DNA在限定的基因组基因座的稳定整合。
转化体：术语“转化体”意指摄取胞外DNA(外源、人工或修饰的)并表达其中含有的基因的细胞。
转化：术语“转化”意指将胞外DNA引入细胞，即，由通过细胞膜摄取并从其周围直接摄取，组入和表达外源遗传材料(外源DNA)导致的细胞的遗传改变。
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶：术语“胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指具有与胰蛋白酶类似的底物特异性的蛋白酶，其使用丝氨酸残基催化肽和蛋白中的肽键水解。就本发明而言，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性根据Dienes等,2007,Enzyme and MicrobialTechnology 40:1087-1094所述的步骤来确定。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在70℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在45℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的杂聚物，其由短的糖链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多种包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，后者包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖。参见，例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。
在本发明的工艺中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of the Science of Food和Agriculture 86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced bySchizophyllum commune,FEBS Letters 580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997,The beta-D-xylosidase of Trichodermareesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratory testing of methods for assay ofxylanase activity,Journal of Biotechnology 23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH 5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates,Anal.Biochem 47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
发明详述
本发明涉及酶组合物，其包含(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种(emersonii)GH61多肽；或其同源物。
在一个方面，所述重组木霉属宿主细胞进一步包含烟曲霉木聚糖酶，烟曲霉β-木糖苷酶，或其组合；或其同源物。
本发明的酶组合物在分解纤维素材料方面比由里氏木霉产生的纤维素分解酶组合物更加有效。
酶组合物
在本发明中可使用任何烟曲霉纤维二糖水解酶I，烟曲霉纤维二糖水解酶II，烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；具有纤维素分解增强活性的青霉属种(emersonii)GH61多肽，烟曲霉木聚糖酶，或烟曲霉β-木糖苷酶，或其同源物。
在一个方面，所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种(emersonii)GH61多肽或其同源物选自下组：(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ IDNO:8的成熟多肽；(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:9、SEQID NO:11或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:16的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
可利用SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14或16的多肽或其片段设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码酶的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少15，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
可从基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码酶的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15；(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)它们的全长互补链；或(iv)它们的亚序列。可使用例如X射线胶片(X-ray film)或其他任何本领域中已知的检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15，或其成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16的多肽，其成熟多肽，或其片段的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括从基因组分离DNA或cDNA，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。所述多核苷酸可为所述多核苷酸的多肽编码区的等位变体或种变体(species variant)。
可使用上述酶(或蛋白)的蛋白质工程改造的变体。
在一个方面，所述变体为烟曲霉β-葡糖苷酶变体。在另一个方面，所述烟曲霉β-葡糖苷酶变体在对应于SEQ ID NO:6的位置100、283、456、和512的一个或多个(几个)位置包含取代，其中所述变体具有β-葡糖苷酶活性。
在一个实施方案中，所述变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，所述变体与的成熟多肽SEQ ID NO:6具有至少80％，例如至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％序列同一性。
就本发明而言，使用公开于SEQ ID NO:6中的成熟多肽以确定在其它β-葡糖苷酶中对应的氨基酸残基。将其它β-葡糖苷酶的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO:6中的成熟多肽进行比对，并基于该比对，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)(如用EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物开放软件套件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，Trends Genet 16:276-277)的Needle程序执行，优选为5.0.0版或之后的版本)确定SEQ ID NO:6所公开的成熟多肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。使用的参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。在另一个β-葡糖苷酶中对应氨基酸残基的鉴定可通过使用数种计算机程序使用其各自的缺省参数进行的多个多肽序列的比对来确定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(根据log预期的多重序列比较，multiple sequence comparison by log-expectation；3.5版或之后的版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research 32:1792-1797)，MAFFT(6.857版或之后的版本；Katoh等,2005,Nucleic Acids Research 33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics 23:372-374；Katoh等,2009,Methods in Molecular Biology 537:39-64；Katoh and Toh,2010,Bioinformatics 26:1899-1900)和使用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或之后；Thompson等,1994,Nucleic Acids Research 22:4673-4680)。
对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别代表205和411位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。
在一个方面，变体包含在一个或多个(几个)对应于位置100、283、456、和512的位置的取代。在另一个方面，变体包含在对应于位置100、283、456、和512的任何两个位置的取代。在另一个方面，变体包含在对应于位置100、283、456、和512的任何三个位置的取代。在另一个方面，变体包含在对应于位置100、283、456、和512的每位置的取代在的取代.
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置100的位置的氨基酸被取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Asp。在另一个方面，S所述变体包含或组成为EQID NO:6的成熟多肽的取代F100D。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置283的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置283的位置的氨基酸被取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Gly。在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQID NO:6的成熟多肽的取代S283G。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置456的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置456的位置的氨基酸被取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Glu。在另一个方面，所述变体包含或组成为取代SEQ ID NO:6的成熟多肽的N456E。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置512的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置512的位置的氨基酸被取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Tyr。在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ IDNO:6的成熟多肽的取代F512Y。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100和283的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100和456的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100和512的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置283和456的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置283和512的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置456和512的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100，283，和456的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100，283，和512的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100，456，和512的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置283，456，和512的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100、283、456、和512的位置的取代，如上述的那些。
在另一个方面，变体包含或组成为一个或多个(几个)选自下组的取代：G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代F100D+S283G。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代F100D+N456E。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代F100D+F512Y。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代S283G+N456E。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代S283G+F512Y。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代N456E+F512Y。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代F100D+S283G+N456E。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代F100D+S283G+F512Y。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代F100D+N456E+F512Y。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代S283G+N456E+F512Y。
在另一个方面，变体包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽的取代F100D+S283G+N456E+F512Y。
所述变体可组成为720至863个氨基酸，例如720至739，740至to 759，760至779，780至799，800至819，820至839，和840至863个氨基酸。
所述变体可进一步包含在一个或多个(几个)其他位置的改变。
所述酶组合物可进一步包含一个或多个(例如几个)选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一个或多个(例如几个)选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶优选为一个或多个(例如几个)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶，和木糖苷酶。
一种或多种(例如几种)酶可为野生型蛋白，重组蛋白，或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如几种)酶可为细胞的天然蛋白，其可用作宿主细胞以重组表达酶组合物。
可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene 45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I；GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene 63:11-22，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II；GENBANKTM登录号M19373；SEQ ID NO:6)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,Molecular Microbiology 13:219-228；GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,NucleicAcids Research 18:5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene 90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
在一个方面，所述酶组合物进一步包含木霉属内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I对于宿主细胞是天然的。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I是SEQID NO:90的成熟多肽。
在另一个方面，所述酶组合物进一步包含木霉属内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉内切葡聚糖酶II.在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶II对于宿主细胞是天然的。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I是SEQ ID NO:92的成熟多肽。
所述组合物可依照本领域中已知的方法制备，并可为液体或干组合物的形式。所述组合物可依照本领域中已知的方法稳定化。
所述酶组合物亦可为发酵液制剂或细胞组合物。
术语“发酵液”用于本文中指由细胞发酵产生、不经历或仅经历最低限的回收和/或纯化的制备物。举例而言，当将微生物培养物生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成(例如由宿主细胞表达酶)，并分泌入细胞培养基时，产生发酵液。所述发酵液可含有在发酵终止时衍生的发酵材料的未分级或分级的内含物。通常而言，发酵液是未分级的，并包含用过的培养基和例如通过离心去除微生物细胞(例如丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎块。在一些实施方案中，所述发酵液含有用过的细胞培养基，胞外酶，和生活和/或非生活的微生物细胞。
在一个实施方案中，所述发酵液制剂和细胞组合物包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一个1-5碳的有机酸和/或其盐，而所述第二有机酸组分包含至少一个6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个具体实施方案中，所述第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两个或更多个的混合物，而所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基缬草酸、苯乙酸、其盐，或前述两个或更多个的混合物。
在一个方面，所述组合物含有有机酸，并任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎块。在一个实施方案中，从细胞杀灭的全培养液中移除所述杀灭的细胞和/或细胞碎块以提供不含这些组分的组合物。
所述发酵液制剂或细胞组合物可进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾和其它本领域中已知的。
所述细胞杀灭的全培养液或组合物可含有在发酵终止时衍生的发酵材料的未分级内含物。通常而言，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基和在将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎块。在一些实施方案中，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基，胞外酶，和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施方案中，在细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞可使用本领域中已知的方法渗透和/或裂解。
如本文中所述的全培养液或细胞组合物通常为液体，但可含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎块、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方案中，可去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液制剂和细胞组合物可通过WO 90/15861或WO 2010/096673中描述的方法来产生。
宿主细胞
本发明亦涉及重组丝状真菌宿主细胞，其包含编码下述的多核苷酸：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。术语“宿主细胞”术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。
所述宿主细胞可为酶或蛋白的重组产生中可用的任何丝状真菌细胞。
“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，所述丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology 6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,NewYork；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。
所述木霉属宿主细胞可为任何可用于酶或蛋白的重组产生的木霉属细胞。例如，所述木霉属细胞可为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。在一个方面，所述木霉属细胞是哈茨木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是康宁木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是长枝木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是里氏木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是绿色木霉细胞。
在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉RutC30。在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉TV10。在另一个方面，所述绿色木霉细胞是里氏木霉RutC30的突变体。在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉TV10的突变体。在另一个方面，所述绿色木霉细胞是里氏木霉的形态学突变体。参见例如WO 97/26330，其通过全文提述并入本文。
可以将木霉属细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的工艺以本身已知的方式转化。用于转化木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。
在木霉属宿主细胞中，可通过破坏或缺失一个或多个(例如几个)天然纤维素酶和/或半纤维素酶基因或其一部分来使所述基因失活，这导致突变细胞与亲本细胞相比，当在相同条件下培养时，产生较少或不产生所述纤维素酶和/或半纤维素酶。在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素酶基因编码选自下组的酶：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，和膨胀素。在另一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素酶基因编码选自下组的酶：木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶。在另一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素酶基因编码选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，和甘露糖苷酶。
所述突变细胞可通过使用本领域公知的方法，例如插入、破坏、替代或缺失，来减少或消除编码木霉属纤维素酶或半纤维素酶的多核苷酸的表达。在一个优选的方面，所述多核苷酸经失活。待修饰或失活的多核苷酸可为，例如编码区或其对于活性必需的部分，或编码区表达所需的调节序列。此种调节或调控序列的实例可为启动子序列或其功能部分，即足以影响多核苷酸表达的部分。其它可供修饰的调控序列包括但不限于：前导序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，信号肽序列，转录终止子，和转录激活子。
可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将多核苷酸的表达减少或消除的突变细胞来进行多核苷酸的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸酯(ethyl methanesulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在所述诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变细胞。
亦可通过插入、取代或缺失基因或其转录或翻译所需的调控元件中的一个或多个(例如几个)核苷酸实现多核苷酸的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。
消除或减少多核苷酸表达的便利方式的实例是基于基因替代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源多核苷酸。理想的是所述缺陷性多核苷酸还编码标志物，其可用于选择其中多核苷酸被修饰或破坏的转化子。在一个方面，用选择性标志物(如本文所述的那些)来破坏所述多核苷酸。
亦可通过在细胞中抑制由所述多核苷酸编码的酶的表达来实现对于多核苷酸的修饰或失活，即向细胞施用或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含编码所述酶的多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，所述dsRNA长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。
所述dsRNA优选为小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制翻译的微RNA。在另一个方面，所述双链RNA(dsRNA)分子包含SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ IDNO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，和/或SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列的一部分，以供在细胞中抑制所述多肽的表达。尽管本发明并不限于任何具体作用机制，但所述dsRNA可进入细胞并导致类似或相同序列的单链RNA(ssRNA)，包括内源mRNA的降解。当细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程受选择性降解。
所述dsRNA可用于基因沉默以使用本发明的dsRNAi选择性降解RNA。该工艺可在体外、离体或体内实践。在一个方面，所述dsRNA分子可用于在细胞、器官或动物中生成功能丧失的突变。用于制备和使用dsRNA分子以选择性降解RNA的方法是本领域中公知的，参见，例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；和6,515,109。
在一个方面，所述木霉属纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:18的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:20的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:22的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25或SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属β-木糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:30的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:30的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在一个方面，木霉属纤维二糖水解酶I基因失活。在另一个方面，木霉属纤维二糖水解酶II基因失活。在另一个方面，木霉属β-葡糖苷酶基因失活。在另一个方面，木霉属木聚糖酶基因失活。在另一个方面，木霉属β-木糖苷酶基因失活。
在另一个方面，木霉属纤维二糖水解酶I基因和木霉属纤维二糖水解酶II基因失活。
在另一个方面，两个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶基因。在另一个方面，三个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶基因。在另一个方面，四个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶基因。在另一个方面，五个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶基因。在另一个方面，六个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶基因。
在另一个方面，所述纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶基因失活
在另一个方面，一个或多个(例如几个)蛋白酶基因失活。在另一个方面，所述一个或多个(例如几个)蛋白酶基因是如WO 2011/075677(其通过全文提述并入本文)中所述的枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。
核酸构建体
包含编码酶或蛋白的核酸构建体可通过将一个或多个(例如几个)调控序列可操作地连接于所述多核苷酸以在与所述调控序列相容的条件下指导所述编码序列在丝状真菌宿主细胞中表达。取决于于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子，其由用于表达编码酶或蛋白的多核苷酸的丝状真菌宿主细胞所识别。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。其它启动子描述于美国专利号6,011,147，其通过全文提述并入本文。
调控序列也可以是转录终止子，其由丝状真菌宿主细胞识别以终止转录。所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。
调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于丝状真菌宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，丝状真菌宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II和里氏木霉内切葡聚糖酶V。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。当编码序列不天然地含有信号肽编码序列时，外源信号肽编码序列可能是必需的。或者，可以直接用外源信号肽编码序列取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III和里氏木霉内切葡聚糖酶V。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽的N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其相对于丝状真菌宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。调节序列包括黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
重组表达载体可构建为包含编码酶或蛋白的多核苷酸，启动子，终止子，和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(例如几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码所述多肽多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。
重组表达载体可以是任何能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达的载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自我复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标志物，以便于容易地选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标志物是这样的基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy toauxotrophs)等。
用于丝状真菌宿主细胞的选择性标志物的实例包括但不限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑琥珀羧酰胺合酶，phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamidesynthase)、adeB(磷酸核糖氨基咪唑合酶，phosphoribosyl-aminoimidazolesynthase)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。细菌选择性标志物的实例是赋予抗生素抗性的标志物，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。
所述选择性标志物可为WO 2010/039889A2(其通过全文提述并入本文)中所述的双重选择性标志物系统。在一个方面，所述选择性标志物是hph-tk双重选择性标志物系统。
所述载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制的元件。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置的额外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的与相应的目标序列具有高度序列同一性的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的目标序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
在丝状真菌宿主细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的多核苷酸插入丝状真菌宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标志物基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标志物基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
产生方法
本发明亦涉及产生酶组合物的方法，其包括：(a)在有助于产生所述酶组合物的条件下培养本发明的丝状真菌宿主细胞；和任选地(b)回收所述酶组合物。
使用本领域已知的方法在适合于产生所述酶组合物的营养培养基中培养丝状真菌宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述酶的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。
可以使用本领域已知的对于多肽特异性的方法来检测所述酶。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzymeassay)可用于确定活性。
所述酶可以使用本领域已知的方法回收。例如，所述多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收了包含所述多肽的发酵液。
可以使用多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的酶，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,Janson和Ryden编,VCHPublishers,New York,1989)。
用途
本发明还涉及下述使用包含本发明的酶组合物的的工艺。
本发明还涉及降解或转化纤维素材料的工艺，其包括：用包含本发明的酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，所述方法进一步包括回收已降解或转化的纤维素材料。所述纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可从不溶性纤维素材料使用本领域已知的方法分离，如例如离心、过滤或重力沉降。
本发明还涉及产生发酵产物的工艺，其包括：(a)用包含本发明的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的工艺，其包括：用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是用包含本发明的酶组合物糖化的。在一个方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，所述工艺进一步包括从发酵回收发酵产物。
本发明的工艺可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇和/或平台化学品(platformchemical)(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规方法完成。此外，本发明的工艺能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质加工设备进行。
水解(糖化)和发酵，分别的或同时的，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)，有时也称为联合生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵组合在一个步骤中(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Productionand Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan,J.,和Himmel,M.,1999,Enzymes,energy and the environment:Astrategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research anddevelopment activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同时糖化和水解步骤之外，还包括单独的水解步骤，所述各步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度进行，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbialcellulose utilization:Fundamentals and biotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66:506-577)。在本文可以理解的是，本领域中已知的任何方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，均可用于实施本发明的工艺。
常规设备可包括补料分批式搅拌反应器、分批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza,FlávioFaria de Moraes,Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel,2003,Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology 25:33-38；Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.,1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysisof cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983,Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996,Enhancementof enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor withintensive stirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的工艺的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substrate pretreatment:The key toeffective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment of lignocellulosicmaterials for efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance thedigestibility of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18；Mosier等,2005,Features of promising technologies for pretreatment oflignocellulosic biomass,Bioresource Technol.96:673-686；Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogasproduction:A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651；Yang和Wyman,2008,Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol,BiofuelsBioproducts and Biorefining-Biofpr.2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调理(conditioning)。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆破)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆破、氨纤维爆破、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子性液体和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使纤维素和其它级分，例如，半纤维素能够被酶触及。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-250℃，例如160-200℃，或170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-60分钟，例如1-30分钟，1-20分钟，3-12分钟，或4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固形物加载量，以致于纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆破放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆破，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology 855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基团被切开，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成为单糖和寡糖。木质素仅以有限的程度被去除。
化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆破(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至5％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523；Sassner等.,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,见上文；Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188；Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆破(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙，在85-150℃的温度进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966；Mosier等,2005,BioresourceTechnol.96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿氧化是一种热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151；Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17；Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理优选以1-40％干物质，例如2-30％干物质，或5-20％干物质进行，并且经常通过加入碱如碳酸钠来增加初始pH。
湿氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆破(湿氧化和蒸汽爆破的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿爆破中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。
氨纤维爆破(AFEX)涉及在温和温度如90-150℃和高压如17-20bar，用液氨或氨气将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖复合物被切开。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素得以去除。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology 96:673-686,和美国专利公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至10wt％酸，例如0.05至5wt％酸或0.1至2wt％酸的范围内。将酸与纤维素材料接触，并在优选140-200℃，例如165-190℃范围内的温度保持1至60分钟的时间。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，例如20-70wt％或30-60wt％，如约40wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的研磨(grinding)或磨制(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可与下述结合：汽蒸/蒸汽爆破、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100至约400psi，例如约150至约250psi的范围的压力。在另一个方面，高温指约100至约300℃，例如约140至约200℃范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、使用蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook onBioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993,Physicochemical and biological treatments forenzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series 566,AmericanChemical Society,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Olsson 和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosicmaterials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
糖化。在水解步骤中，将纤维素材料，例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解通过包含本发明的酶组合物酶促进行。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，在连续过程中将纤维素材料逐渐补入，例如，补入含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约120小时，例如约16至约72小时，或约24至约48小时。温度为优选约25℃至约70℃的范围，例如约30℃至约65℃，约40℃至约60℃，或约50℃至约55℃。pH优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约5.0至约5.5的范围。干固形物含量优选约5至约50wt％，例如约10至约40wt％，或20至约30wt％。
在本发明的工艺中，所述包含本发明的酶组合物可在发酵之前或之中添加，例如在糖化之中或在发酵微生物繁殖之中或之后添加。
包含本发明的酶组合物可为任何适用的形式，例如移除或不移除细胞的粗发酵液，含或不含细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或作为酶的来源的木霉属宿主细胞。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
烟曲霉纤维素酶或半纤维素酶的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同时糖化和发酵的酵母)。
在一个方面，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，例如约0.01至约40mg，约0.01至约30mg，约0.01至约20mg，约0.01至约10mg，约0.01至约5mg，约0.025至约1.5mg，约0.05至约1.25mg，约0.075至约1.25mg，约0.1至约1.25mg，约0.15至约1.25mg，或约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在WO 2008/151043中所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下使用。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材料(如经预处理的玉米秸秆(PCS))获得的液体的存在下使用。
所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(例如几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；连苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acrolein acetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。
所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(例如几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色离子(flavyliumion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素(isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)；kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。
所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、硫杂环庚三烯基(thiepinyl)、哌啶基和氧杂环庚三烯基(oxepinyl)。在另一个方面所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。
所述含氮化合物可为任何具有一个或多个(例如几个)氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。
所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。
所述含硫化合物可为任何包含一个或多个(例如几个)硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自如下的模块：亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。
在一个方面，此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，以对纤维素糖单元的摩尔比例计为约10-6至约10，例如约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2。在另一个方面，如上所述的化合物的有效量为约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约1mM。
术语“液料(liquor)”意指在本文中所述的条件下，通过处理浆料中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内含物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液料可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在有机溶剂的存在下，且任选与对所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/或压力来处理纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液与残余固体分离来产生。此类条件决定了在借助纤维素酶制备物水解纤维素材料的过程中通过液料和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液料可使用本领域中的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。
在一个方面，所述液料对纤维素的有效量为约10-6至约10g每g纤维素，例如约10-6至约7.5g，约10-6至约5，约10-6至约2.5g，约10-6至约1g，约10-5至约1g，约10-5至约10-1g，约10-4至约10-1g，约10-3至约10-1g，或约10-3至约10-2g每g纤维素。
发酵。可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同时糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体在本领域均是公知的。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。
以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis；和毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773的菌株。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能够发酵戊糖如木糖和阿拉伯糖的生物可通过本领域已知方法遗传修饰而发酵戊糖。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)和运动发酵单胞菌(Philippidis，1996，见上文)。
其它发酵生物包括芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产率(yield)的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.latic)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌，和发酵单胞菌属，如运动发酵单胞菌的菌株。
在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个更优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida entomophiliia。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在另一个优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridium phytofermentans。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERMTMAFT和XR(NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation，GA，USA)，ETHANOLREDTM酵母(Red Star/Lesaffre，USA)、FALITM(Fleischmann’s Yeast，Burns PhilpFood Inc.，USA)，FERMIOLTM(DSMSpecialties)，GERT STRANDTM(GertStrand AB，Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology，WI，USA)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
已经通过将异源基因克隆入多种发酵微生物构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression of Pichiastipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等，1998，Genetically engineeredSaccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentationby Saccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressingthe TKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle，FEMS Yeast Research 4:655-664；Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267:240-243；Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strainby metabolic pathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO 2003/062430，Xylose Isomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensis。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，例如约32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，例如约pH 4-5、6或7。
在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，并且约32℃至约50℃，约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，例如约pH 4至约pH 7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x 108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，Nottingham University Press，UnitedKingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何工艺组合使用，以进一步改进发酵方法，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomycescerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个(例如几个)羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.,和Tsao，G.T.，1999，Ethanolproduction from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65:207-241；Silveira，M.M.,和Jonas，R.，2002，The biotechnological production ofsorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam，P.,和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol–a sugar substitute，ProcessBiochemistry 30(2):117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridium beijerinckiiBA101and in situ recovery by gas stripping，World Journal of Microbiology andBiotechnology 19(6):595-603。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.,和Margaritis，A.，2004，Empirical modeling of batch fermentationkinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4):501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya,和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，Water Science and Technology 36(6-7):41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass and Bioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobicdigestion of biomass for methane production:A review。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个(例如几个)酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.,和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是聚酮化合物(polyketide)。
回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
本发明涉及以下技术方案：
1.一种酶组合物，其包含：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。
2.项1的酶组合物，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:2的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：
(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；
(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:6的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和
(v)β-葡糖苷酶变体，其在对应于SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置100、283、456、和512的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有β-葡糖苷酶活性；和
其中所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽或其同源物选自下组：
(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；
(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列杂交或其全长互补链。
3.项1或2的酶组合物，其中所述β-葡糖苷酶变体包含一种或多种(几种)选自下组的取代：G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
4.项1-3任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的酶：(i)烟曲霉木聚糖酶或其同源物，(ii)烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物；或(iii)(i)和(ii)的组合；
其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：
(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ IDNO:14的成熟多肽；
(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:10，SEQID NO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列；或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物选自下组：
(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:16的成熟多肽；
(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:16的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
5.项1-4任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。
6.一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含编码下述的多核苷酸：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。
7.项6的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:2的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性与；和
(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：
(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；
(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:6的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件非常高严格条件下与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
(v)β-葡糖苷酶变体，其在对应于SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置100、283、456、和512的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有β-葡糖苷酶活性；和
其中所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽选自下组：
(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:8的成熟多肽；
(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
8.项6或7的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述β-葡糖苷酶变体包含一种或多种(几种)选自下组的取代：G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
9.项6-8任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶：(i)烟曲霉木聚糖酶，(ii)烟曲霉β-木糖苷酶；或(iii)(i)和(ii)的组合；
其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：
(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ IDNO:14的成熟多肽；
(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:10，SEQID NO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和
其中所述烟曲霉β-木糖苷酶或同源物选自下组：
(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:16的成熟多肽；
(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:16的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
10.项6-7任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其为木霉属细胞。
11.项10的重组丝状真菌宿主细胞，其为里氏木霉。
12.项6-11任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中内源于所述丝状真菌宿主的一种或多种纤维素酶基因，一种或多种半纤维素酶基因，或其组合已失活。
13.项12的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维素酶基因是已失活的纤维二糖水解酶I基因，其中所述纤维二糖水解酶I基因编码选自下组的纤维二糖水解酶I：
(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:18的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:18的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
14.项12或13的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维素酶基因是已失活的纤维二糖水解酶II基因，其中所述纤维二糖水解酶II基因编码选自下组的纤维二糖水解酶II：
(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:20的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:20的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
15.项12-14任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维素酶基因是已失活的β-葡糖苷酶基因，其中所述β-葡糖苷酶基因编码选自下组的β-葡糖苷酶：
(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:22的成熟多肽
；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:22的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
16.项12-15任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述半纤维素酶基因是已失活的木聚糖酶基因，其中所述木聚糖酶基因编码选自下组的木聚糖酶：
(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、和SEQID NO:28的成熟多肽；
(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:24、SEQID NO:26、和SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、和SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、和SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
17.项12-16任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述半纤维素酶基因是已失活的β-木糖苷酶基因，其中所述β-木糖苷酶基因编码选自下组的β-木糖苷酶：
(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:30的成熟多肽；
(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:30的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
18.项6-17任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其进一步包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。
19.一种产生酶组合物的方法，其包括：在有助于所述酶组合物产生的条件下培养项7-18任一项的宿主细胞。
20.项19的方法，进一步包括回收所述酶组合物。
21.一种降解纤维素材料的工艺，其包括用项1-6任一项的酶组合物处理所述纤维素材料。
22.一种用于产生发酵产物的工艺，其包括：
(a)用项1-6任一项的酶组合物糖化纤维素材料；
(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
23.一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料用项1-6任一项的酶组合物糖化。
实施例
菌株
里氏木霉菌株981-O-8(D4)是里氏木霉RutC30的诱变柱(ATCC 56765；Montenecourt和Eveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301)。
里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1(PCT/US2010/061105,WO 2011/075677)是里氏木霉菌株981-O-8(D4)的ku70衍生物。
培养基和缓冲溶液
2XYT plus氨苄青霉素平板由16g的胰蛋白胨，10g的酵母提取物，5g的氯化钠，15g的Bacto琼脂，和去离子水加至1升构成。在经蒸汽灭菌的培养基冷却至55℃之后添加一ml的100mg/ml氨苄青霉素溶液。
SOC培养基由20g的Bacto-胰蛋白胨，5g的Bacto酵母提取物，0.5g的NaCl，2.5ml的1M KCl，和去离子水加至1升构成。在蒸汽灭菌之前，将pH用10N NaOH调整至7.0。然后在即将使用前添加20ml的灭菌1M葡萄糖。
COVE盐溶液由26g的KCl，26g的MgSO4·7H2O，76g的KH2PO4，50ml of COVE微量金属溶液，和去离子水加至1升构成。
COVE微量金属溶液由0.04g的NaB4O7·10H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，1.2g的FeSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.8g的Na2MoO2·2H2O，10g的ZnSO4·7H2O，和去离子水加至1升构成。
COVE平板由342.3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10ml的1M乙酰胺，10ml的1.5MCsCl，25g的Noble琼脂(Difco)，和去离子水加至1升构成。
COVE2平板由30g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10ml的1M乙酰胺，25g的Noble琼脂(Difco)，和去离子水加至1升构成。
木霉属微量金属溶液由216g的FeCl3·6H2O，58g的ZnSO4·7H2O，27g的MnSO4·H2O，10g的CuSO4·5H2O，2.4g的H3BO3，336g的柠檬酸，和去离子水加至1升构成。
CIM培养基由20g的纤维素，10g的玉米浆固形物(corn steep solids)，1.45g的(NH4)2SO4，2.08g的KH2PO4，0.28g的CaCl2，0.42g的MgSO4·7H2O，0.42ml的木霉属微量金属溶液，1-2滴抑泡剂，和去离子水加至1升构成；pH调整至6.0。
YP培养基由10g的酵母提取物，20g的Bacto蛋白胨，和去离子水加至1升构成。
PEG缓冲液由500g的聚乙二醇4000(PEG 4000)，10mM CaCl2，10mMTris-HCl pH7.5，和去离子水加至1升构成；过滤灭菌。
PDA平板由39g的Potato Dextrose琼脂(Difco)和去离子水加至1升构成。
PDA覆盖培养基由构成39g的Potato Dextrose琼脂(Difco)，2.44g的尿苷，和去离子水加至1升。将之前蒸汽灭菌的培养基在微波炉中熔融，然后在使用前冷却至55℃。
STC由1M山梨醇，10mM mM CaCl2，和10mM Tris-HCl，pH 7.5构成；过滤灭菌。
TE缓冲液由1M Tris pH 8.0和0.5M EDTA pH 8.0构成。
20X SSC由175.3g的NaCl，88.2g的柠檬酸钠，和去离子水加至1升构成。
TrMM-G培养基由20ml的COVE盐溶液，6g的(NH4)2SO4，0.6g的CaCl2，25g的Nobel琼脂(Difco)，20g的葡萄糖，和去离子水加至1升构成。
NZY+培养基由5g的NaCl，3g的MgSO4·7H2O，5g的酵母提取物，10g的NZ胺，1.2g的MgCl2，4g的葡萄糖，和去离子水加至1升构成。
实施例1：里氏木霉cbhI-烟曲霉cbhI替代构建体pJfyS139的构建
将烟曲霉纤维二糖水解酶(cbhI)编码序列(SEQ ID NO:1[DNA序列]和SEQ ID NO:2[推导的氨基酸序列])从pEJG93(WO 2011/057140)使用下示的基因特异性正向和反向引物进行扩增。斜体区域代表与反应的插入位点同源的载体，而下划线部分为引入的Pac I位点
正向引物：
5’-cgcggactgcgcaccATGCTGGCCTCCACCTTCTCCTACC-3’(SEQ ID NO:31)
反向引物：
5’-ctttcgccacggagcttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAATAATCA-3’(SEQ ID NO:32)
扩增反应物由20ng的pEJG93，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1XReaction Buffer(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，和1.875单位的HotStart High-Fidelity DNA Polymerase(Stratagene，LaJolla，CA，USA)构成，最终体积为50μl。将扩增反应物在 5333epgradient S(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟；和1个循环，在72℃进行7分钟。PCR产物通过使用40mM Tris碱，20mM柠檬酸钠，1mM EDTA二钠盐(TAE)缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中1.6kb片段从凝胶切出和使用GelExtraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)依照生产商的实验方案提取。
将1.6kb PCR产物使用Advantage PCR Cloning Kit(Clontech，Palo Alto，CA，USA)依照生产商的实验方案插入Nco I/Pac I-消化的pSMai155(WO 05/074647)。所述反应由1X Reaction Buffer(Clontech，Palo Alto，CA，USA)，125ng的Nco I/Pac I-消化的pSMai155，100ng的所述1.6kb PCR产物，和1μl of Enzyme(Clontech，Palo Alto，CA，USA)构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。在温育期之后，将40μl的TE缓冲液添加至反应，使用2μl等分试样依照生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。将细胞在42℃热激30秒并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时，并将250μl铺板于150mm直径2XYT plus氨苄青霉素平板，并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过测序筛选，并鉴定出一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，将其命名为pJfyS139-A。将pJfyS139-A用于插入单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因。
将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶tk编码序列(SEQ ID NO:33[DNA序列]和SEQ IDNO:34[推导的氨基酸序列])从pJfyS1579-8-6(WO 2010/039840)通过用Bgl II和Bam HI消化该质粒而释放出。对消化物进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，其中2.3kb条带从凝胶切出并使用GelExtraction Kit提取。将tk基因使用QUICKLIGATIONTMKit(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA USA)依照生产商的实验方案插入Bam HI-消化的，小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139-A。连接反应由构成50ng的所述Bam HI-消化的，小牛肠磷酸酶处理的ppJfyS139-A，50ng的the 2.3kb tk基因插入物，1XQUICKLIGATIONTM缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA USA)，和5单位的QUICKLIGASETM(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA USA)，最终体积为20μl。将反应在室温温育5分钟，并使用2μl的反应物依照生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热激30秒，并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时，并将250μl铺板于150mm直径2XYT plus氨苄青霉素平板，并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Xma I的限制性消化分析来筛选，以确定插入物的存在和取向，并鉴定出一个含有所述插入物的克隆，将其命名为pJfyS139-B。将pJfyS139-B用于插入里氏木霉3’cbhI基因侧翼序列。
3’cbhI基因侧翼序列从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下述正向和反向引物扩增。下划线部分代表用于克隆的引入的Not I位点。
正向引物：
5’-ttagactgcggccgcGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGAT-3’(SEQ ID NO:35)
反向引物：
5’-agtagttagcggccgcACGGCACGGTTAAGCAGGGTCTTGC-3’(SEQ ID NO:36)
将里氏木霉RutC30在250ml带挡板的摇瓶中50ml的补充2％葡萄糖(w/v)的YP培养基作用在28℃在200rpm搅拌下生长2日。菌丝体通过使用(Calbiochem，La Jolla，CA，USA)的过滤收获，在去离子水中洗涤两次，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体通过杵和研钵磨碎至精细粉末。总DNA使用Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离，其中裂解温育延长至2小时。
扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1XReaction Buffer，和1.875单位的Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，60℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
对PCR反应物依照生产商的实验方案施以Nucleotide RemovalKit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)。将所得的PCR混合物用Not I消化，并将消化的PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将含有3’cbhI基因侧翼序列的1.3kb片段从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit提取。将所述1.3kb片段使用QUICKLIGATIONTMKit插入Not I-直链化，小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139-B。所述QUICKLIGATIONTM反应由100ng的所述Not I-直链化，小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139-B，20ng的所述1.3kb fragment，1X QUICK LIGATIONTMBuffer，和5单位的QUICK LIGASETM构成，最终体积为20μl。将所述反应物在室温温育5分钟，并将2μl的的所述反应物用于依照生产商的实验方案转化ONETOP10感受态细胞。将细胞在42℃热激30秒，并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时，并将250μl铺板于150mm直径2XYT plus氨苄青霉素平板，并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Xma I的限制性消化分析来筛选，以确定插入物的存在和取向，并对阳性克隆测序。将一个含有不具有PCR错误的3’cbhI基因侧翼序列的克隆命名为pJfyS139(图1)。将pJfyS139用作载体以替代里氏木霉cbhI基因。
实施例2：里氏木霉原生质体生成和转化
原生质体制备和转化使用Penttila等，1987，Gene 61：155-164的修饰的实验方案进行。简言之，将里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1(PCT/US2010/061105，WO 2011/075677)在补充2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的25ml的YP培养基在27℃在90rpm的轻柔搅拌下培养17小时。菌丝体通过使用Vacuum Driven Disposable Filtration System(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤来收集，并用去离子水洗涤两次，并用1.2M山梨醇洗涤两次。原生质体通过将经洗涤的菌丝体在34℃在90rpm的轻柔振荡下悬于20ml的含有15mg每ml的200G(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)和0.36单位)每ml的壳多糖酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA的1.2M山梨醇中15-25分钟来生成。将原生质体通过在400x g离心7分钟并用冷1.2M山梨醇洗涤两次来收集。将原生质体使用血细胞计数器计数，并在STC中重悬至1x108原生质体每ml的最终浓度。将过量的原生质体在-80℃储藏于Cryo 1℃ Freezing Container(Nalgene，Rochester，NY，USA)。
将大约100μg的下述实施例中所述的转化质粒用Pme I消化。将消化反应通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将DNA条带从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)提取。将所得的纯化的DNA添加至100μl的原生质体溶液并轻柔地混合。添加PEG缓冲液(250μl)，混合，并在34℃温育30分钟。然后添加STC(3ml)，混合，并铺板于补充1M蔗糖的PDA平板。在28℃温育16小时之后，将20ml的补充35μg每ml的潮霉素B的覆盖PDA培养基添加至每个平板。将平板在28℃温育4-7日。
实施例3：用烟曲霉cbhI编码序列替代天然的里氏木霉cbhI基因
为了用烟曲霉bhI编码序列(SEQ ID NO:1[DNA序列]和SEQ ID NO:2[推导的氨基酸序列])替代里氏木霉天然cbhI基因(SEQ ID NO:17[DNA序列]和SEQ ID NO:18[推导的氨基酸序列])，将里氏木霉ku70-菌株AgJg115-104-7B1(PCT/US2010/061105，WO 2011/075677)用4x 2μg的Pme I直链化的pJfyS139(实施例1)依照实施例2中所述的步骤来转化。获得了七个转化体，并将每一个挑取并转移至PDA平板，并在28℃温育7日。将基因组DNA从转化体根据实施例1中所述的步骤分离，并对每个转化体施以Southern分析。
对于Southern分析，将2μg的基因组DNA用33单位的Bgl II在50μl反应溶液体积中消化，并对其进行TAE缓冲液中的1％琼脂糖电泳。将凝胶中的DNA用一次在0.25N HCl中的10分钟洗涤来去嘌呤，用两次在0.5NNaOH-1.5M NaCl中的洗涤来变性，用一次在1M TrispH 8-1.5M NaCl中的30分钟洗涤来中和，并在20X SSC中温育5分钟。将DNA)使用TURBOBLOTTERTMSystem(Whatman，Inc.，Florham Park，NJ，USA)依照生产商的实验方案转移至Supercharge膜(Whatman，Inc.，FlorhamPark，NJ，USA。将DNA使用STRATALINKERTMUV Crosslinker(Stratagene，La Jolla，CA，USA)UV交联至膜，并在42℃在20ml的DIG Easy Hyb(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)中预杂交1小时。
杂交于3’cbhI基因侧翼序列的探针使用Dig Probe Synthesis Kit(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)依照生产商的指示用下示的正向和反向引物来生成。PCR反应由1X Reaction Buffer，各400nM的引物，200μM DIG-标记的含dUTP-的dNTP，20ng的pJfyS139，和1.5单位的Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成。扩增反应物在5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；25个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行40秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
正向引物：
5’-AAAAAACAAACATCCCGTTCATAAC-3’(SEQ ID NO:37)
反向引物：
5’-AACAAGGTTTACCGGTTTCGAAAAG-3’(SEQ ID NO:38)
将探针通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中对应于探针的0.5kb条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。将探针煮沸5分钟，在冰上冷却2分钟，并添加至10ml的DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42℃进行15至17小时。然后将膜在低严格条件下在2XSSC加0.1％SDS中在室温洗涤5分钟，接着进行在0.5XSSC加0.1％SDS中在65℃的两次高严格性洗涤，每次15分钟。探针-靶杂交通过化学发光测定(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，USA)依照生产商的指示来检测。Southern分析指示7个转化体中的3个含有在cbhI基因座的替代盒，且选择一个转化体里氏木霉JfyS139-8用于校正(cure)hpt和tk标志物。
生成孢子的新鲜平板，即将在28℃生长7日龄PDA平板的孢子转移至PDA平板，并在28℃温育7日。将孢子在10ml的0.01％20中使用灭菌的涂布器收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确定，并将105个孢子铺板于含有补充1μM 5-氟-2'-脱氧尿苷(FdU)的TrMM-G培养基的150mm平板上。
获得了三百个FdU抗性的孢子分离株，并从上述孢子分离株中的2个提取了DNA。对分离株进行如上所述的Southern分析，且结果指示两个孢子分离株均切出了替代和的同源重复之间的hpt/tk区。选择一个称作里氏木霉JfyS139-8A的菌株用于替代cbhII基因。
实施例4：空里氏木霉cbhII替代构建体pJfyS142的构建
为了生成构建体以用Aspergillus fumigatus cbhII编码序列(SEQ ID NO:3[DNA序列]和SEQ ID NO:4[推导的氨基酸序列])替代里氏木霉cbhII基因(SEQ ID NO:19[DNA序列]和SEQ ID NO:20[推导的氨基酸序列])，里氏木霉cbhII启动子首先从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下示的基因特异性正向和反向引物扩增。。里氏木霉RutC30基因组DNA根据实施例1中所述的步骤制备。
正向引物：
5’-acgaattgtttaaacgtcgacCCAAGTATCCAGAGGTGTATGGAAATATCAGAT-3’(SEQ IDNO:39)
反向引物：
5’-cgcgtagatctgcggccatGGTGCAATACACAGAGGGTGATCTT-3’(SEQ ID NO:40)
扩增反应物由20ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1XReaction Buffer，和1.875单位的Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在 中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；25个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中1.6kb片段从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。
将1.6kb PCR产物使用Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案插入Nco I/Sal I-消化的pSMai155(WO 05/074647)。所述反应由1X Reaction Buffer，125ng的the Nco I/Sal I-消化的pSMai155，100ng的所述1.6kb PCR产物，和1μl的Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热激30秒并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT plus氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Pci I的限制性消化来筛选并对正向克隆测序以确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，并将其命名为pJfyS142-A。将质粒pJfyS142-A用于插入里氏木霉cbhII终止子。
所述cbhII从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下示的基因特异性正向和反向引物扩增。斜体区域代表与反应的插入位点同源的载体。
正向引物：
5’-atctacgcgtactagttaattaaGGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACA-3’(SEQ IDNO:41)
反向引物：
5’-gcggccgttactagtggatccACTCGGAGTTGTTATACGCTACTCG-3’(SEQ IDNO:42)
扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1XReaction Buffer，和1.875单位的Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在 中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；25个循环，每循环在95℃进行30秒，54℃进行30秒，和72℃进行50秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中将0.3kb片段从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。
将所述0.3kb PCR产物使用Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案插入Pac I/Bam HI-消化的pJfyS142-A。所述反应由1XReaction Buffer，150ng的the PacI/BamHI-消化的pJfyS142-A，50ng的the 0.3kb PCR产物，和1μl的Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热激30秒并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT plus氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。通过序列分析筛选转化体来鉴定阳性克隆和确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，并将其命名为pJfyS142-B。将质粒pJfyS142-B用于插入单纯疱疹tk基因。
将单纯疱疹病毒tk基因从pJfyS1579-8-6(WO 2010/039840)通过用Bgl II和BamHI消化所述质粒来释放出。对消化物施以使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，其中2.3kb条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。将tk盒使用QUICKLIGATIONTMKit依照生产商的实验方案插入Bam HI-消化的，小牛肠磷酸酯酶去磷酸的pJfyS142-B。所述连接反应由50ng的所述Bam HI-消化的，小牛肠磷酸酯酶去磷酸的pJfyS142-B，50ng的the 2.3kb tk基因插入物，1X QUICK LIGATIONTMBuffer，和5单位的QUICK LIGASETM构成，连接体积为20μl。将反应物在室温温育5分钟并将2μl的所述反应物用于依照生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热激30秒并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYTplus氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Xma I和Bam HI的限制性消化来筛选来确定插入物的存在和取向，并坚定了含有插入物的克隆，并将其命名为pJfyS142-C。将质粒pJfyS142-C用于插入里氏木霉3’cbhII基因侧翼序列。
所述3’cbhII基因侧翼序列使用下示的正向和反向引物从里氏木霉RutC30基因组DNA扩增。斜体区域代表与反应的插入位点同源的载体。
正向引物：
5’-atccatcacactggcggccgcGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGT-3’(SEQ IDNO:43)
反向引物：
5’-gatgcatgctcgagcggccgcCTACCTTGGCAGCCCTACGAGAGAG-3’(SEQ IDNO:44)
扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1XReaction Buffer，和1.875单位的Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在 中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分钟50秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。对PCR反应进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，其中1.5kb条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。将所述3’cbhII基因侧翼序列使用Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案插入Not I-linearized pJfyS142-C。所述反应由1X ReactionBuffer，150ng的pJfyS142-C，80ng的所述1.5kb PCR产物，和1μl的Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热激30秒并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT plus氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Bgl II的限制性消化来筛选，并将阳性克隆测序以确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，并命名为pJfyS142(图2)。使用质粒pJfyS142插入烟曲霉cbhII编码序列。
实施例5：里氏木霉cbhII-烟曲霉cbhII替代构建体pJfyS144的构建
所述烟曲霉cbhII编码序列(SEQ ID NO:3[DNA序列]和SEQ ID NO:4[推导的氨基酸序列])从pAlLo33(WO 2011/057140)使用下示的正向和反向引物扩增。斜体区域代表与反应的插入位点同源的载体。
正向引物：
5’-ctctgtgtattgcaccATGAAGCACCTTGCATCTTCCATCG-3’(SEQ ID NO:45)
反向引物：
5’-ccggtcacgaaagccTTAATTAAAAGGACGGGTTAGCGTT-3’(SEQ ID NO:46)
扩增反应物由20ng的pAlLo33，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1mMReaction Buffer，和1.875单位的Hot StartHigh-Fidelity DNAPolymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行2分钟；和1个循环，在72℃进行7分钟。
对PCR反应进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，其中1.7kb条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。将所述1.7kb PCR产物使用Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案插入Nco I/Pac I-消化的pJfyS142(实施例4)。所述反应由1XReaction Buffer，120ng的the Nco I/Pac I-消化的pJfyS142，70ng的the 1.7kb PCR产物，和1μl的Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热激30秒并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT plus氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。对所得的转化体测序以确保不存在PCR错误和确定插入物的存在。鉴定出了一个具有不含错误的序列的克隆并命名为pJfyS144(图3)。使用质粒pJfyS144以用来自烟曲霉的cbhII编码序列替代天然cbhII基因。
实施例6：用烟曲霉cbhII编码序列替代天然里氏木霉cbhII基因
为了用烟曲霉cbhII编码序列(SEQ ID NO:3[DNA序列]和SEQ ID NO:4[推导的氨基酸序列])替代天然里氏木霉cbhII基因(SEQ ID NO:19[DNA序列]和SEQ ID NO:20[推导的氨基酸序列])，将里氏木霉JfyS139-8A(实施例3)根据实施例2中所述的步骤用2μg的PmeI-直链化和凝胶纯化的pJfyS144(实施例5)转化。获得了七个转化体，挑取每一个，并转移至PDA平板并在28℃温育7日。使用下述的真菌孢子PCR方法以筛选携带基因替代的转化体，其中使用了下示的退火于5’cbhII基因侧翼序列上游超过整合区域的区域的正向引物，和下示的退火于烟曲霉cbhII编码序列的反向引物。
正向引物：
5’-AGCCACATGCCGCATATTGACAAAG-3’(SEQ ID NO:47)
反向引物：
5’-AGGGATTCAGTGTGCTACAGGCTGC-3’(SEQ ID NO:48)
仅在cbhII基因座处发生准确的基因替代时会生成1.8kb PCR产物。若盒整合至基因组的别处，不会导致扩增。
将来自每个转化体的少量孢子悬于25μl的TE缓冲液中，并在微波炉以“高”档加热1分钟。将每个经微波加热的孢子悬液用作PCR反应中的模板。所述反应由1μl的所述微波加热的孢子悬液，各1μl的10mM dNTP，12.5μl的2X GC-Melt LA缓冲液(Clontech，Mountain View，CA，USA)，25pmol的正向引物，25pmol的反向引物，1.25单位的GC Genome LA Polymerase Mix(Clontech，Mountain View，CA，USA)，和9.25μl的水构成。反应在5333epgradientS中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行10分钟；35个循环，每循环在95℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分钟40秒；1个循环，在72℃进行7分钟；和4℃维持。对PCR反应进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳。孢子PCR指示七个转化体中的四个在靶向的基因座含有所述替代盒，且对其中三个进行Southern分析以确认替代盒为单拷贝。
将基因组DNA从三个转化体根据实施例1中所述的步骤分离，并对每个转化体施以Southern分析。对于Southern分析，将2μg的基因组DNA用50μl反应体积中的50单位的Dra I消化，并对其进行TAE缓冲液中的1％琼脂糖电泳。将凝胶中的DNA用一次在0.25N HCl中的10分钟洗涤来去嘌呤，用两次在0.5N NaOH-1.5M NaCl中的洗涤来变性，用一次在1M TrispH 8-1.5M NaCl中的30分钟洗涤来中和，并在20X SSC中温育5分钟。将DNA转移至Supercharge膜。将DNA使用STRATALINKERTMUV Crosslinker UV交联至膜，并在42℃在20ml的DIG Easy Hyb中预杂交1小时。
杂交于3’cbhII基因侧翼序列的探针使用Dig Probe Synthesis Kit依照生产商的指示用下示的正向和反向引物来生成。PCR反应由1X ReactionBuffer，各400nM的引物，200μM DIG-标记的含dUTP-的dNTP，150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，和1.5单位的Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase。扩增反应物在 5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，51℃进行30秒，和72℃进行40秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
正向引物：
5’-AAAAAACAAACATCCCGTTCATAAC-3’(SEQ ID NO:49)
反向引物：
5’-AACAAGGTTTACCGGTTTCGAAAAG-3’(SEQ ID NO:50)
将探针通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中对应于探针的0.5kb条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。将探针煮沸5分钟，在冰上冷却2分钟，并添加至10ml的DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42℃进行大约17小时。然后将膜在低严格条件下在2XSSC加0.1％SDS中在室温洗涤5分钟，接着进行在0.5XSSC加0.1％SDS中在65℃的两次高严格性洗涤，每次15分钟。探针-靶杂交通过化学发光测定(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，USA)依照生产商的指示来检测。Southern分析指示三个转化体在cbhII基因座含有替代盒，且选择所有三个(命名为JfyS139/144-5，-6，和-10)用于校正hpt和tk标志物。
生成孢子的新鲜平板，即将在28℃生长7日龄PDA平板的孢子转移至新鲜PDA平板，并在28℃温育7日。将孢子在10ml的0.01％20中使用灭菌的涂布器收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确定，并将105和104个孢子铺板于含有补充1μM FdU的TrMM-G培养基的150mm平板上。
从含有105个孢子的平板对于每个转化体获得了大约500个FdU抗性的孢子分离株，而从含有104个孢子的平板对于每个转化体获得了大约100个FdU抗性的孢子分离株。对于菌株JfyS139/144-5和-6挑取了八个孢子分离株，而对于菌株菌株JfyS139/144-10挑取了四个。来自初级转化体5的每个分离株1至8命名为JfyS139/144-5A至-5H。来自初级转化体6的每个分离株1至8命名为JfyS139/144-6A至-5H。对于分离株1至4，来自初级转化体6的分离株命名为JfyS139/144-10A至10D。孢子PCR如上所述进行，使用下示的正向和反向引物，以确认hpt和tk标志物已正确地切出。
正向引物：
5’-GTTAAGCATACAATTGAACGAGAATGG-3’(SEQ ID NO:51)
反向引物：
5’-GATGATATAATGGAGCAAATAAGGG-3’(SEQ ID NO:52)
PCR反应如上所述以下述循环参数进行：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行6分钟秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
使用退火于5’(正向)和3’(反向)侧翼序列的引物进行cbhII基因替代。正确地切出htp/tk盒的菌株会显示3.5kb片段，而具有完好的标志物的那些菌株会显示8kb片段。PCR筛选指示所有的孢子分离株正确地切出了htp/tk盒。
对于每个初级转化体，从A和B孢子分离株提取了DNA，并对其进行了如上所述的Southern分析。Southern分析确认每个孢子分离株正确地切除了htp/tk盒。选择孢子分离株里氏木霉JfyS139/144-10B代表含有里氏木霉cbhI和cbhII基因二者均由来自烟曲霉的相应同源物替代的菌株。
实施例7：里氏木霉ku70基因修复质粒pTH239的生成
将四个DNA片段使用Advantage PCR Cloning Kit合并以生成构建体，其用天然里氏木霉ku70编码序列(SEQ ID NO:53[DNA序列]和SEQ ID NO:54[推导的氨基酸序列])替代了破坏的里氏木霉ku70编码序列。含有原核复制起点的氨苄青霉素抗性标志物区从pJfyS139-B(实施例4)使用下示的序列特异性正向和反向引物(SEQ ID NO:55和56)扩增。里氏木霉ku70基因上游序列(由来自ku70编码序列上游的989bp和ku70编码序列的最初1010bp组成)从里氏木霉981-O-8基因组DNA使用下示的序列特异性正向和反向引物(SEQ ID NO:57和58)扩增。里氏木霉ku70基因下游序列(由从上游PCR产物中扩增的ku70编码序列的1010bp区段的3’端重复的500bp的区段，和含有剩余ku70编码序列的1067bp区段，和来自ku70编码序列的下游的461bp组成)从里氏木霉981-O-8基因组DNA使用下示的序列特异性正向和反向引物(SEQ ID NO:59和60)扩增。里氏木霉981-O-8基因组DNA根据实施例1中所述的步骤制备。
正向引物：
5’-GTGTGCGGCCGCTCGAGCATGCATGTTTAAACAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTT-3’(SEQ IDNO:55)
反向引物：
5’-ATCAGCCCCGAGACGGCGCCGCGTTTAAACAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGT-3’(SEQ IDNO:56)
正向引物：
5’-CATGATTACGAATTGTTTAAACGCGGCGCCGTCTCGGGGCTGATCTTGTCGAGGA-3’(SEQ IDNO:57)
反向引物：
5’-GGCGGCCGTTACTAGTGGATCCAGCCCTTGACAGTGATCTTGAGTCCAGGTGCAA-3’(SEQ IDNO:58)
正向引物：
5’-TGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCAGTTTCCATGTCCAACGTGTTGTTTTGCGC-3’(SEQID NO:59)
反向引物：
5’-GCCAGTGCCAAGCTGTTTAAACATGCATGCTCGAGCGGCCGCACACGCCCTCTCCTCG-3’(SEQID NO:60)
为了扩增氨苄青霉素抗性标志物和原核复制起点区，所述反应由100ng的里氏木霉981-O-8基因组DNA，200μM dNTPs，1μM的每种引物(SEQ IDNO:55和56)，1X High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA，USA)，和1.0unit of High-Fidelity Hot Start DNAPolymerase(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA，USA)构成，最终体积为50μl。扩增反应物在 5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；30个循环，每循环在98℃进行10秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。所述PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中2.692kb片段从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。
为了扩增ku70基因上游序列或下游序列，所述反应由100ng的pJfyS139-B，200μMdNTPs，1μM的每种引物(分别为SEQ ID NO:57和58，或者59和60)，1X High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase Buffer，和1.0unit of High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。所述扩增反应在5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；30个循环，每循环在98℃进行10秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中1.999kb和2.028kb片段分别从凝胶切出并使用Gel ExtractionKit提取。
第四DNA区段从用Not I和Bam HI对pJfyS139-B的限制性酶消化来生成。反应由5μg的pJfyS139-B，10单位的Not I，20单位的Bam HI，和20μl的Restriction Enzyme Buffer2(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA，USA)构成，总体积为50μl。将所述反应在37℃温育1小时，然后通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中4.400kb片段从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。
将2,028bp，1,999bp和2,692bp的三种PCR产物使用AdvantagePCR Cloning Kit依照生产商的实验方案插入Not I和Bam HI-消化的pJfyS139-B。所述反应由1X Reaction Buffer，50ng的Not I/Bam HI-消化的pJfyS139-B，50ng的1.999kb ku70基因上游PCR产物，50ng的2.028kb ku70基因下游PCR产物，50ng的2.692kb氨苄青霉素抗性标志物和原核复制起点PCR产物，和1μl的Enzyme构成，反应体积为10μl。所述反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将3μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化大肠杆菌XL10感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。将细胞在42℃热激30秒，然后添加预加热至42℃的500μl的NZY+培养基。将试管在37℃在200rpm振荡下温育40分钟，然后铺板于150mm直径2XYT plus氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Hind III和Xba I的限制性消化来筛选并对正向克隆测序以确保不存在PCR错误。鉴定了一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆并命名为pTH239。
实施例8：烟曲霉cbh1和cbh2中ku70基因替代菌株JfyS139/144-10B的修复
将天然里氏木霉ku70基因在菌株里氏木霉JfyS139/144-10B(实施例6)中修复，以协助菌株操作，需要ku70基因在非同源末端连接中的功能。将里氏木霉JfyS129/144-10B用23x 2μg的Pme I-直链化的pTH239(实施例7)根据实施例2中所述的步骤转化。获得了十九个转化体，并将每一个分别转移至PDA平板，并在28℃温育7日。
将所有十九个转化体通过PCR筛选以确认pTH239Pme I片段在破坏的ku70基因基因座的同源整合。对于每个转化体，使用灭菌的接种环来从7日龄PDA平板收集孢子。将孢子转移至含有25μl的1mM EDTA-10mM Tris缓冲液的试管，并在“高”档微波处理1分钟。将经微波处理的孢子混合物的1μl等分试样直接添加至PCR反应作为模板DNA。设计了下示的一组PCR引物以扩增整个ku70编码序列的破坏的区域以区分具有ku70编码序列(848bp)中的破坏的宿主基因组和感兴趣的pTH239靶向的菌株(606bp)。所述PCR反应由1X基因组LA Polymerase Reaction Buffer(Clontech，Mountain View，CA，USA)，各400nM的引物，各200μM的dNTP，1μl的经微波处理的TE-孢子混合物(如上所述)，和1.0unit of 基因组LA Polymerase(Clontech，Mountain View，CA，USA)构成。扩增反应物在5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行10分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行60秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
正向引物：
5’-CAATGACGATCCGCACGCGT-3’(SEQ ID NO:61)
反向引物：
5’-CAATGACGATCCGCACGCGT-3’(SEQ ID NO:62)
十九个转化体中仅有一个(#19)对于606bp PCR产物是阳性的且对于848bp PCR产物是阴性的，指示含有在ku70基因座同源整合的pTH239PmeI片段的菌株。
将来自转化体#19的7日龄PDA平板的孢子在10ml的0.01％20中使用灭菌的涂布器收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确认，并将106个孢子铺板于含有补充1μM5-氟-2'-脱氧尿苷(FdU)的TrMM-G培养基的150mm平板，并在28℃培养5日。获得了二十二个FdU-抗性孢子分离株，并将其转化至PDA平板，并在28℃培养5日。
将所有二十二个孢子分离株(#19A-V)通过PCR筛选在修复盒内ku70编码序列的同源重复之间存在的hpt/tk标志物区的切出。对于每个孢子分离株，使用灭菌接种环从7日龄PDA平板收集孢子。将孢子转移至含有25μl的1mM EDTA-10mM Tris缓冲液的试管，并在“高”档微波处理1分钟。将孢子混合物的1μl等分试样太直接添加至PCR反应作为模板基因组DNA。涉及了下示的一组PCR引物以扩增整个hpt/tk区域以区分hpt/tk区域的存在(6kb)或不存在(1.1kb)。所述PCR反应由1X 基因组LA PolymeraseReactionBuffer，各400nM的引物(见下)，各200μM的dNTP，1μl的微波处理的TE-孢子混合物(如上所述)，和1.0单位的基因组LAPolymerase构成。扩增反应物在5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行10分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，50℃进行30秒，和72℃进行6分钟；和1个循环，在72℃进行7分钟。
正向引物：
5’-GACACTCTTTTCTCCCATCT-3’(SEQ ID NO:63)
反向引物：
5’-GAGGAGCAGAAGAAGCTCCG-3’(SEQ ID NO:64)
所有二十二个孢子分离株对于对应于hpt/tk标志物区的6kb PCR产物是阴性的。
将来自分离株#19A和#19L的7日龄PDA平板的孢子使用灭菌的涂布器在10ml的0.01％20中收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确定，并将103，102，和101个孢子铺板于含有1M蔗糖的150mm PDA平板上，并在28℃培养3日。对于菌株#19A和#19L两者从PDA平板选择了十个孢子分离株，并将其转移至新鲜PDA平板并置于28℃。
根据实施例中所述的步骤从#19L和#19A两者的6个孢子分离株提取基因组DNA，并对其施以Southern分析。
对于Southern分析，将2μg的基因组DNA在50μl反应体积中用下述消化：(1)分别为5单位和10单位的Asc I和Xho I或(2)分别为5单位和25单位的Asc I和Apa I，并对其进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳。将凝胶中的DNA用一次在0.25N HCl中的10分钟洗涤来去嘌呤，用两次在0.5NNaOH-1.5M NaCl中的洗涤来变性，用一次在1M Tris pH 8-1.5MNaCl中的30分钟洗涤来中和，并在20X SSC中温育5分钟。将DNA使用TURBOBLOTTERTMSystem依照生产商的实验方案转移至Supercharge膜。将DNA使用STRATALINKERTMUVCrosslinker UV交联至膜，并在42℃在20ml的DIG Easy Hyb中预杂交1小时。
杂交于ku70编码序列的3’端的探针使用PCR Dig Probe Synthesis Kit(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)根据生产商的指示用下示的正向和反向引物来生成。为了生成纯木板以供探针PCR反应，将ku70编码序列的3’端从里氏木霉981-O-8基因组DNA扩增。所述PCR反应由1XHigh-Fidelity Hot StartDNAPolymerase Buffer，各1μM的引物，各200μM的dNTP，165ng的里氏木霉981-O-8基因组DNA，和1.0单位的High-Fidelity Hot Start DNAPolymerase构成。扩增反应物在5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；35个循环，每循环在98℃进行10秒，60℃进行30秒，和72℃进行15秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。
正向引物：
5’-GCATATATAACCCACTCAAGTA-3’(SEQ ID NO:65)
反向引物：
5’-ATTATCTTGGACCGGCCGCAGG-3’(SEQ ID NO:66)
将0.5kb探针木板通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化并从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit提取。将纯化的PCR产物用于使用如上所指示的引物和扩增条件如生产商的指示生成DIG标记的探针。将0.5kb DIG标记的探针通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化并从凝胶切出，并使用GelExtraction Kit提取。将探针煮沸5分钟，在冰上冷却2分钟，并添加至10ml的DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42℃进行15至17小时。然后将膜在低严格条件下在2X SSC加0.1％SDS中在室温洗涤5分钟，接着进行在0.5X SSC加0.1％SDS中在65℃的两次高严格性洗涤，每次15分钟。探针-靶杂交通过化学发光测定(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN，USA)依照生产商的指示来检测。Southern分析指示所有孢子分离株在ku70基因座含有修复/替代盒，并校正了hpt和tk标志物。选择了一个命名为里氏木霉981-O-8.5#10B+Ku70#19L3的菌株进行进一步转化。
实施例9：表达青霉属种GH61A多肽的pDM286的构建
将青霉属种(emersonii)GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:7[DNA序列]和SEQ IDNO:8[推导的氨基酸序列])使用下示的基因特异性正向和反向引物从质粒pGH61D23Y4(WO2011/041397)扩增。斜体区域代表与反应的插入位点同源的载体。
正向引物：
5’-CGGACTGCGCACCATGCTGTCTTCGACGACTCGCAC-3'(SEQ IDNO:67)
反向引物：
5’-TCGCCACGGAGCTTATCGACTTCTTCTAGAACGTC-3'(SEQ ID NO:68)
所述扩增反应由30ng的pGH61D23Y4DNA，50pmol的上述各引物，1μl的dATP、dTTP、dGTP、和dCTP的10mM共混物，1X PHUSIONTMHigh-Fidelity Hot Start DNAPolymeraseBuffer，和1单位的PHUSIONTMHigh-Fidelity Hot Start DNAPolymerase构成，最终体积为50μl。将所述扩增反应在5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；35个循环，每个循环在98℃进行10秒，60℃进行30秒，和72℃进行30秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中大约0.9kb片段从凝胶切出，并使用GelExtraction Kit根据生产商的实验方案提取。
将质粒pMJ09(WO 2005/047499)用Nco I和Pac I消化，通过1mM EDTA二钠盐-50mMTris碱-50mM硼酸(TBE)缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳来分离，从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit根据生产商的实验方案提取。
将0.9kb PCR产物使用IN-FUSIONTMAdvantage PCR Cloning Kit根据生产商的实验方案插入凝胶纯化的、Nco I/Pac I消化的pMJ09。IN-FUSIONTM反应由1X IN-FUSIONTMReaction Buffer，180ng的凝胶纯化的、Nco I/Pac I消化的pMJ09，108ng的0.9kbPCR产物，和1μl的IN-FUSIONTMEnzyme构成，最终反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟，和在50℃温育15分钟。在温育期之后，将40μl的TE添加至反应。使用2μl等分试样以根据生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞。将大肠杆菌转化反应涂布于2XYT加上氨苄青霉素平板。将转化体通过测序筛选，且鉴定出一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，并命名为pDM286(图4)。可将质粒pDM286用Pme I消化以生成大约5.4kb的片段以供里氏木霉转化。所述5.4kb片段含有由里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I基因启动子，P.emersonii GH61A多肽编码序列，和里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I基因终止子构成的表达盒。所述5.4kb片段亦含有构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因。
实施例10：编码烟曲霉β-葡糖苷酶(Cel3A)突变体基因的里氏木霉表达载体的生成
含有取代G142S，Q183R，H266Q，和D703G的烟曲霉家族3Aβ-葡糖苷酶的变体通过使用Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA，USA)进行对pEJG97(WO 2005/074647)的定位诱变来构建。用于定位诱变的寡聚物的总结示于表1。
所得的变体质粒pDFng128-6使用9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)来制备。将所述变体质粒构建体使用Applied Biosystems 3130xl GeneticAnalyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)测序来验证变化。
表1
设计了下示的两个合成的寡核苷酸引物以从质粒pDFng128-6PCR扩增烟曲霉β-葡糖苷酶突变体编码序列。使用IN-FUSIONTMCloning Kit将片段直接克隆入表达载体pMJ09。粗体字母代表编码序列。剩余序列同源于pMJ09的插入位点。
正向引物：
5’-CGGACTGCGCACCATGAGATTCGGTTGGCTCGA-3’(SEQ ID NO:73)
反向引物：
5’-TCGCCACGGAGCTTACTAGTAGACACGGGGCAGAG-3’(SEQ ID NO:74)
将五十皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，所述反应由50ng的pDFng128-6，含MgCl2的1X High Fidelity PCR Buffer(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)，各0.25mM的dATP、dTTP、dGTP、和dCTP，和2.6单位的High Fidelity Enzyme Mix(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)构成，最终体积为50μl。扩增在5333epgradient S中进行，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；30个循环，每个循环在94℃进行15秒，65℃进行30秒，和68℃进行1分钟；和在68℃进行最终延伸7分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。将反应产物通过TBE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，其中在凝胶上观察到大约3.1kb的产物条带。PCR反应使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示进行纯化。
将质粒pMJ09用Nco I和Pac I消化，通过TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示提取。
将3.1kb基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMCloning Kit连接在一起，得到pDFng113-3(图5)，其中β-葡糖苷酶突变体编码序列的转录处于来自里氏木霉cbhI基因的调控下。连接反应(20μl)由1X IN-FUSIONTMBuffer，1X BSA，1μl的IN-FUSIONTMEnzyme(稀释1:10)，200ng的凝胶纯化的NcoI/Pac I消化的pMJ09，和172.2ng的纯化的3.1kb PCR产物构成。The reaction was incubated at 37℃进行15分钟followed by 50℃进行15分钟。使用二μl的反应转化大肠杆菌XL10Gold Supercompetent细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。将大肠杆菌转化反应涂布于2XYT加上氨苄青霉素平板。使用9600制备含有pDFng133-3的大肠杆菌转化体。pDFng133中的烟曲霉β-葡糖苷酶突变体插入物通过DNA测序确认。
实施例11：质粒pSMai139的构建
为了构建pSMai139，将特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码区用下示的引物从作为模板的pMJ05(US 2004/0248258 A1)PCR扩增。下划线部分为通过Car-F2有义引物引入的Sph I和Hind III位点。粗体部分为通过Car-R2反义引物引入的Eco RI位点。
Car-F2有义引物：
5’-TATAAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTC-3’(SEQ ID NO:75)
Car-R2反义引物：
5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO:76)
扩增反应(50μl)由构成1X ThermoPol Reaction Buffer(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA USA)，各0.3mM的dNTP，10ng的pMJ05DNA，0.3μM Car-F2有义引物，0.3μMCar-R2反义引物，和2.5单位的DNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA USA)。将反应在5333epgradient S中温育，其程序如下：30个循环，每个循环在94℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行60秒(15分钟最终延伸)。反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其中900bp产物条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示纯化。然后将900bp PCR片段用Eco RI和Hind III消化，并根据生产商的实验方案对其施以PCR Purification Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)。
将质粒pMJ05用Eco RI和Hind III消化，通过TAE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示提取。
将900bp Eco RI和Hind III消化的PCR片段使用T4DNA连接酶(Roche，Indianapolis，IN，USA)连接入Eco RI和Hind III消化的pMJ05。连接反应由50ng的Eco RI和Hind III消化的pMJ05，33ng的Eco RI和Hind III消化的0.9kb PCR片段，1X LigaseBuffer(Roche，Indianapolis，IN，USA)，和2单位的T4DNA连接酶构成，最终体积为20μl。将反应在15℃温育17小时，并使用2μl的反应物根据生产商的实验方案转化ONE TOP10转化态细胞。将细胞在42℃热激30秒，并添加了250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时，并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板，并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Sph I和Bam HI的限制性消化分析来筛选以确定插入物的存在和取消，并对阳性克隆进行测序。含有特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区、不具有PCR错误的克隆命名为pSMai139(图6)。
实施例12：pSMai143质粒的构建
质粒pSMai143通过使用下示的引物994148和994149从里氏木霉RutC30基因组DNA扩散620bp的里氏木霉纤维二糖水解酶Cel6A启动子来构建。下划线部分是由引物994148引入的Sal I位点。粗体部分是由引物994149引入的“CAT”序列。
引物994148：
5’-ACGCGTCGACGAATTCTAGGCTAGGTATGCGAGGCA-3’(SEQ ID NO:77)
引物994149：
5’-CATGGTGCAATACACAGAGGGTG-3’(SEQ ID NO:78)
扩增反应(50μl)由1X ThermoPol Reaction Buffer，各0.3mM的dNTP，100ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，0.3μM 994148有义引物，0.3μM994149反义引物，和2.5单位的Vent DNA聚合酶构成。将反应在5333epgradientS中温育，其程序如下：30个循环，每个循环在94℃进行60秒，55℃进行60秒，和72℃进行60秒(15分钟最终延伸)。反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其中620bp产物条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示纯化。
将质粒pSMai139用Sph I消化，将其3’悬突端用T4DNA聚合酶平端化，然后用Sal I消化。将消化的DNA通过在TAE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示提取。
将620bp Sal I消化的PCR片段使用T4DNA连接酶连接入Sph I和Sal I消化的pSMai139。连接反应由50ng的Sph I和Sal I消化的pSMai139，22ng的Sal I消化的0.62kbPCR片段，1X Ligase Buffer，和2单位的T4DNA连接酶构成，最终体积为20μl。将反应在15℃温育17小时，并使用2μl的反应物根据生产商的实验方案转化ONE TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热激30秒，并添加250μl的SOC培养基。将试管在37℃，200rpm温育1小时，并将250μl涂布于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板上，并在37℃温育过夜。通过用Eco RI得限制性消化分析来筛选所得的转化体以确定插入物的存在和取消，并筛选阳性克隆。将含有不具有PCR错误的里氏木霉纤维二糖水解酶Cel6A启动子的克隆命名为pSMai143(图7)。
实施例13：质粒pAG121的构建
具有Nco I限制性位点的表达载体pAG121通过使用Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA，USA)使用下示的引物对pSMai143(实施例12)进行定位诱变来构建。诱变根据生产商的推荐使用20ng的质粒pAG121和12.5μM引物进行，最终体积为50μl。
Smai143SDM Fwd：
gtgtattgcaccatggcgttcctcccccctcc(SEQ ID NO:79)
Smai143SDM Rev
ggaggggggaggaacgccatggtgcaataca(SEQ ID NO:80)
所得的变体质粒pAG121使用9600制备。将变体质粒构建体使用Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer测序以验证变化。
实施例14：编码烟曲霉β-葡糖苷酶(Cel3A)突变体基因的里氏木霉表达载体pSMai229的构建
将编码实施例9的烟曲霉β-葡糖苷酶(Cel3A)突变体编码序列的里氏木霉表达载体pSMai229从pDFng133-3(实施例10)和pAG121(实施例13)构建。
将烟曲霉β-葡糖苷酶(Cel3A)突变体编码序列使用下示的引物0611689和0611690从pDFng133-3PCR扩增。粗体区域代表与反应的插入位点同源的pAG121载体。
引物0611689：
CACCCTCTGTGTATTGCACCATGAGATTCGGTTGGCTCGA(SEQ ID NO:81)
引物0611690：
TTCGCCACGGAGCTACTAGTCTAGTAGACACGGGGCAGAG(SEQ ID NO:82)
所述扩增反应由25ng的pDFng133-3DNA，各200μm的dNTP，各0.4μM的引物，1XBuffer，和1单位的Hot Start HighFidelity DNA聚合酶构成，最终体积为50μl。将所述扩增反应在5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；30个循环，每个循环在98℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行3分钟30秒；和1个循环，在72℃进行15分钟.
PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中将3100bp片段从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示纯化。然后将片断使用IN-FUSIONTMAdvantage PCR Cloning Kit克隆至用NcoI和SpeI消化的pAG121的最大片段，得到pSMai229(图8)。连接反应物(10μl)由1X IN-FUSIONTMBuffer，1μl的IN-FUSIONTMEnzyme，100ng的用Nco I和Spe I消化的pAG121，和142ng的3100bp纯化的PCR产物构成。将反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。在用50μl的TE缓冲液(pH 8)稀释反应混合物之后，使用2.5μl的反应物根据生产商的实验方案转化大肠杆菌ONE TOP10感受态细胞。通过限制性消化检测出含有pSMai229的大肠杆菌转化体，并使用9600制备质粒DNA。pSMai229中的烟曲霉β-葡糖苷酶(Cel3A)突变体插入物通过DNA测序确认。
实施例15：将pDM286和pSMai229共转化入里氏木霉981-O-8.5#10B+Ku70#19L3
里氏木霉菌株981-O-8.5#10B+Ku70#19L3的原生质体制备和转化如实施例2中所述进行。
将大约100μg的pDM286和pSMai229用Pme I消化。将每个消化反应通过TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳纯化，将DNA条带从凝胶切出，并使用GelExtraction Kit提取。转化通过将0.7-1.7μg的Pme I消化的和凝胶纯化的pSMai229和0.7-2.0μg的pDM286添加至100μl的里氏木霉981-O-8#10B+Ku70#19L3原生质体溶液并轻柔地混合来进行。添加PEG缓冲液(250μl)，混合，并在34℃温育30分钟。然后添加STC(4ml)，混合，并铺板于COVE平板上。将平板在28℃温育7至10日。在COVE2加10mM尿苷平板上的一轮孢子纯化之后，将362个转化体在28℃在200rpm搅拌下在含有25ml的纤维素酶诱导培养基的125ml带挡板的摇瓶中生长5日。在接种后5日移除培养液样品，在2000rpm离心20分钟，并将上清转化至新的使馆，并储藏于-20℃直至酶测定。
对上清使用对硝基苯基-β-葡糖吡喃糖苷作为底物测定β-葡糖苷酶活性。简言之，将培养上清适当地在0.1M琥珀酸-0.01％X-100pH 5.0缓冲液(样品缓冲液)中稀释，接着进行从0倍至1/3倍至1/9倍稀释样品的系列稀释。将里氏木霉RutC30发酵液起初稀释1/64，接着在样品缓冲液中用2倍稀释步骤稀释至16倍稀释以确立测定的线性范围。将总共20μl的各稀释液转移至96孔平底板。将二百微升0.1M琥珀酸pH 5.0缓冲液中的1mg/ml对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷底物添加至每个孔，然后在环境温度温育45分钟。在完成温育期之后，添加每孔50μl的淬灭溶液(1M Tris pH 9缓冲液)。对于96孔板在405nm的光密度测量终点。样品活性根据下式确定：(((OD405/ec)*1x106)/温育时间)/样品体积，其中ec＝17,749，温育时间＝45分钟，而样品体积＝0.02ml.
多种转化体显示比里氏木霉981-O-8.5#10B+Ku70#19L3高数倍的β-葡糖苷酶活性。将所有具有β-葡糖苷酶活性值大于7000μM/min/ml的样品通过使用具有Cell(Bio-Rad Laboratories，Inc。Hercules，CA，USA)的8-16％Tris-HCl凝胶(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)的SDS-PAGE进行分析以确定Penicillium emersonii GH61A多肽表达。将五μl的第5日样品悬于2X浓度的Laemmli Sample Buffer(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)并在5％β-巯基乙醇的存在下在95℃加热5分钟。将所有样品加载于8-16％Tris-HCl上，并对其进行在1X Tris/Glycine/SDS运行缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)中的电泳。将所得的凝胶用Coomassie Stain(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示烟曲霉β-葡糖苷酶变体和Penicilliumemersonii GH61A在样品#1，64，79，82，83，116，147，167，193，198，210，219，908，922，928，930，935，951，963，和980中的村子啊。
实施例16：pAG57的构建
根据下述方法重组制备烟曲霉菌株NN051616GH3β-木糖苷酶(SEQ ID NO:15[DNA序列]和SEQ ID NO:16[推导的氨基酸序列])。
设计了两个下示的合成寡核苷酸引物以从基因组DNAPCR扩增烟曲霉β-木糖苷酶基因。基因组DNA如实施例1中所述制备。使用IN-FUSIONTMAdvantage PCR Cloning Kit将片段直接克隆入表达载体pAILo2(WO 2005/074647)，无需限制性消化和连接。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACCATGGCGGTTGCCAAATCTATTGCT-3'(SEQ ID NO:83)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAATCACGCAGACGAAATCTGCT-3’(SEQ ID NO:84)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将十五皮摩尔的上述每种引物用于PCR反应，所述反应含有250ng的烟曲霉基因组DNA，含MgCl2的1X High Fidelity PCR Buffer，1μl的dATP、dTTP、dGTP、和dCTP的10mM共混物，和0.75单位的High Fidelity Enzyme Mix，最终体积为50μl。所述扩增使用 5333epgradient S进行，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；10个循环，每个循环在94℃进行15秒，56.5℃进行30秒，和72℃进行2分钟；和20个循环，每个循环在94℃进行15秒，56.5℃进行30秒，和72℃进行2分钟加上每循环加5秒。加热块然后在72℃保持7分钟，接着进行4℃浸泡循环。
将反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其中将2.4kb的产物条带从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示纯化。
然后将片段使用IN-FUSIONTMAdvantage PCR Cloning Kit克隆入pAlLo2。将载体用Nco I和Pac I消化。将片段通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit提取。将基因片段和消化的载体在反应中组合在一起，得到表达质粒pAG57，其中烟曲霉β-木糖苷酶编码序列的转录处于NA2-tpi启动子(来自对于黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)调控下。反应(20μl)由1X IN-FUSIONTMBuffer，1X BSA，1μl的IN-FUSIONTMEnzyme(稀释1:10)，182ng的用Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和97.7ng的烟曲霉β-木糖苷酶纯化的PCR产物构成。将反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。将反应用40μl的TE缓冲液稀释，并使用2.5μl的稀释的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。通过限制性酶消化鉴定出了含有pAG57(图9)的大肠杆菌转化体，并使用9600制备了质粒DNA。将pAG57质粒构建体使用Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer测序以验证序列。
实施例17：表达烟曲霉β-木糖苷酶的pDFng124-1的构建
设计了两个下示的合成寡核苷酸引物以从pAG57PCR扩增烟曲霉β-木糖苷酶(实施例16)。使用IN-FUSIONTMAdvantage PCR Cloning Kit将片段直接克隆入表达载体pMJ09，而屈戌限制性消化和连接。
正向引物：
5'-CGGACTGCGCACCATGGCGGTTGCCAAATC-3'(SEQ ID NO:85)
反向引物：
5'-TCGCCACGGAGCTTATCACGCAGACGAAATCT-3'(SEQ ID NO:86)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pMJ09的插入位点同源。
将五十皮摩尔的每种上述引物用于PCR反应，所述反应由100ng的pAG57，含MgCl2的1X High Fidelity PCR缓冲液，各0.25mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP，和2.6单位的Enzyme Mix构成，最终体积为50μl。扩增使用5333epgradient S进行，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；30个循环，每个循环在94℃进行15秒，65℃进行30秒，和72℃进行2分钟；和在72℃进行最终延伸7分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
将反应产物通过TBE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，其中将2.4kb产物条带从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示纯化。
将质粒pMJ09用Nco I和Pac I消化，通过TBE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTMAdvantage PCR Cloning Kit连接在一起，得到pDFng124-1(图10)，其中β-木糖苷酶编码序列的转录处于里氏木霉cbhI基因启动子的调控下。连接反应物(20μl)由1X IN-FUSIONTMBuffer，1μl的IN-FUSIONTMEnzyme(稀释1:10)，200ng的用Nco I和Pac I消化的pMJ09，和100ng的纯化的β-木糖苷酶PCR产物构成。将反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。使用两μl的反应物根据生产商的指示转化大肠杆菌XL10Gold Supercompetent细胞。含有pDFng124-1的大肠杆菌转化体使用9600制备。pDFng124-1中的烟曲霉β-木糖苷酶插入物通过DNA测序来确认。
实施例18：表达烟曲霉木聚糖酶的pSaMe-AFGH10的构建
设计了两个下示的合成寡核苷酸引物以从pHyGe001(WO 2006/078256)PCR扩增烟曲霉GH10木聚糖酶。使用IN-FUSIONTMAdvantage PCR Cloning Kit将片段直接克隆入表达载体pMJ09，而无需限制性消化和连接。
正向引物：
5'-CGGACTGCGCACCATGGTCCATCTATCTTCATT-3'(SEQ ID NO:87)
反向引物：
5'-TCGCCACGGAGCTTATTACAGGCACTGTGAGTACC-3'(SEQ ID NO:88)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pMJ09的插入位点同源。
将五十皮摩尔的每种上述引物用于PCR反应，所述反应由50ng的pHYGE001，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的10mM共混物，5μl 10XACCUTAQTMDNAPolymerase Buffer(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，和5单位的ACCUTAQTMDNA Polymerase(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)构成，最终体积为50μl。使用5333 epgradient S扩增DNA片段，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；和30个循环，每循环在94℃进行15秒，在55℃进行30秒，和在68℃进行1分钟。在30个循环之后，将反应在72℃温育10分钟，然后冷却至4℃直至进一步处理。
将反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖胶粘度仪分离，其中将1.4kb产物条带从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit根据生产商的指示纯化。
然后将1.4kb片段使用IN-FUSIONTMCloning Kit克隆入pMJ09。将质粒pMJ09用NcoI和Pac I消化，并通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳纯化。将基因片段和消化的载体在反应中连接在一起，得到表达质粒pSaMe-AfGH10，其中木聚糖酶编码序列的转录处于里氏木霉cbh1基因启动子的调控下。连接反应(50μl)由1X IN-FUSIONTMBuffer，1X BSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(稀释1:10)，100ng的用Nco I和Pac I消化的pMJ09，和100ng的烟曲霉木聚糖酶纯化的PCR产物构成。将反应在室温温育30分钟。使用一μl的反应转化大肠杆菌XL10Gold细胞。通过限制性酶消化检测出了含有pSaMe-AfGH10(图11)的大肠杆菌转化体，并使用9600制备质粒DNA。来自pSaMe-AfGH10的烟曲霉木聚糖酶编码序列的DNA测序使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，Journal of VirologyMethods 38:47-60)和引物步移策略进行。
实施例19：表达烟曲霉木聚糖酶和烟曲霉β-木糖苷酶的里氏木霉RutC30菌株的生成
里氏木霉菌株RutC30的原生质体制备和转化如实施例2中所述进行。
将大约100μg的pSaMe-AFGH10和pDFng124-1用Pme I消化，将每个消化反应通过TAE缓冲液中的0.65％琼脂糖凝胶电泳纯化，将DNA条带从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit提取。转化通过添加2μg的Pme I消化的和凝胶纯化的pDFng124-1，和将1.72μg的pSaMe-AfGH10添加至100μl的里氏木霉菌株RutC30原生质体溶液并轻柔地混合来进行。添加PEG缓冲液(250μl)，混合，并在34℃温育30分钟，然后添加STC(6ml)，混合，并铺板于COVE平板。将平板在28℃温育7至10日。在COVE2加10mM尿苷平板上一轮孢子纯化之后，将200个转化体在28℃在200rpm搅拌下在含有25ml纤维素酶诱导培养基的125ml带挡板的摇瓶中生长5日。在接种后5日移除培养液样品，在2000rpm离心20分钟，然后将上清转移至新使馆，并储藏于-20℃直至酶测定。
将三至五μl的每份上清与5至6μl的含5％β-巯基乙醇的Laemelli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)在0.2ml微离心管中合并，并在95℃在5333epgradient S中煮沸2分钟。样品通过使用10μl的PRECISION PLUSTMAll Blue Protein Standards(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)和8-16％Tris-HCl Gel的SDS-PAGE根据生产商的指示分析。将凝胶用Coomassie Stain染色。
基于β-木糖苷酶和木聚糖酶多肽的高表达选择了四个菌株，并通过将收集于10μl接种环上的孢子添加至1.5ml的0.01％20来孢子纯化。将1:1500和1:150的孢子稀释液铺板于150mm COVE平板，并在28℃培养4日。获得了每个菌株四个孢子分离株(总共16个分离株)，并转移至COVE2+10mM尿苷平板，并在28℃培养9日。将烧瓶和SDS-PAGE步骤对于第一轮孢子分离株重复。基于β-木糖苷酶和木聚糖酶多肽的高表达选择了八个菌株，并如上所述进行第二次孢子纯化，得到每个菌株四个孢子分离株(总共32个分离株)。对于第二轮孢子分离株重复摇瓶和SDS-PAGE步骤。基于β-木糖苷酶和木聚糖酶多肽的高表达选择了最终菌株，并命名为O6HY4。
实施例20：经预处理的玉米秸秆水解测定
将玉米秸秆在U.S。Department of Energy National Renewable EnergyLaboratory(美国能源部国家可再生能源实验室)(NREL)使用1.4wt％硫酸在165℃和107psi预处理8分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的不溶于水的固形物含有56.5％纤维素，4.6％半纤维素和28.4％木质素。通过两阶段硫酸水解，接着通过使用NREL标准分析程序(Standard Analytical Procedure)#002的高效液相色谱分析糖来测定纤维素和半纤维素。木质素在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后使用NREL标准分析程序#003以重量分析法确定。
经磨制、未经洗涤的PCS通过在Cosmos ICMG 40湿式多用途研磨机(EssEmmCorporation，Tamil Nadu，India)中磨制全浆料PCS来制备。
PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)在1.0ml的总反应体积中进行。水解用50mg的不溶性PCS固体每ml的含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH 5.0缓冲液和多种蛋白加载量的多种酶组合物(表示为mg蛋白每克纤维素)进行。制备酶组合物，然后以50μl至200μl范围的体积同时添加至所有孔，至每个反应中1ml的终体积。然后使用ALPS-300TM平板热密封器(Abgene，Epsom，United Kingdom)密封平板，充分混合，并在特定温度温育72小时。所有报道的反应重复三次进行。
在水解之后，使用0.45μm 96孔过滤板(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤样品，然后如后文所述分析滤过物的糖含量。当不立即使用时，将过滤的等分试样冷冻于-20℃。如下测量稀释于0.005M H2SO4的样品的糖浓度：使用4.6x 250mmHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)通过在65℃用0.05％w/w苯甲酸-0.005M H2SO4以0.6ml每分钟的流速洗脱，并通过从由纯糖样品校正的折光率检测(1100HPLC，Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)对所得的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号积分来进行定量。使用所得的葡萄糖和纤维二糖当量对于每个反应计算纤维素转化的百分比。
分别测量葡萄糖、纤维二糖和木糖。根据合适的稀释因子调整测得的糖浓度。在未洗涤的PCS的情况下，酶法产生的糖的净浓度通过就在零时点未洗涤的PCS中相应的背景糖浓度调整测得的糖浓度来确定。所有HPLC数据处理均使用MICROSOFT EXCELTM软件(Microsoft，Richland，WA，USA)进行。
使用下式计算纤维素转化为葡萄糖的程度：％转化＝(葡萄糖浓度/消化中的葡萄糖浓度)x 100。为了计算总转化，合并葡萄糖和纤维二糖值。总纤维素转化的程度使用下述公式计算：％转化[葡萄糖浓度]/[(限制消化中的葡萄糖浓度]x 100。为了计算％转化，基于纤维素酶对照(50mg的里氏木霉纤维素酶每克纤维素)设定100％转化点，并将所有值除以该数值并接着乘以100。将三次重复数据点取平均值，并计算标准偏差。
将包含烟曲霉纤维二糖水解酶I；烟曲霉纤维二糖水解酶II；烟曲霉β-葡糖苷酶变体；具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽，烟曲霉木聚糖酶，和烟曲霉β-木糖苷酶的酶组合物(命名为“酶组合物#1”)与包含棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/021785)和里氏木霉纤维素酶制备物(含有烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499)和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656))的共混物的酶组合物(命名为“酶组合物#2”)相比较。
在水解测定完成之后，生成了蛋白加载(mg EP/g纤维素)对百分比转化(％)的图。使用线性内插，可确定达到特定百分比转化所需的蛋白加载。在此情况下，选择葡聚糖至葡萄糖80％转化的当量以确定酶组合物相对于酶组合物2的相对改善。该测定的结果示于图12，指示酶组合物1能够以4.1mgEP/g纤维素达到80％转化，而酶组合物2能够以7.3mg EP/g纤维素达到相同的转化目标。这反映了对于组合物1相比于组合2，每毫克蛋白性能方面1.78倍的改善，或达到80％转化所需的蛋白方面1.78倍的减少。
本发明进一步通过下述编号段落描述。
[1]一种酶组合物，其包含(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。
[2]段1的酶组合物，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[3]段1的酶组合物，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[4]段1的酶组合物，其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[5]段1的酶组合物，其中所述β-葡糖苷酶变体在对应于SEQ ID NO:6的位置100、283、456、和512的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有β-葡糖苷酶活性。
[6]段5的酶组合物，其中所述变体的亲本β-葡糖苷酶是：(a)多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；(b)多肽，其与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％序列同一性；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中含有的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(d)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性；或(e)SEQ ID NO:6的成熟多肽的片段，其具有β-葡糖苷酶活性。
[7]段5或6的酶组合物，其中所述变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％序列同一性。
[8]段5-7任一项的酶组合物，其中所述变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％序列同一性。
[9]段5-8任一项的酶组合物，其中取代数为1-4，如1、2、3或4处取代。
[10]段5-9任一项的酶组合物，其中所述变体包含在对应于位置100的位置的取代，在对应于位置283的位置的取代，在对应于位置456的位置的取代，和/或在对应于位置512的位置的取代。
[11]段10的酶组合物，其中在对应于位置100的位置的取代是Ser；在对应于位置456的位置的取代是Gly；在对应于位置456的位置的取代是Gln；和在对应于位置512的位置的取代是Gly。
[12]段5-11任一项的酶组合物，其中所述变体包含一种或多种(几种)选自下组的取代：G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
[13]段5-12任一项的酶组合物，其中所述变体包含取代G142S和Q183R；G142S和H266Q；G142S和D703G；Q183R和H266Q；Q183R和D703G；H266Q和D703G；G142S，Q183R，和H266Q；G142S，Q183R，和D703G；G142S，H266Q，和D703G；Q183R，H266Q，和D703G；或者G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
[14]段1的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽或其同源物选自下组：(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[15]段1-14任一项的酶组合物，其包含一种或多种选自下组的酶：(i)烟曲霉木聚糖酶或其同源物，(ii)烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物；或(iii)(i)和(ii)的组合。
[16]段15的酶组合物，其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ IDNO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列；或其全长互补链杂交。
[17]段15的酶组合物，其中所述烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:16的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQID NO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[18]段1-17任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。
[19]段18的酶组合物，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。
[20]段19的酶组合物，其中所述内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶I。
[21]段19的酶组合物，其中所述内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶II。
[22]段18的酶组合物，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[23]一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含编码下述的多核苷酸：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。
[24]段23的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[25]段23的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[26]段23的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[27]段23的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述β-葡糖苷酶变体在对应于SEQ IDNO:6的成熟多肽的位置100、283、456和512的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有β-葡糖苷酶活性。
[28]段27的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述变体的亲本β-葡糖苷酶是：(a)多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；(b)多肽，其与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％序列同一性；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中含有的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(d)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性；或(e)SEQ ID NO:6的成熟多肽的片段，其具有β-葡糖苷酶活性。
[29]段27或28的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％序列同一性。
[30]段27-29任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述变体与SEQ IDNO:6的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％序列同一性。
[31]段27-30任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中取代数为1-4，如1、2、3或4处取代。
[32]段27-31任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述变体包含在对应于位置100的位置的取代，在对应于位置283的位置的取代，在对应于位置456的位置的取代，和/或在对应于位置512的位置的取代。
[33]段32的重组丝状真菌宿主细胞，其中在对应于位置100的位置的取代是Ser；在对应于位置456的位置的取代是Gly；在对应于位置456的位置的取代是Gln；和在对应于位置512的位置的取代是Gly。
[34]段27-33任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述变体包含一种或多种(几种)选自下组的取代：G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
[35]段27-34任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述变体包含取代G142S和Q183R；G142S和H266Q；G142S和D703G；Q183R和H266Q；Q183R和D703G；H266Q和D703G；G142S，Q183R，和H266Q；G142S，Q183R，和D703G；G142S，H266Q，和D703G；Q183R，H266Q，和D703G；或者G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
[36]段23的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽或其同源物选自下组：(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:8的成熟多肽；(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[37]段23-26任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其包含一种或多种选自下组的多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶：(i)烟曲霉木聚糖酶，(ii)烟曲霉β-木糖苷酶；或(iii)(i)和(ii)的组合。
[38]段37的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列；或其全长互补链杂交。
[39]段37的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:16的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:16的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[40]段23-39任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其为木霉属细胞。
[41]段40的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述木霉属细胞选自下组：哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)。
[42]段40的重组丝状真菌宿主细胞，其为里氏木霉。
[43]段23-42任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中内源于所述丝状真菌宿主的一种或多种纤维素酶基因，一种或多种半纤维素酶基因，或其组合已失活。
[44]段43的重组丝状真菌宿主细胞，其中纤维二糖水解酶I基因已失活。
[45]段44的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维二糖水解酶I基因编码选自下组的纤维二糖水解酶I：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQID NO:18的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[46]段43-45任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中纤维二糖水解酶II基因已失活。
[47]段46的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维二糖水解酶II基因编码选自下组的纤维二糖水解酶II：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:20的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[48]段43-47任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中β-葡糖苷酶基因已失活。
[49]段48的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述β-葡糖苷酶基因编码选自下组的β-葡糖苷酶：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:22的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[50]段43-49任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中木聚糖酶I基因已失活。
[51]段50的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述木聚糖酶I基因编码选自下组的木聚糖酶I：(i)木聚糖酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:24的成熟多肽；(ii)木聚糖酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:24的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[52]段43-51任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中木聚糖酶II基因已失活。
[53]段52的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述木聚糖酶II基因编码选自下组的木聚糖酶II：(i)木聚糖酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:26的成熟多肽；(ii)木聚糖酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:26的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[54]段43-53任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中里氏木霉木聚糖酶III基因已失活。
[55]段54的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述木聚糖酶III基因编码选自下组的木聚糖酶III：(i)木聚糖酶III，其包含或组成为SEQ ID NO:28的成熟多肽；(ii)木聚糖酶III，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:28的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶III，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶III，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[56]段43-55任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中β-木糖苷酶基因已失活。
[57]段56的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述β-木糖苷酶基因编码选自下组的β-木糖苷酶：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:30的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:30的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[58]段23-55任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其进一步包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。
[59]段58的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。
[60]段58的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[61]段58-60任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中一种或多种酶对于所述丝状真菌宿主细胞是天然的。
[62]段61的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述对于丝状真菌宿主细胞天然的酶是内切葡聚糖酶。
[63]段62的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶I。
[64]段62的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶II。
[65]一种产生酶组合物的方法，其包括：(a)在有助于所述酶组合物产生的条件下培养段23-64任一项的宿主细胞；和任选地(b)回收所述酶组合物。
[66]一种降解纤维素材料的工艺，其包括用段1-22任一项所述酶组合物处理所述纤维素材料。
[67]段66的工艺，其中所述纤维素材料经预处理。
[68]段66或67的工艺，进一步包括回收降解的纤维素材料。
[69]段68的工艺，其中所述降解的纤维素材料是糖。
[70]段69的工艺，其中所述糖选自下组：葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，和阿拉伯糖。
[71]一种用于产生发酵产物的工艺，其包括：(a)用段1-22任一项的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
[72]段71的工艺，其中所述纤维素材料经预处理。
[73]段71或72的工艺，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。
[74]段71-73任一项的工艺，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
[75]一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料用段1-22任一项的酶组合物糖化。
[76]段75的工艺，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[77]段76的工艺，进一步包括从发酵回收发酵产物。
[78]段76或77的工艺，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
[79]段75-78任一项的工艺，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
[80]段47-49的酶组合物，进一步包含木霉属内切葡聚糖酶I，木霉属内切葡聚糖酶II，或木霉属内切葡聚糖酶I和木霉属内切葡聚糖酶II。
[81]段80的酶组合物，其中所述木霉属木霉属内切葡聚糖酶I是里氏木霉内切葡聚糖酶I。
[82]段80的酶组合物，其中所述木霉属内切葡聚糖酶II是里氏木霉内切葡聚糖酶II。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。
SEQUENCE LISTING
<110>诺维信股份有限公司
<120> 纤维素分解酶组合物及其用途
<130> 12298-WO-PCT
<150> US 61/526,833
<151> 2011-08-24
<150> US 61/577,609
<151> 2011-12-19
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<170> PatentIn version 3.5
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tgacctcaac tccgccttcc ctgctggtac taatgtcgcc gcgacatggg acaagacact 600
cgcctacctt cgtggcaagg ccatgggtga ggaattcaac gacaagggcg tggacatttt 660
gctggggcct gctgctggtc ctctcggcaa atacccggac ggcggcagaa tctgggaagg 720
cttctctcct gatccggttc tcactggtgt acttttcgcc gaaactatca agggtatcca 780
agacgcgggt gtgattgcta ctgccaagca ttacattctg aatgaacagg agcatttccg 840
acaggttggc gaggcccagg gatatggtta caacatcacg gagacgatca gctccaacgt 900
ggatgacaag accatgcacg agttgtacct ttggtgagta gttgacactg caaatgagga 960
ccttgattga tttgactgac ctggaatgca ggccctttgc agatgctgtg cgcggtaaga 1020
ttttccgtag acttgacctc gcgacgaaga aatcgctgac gaaccatcgt agctggcgtt 1080
ggcgctgtca tgtgttccta caatcaaatc aacaacagct acggttgtca aaacagtcaa 1140
actctcaaca agctcctcaa ggctgagctg ggcttccaag gcttcgtcat gagtgactgg 1200
agcgctcacc acagcggtgt cggcgctgcc ctcgctgggt tggatatgtc gatgcctgga 1260
gacatttcct tcgacgacgg actctccttc tggggcacga acctaactgt cagtgttctt 1320
aacggcaccg ttccagcctg gcgtgtcgat gacatggctg ttcgtatcat gaccgcgtac 1380
tacaaggttg gtcgtgaccg tcttcgtatt ccccctaact tcagctcctg gacccgggat 1440
gagtacggct gggagcattc tgctgtctcc gagggagcct ggaccaaggt gaacgacttc 1500
gtcaatgtgc agcgcagtca ctctcagatc atccgtgaga ttggtgccgc tagtacagtg 1560
ctcttgaaga acacgggtgc tcttcctttg accggcaagg aggttaaagt gggtgttctc 1620
ggtgaagacg ctggttccaa cccgtggggt gctaacggct gccccgaccg cggctgtgat 1680
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cccgagcagg ctatccagcg agaggtcatc agcaacggcg gcaatgtctt tgctgtgact 1800
gataacgggg ctctcagcca gatggcagat gttgcatctc aatccaggtg agtgcgggct 1860
cttagaaaaa gaacgttctc tgaatgaagt tttttaacca ttgcgaacag cgtgtctttg 1920
gtgtttgtca acgccgactc tggagagggt ttcatcagtg tcgacggcaa cgagggtgac 1980
cgcaaaaatc tcactctgtg gaagaacggc gaggccgtca ttgacactgt tgtcagccac 2040
tgcaacaaca cgattgtggt tattcacagt gttgggcccg tcttgatcga ccggtggtat 2100
gataacccca acgtcactgc catcatctgg gccggcttgc ccggtcagga gagtggcaac 2160
tccctggtcg acgtgctcta tggccgcgtc aaccccagcg ccaagacccc gttcacctgg 2220
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aatgagaccc ccatttatga gtttggccat ggcttgagct acaccacctt tggttactct 2400
caccttcggg ttcaggccct caatagttcg agttcggcat atgtcccgac tagcggagag 2460
accaagcctg cgccaaccta tggtgagatc ggtagtgccg ccgactacct gtatcccgag 2520
ggtctcaaaa gaattaccaa gtttatttac ccttggctca actcgaccga cctcgaggat 2580
tcttctgacg acccgaacta cggctgggag gactcggagt acattcccga aggcgctagg 2640
gatgggtctc ctcaacccct cctgaaggct ggcggcgctc ctggtggtaa ccctaccctt 2700
tatcaggatc ttgttagggt gtcggccacc ataaccaaca ctggtaacgt cgccggttat 2760
gaagtccctc aattggtgag tgacccgcat gttccttgcg ttgcaatttg gctaactcgc 2820
ttctagtatg tttcactggg cggaccgaac gagcctcggg tcgttctgcg caagttcgac 2880
cgaatcttcc tggctcctgg ggagcaaaag gtttggacca cgactcttaa ccgtcgtgat 2940
ctcgccaatt gggatgtgga ggctcaggac tgggtcatca caaagtaccc caagaaagtg 3000
cacgtcggca gctcctcgcg taagctgcct ctgagagcgc ctctgccccg tgtctactag 3060
<210> 6
<211> 863
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 6
Met Arg Phe Gly Trp Leu Glu Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Ala Asn Ala Gln Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro
20 25 30
Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Asp Ala His Arg Arg Ala Val
35 40 45
Glu Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Trp Glu Met Asp Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser Val
65 70 75 80
Pro Arg Leu Gly Ile Asn Trp Gly Leu Cys Gly Gln Asp Ser Pro Leu
85 90 95
Gly Ile Arg Phe Ser Asp Leu Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Thr Asn
100 105 110
Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala
115 120 125
Met Gly Glu Glu Phe Asn Asp Lys Gly Val Asp Ile Leu Leu Gly Pro
130 135 140
Ala Ala Gly Pro Leu Gly Lys Tyr Pro Asp Gly Gly Arg Ile Trp Glu
145 150 155 160
Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr
165 170 175
Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr
180 185 190
Ile Leu Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Gly Glu Ala Gln Gly
195 200 205
Tyr Gly Tyr Asn Ile Thr Glu Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys
210 215 220
Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala
225 230 235 240
Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr
245 250 255
Gly Cys Gln Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu
260 265 270
Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ser Ala His His Ser Gly
275 280 285
Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile
290 295 300
Ser Phe Asp Asp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Ala Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val
325 330 335
Arg Ile Met Thr Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Arg Ile
340 345 350
Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Trp Glu His
355 360 365
Ser Ala Val Ser Glu Gly Ala Trp Thr Lys Val Asn Asp Phe Val Asn
370 375 380
Val Gln Arg Ser His Ser Gln Ile Ile Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser
385 390 395 400
Thr Val Leu Leu Lys Asn Thr Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu
405 410 415
Val Lys Val Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly
420 425 430
Ala Asn Gly Cys Pro Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met
435 440 445
Ala Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu
450 455 460
Gln Ala Ile Gln Arg Glu Val Ile Ser Asn Gly Gly Asn Val Phe Ala
465 470 475 480
Val Thr Asp Asn Gly Ala Leu Ser Gln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln
485 490 495
Ser Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Phe
500 505 510
Ile Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp
515 520 525
Lys Asn Gly Glu Ala Val Ile Asp Thr Val Val Ser His Cys Asn Asn
530 535 540
Thr Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Arg Trp
545 550 555 560
Tyr Asp Asn Pro Asn Val Thr Ala Ile Ile Trp Ala Gly Leu Pro Gly
565 570 575
Gln Glu Ser Gly Asn Ser Leu Val Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn
580 585 590
Pro Ser Ala Lys Thr Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr
595 600 605
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610 615 620
Asp Asp Phe Asn Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys
625 630 635 640
Arg Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr
645 650 655
Thr Phe Gly Tyr Ser His Leu Arg Val Gln Ala Leu Asn Ser Ser Ser
660 665 670
Ser Ala Tyr Val Pro Thr Ser Gly Glu Thr Lys Pro Ala Pro Thr Tyr
675 680 685
Gly Glu Ile Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Lys
690 695 700
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Asp Ser Ser Asp Asp Pro Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Glu Tyr Ile
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Pro Glu Gly Ala Arg Asp Gly Ser Pro Gln Pro Leu Leu Lys Ala Gly
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Gly Ala Pro Gly Gly Asn Pro Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Val Arg Val
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Ser Ala Thr Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Tyr Glu Val Pro
770 775 780
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Gln Asp Trp Val Ile Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser
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Ser Ser Arg Lys Leu Pro Leu Arg Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr
850 855 860
<210> 7
<211> 835
<212> DNA
<213> Penicillium sp.
<400> 7
atgctgtctt cgacgactcg caccctcgcc tttacaggcc ttgcgggcct tctgtccgct 60
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cctctcttgc agttctgtcg attaactgct ggactgcttg cttgactccc tgctgactcc 180
caacagctac agcgggtaca tcgtcaactc gttcccctac gaatccaacc caccccccgt 240
catcggctgg gccacgaccg ccaccgacct gggcttcgtc gacggcacag gataccaagg 300
cccggacatc atctgccacc ggaatgcgac gcccgcgccg ctgacagccc ccgtggccgc 360
cggcggcacc gtcgagctgc agtggacgcc gtggccggac agccaccacg gacccgtcat 420
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ttacgagccc attgcgacgt ataccattcc ggggccgcct gagccgacgt tctag 835
<210> 8
<211> 253
<212> PRT
<213> Penicillium sp.
<400> 8
Met Leu Ser Ser Thr Thr Arg Thr Leu Ala Phe Thr Gly Leu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Leu Ser Ala Pro Leu Val Lys Ala His Gly Phe Val Gln Gly Ile
20 25 30
Val Ile Gly Asp Gln Phe Tyr Ser Gly Tyr Ile Val Asn Ser Phe Pro
35 40 45
Tyr Glu Ser Asn Pro Pro Pro Val Ile Gly Trp Ala Thr Thr Ala Thr
50 55 60
Asp Leu Gly Phe Val Asp Gly Thr Gly Tyr Gln Gly Pro Asp Ile Ile
65 70 75 80
Cys His Arg Asn Ala Thr Pro Ala Pro Leu Thr Ala Pro Val Ala Ala
85 90 95
Gly Gly Thr Val Glu Leu Gln Trp Thr Pro Trp Pro Asp Ser His His
100 105 110
Gly Pro Val Ile Thr Tyr Leu Ala Pro Cys Asn Gly Asn Cys Ser Thr
115 120 125
Val Asp Lys Thr Thr Leu Glu Phe Phe Lys Ile Asp Gln Gln Gly Leu
130 135 140
Ile Asp Asp Thr Ser Pro Pro Gly Thr Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile
145 150 155 160
Ala Asn Asn Asn Ser Trp Thr Val Thr Ile Pro Asn Ser Val Ala Pro
165 170 175
Gly Asn Tyr Val Leu Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Asn
180 185 190
Asn Lys Asp Gly Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Ile Glu Val
195 200 205
Thr Gly Gly Gly Ser Asp Ala Pro Glu Gly Thr Leu Gly Glu Asp Leu
210 215 220
Tyr His Asp Thr Asp Pro Gly Ile Leu Val Asp Ile Tyr Glu Pro Ile
225 230 235 240
Ala Thr Tyr Thr Ile Pro Gly Pro Pro Glu Pro Thr Phe
245 250
<210> 9
<211> 1145
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 9
atgcgtttct cccttgccgc caccgctctt ctcgctggcc tggccacggc agcgccttcg 60
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tctacaccgc cgaggcccaa aagcagcagg ctgccgacta ctatgctagc gtcgccagtt 960
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gctag 1145
<210> 10
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<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 10
Met Arg Phe Ser Leu Ala Ala Thr Ala Leu Leu Ala Gly Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ser Asn Lys Asn Asn Val Asn Leu Asp Lys Leu Ala
20 25 30
Arg Arg Asn Gly Met Leu Trp Phe Gly Thr Ala Ala Asp Ile Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Thr Thr Asp Lys Pro Tyr Leu Ser Ile Leu Arg Lys Gln
50 55 60
Phe Gly Glu Met Thr Pro Ala Asn Ala Leu Lys Val Ser Gln Ser Asp
65 70 75 80
Phe Met Tyr Thr Glu Pro Glu Gln Asn Val Phe Asn Phe Thr Gln Gly
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Asp Tyr Phe Met Asp Leu Ala Asp His Tyr Gly His Ala Val Arg Cys
100 105 110
His Asn Leu Val Trp Ala Ser Gln Val Ser Asp Trp Val Thr Ser Arg
115 120 125
Asn Trp Thr Ala Thr Glu Leu Lys Glu Val Met Lys Asn His Ile Phe
130 135 140
Lys Thr Val Gln His Phe Gly Lys Arg Cys Tyr Ala Trp Asp Val Val
145 150 155 160
Asn Glu Ala Ile Asn Gly Asp Gly Thr Phe Ser Ser Ser Val Trp Tyr
165 170 175
Asp Thr Ile Gly Glu Glu Tyr Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Tyr Ala Gln
180 185 190
Glu Ala Leu Ala Gln Ile His Ala Asn Gln Val Lys Leu Tyr Tyr Asn
195 200 205
Asp Tyr Gly Ile Glu Asn Pro Gly Pro Lys Ala Asp Ala Val Leu Lys
210 215 220
Leu Val Ala Glu Leu Arg Lys Arg Gly Ile Arg Ile Asp Gly Val Gly
225 230 235 240
Leu Glu Ser His Phe Ile Val Gly Glu Thr Pro Ser Leu Ala Asp Gln
245 250 255
Leu Ala Thr Lys Lys Ala Tyr Ile Glu Ala Gly Leu Glu Val Ala Ile
260 265 270
Thr Glu Leu Asp Val Arg Phe Ser Gln Ala Pro Phe Tyr Thr Ala Glu
275 280 285
Ala Gln Lys Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Tyr Ala Ser Val Ala Ser Cys
290 295 300
Lys His Ala Gly Pro Arg Cys Val Gly Val Val Val Trp Asp Phe Asp
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Asp Ala Tyr Ser Trp Ile Pro Gly Thr Phe Glu Gly Gln Gly Gly Ala
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Cys Leu Tyr Asn Glu Thr Leu Glu Val Lys Pro Ala Phe Tyr Ala Ala
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Ala Glu Ala Leu Glu Asn Lys Pro Cys Thr Val Cys
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<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 11
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aaggacgtcg tcaacgagat cttcaacgag gacggctccc tccgcgacag cgtcttctcc 720
cgcgtgctgg gcgaggactt tgtgcggatt gccttcgaga cggcgcgctc tgtggatccc 780
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accttggtgc gggtgcttcg tccagcgtca aaggataagt ctccttggtt ttcttgccta 1080
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ctcctgattg ccagtggcag ggtcatcgat actaatagaa acaggtcgtc aaggcatgcc 1260
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<212> PRT
<213> 烟曲霉
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Met Val Val Leu Ser Lys Leu Val Ser Ser Ile Leu Phe Val Ser Leu
1 5 10 15
Val Ser Ala Gly Val Ile Asp Glu Arg Gln Ala Ala Gly Ile Asn Gln
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Ala Leu Leu Gln Lys Ser Gln Asn Glu Ala Ile Val Arg Lys Asp Phe
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Gly Gln Leu Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Ala
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Ser Gln Gly Arg Phe Asn Phe Ala Gly Ala Asp Phe Leu Val Asn Tyr
85 90 95
Ala Lys Gln Asn Gly Lys Lys Val Arg Gly His Thr Leu Trp His Ser
100 105 110
Gln Leu Pro Ser Trp Val Ser Ala Ile Ser Asp Lys Asn Thr Leu Thr
115 120 125
Ser Val Leu Lys Asn His Ile Thr Thr Val Met Thr Arg Tyr Lys Gly
130 135 140
Gln Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ile Phe Asn Glu Asp Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Asp Ser Val Phe Ser Arg Val Leu Gly Glu Asp Phe Val
165 170 175
Arg Ile Ala Phe Glu Thr Ala Arg Ser Val Asp Pro Ser Ala Lys Leu
180 185 190
Tyr Ile Asn Asp Tyr Lys Leu Asp Ser Ala Ser Tyr Gly Lys Thr Gln
195 200 205
Gly Met Val Arg Tyr Val Lys Lys Trp Leu Ala Ala Gly Ile Pro Ile
210 215 220
Asp Gly Ile Gly Gln Thr His Leu Gly Ala Gly Ala Ser Ser Ser Val
225 230 235 240
Lys Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Ser Ser Gly Val Ser Glu Val Ala
245 250 255
Ile Thr Glu Leu Asp Ile Ala Gly Ala Ser Ser Gln Asp Tyr Val Asn
260 265 270
Val Val Lys Ala Cys Leu Asp Val Pro Lys Cys Val Gly Ile Thr Val
275 280 285
Trp Gly Val Ser Asp Arg Asp Ser Trp Arg Ser Gly Ser Ser Pro Leu
290 295 300
Leu Phe Asp Ser Asn Tyr Gln Pro Lys Ala Ala Tyr Asn Ala Ile Ile
305 310 315 320
Ala Ala Leu
<210> 13
<211> 1415
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 13
atggtccatc tatcttcatt ggcagcagcc ctggctgctc tgcctctgta tgtttaccca 60
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atgaagaatc atatcaccaa tgtggttact cactacaagg ggaagtgcta cgcctgggat 600
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gcaccactgg ctgcgtgggt gtcactatct gggactggac cgacaagtac tcctgggtcc 1140
ccagcgtgtt ccaaggctac ggcgccccat tgccttggga tgagaactat gtgaagaagc 1200
cagcgtacga tggcctgatg gcgggtcttg gagcaagcgg ctccggcacc acaacgacca 1260
ctactactac ttctactacg acaggaggta cggaccctac tggagtcgct cagaaatggg 1320
gacagtgtgg cggtattggc tggaccgggc caacaacttg tgtcagtggt accacttgcc 1380
aaaagctgaa tgactggtac tcacagtgcc tgtaa 1415
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<211> 397
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 14
Met Val His Leu Ser Ser Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Leu
1 5 10 15
Val Tyr Gly Ala Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Lys Gly Leu Lys
20 25 30
Tyr Phe Gly Ser Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Thr Asp Ser Ala Tyr
35 40 45
Val Ala Gln Leu Ser Asn Thr Asp Asp Phe Gly Gln Ile Thr Pro Gly
50 55 60
Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Asn Ser Phe Ser
65 70 75 80
Phe Ala Asn Gly Asp Ala Val Val Asn Leu Ala Asn Lys Asn Gly Gln
85 90 95
Leu Met Arg Cys His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Asn Trp
100 105 110
Val Ser Ser Gly Ser Trp Thr Asn Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Lys
115 120 125
Asn His Ile Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Lys Cys Tyr Ala
130 135 140
Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu Asn Glu Asp Gly Thr Phe Arg Asn
145 150 155 160
Ser Val Phe Tyr Gln Ile Ile Gly Pro Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe
165 170 175
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Pro Asp Val Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp
180 185 190
Tyr Asn Ile Glu Tyr Ser Gly Ala Lys Ala Thr Ala Ala Gln Asn Ile
195 200 205
Val Lys Met Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Lys Ile Asp Gly Val Gly Leu
210 215 220
Gln Ala His Phe Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Gln Ser Asp Leu Thr
225 230 235 240
Thr Val Leu Lys Gly Tyr Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Tyr Thr
245 250 255
Glu Leu Asp Ile Arg Met Gln Leu Pro Ser Thr Ala Ala Lys Leu Ala
260 265 270
Gln Gln Ser Thr Asp Phe Gln Gly Val Ala Ala Ala Cys Val Ser Thr
275 280 285
Thr Gly Cys Val Gly Val Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser
290 295 300
Trp Val Pro Ser Val Phe Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Leu Pro Trp Asp
305 310 315 320
Glu Asn Tyr Val Lys Lys Pro Ala Tyr Asp Gly Leu Met Ala Gly Leu
325 330 335
Gly Ala Ser Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Thr
340 345 350
Thr Thr Gly Gly Thr Asp Pro Thr Gly Val Ala Gln Lys Trp Gly Gln
355 360 365
Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr
370 375 380
Thr Cys Gln Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
385 390 395
<210> 15
<211> 2376
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 15
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caggcgaata caagctatgt tgattacaat gtggaggcga atccggatct cacccctcag 120
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aataacgttg ggcggtatgg gctggacgtg tacgccccga atataaatgc attcagatcg 540
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tatgcgtacg agtatatcac tggcatccag ggtggtgttg atccggaaca cctcaagttg 660
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<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 16
Met Ala Val Ala Lys Ser Ile Ala Ala Val Leu Val Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Leu Ala Gln Ala Asn Thr Ser Tyr Val Asp Tyr Asn Val Glu
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Ala Asn Pro Asp Leu Thr Pro Gln Ser Val Ala Thr Ile Asp Leu Ser
35 40 45
Phe Pro Asp Cys Glu Asn Gly Pro Leu Ser Lys Thr Leu Val Cys Asp
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Thr Ser Ala Arg Pro His Asp Arg Ala Ala Ala Leu Val Ser Met Phe
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Thr Phe Glu Glu Leu Val Asn Asn Thr Gly Asn Thr Ser Pro Gly Val
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Gly Leu Asp Arg Ala Asn Phe Thr Asn Glu Gly Glu Tyr Ser Trp Ala
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Leu Ile Asn Gln Ile Ala Thr Ile Ile Ala Thr Gln Gly Arg Ala Phe
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Asn Asn Val Gly Arg Tyr Gly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Ile Asn
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195 200 205
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Leu Gly Asn Asp Met Asn Ile Thr Gln Gln Glu Leu Ser Glu Tyr Tyr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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His Glu Phe Ala Ala Asn Ile Thr Gly Ala Ala Ala Asp Ser Ile Arg
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Asn Ser Asp Phe Asp Val Asn Tyr Ala Phe Gly Thr Asn Ile Ser Ser
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<212> DNA
<213> 里氏木霉
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<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 18
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1 5 10 15
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Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala
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Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
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Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
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Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
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Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
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Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
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Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
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Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
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Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
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Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
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500 505 510
Cys Leu
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<211> 1611
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 19
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165 170 175
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180 185 190
Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu
195 200 205
Tyr Ser Ile Ala Asp Gly Gly Val Ala Lys Tyr Lys Asn Tyr Ile Asp
210 215 220
Thr Ile Arg Gln Ile Val Val Glu Tyr Ser Asp Ile Arg Thr Leu Leu
225 230 235 240
Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Gly Thr
245 250 255
Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Ile Asn Tyr
260 265 270
Ala Val Thr Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala
275 280 285
Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Gln Asp Pro Ala Ala
290 295 300
Gln Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala Ser Ser Pro Arg Ala Leu
305 310 315 320
Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Asn Ile Thr
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<213> 里氏木霉
<400> 21
atgggatttg gccgcaatgc tgccgagccc gagtgtttct gcaacgttat ccaggagatt 60
tgcgcttgcc caagagggag ttgacgggga gagtcccaac tggttccttc agtaacgcca 120
ccctggcaga ctatataact tgtggacaag actctgcttt gttgagttct tcctaccagt 180
cttgaccaag accattctgt tgagcccaat cagaaatgcg ttaccgaaca gcagctgcgc 240
tggcacttgc cactgggccc tttgctaggg cagacagtca gtatagctgg tccatactgg 300
gatgtatatg tatcctggag acaccatgct gactcttgaa tcaaggtagc tcaacatcgg 360
gggcctcggc tgaggcagtt gtacctcctg cagggactcc atggggaacc gcgtacgaca 420
aggcgaaggc cgcattggca aagctcaatc tccaagataa ggtcggcatc gtgagcggtg 480
tcggctggaa cggcggtcct tgcgttggaa acacatctcc ggcctccaag atcagctatc 540
catcgctatg ccttcaagac ggacccctcg gtgttcgata ctcgacaggc agcacagcct 600
ttacgccggg cgttcaagcg gcctcgacgt gggatgtcaa tttgatccgc gaacgtggac 660
agttcatcgg tgaggaggtg aaggcctcgg ggattcatgt catacttggt cctgtggctg 720
ggccgctggg aaagactccg cagggcggtc gcaactggga gggcttcggt gtcgatccat 780
atctcacggg cattgccatg ggtcaaacca tcaacggcat ccagtcggta ggcgtgcagg 840
cgacagcgaa gcactatatc ctcaacgagc aggagctcaa tcgagaaacc atttcgagca 900
acccagatga ccgaactctc catgagctgt atacttggcc atttgccgac gcggttcagg 960
ccaatgtcgc ttctgtcatg tgctcgtaca acaaggtcaa taccacctgg gcctgcgagg 1020
atcagtacac gctgcagact gtgctgaaag accagctggg gttcccaggc tatgtcatga 1080
cggactggaa cgcacagcac acgactgtcc aaagcgcgaa ttctgggctt gacatgtcaa 1140
tgcctggcac agacttcaac ggtaacaatc ggctctgggg tccagctctc accaatgcgg 1200
taaatagcaa tcaggtcccc acgagcagag tcgacgatat ggtgactcgt atcctcgccg 1260
catggtactt gacaggccag gaccaggcag gctatccgtc gttcaacatc agcagaaatg 1320
ttcaaggaaa ccacaagacc aatgtcaggg caattgccag ggacggcatc gttctgctca 1380
agaatgacgc caacatcctg ccgctcaaga agcccgctag cattgccgtc gttggatctg 1440
ccgcaatcat tggtaaccac gccagaaact cgccctcgtg caacgacaaa ggctgcgacg 1500
acggggcctt gggcatgggt tggggttccg gcgccgtcaa ctatccgtac ttcgtcgcgc 1560
cctacgatgc catcaatacc agagcgtctt cgcagggcac ccaggttacc ttgagcaaca 1620
ccgacaacac gtcctcaggc gcatctgcag caagaggaaa ggacgtcgcc atcgtcttca 1680
tcaccgccga ctcgggtgaa ggctacatca ccgtggaggg caacgcgggc gatcgcaaca 1740
acctggatcc gtggcacaac ggcaatgccc tggtccaggc ggtggccggt gccaacagca 1800
acgtcattgt tgttgtccac tccgttggcg ccatcattct ggagcagatt cttgctcttc 1860
cgcaggtcaa ggccgttgtc tgggcgggtc ttccttctca ggagagcggc aatgcgctcg 1920
tcgacgtgct gtggggagat gtcagccctt ctggcaagct ggtgtacacc attgcgaaga 1980
gccccaatga ctataacact cgcatcgttt ccggcggcag tgacagcttc agcgagggac 2040
tgttcatcga ctataagcac ttcgacgacg ccaatatcac gccgcggtac gagttcggct 2100
atggactgtg taagtttgct aacctgaaca atctattaga caggttgact gacggatgac 2160
tgtggaatga tagcttacac caagttcaac tactcacgcc tctccgtctt gtcgaccgcc 2220
aagtctggtc ctgcgactgg ggccgttgtg ccgggaggcc cgagtgatct gttccagaat 2280
gtcgcgacag tcaccgttga catcgcaaac tctggccaag tgactggtgc cgaggtagcc 2340
cagctgtaca tcacctaccc atcttcagca cccaggaccc ctccgaagca gctgcgaggc 2400
tttgccaagc tgaacctcac gcctggtcag agcggaacag caacgttcaa catccgacga 2460
cgagatctca gctactggga cacggcttcg cagaaatggg tggtgccgtc ggggtcgttt 2520
ggcatcagcg tgggagcgag cagccgggat atcaggctga cgagcactct gtcggtagcg 2580
tagcgcgagg agggtgaagg cggttgacct gtgac 2615
<210> 22
<211> 744
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 22
Met Arg Tyr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Pro Phe
1 5 10 15
Ala Arg Ala Asp Ser His Ser Thr Ser Gly Ala Ser Ala Glu Ala Val
20 25 30
Val Pro Pro Ala Gly Thr Pro Trp Gly Thr Ala Tyr Asp Lys Ala Lys
35 40 45
Ala Ala Leu Ala Lys Leu Asn Leu Gln Asp Lys Val Gly Ile Val Ser
50 55 60
Gly Val Gly Trp Asn Gly Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Ser Pro Ala
65 70 75 80
Ser Lys Ile Ser Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly
85 90 95
Val Arg Tyr Ser Thr Gly Ser Thr Ala Phe Thr Pro Gly Val Gln Ala
100 105 110
Ala Ser Thr Trp Asp Val Asn Leu Ile Arg Glu Arg Gly Gln Phe Ile
115 120 125
Gly Glu Glu Val Lys Ala Ser Gly Ile His Val Ile Leu Gly Pro Val
130 135 140
Ala Gly Pro Leu Gly Lys Thr Pro Gln Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly
145 150 155 160
Phe Gly Val Asp Pro Tyr Leu Thr Gly Ile Ala Met Gly Gln Thr Ile
165 170 175
Asn Gly Ile Gln Ser Val Gly Val Gln Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile
180 185 190
Leu Asn Glu Gln Glu Leu Asn Arg Glu Thr Ile Ser Ser Asn Pro Asp
195 200 205
Asp Arg Thr Leu His Glu Leu Tyr Thr Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val
210 215 220
Gln Ala Asn Val Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Val Asn Thr
225 230 235 240
Thr Trp Ala Cys Glu Asp Gln Tyr Thr Leu Gln Thr Val Leu Lys Asp
245 250 255
Gln Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Val Met Thr Asp Trp Asn Ala Gln His
260 265 270
Thr Thr Val Gln Ser Ala Asn Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly
275 280 285
Thr Asp Phe Asn Gly Asn Asn Arg Leu Trp Gly Pro Ala Leu Thr Asn
290 295 300
Ala Val Asn Ser Asn Gln Val Pro Thr Ser Arg Val Asp Asp Met Val
305 310 315 320
Thr Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gln Asp Gln Ala Gly
325 330 335
Tyr Pro Ser Phe Asn Ile Ser Arg Asn Val Gln Gly Asn His Lys Thr
340 345 350
Asn Val Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp
355 360 365
Ala Asn Ile Leu Pro Leu Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Val Val Gly
370 375 380
Ser Ala Ala Ile Ile Gly Asn His Ala Arg Asn Ser Pro Ser Cys Asn
385 390 395 400
Asp Lys Gly Cys Asp Asp Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser Gly
405 410 415
Ala Val Asn Tyr Pro Tyr Phe Val Ala Pro Tyr Asp Ala Ile Asn Thr
420 425 430
Arg Ala Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Asn
435 440 445
Thr Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ala Arg Gly Lys Asp Val Ala Ile Val
450 455 460
Phe Ile Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly Asn
465 470 475 480
Ala Gly Asp Arg Asn Asn Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Ala Leu
485 490 495
Val Gln Ala Val Ala Gly Ala Asn Ser Asn Val Ile Val Val Val His
500 505 510
Ser Val Gly Ala Ile Ile Leu Glu Gln Ile Leu Ala Leu Pro Gln Val
515 520 525
Lys Ala Val Val Trp Ala Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala
530 535 540
Leu Val Asp Val Leu Trp Gly Asp Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val
545 550 555 560
Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Asp Tyr Asn Thr Arg Ile Val Ser
565 570 575
Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Lys His
580 585 590
Phe Asp Asp Ala Asn Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu
595 600 605
Ser Tyr Thr Lys Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Val Leu Ser Thr Ala
610 615 620
Lys Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser Asp
625 630 635 640
Leu Phe Gln Asn Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser Gly
645 650 655
Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Thr Tyr Pro Ser
660 665 670
Ser Ala Pro Arg Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys Leu
675 680 685
Asn Leu Thr Pro Gly Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg Arg
690 695 700
Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val Pro
705 710 715 720
Ser Gly Ser Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg
725 730 735
Leu Thr Ser Thr Leu Ser Val Ala
740
<210> 23
<211> 752
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 23
atggttgcct tttccagcct catctgcgct ctcaccagca tcgccagtac tctggcgatg 60
cccacaggcc tcgagcctga gagcagtgtc aacgtcacag agcgtggcat gtacgacttt 120
gttcttggag ctcacaatga tcatcgccgt cgtgctagca tcaactacga ccaaaactac 180
caaactggcg gacaagtcag ctattcgcct tccaacactg gcttctcagt gaactggaac 240
actcaagatg actttgttgt gggcgttggt tggacgactg gatcttctgc gtaggaggac 300
tcctcatcat tctgcacttt gaaagcatct tctgaccaaa agcttctctt agtcccatca 360
actttggcgg ctcttttagt gtcaacagcg gaactggcct gctttccgtc tatggctgga 420
gcaccaaccc actggttgag tactacatca tggaggacaa ccacaactac ccagcacagg 480
gtaccgtcaa gggaaccgtc accagcgacg gagccactta caccatctgg gagaataccc 540
gtgtcaacga gccttccatc cagggcacag cgaccttcaa ccagtacatt tccgtgcgga 600
actcgcccag gaccagcgga actgttactg tgcagaacca cttcaatgct tgggcctcgc 660
ttggcctgca ccttgggcag atgaactacc aggttgtcgc tgtcgaaggc tggggtggta 720
gtggttctgc ctcacagagt gtcagcaact ag 752
<210> 24
<211> 229
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 24
Met Val Ala Phe Ser Ser Leu Ile Cys Ala Leu Thr Ser Ile Ala Ser
1 5 10 15
Thr Leu Ala Met Pro Thr Gly Leu Glu Pro Glu Ser Ser Val Asn Val
20 25 30
Thr Glu Arg Gly Met Tyr Asp Phe Val Leu Gly Ala His Asn Asp His
35 40 45
Arg Arg Arg Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gln Asn Tyr Gln Thr Gly Gly
50 55 60
Gln Val Ser Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Val Asn Trp Asn
65 70 75 80
Thr Gln Asp Asp Phe Val Val Gly Val Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser
85 90 95
Ala Pro Ile Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Val Asn Ser Gly Thr Gly
100 105 110
Leu Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr
115 120 125
Ile Met Glu Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gln Gly Thr Val Lys Gly
130 135 140
Thr Val Thr Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg
145 150 155 160
Val Asn Glu Pro Ser Ile Gln Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gln Tyr Ile
165 170 175
Ser Val Arg Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Gln Asn
180 185 190
His Phe Asn Ala Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gln Met Asn
195 200 205
Tyr Gln Val Val Ala Val Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser
210 215 220
Gln Ser Val Ser Asn
225
<210> 25
<211> 796
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 25
caagaagaca tcaacatggt ctccttcacc tccctcctcg ccggcgtcgc cgccatctcg 60
ggcgtcttgg ccgctcccgc cgccgaggtc gaatccgtgg ctgtggagaa gcgccagacg 120
attcagcccg gcacgggcta caacaacggc tacttctact cgtactggaa cgatggccac 180
ggcggcgtga cgtacaccaa tggtcccggc gggcagttct ccgtcaactg gtccaactcg 240
ggcaactttg tcggcggcaa gggatggcag cccggcacca agaacaagta agactaccta 300
ctcttacccc ctttgaccaa cacagcacaa cacaatacaa cacatgtgac taccaatcat 360
ggaatcggat ctaacagctg tgttttcaaa aaaaagggtc atcaacttct cgggcagcta 420
caaccccaac ggcaacagct acctctccgt gtacggctgg tcccgcaacc ccctgatcga 480
gtactacatc gtcgagaact ttggcaccta caacccgtcc acgggcgcca ccaagctggg 540
cgaggtcacc tccgacggca gcgtctacga catttaccgc acgcagcgcg tcaaccagcc 600
gtccatcatc ggcaccgcca ccttttacca gtactggtcc gtccgccgca accaccgctc 660
gagcggctcc gtcaacacgg cgaaccactt caacgcgtgg gctcagcaag gcctgacgct 720
cgggacgatg gattaccaga ttgttgccgt ggagggttac tttagctctg gctctgcttc 780
catcaccgtc agctaa 796
<210> 26
<211> 223
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 26
Met Val Ser Phe Thr Ser Leu Leu Ala Gly Val Ala Ala Ile Ser Gly
1 5 10 15
Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Val Glu Ser Val Ala Val Glu Lys
20 25 30
Arg Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr
35 40 45
Ser Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro
50 55 60
Gly Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly
65 70 75 80
Gly Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp
100 105 110
Ser Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr
115 120 125
Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp
130 135 140
Gly Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser
145 150 155 160
Ile Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn
165 170 175
His Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp
180 185 190
Ala Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala
195 200 205
Val Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser
210 215 220
<210> 27
<211> 1352
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 27
atgaaagcaa acgtcatctt gtgcctcctg gcccccctgg tcgccgctct ccccaccgaa 60
accatccacc tcgaccccga gctcgccgct ctccgcgcca acctcaccga gcgaacagcc 120
gacctctggg accgccaagc ctctcaaagc atcgaccagc tcatcaagag aaaaggcaag 180
ctctactttg gcaccgccac cgaccgcggc ctcctccaac gggaaaagaa cgcggccatc 240
atccaggcag acctcggcca ggtgacgccg gagaacagca tgaagtggca gtcgctcgag 300
aacaaccaag gccagctgaa ctggggagac gccgactatc tcgtcaactt tgcccagcaa 360
aacggcaagt cgatacgcgg ccacactctg atctggcact cgcagctgcc tgcgtgggtg 420
aacaatatca acaacgcgga tactctgcgg caagtcatcc gcacccatgt ctctactgtg 480
gttgggcggt acaagggcaa gattcgtgct tgggtgagtt ttgaacacca catgcccctt 540
ttcttagtcc gctcctcctc ctcttggaac ttctcacagt tatagccgta tacaacattc 600
gacaggaaat ttaggatgac aactactgac tgacttgtgt gtgtgatggc gataggacgt 660
ggtcaatgaa atcttcaacg aggatggaac gctgcgctct tcagtctttt ccaggctcct 720
cggcgaggag tttgtctcga ttgcctttcg tgctgctcga gatgctgacc cttctgcccg 780
tctttacatc aacgactaca atctcgaccg cgccaactat ggcaaggtca acgggttgaa 840
gacttacgtc tccaagtgga tctctcaagg agttcccatt gacggtattg gtgagccacg 900
acccctaaat gtcccccatt agagtctctt tctagagcca aggcttgaag ccattcaggg 960
actgacacga gagccttctc tacaggaagc cagtcccatc tcagcggcgg cggaggctct 1020
ggtacgctgg gtgcgctcca gcagctggca acggtacccg tcaccgagct ggccattacc 1080
gagctggaca ttcagggggc accgacgacg gattacaccc aagttgttca agcatgcctg 1140
agcgtctcca agtgcgtcgg catcaccgtg tggggcatca gtgacaaggt aagttgcttc 1200
ccctgtctgt gcttatcaac tgtaagcagc aacaactgat gctgtctgtc tttacctagg 1260
actcgtggcg tgccagcacc aaccctcttc tgtttgacgc aaacttcaac cccaagccgg 1320
catataacag cattgttggc atcttacaat ag 1352
<210> 28
<211> 347
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 28
Met Lys Ala Asn Val Ile Leu Cys Leu Leu Ala Pro Leu Val Ala Ala
1 5 10 15
Leu Pro Thr Glu Thr Ile His Leu Asp Pro Glu Leu Ala Ala Leu Arg
20 25 30
Ala Asn Leu Thr Glu Arg Thr Ala Asp Leu Trp Asp Arg Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Asp Gln Leu Ile Lys Arg Lys Gly Lys Leu Tyr Phe Gly
50 55 60
Thr Ala Thr Asp Arg Gly Leu Leu Gln Arg Glu Lys Asn Ala Ala Ile
65 70 75 80
Ile Gln Ala Asp Leu Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp
85 90 95
Gln Ser Leu Glu Asn Asn Gln Gly Gln Leu Asn Trp Gly Asp Ala Asp
100 105 110
Tyr Leu Val Asn Phe Ala Gln Gln Asn Gly Lys Ser Ile Arg Gly His
115 120 125
Thr Leu Ile Trp His Ser Gln Leu Pro Ala Trp Val Asn Asn Ile Asn
130 135 140
Asn Ala Asp Thr Leu Arg Gln Val Ile Arg Thr His Val Ser Thr Val
145 150 155 160
Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp Asp Val Val Asn Glu
165 170 175
Ile Phe Asn Glu Asp Gly Thr Leu Arg Ser Ser Val Phe Ser Arg Leu
180 185 190
Leu Gly Glu Glu Phe Val Ser Ile Ala Phe Arg Ala Ala Arg Asp Ala
195 200 205
Asp Pro Ser Ala Arg Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Arg Ala
210 215 220
Asn Tyr Gly Lys Val Asn Gly Leu Lys Thr Tyr Val Ser Lys Trp Ile
225 230 235 240
Ser Gln Gly Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Ser His Leu Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ala Leu Gln Gln Leu Ala Thr
260 265 270
Val Pro Val Thr Glu Leu Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gln Gly Ala
275 280 285
Pro Thr Thr Asp Tyr Thr Gln Val Val Gln Ala Cys Leu Ser Val Ser
290 295 300
Lys Cys Val Gly Ile Thr Val Trp Gly Ile Ser Asp Lys Asp Ser Trp
305 310 315 320
Arg Ala Ser Thr Asn Pro Leu Leu Phe Asp Ala Asn Phe Asn Pro Lys
325 330 335
Pro Ala Tyr Asn Ser Ile Val Gly Ile Leu Gln
340 345
<210> 29
<211> 2564
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 29
ggacagccgg acgcaatggt gaataacgca gctcttctcg ccgccctgtc ggctctcctg 60
cccacggccc tggcgcagaa caatcaaaca tacgccaact actctgctca gggccagcct 120
gatctctacc ccgagacact tgccacgctc acactctcgt tccccgactg cgaacatggc 180
cccctcaaga acaatctcgt ctgtgactca tcggccggct atgtagagcg agcccaggcc 240
ctcatctcgc tcttcaccct cgaggagctc attctcaaca cgcaaaactc gggccccggc 300
gtgcctcgcc tgggtcttcc gaactaccaa gtctggaatg aggctctgca cggcttggac 360
cgcgccaact tcgccaccaa gggcggccag ttcgaatggg cgacctcgtt ccccatgccc 420
atcctcacta cggcggccct caaccgcaca ttgatccacc agattgccga catcatctcg 480
acccaagctc gagcattcag caacagcggc cgttacggtc tcgacgtcta tgcgccaaac 540
gtcaatggct tccgaagccc cctctggggc cgtggccagg agacgcccgg cgaagacgcc 600
tttttcctca gctccgccta tacttacgag tacatcacgg gcatccaggg tggcgtcgac 660
cctgagcacc tcaaggttgc cgccacggtg aagcactttg ccggatacga cctcgagaac 720
tggaacaacc agtcccgtct cggtttcgac gccatcataa ctcagcagga cctctccgaa 780
tactacactc cccagttcct cgctgcggcc cgttatgcaa agtcacgcag cttgatgtgc 840
gcatacaact ccgtcaacgg cgtgcccagc tgtgccaaca gcttcttcct gcagacgctt 900
ttgcgcgaga gctggggctt ccccgaatgg ggatacgtct cgtccgattg cgatgccgtc 960
tacaacgttt tcaaccctca tgactacgcc agcaaccagt cgtcagccgc cgccagctca 1020
ctgcgagccg gcaccgatat cgactgcggt cagacttacc cgtggcacct caacgagtcc 1080
tttgtggccg gcgaagtctc ccgcggcgag atcgagcggt ccgtcacccg tctgtacgcc 1140
aacctcgtcc gtctcggata cttcgacaag aagaaccagt accgctcgct cggttggaag 1200
gatgtcgtca agactgatgc ctggaacatc tcgtacgagg ctgctgttga gggcatcgtc 1260
ctgctcaaga acgatggcac tctccctctg tccaagaagg tgcgcagcat tgctctgatc 1320
ggaccatggg ccaatgccac aacccaaatg caaggcaact actatggccc tgccccatac 1380
ctcatcagcc ctctggaagc tgctaagaag gccggctatc acgtcaactt tgaactcggc 1440
acagagatcg ccggcaacag caccactggc tttgccaagg ccattgctgc cgccaagaag 1500
tcggatgcca tcatctacct cggtggaatt gacaacacca ttgaacagga gggcgctgac 1560
cgcacggaca ttgcttggcc cggtaatcag ctggatctca tcaagcagct cagcgaggtc 1620
ggcaaacccc ttgtcgtcct gcaaatgggc ggtggtcagg tagactcatc ctcgctcaag 1680
agcaacaaga aggtcaactc cctcgtctgg ggcggatatc ccggccagtc gggaggcgtt 1740
gccctcttcg acattctctc tggcaagcgt gctcctgccg gccgactggt caccactcag 1800
tacccggctg agtatgttca ccaattcccc cagaatgaca tgaacctccg acccgatgga 1860
aagtcaaacc ctggacagac ttacatctgg tacaccggca aacccgtcta cgagtttggc 1920
agtggtctct tctacaccac cttcaaggag actctcgcca gccaccccaa gagcctcaag 1980
ttcaacacct catcgatcct ctctgctcct caccccggat acacttacag cgagcagatt 2040
cccgtcttca ccttcgaggc caacatcaag aactcgggca agacggagtc cccatatacg 2100
gccatgctgt ttgttcgcac aagcaacgct ggcccagccc cgtacccgaa caagtggctc 2160
gtcggattcg accgacttgc cgacatcaag cctggtcact cttccaagct cagcatcccc 2220
atccctgtca gtgctctcgc ccgtgttgat tctcacggaa accggattgt ataccccggc 2280
aagtatgagc tagccttgaa caccgacgag tctgtgaagc ttgagtttga gttggtggga 2340
gaagaggtaa cgattgagaa ctggccgttg gaggagcaac agatcaagga tgctacacct 2400
gacgcataag ggttttaatg atgttgttat gacaaacggg tagagtagtt aatgatggaa 2460
taggaagagg ccatagtttt ctgtttgcaa accatttttg ccattgcgaa aaaaaaaaaa 2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2564
<210> 30
<211> 780
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 30
Met Val Asn Asn Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Thr Ala Leu Ala Gln Asn Asn Gln Thr Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Gln
20 25 30
Gly Gln Pro Asp Leu Tyr Pro Glu Thr Leu Ala Thr Leu Thr Leu Ser
35 40 45
Phe Pro Asp Cys Glu His Gly Pro Leu Lys Asn Asn Leu Val Cys Asp
50 55 60
Ser Ser Ala Gly Tyr Val Glu Arg Ala Gln Ala Leu Ile Ser Leu Phe
65 70 75 80
Thr Leu Glu Glu Leu Ile Leu Asn Thr Gln Asn Ser Gly Pro Gly Val
85 90 95
Pro Arg Leu Gly Leu Pro Asn Tyr Gln Val Trp Asn Glu Ala Leu His
100 105 110
Gly Leu Asp Arg Ala Asn Phe Ala Thr Lys Gly Gly Gln Phe Glu Trp
115 120 125
Ala Thr Ser Phe Pro Met Pro Ile Leu Thr Thr Ala Ala Leu Asn Arg
130 135 140
Thr Leu Ile His Gln Ile Ala Asp Ile Ile Ser Thr Gln Ala Arg Ala
145 150 155 160
Phe Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Gly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Val
165 170 175
Asn Gly Phe Arg Ser Pro Leu Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly
180 185 190
Glu Asp Ala Phe Phe Leu Ser Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Tyr Ile Thr
195 200 205
Gly Ile Gln Gly Gly Val Asp Pro Glu His Leu Lys Val Ala Ala Thr
210 215 220
Val Lys His Phe Ala Gly Tyr Asp Leu Glu Asn Trp Asn Asn Gln Ser
225 230 235 240
Arg Leu Gly Phe Asp Ala Ile Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ser Glu Tyr
245 250 255
Tyr Thr Pro Gln Phe Leu Ala Ala Ala Arg Tyr Ala Lys Ser Arg Ser
260 265 270
Leu Met Cys Ala Tyr Asn Ser Val Asn Gly Val Pro Ser Cys Ala Asn
275 280 285
Ser Phe Phe Leu Gln Thr Leu Leu Arg Glu Ser Trp Gly Phe Pro Glu
290 295 300
Trp Gly Tyr Val Ser Ser Asp Cys Asp Ala Val Tyr Asn Val Phe Asn
305 310 315 320
Pro His Asp Tyr Ala Ser Asn Gln Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Leu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Ser Val Thr Arg Leu Tyr Ala Asn Leu Val Arg Leu Gly Tyr Phe Asp
370 375 380
Lys Lys Asn Gln Tyr Arg Ser Leu Gly Trp Lys Asp Val Val Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ala Trp Asn Ile Ser Tyr Glu Ala Ala Val Glu Gly Ile Val Leu
405 410 415
Leu Lys Asn Asp Gly Thr Leu Pro Leu Ser Lys Lys Val Arg Ser Ile
420 425 430
Ala Leu Ile Gly Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Met Gln Gly Asn
435 440 445
Tyr Tyr Gly Pro Ala Pro Tyr Leu Ile Ser Pro Leu Glu Ala Ala Lys
450 455 460
Lys Ala Gly Tyr His Val Asn Phe Glu Leu Gly Thr Glu Ile Ala Gly
465 470 475 480
Asn Ser Thr Thr Gly Phe Ala Lys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ser
485 490 495
Asp Ala Ile Ile Tyr Leu Gly Gly Ile Asp Asn Thr Ile Glu Gln Glu
500 505 510
Gly Ala Asp Arg Thr Asp Ile Ala Trp Pro Gly Asn Gln Leu Asp Leu
515 520 525
Ile Lys Gln Leu Ser Glu Val Gly Lys Pro Leu Val Val Leu Gln Met
530 535 540
Gly Gly Gly Gln Val Asp Ser Ser Ser Leu Lys Ser Asn Lys Lys Val
545 550 555 560
Asn Ser Leu Val Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln Ser Gly Gly Val Ala
565 570 575
Leu Phe Asp Ile Leu Ser Gly Lys Arg Ala Pro Ala Gly Arg Leu Val
580 585 590
Thr Thr Gln Tyr Pro Ala Glu Tyr Val His Gln Phe Pro Gln Asn Asp
595 600 605
Met Asn Leu Arg Pro Asp Gly Lys Ser Asn Pro Gly Gln Thr Tyr Ile
610 615 620
Trp Tyr Thr Gly Lys Pro Val Tyr Glu Phe Gly Ser Gly Leu Phe Tyr
625 630 635 640
Thr Thr Phe Lys Glu Thr Leu Ala Ser His Pro Lys Ser Leu Lys Phe
645 650 655
Asn Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ala Pro His Pro Gly Tyr Thr Tyr Ser
660 665 670
Glu Gln Ile Pro Val Phe Thr Phe Glu Ala Asn Ile Lys Asn Ser Gly
675 680 685
Lys Thr Glu Ser Pro Tyr Thr Ala Met Leu Phe Val Arg Thr Ser Asn
690 695 700
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Leu Ala Asp Ile Lys Pro Gly His Ser Ser Lys Leu Ser Ile Pro Ile
725 730 735
Pro Val Ser Ala Leu Ala Arg Val Asp Ser His Gly Asn Arg Ile Val
740 745 750
Tyr Pro Gly Lys Tyr Glu Leu Ala Leu Asn Thr Asp Glu Ser Val Lys
755 760 765
Leu Glu Phe Glu Leu Val Gly Glu Glu Val Thr Ile
770 775 780
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 31
cgcggactgc gcaccatgct ggcctccacc ttctcctacc 40
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 32
ctttcgccac ggagcttaat taactacagg cactgagagt aataatca 48
<210> 33
<211> 1131
<212> DNA
<213> Herpes simplex virus
<400> 33
atggcttcgt accccggcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcccggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc ccacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcgggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcggta ccttatgggc 540
agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
accaacatcg tgcttggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
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cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg gccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
tccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cataccgacg 1080
atatgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131
<210> 34
<211> 376
<212> PRT
<213> Herpes simplex virus
<400> 34
Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
20 25 30
Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45
Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr
50 55 60
Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
100 105 110
Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met
115 120 125
Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly
130 135 140
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
145 150 155 160
Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala
180 185 190
Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly
210 215 220
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg
245 250 255
Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 265 270
Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
275 280 285
Phe Thr Leu Phe Arg Gly Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
290 295 300
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val
340 345 350
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
355 360 365
Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
370 375
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 35
ttagactgcg gccgcgtggc gaaagcctga cgcaccggta gat 43
<210> 36
<211> 41
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 36
agtagttagc ggccgcacgg cacggttaag cagggtcttg c 41
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 37
aaaaaacaaa catcccgttc ataac 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 38
aacaaggttt accggtttcg aaaag 25
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 39
acgaattgtt taaacgtcga cccaagtatc cagaggtgta tggaaatatc agat 54
<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 40
cgcgtagatc tgcggccatg gtgcaataca cagagggtga tctt 44
<210> 41
<211> 48
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 41
atctacgcgt actagttaat taaggctttc gtgaccgggc ttcaaaca 48
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 42
gcggccgtta ctagtggatc cactcggagt tgttatacgc tactcg 46
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 43
atccatcaca ctggcggccg cgcttcaaac aatgatgtgc gatggt 46
<210> 44
<211> 46
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 44
gatgcatgct cgagcggccg cctaccttgg cagccctacg agagag 46
<210> 45
<211> 41
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 45
ctctgtgtat tgcaccatga agcaccttgc atcttccatc g 41
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 46
ccggtcacga aagccttaat taaaaggacg ggttagcgtt 40
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 47
agccacatgc cgcatattga caaag 25
<210> 48
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<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 48
agggattcag tgtgctacag gctgc 25
<210> 49
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<212> DNA
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<400> 49
aaaaaacaaa catcccgttc ataac 25
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<212> DNA
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<400> 50
aacaaggttt accggtttcg aaaag 25
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<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 51
gttaagcata caattgaacg agaatgg 27
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 52
gatgatataa tggagcaaat aaggg 25
<210> 53
<211> 2077
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 53
atgacggatg cacaaaagaa ttggaggaga gacgaaaacg acgaggacga tgaagcagag 60
caggagctcg atgaggctgt aagtcgccgc gagtcgcatc tggtctgaca agcgtcgtct 120
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ggacagcccc gttcaagctg cgctgaaatg cgcccgccac ctgatggagc agcgcatcat 300
ctccaacccc aaagacatga tgggaatcct cctctttggg acagaaaaga ccaagttccg 360
ggacgacaat ggccgcagtg ggctcgggta tccgaattgc tacctcttta tggacctcga 420
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caagtttgat ctcagcaaat tttacgatgt aagctatatt tcttcgtttc ttcgctctaa 780
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gataaaaaag gcctacaagt ttggtggcga atacgtatac tttacgcccg aggagcagaa 1200
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caaggcgata agcaaacgcg tcggaggtta cttggaggag tggtccgaga ctctgaaaga 1800
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ggagcggata gagcagtggg ttgaggagaa cagctga 2077
<210> 54
<211> 649
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 54
Met Thr Asp Ala Gln Lys Asn Trp Arg Arg Asp Glu Asn Asp Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Ala Glu Gln Glu Leu Asp Glu Ala Val Ser Arg Arg Asp Leu
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Lys Ala Gln Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Ile Glu Val Ser Pro Ser
35 40 45
Met Leu Glu Pro Pro Pro Val Ser Ser Ser Arg Lys Ala Asp Arg Asp
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Arg Ile Ile Ser Asn Pro Lys Asp Met Met Gly Ile Leu Leu Phe Gly
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Thr Glu Lys Thr Lys Phe Arg Asp Asp Asn Gly Arg Ser Gly Leu Gly
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Tyr Pro Asn Cys Tyr Leu Phe Met Asp Leu Asp Ile Pro Ala Ala Glu
115 120 125
Asp Val Lys Ala Leu Lys Ala Leu Thr Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu
130 135 140
Val Leu Lys Pro Ala Thr Thr Asp Thr Val Ser Met Ser Asn Val Leu
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Phe Cys Ala Asn Gln Ile Phe Thr Thr Lys Ala Ala Asn Phe Gly Ser
165 170 175
Arg Arg Leu Phe Ile Val Thr Asp Asn Asp Asp Pro His Ala Ser Asp
180 185 190
Lys Ala Ala Arg Ser Ala Ala Ala Val Arg Ala Lys Asp Leu Tyr Asp
195 200 205
Leu Gly Ile Thr Ile Asp Leu Phe Pro Ile Thr Thr Gly Asp Ser Lys
210 215 220
Phe Asp Leu Ser Lys Phe Tyr Asp Asp Ile Val Tyr Arg Asp Pro Asn
225 230 235 240
Ala Glu Ala Asn Arg Thr Glu Val Arg Ala Ser Lys Ser Gly Asp Gly
245 250 255
Leu Ser Leu Leu Asn Ser Leu Ile Ser Asn Ile Asn Ser Lys Gln Thr
260 265 270
Pro Lys Arg Ala Leu Phe His Leu Pro Phe Glu Ile Ala Pro Gly Leu
275 280 285
Lys Ile Thr Val Lys Gly Tyr Asn Ile Val His Arg Gln Thr Pro Ala
290 295 300
Arg Thr Cys Tyr Ile Trp Leu Glu Gly Glu Lys Ala Gln Ile Ala Thr
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Gly Glu Thr Thr Arg Val Ala Glu Asp Ser Ala Arg Thr Val Glu Lys
325 330 335
Gln Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Lys Phe Gly Gly Glu Tyr Val Tyr Phe
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Thr Pro Glu Glu Gln Lys Lys Leu Arg Asp Phe Gly Ala Pro Thr Ile
355 360 365
Arg Ile Ile Gly Phe Lys Lys Arg Ser Met Ile Pro Val Trp Ala Ser
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Val Lys Lys Ser Thr Phe Ile Phe Pro Ser Glu Glu Asp Tyr Ile Gly
385 390 395 400
Ser Thr Arg Val Phe Ser Ala Leu Trp Gln Lys Leu Leu Lys Asp Asp
405 410 415
Lys Ile Gly Leu Ala Trp Cys Val Leu Arg Ser Asn Ala Gln Pro Met
420 425 430
Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Arg Glu Gln Ser Glu Asp Asp Ala Gly
435 440 445
Thr Pro Tyr Leu Pro Ala Gly Leu Trp Leu Tyr Pro Leu Pro Thr Ala
450 455 460
Asp Asp Leu Arg Asp Ile Asn Val Glu Arg Lys Leu Asp Cys Ser Glu
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Asp Leu Lys Thr Lys Met Arg Val Ile Val Gln Gln Leu Asn Leu Pro
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<211> 55
<212> DNA
<213> 里氏木霉
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<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 56
atcagccccg agacggcgcc gcgtttaaac aattcgtaat catggtcata gctgt 55
<210> 57
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<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 57
catgattacg aattgtttaa acgcggcgcc gtctcggggc tgatcttgtc gagga 55
<210> 58
<211> 55
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 58
ggcggccgtt actagtggat ccagcccttg acagtgatct tgagtccagg tgcaa 55
<210> 59
<211> 58
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 59
tgcagatatc catcacactg gcggccgcag tttccatgtc caacgtgttg ttttgcgc 58
<210> 60
<211> 58
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 60
gccagtgcca agctgtttaa acatgcatgc tcgagcggcc gcacacgccc tctcctcg 58
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<400> 62
caatgacgat ccgcacgcgt 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 63
gacactcttt tctcccatct 20
<210> 64
<211> 20
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tcgccacgga gcttatcgac ttcttctaga acgtc 35
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<213> 烟曲霉
<400> 69
ccctttgggt atccgtgact gtgagctata cccgcg 36
<210> 70
<211> 35
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 70
cgtcatgagt gactggggcg ctcaccacag cggtg 35
<210> 71
<211> 36
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 71
gggtagtggt actgccgagt tcccttacct tgtcac 36
<210> 72
<211> 39
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 72
gccgactctg gagagggtta catcagtgtc gacggcaac 39
<210> 73
<211> 33
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 73
cggactgcgc accatgagat tcggttggct cga 33
<210> 74
<211> 35
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 74
tcgccacgga gcttactagt agacacgggg cagag 35
<210> 75
<211> 31
<212> DNA
<213> Humicola insolens
<400> 75
tataagctta agcatgcgtt cctcccccct c 31
<210> 76
<211> 32
<212> DNA
<213> Humicola insolens
<400> 76
ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag 32
<210> 77
<211> 36
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 77
acgcgtcgac gaattctagg ctaggtatgc gaggca 36
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 78
catggtgcaa tacacagagg gtg 23
<210> 79
<211> 32
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 79
gtgtattgca ccatggcgtt cctcccccct cc 32
<210> 80
<211> 31
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 80
ggagggggga ggaacgccat ggtgcaatac a 31
<210> 81
<211> 40
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 81
caccctctgt gtattgcacc atgagattcg gttggctcga 40
<210> 82
<211> 40
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 82
ttcgccacgg agctactagt ctagtagaca cggggcagag 40
<210> 83
<211> 36
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 83
actggattta ccatggcggt tgccaaatct attgct 36
<210> 84
<211> 38
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 84
tcacctctag ttaattaatc acgcagacga aatctgct 38
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 85
cggactgcgc accatggcgg ttgccaaatc 30
<210> 86
<211> 32
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 86
tcgccacgga gcttatcacg cagacgaaat ct 32
<210> 87
<211> 33
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 87
cggactgcgc accatggtcc atctatcttc att 33
<210> 88
<211> 35
<212> DNA
<213> 烟曲霉
<400> 88
tcgccacgga gcttattaca ggcactgtga gtacc 35
<210> 89
<211> 1377
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 89
atggcgccct cagttacact gccgttgacc acggccatcc tggccattgc ccggctcgtc 60
gccgcccagc aaccgggtac cagcaccccc gaggtccatc ccaagttgac aacctacaag 120
tgtacaaagt ccggggggtg cgtggcccag gacacctcgg tggtccttga ctggaactac 180
cgctggatgc acgacgcaaa ctacaactcg tgcaccgtca acggcggcgt caacaccacg 240
ctctgccctg acgaggcgac ctgtggcaag aactgcttca tcgagggcgt cgactacgcc 300
gcctcgggcg tcacgacctc gggcagcagc ctcaccatga accagtacat gcccagcagc 360
tctggcggct acagcagcgt ctctcctcgg ctgtatctcc tggactctga cggtgagtac 420
gtgatgctga agctcaacgg ccaggagctg agcttcgacg tcgacctctc tgctctgccg 480
tgtggagaga acggctcgct ctacctgtct cagatggacg agaacggggg cgccaaccag 540
tataacacgg ccggtgccaa ctacgggagc ggctactgcg atgctcagtg ccccgtccag 600
acatggagga acggcaccct caacactagc caccagggct tctgctgcaa cgagatggat 660
atcctggagg gcaactcgag ggcgaatgcc ttgacccctc actcttgcac ggccacggcc 720
tgcgactctg ccggttgcgg cttcaacccc tatggcagcg gctacaaaag ctactacggc 780
cccggagata ccgttgacac ctccaagacc ttcaccatca tcacccagtt caacacggac 840
aacggctcgc cctcgggcaa ccttgtgagc atcacccgca agtaccagca aaacggcgtc 900
gacatcccca gcgcccagcc cggcggcgac accatctcgt cctgcccgtc cgcctcagcc 960
tacggcggcc tcgccaccat gggcaaggcc ctgagcagcg gcatggtgct cgtgttcagc 1020
atttggaacg acaacagcca gtacatgaac tggctcgaca gcggcaacgc cggcccctgc 1080
agcagcaccg agggcaaccc atccaacatc ctggccaaca accccaacac gcacgtcgtc 1140
ttctccaaca tccgctgggg agacattggg tctactacga actcgactgc gcccccgccc 1200
ccgcctgcgt ccagcacgac gttttcgact acacggagga gctcgacgac ttcgagcagc 1260
ccgagctgca cgcagactca ctgggggcag tgcggtggca ttgggtacag cgggtgcaag 1320
acgtgcacgt cgggcactac gtgccagtat agcaacgact actactcgca atgcctt 1377
<210> 90
<211> 459
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 90
Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile
1 5 10 15
Ala Arg Leu Val Ala Ala Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val
20 25 30
His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val
35 40 45
Ala Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His
50 55 60
Asp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr
65 70 75 80
Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly
85 90 95
Val Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr
100 105 110
Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser
115 120 125
Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys
130 135 140
Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro
145 150 155 160
Cys Gly Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly
165 170 175
Gly Ala Asn Gln Tyr Asn Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr
180 185 190
Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn
195 200 205
Thr Ser His Gln Gly Phe Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly
210 215 220
Asn Ser Arg Ala Asn Ala Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala
225 230 235 240
Cys Asp Ser Ala Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys
245 250 255
Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr
260 265 270
Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu
275 280 285
Val Ser Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser
290 295 300
Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala
305 310 315 320
Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val
325 330 335
Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu
340 345 350
Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser
355 360 365
Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile
370 375 380
Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro
385 390 395 400
Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr
405 410 415
Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly
420 425 430
Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys
435 440 445
Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
450 455
<210> 91
<211> 1254
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 91
atgaacaagt ccgtggctcc attgctgctt gcagcgtcca tactatatgg cggcgccgtc 60
gcacagcaga ctgtctgggg ccagtgtgga ggtattggtt ggagcggacc tacgaattgt 120
gctcctggct cagcttgttc gaccctcaat ccttattatg cgcaatgtat tccgggagcc 180
actactatca ccacttcgac ccggccacca tccggtccaa ccaccaccac cagggctacc 240
tcaacaagct catcaactcc acccacgagc tctggggtcc gatttgccgg cgttaacatc 300
gcgggttttg actttggctg taccacagat ggcacttgcg ttacctcgaa ggtttatcct 360
ccgttgaaga acttcaccgg ctcaaacaac taccccgatg gcatcggcca gatgcagcac 420
ttcgtcaacg aggacgggat gactattttc cgcttacctg tcggatggca gtacctcgtc 480
aacaacaatt tgggcggcaa tcttgattcc acgagcattt ccaagtatga tcagcttgtt 540
caggggtgcc tgtctctggg cgcatactgc atcgtcgaca tccacaatta tgctcgatgg 600
aacggtggga tcattggtca gggcggccct actaatgctc aattcacgag cctttggtcg 660
cagttggcat caaagtacgc atctcagtcg agggtgtggt tcggcatcat gaatgagccc 720
cacgacgtga acatcaacac ctgggctgcc acggtccaag aggttgtaac cgcaatccgc 780
aacgctggtg ctacgtcgca attcatctct ttgcctggaa atgattggca atctgctggg 840
gctttcatat ccgatggcag tgcagccgcc ctgtctcaag tcacgaaccc ggatgggtca 900
acaacgaatc tgatttttga cgtgcacaaa tacttggact cagacaactc cggtactcac 960
gccgaatgta ctacaaataa cattgacggc gccttttctc cgcttgccac ttggctccga 1020
cagaacaatc gccaggctat cctgacagaa accggtggtg gcaacgttca gtcctgcata 1080
caagacatgt gccagcaaat ccaatatctc aaccagaact cagatgtcta tcttggctat 1140
gttggttggg gtgccggatc atttgatagc acgtatgtcc tgacggaaac accgactagc 1200
agtggtaact catggacgga cacatccttg gtcagctcgt gtctcgcaag aaag 1254
<210> 92
<211> 418
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 92
Met Asn Lys Ser Val Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ile Leu Tyr
1 5 10 15
Gly Gly Ala Val Ala Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile
20 25 30
Gly Trp Ser Gly Pro Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr
35 40 45
Leu Asn Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Thr Ile Thr
50 55 60
Thr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pro Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr
65 70 75 80
Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Ser Ser Gly Val Arg Phe Ala
85 90 95
Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys Thr Thr Asp Gly Thr
100 105 110
Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Asn Phe Thr Gly Ser
115 120 125
Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Ile Gly Gln Met Gln His Phe Val Asn Glu
130 135 140
Asp Gly Met Thr Ile Phe Arg Leu Pro Val Gly Trp Gln Tyr Leu Val
145 150 155 160
Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp Ser Thr Ser Ile Ser Lys Tyr
165 170 175
Asp Gln Leu Val Gln Gly Cys Leu Ser Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Val
180 185 190
Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Gln Gly
195 200 205
Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Thr Ser Leu Trp Ser Gln Leu Ala Ser
210 215 220
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Arg Val Trp Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro
225 230 235 240
His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Val
245 250 255
Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gln Phe Ile Ser Leu Pro
260 265 270
Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala Phe Ile Ser Asp Gly Ser Ala
275 280 285
Ala Ala Leu Ser Gln Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Thr Thr Asn Leu
290 295 300
Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr His
305 310 315 320
Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp Gly Ala Phe Ser Pro Leu Ala
325 330 335
Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln Ala Ile Leu Thr Glu Thr Gly
340 345 350
Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ile Gln Asp Met Cys Gln Gln Ile Gln
355 360 365
Tyr Leu Asn Gln Asn Ser Asp Val Tyr Leu Gly Tyr Val Gly Trp Gly
370 375 380
Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Val Leu Thr Glu Thr Pro Thr Ser
385 390 395 400
Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser Cys Leu Ala
405 410 415
Arg Lys

Claims (10)

1.一种酶组合物，其包含：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。
2.权利要求1的酶组合物，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：
(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；
(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和
(v)β-葡糖苷酶变体，其在对应于SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置100、283、456、和512的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有β-葡糖苷酶活性；和
其中所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽或其同源物选自下组：
(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；
(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列杂交或其全长互补链。
3.权利要求1或2的酶组合物，其中所述β-葡糖苷酶变体包含一种或多种(几种)选自下组的取代：G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
4.权利要求1-3任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的酶：(i)烟曲霉木聚糖酶或其同源物，(ii)烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物；或(iii)(i)和(ii)的组合；
其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：
(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽；
(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列；或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物选自下组：
(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:16的成熟多肽；
(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
5.权利要求1-4任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。
6.一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含编码下述的多核苷酸：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。
7.权利要求6的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性与；和
(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：
(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；
(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件非常高严格条件下与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
(v)β-葡糖苷酶变体，其在对应于SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置100、283、456、和512的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有β-葡糖苷酶活性；和
其中所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽选自下组：
(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:8的成熟多肽；
(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
8.权利要求6或7的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述β-葡糖苷酶变体包含一种或多种(几种)选自下组的取代：G142S，Q183R，H266Q，和D703G。
9.权利要求6-8任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶：(i)烟曲霉木聚糖酶，(ii)烟曲霉β-木糖苷酶；或(iii)(i)和(ii)的组合；
其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：
(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽；
(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:12，或SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，或SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和
其中所述烟曲霉β-木糖苷酶或同源物选自下组：
(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:16的成熟多肽；
(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
10.权利要求6-7任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其为木霉属细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113015796A (zh) * 2018-10-29 2021-06-22 罗伯托·巴西 用于产生具有热稳定纤维素分解活性的植物细胞壁降解酶的转基因微藻

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103890169A (zh) * 2011-08-24 2014-06-25 诺维信股份有限公司 烟曲霉纤维素分解酶组合物及其用途
CA2862703A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Novozymes North America, Inc. Methods of preconditioning cellulosic material
ES2935920T3 (es) 2012-03-30 2023-03-13 Novozymes North America Inc Procesos de elaboración de productos de fermentación
EP2898068A2 (en) 2012-09-19 2015-07-29 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
DK2903412T3 (da) 2012-10-08 2019-12-16 Novozymes As Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem
WO2014060378A1 (en) * 2012-10-16 2014-04-24 Dsm Ip Assets B.V. Cell wall deconstruction enzymes of pseudocercosporella herpotrichoides and|uses thereof
US20150275194A1 (en) 2012-10-24 2015-10-01 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
CA2892031A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Novozymes A/S Milling process
DK2925790T3 (da) 2012-11-27 2021-10-11 Novozymes As Formalingsproces
US9765373B2 (en) 2012-12-14 2017-09-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2014099798A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancinc activity and polynucleotides encoding same
CN105074001A (zh) 2013-02-21 2015-11-18 诺维信公司 糖化和发酵纤维素材料的方法
EP2964760B1 (en) 2013-03-08 2021-05-12 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
CA2910239A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
CN105431528A (zh) * 2013-08-30 2016-03-23 诺维信公司 酶组合物及其用途
WO2015035029A1 (en) 2013-09-04 2015-03-12 Novozymes A/S Processes for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material
US9938552B2 (en) 2013-11-01 2018-04-10 Novozymes A/S Methods of saccharifying and fermenting a cellulosic material
WO2015081139A1 (en) 2013-11-26 2015-06-04 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
EP3511418B1 (en) 2014-01-07 2020-07-15 Novozymes A/S Corollospora maritima mannanase and its use
WO2015144782A1 (en) * 2014-03-25 2015-10-01 Novozymes A/S Dishwashing composition containing cellulytic enzymes and use thereof
CN115975994A (zh) 2014-06-06 2023-04-18 诺维信公司 酶组合物及其用途
EP3191597A1 (en) 2014-08-21 2017-07-19 Novozymes A/S Process for saccharifying cellulosic material under oxygen addition
DK3186372T3 (da) 2014-08-28 2020-12-21 Novozymes As Solubilisering af kommunalt fast affald (MSW) ved hjælp af en enzymblanding
BR112017004251A2 (pt) 2014-09-05 2017-12-12 Novozymes As variantes de módulos de ligação a carboidrato e polinucleotídeos que os codificam
CN107109346B (zh) 2014-09-23 2021-07-20 诺维信公司 用于生产乙醇的方法和发酵生物
WO2016138167A2 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
DK3268482T3 (da) 2015-03-09 2020-03-09 Novozymes As Fremgangsmåder til indføring af en flerhed af ekspressionskonstruktioner i en eukaryot celle
BR112017018461A2 (pt) 2015-03-12 2018-04-17 Novozymes As processos para hidrólise multiestágio, para produção de um produto de fermentação, e, para aumento de rendimento de açúcar de hidrólise.
TN2017000318A1 (en) 2015-03-12 2019-01-16 Beta Renewable Spa Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
BR112017019331A2 (pt) 2015-03-12 2018-06-05 Beta Renewables Spa processos para sacarificação de múltiplos estágios de um material lignocelulósico e para melhorar um rendimento de glicose ou xilose de sacarificação de um material lignocelulósico em um reator de tanque continuamente agitado
CN116676293A (zh) 2015-05-27 2023-09-01 国投生物科技投资有限公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
WO2016205127A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Novozymes A/S Polypeptides having trehalase activity and the use thereof in process of producing fermentation products
CN107922896A (zh) * 2015-06-30 2018-04-17 诺维信公司 衣物洗涤剂组合物、用于洗涤的方法和组合物的用途
WO2017019491A1 (en) 2015-07-24 2017-02-02 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
BR112018001041A2 (pt) 2015-07-24 2018-09-11 Novozymes Inc polipeptídeo isolado, composição, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo e para produção de uma proteína, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, e, processos para degradação de um material celulósico ou hemicelulósico, para produção de um produto de fermentação e para fermentação de um material celulósico ou hemicelulósico.
EP3344761A1 (en) 2015-09-04 2018-07-11 Novozymes A/S Methods of inhibiting aa9 lytic polysaccharide monooxygenase catalyzed inactivation of enzyme compositions
CN108350044B (zh) 2015-09-22 2022-05-24 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
WO2017070219A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Novozymes A/S Lytic polysaccharide monooxygenase (lpmo) variants and polynucleotides encoding same
WO2017076421A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Renescience A/S Solubilization of msw with blend enzymes
EP3387139B1 (en) * 2015-12-10 2020-04-22 DSM IP Assets B.V. Beta-glucosidase and uses thereof
US11623885B2 (en) 2015-12-23 2023-04-11 Novozymes A/S Methods for enhancing the dewaterability of sludge with enzyme treatment
CN114368888A (zh) * 2015-12-23 2022-04-19 诺维信公司 用于用酶处理增强污泥的脱水性能的方法
PL3416740T3 (pl) 2016-02-19 2021-05-17 Intercontinental Great Brands Llc Procesy tworzenia wielu strumieni wartości ze źródeł biomasy
CN109415712A (zh) 2016-03-02 2019-03-01 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
US11965189B2 (en) 2016-03-24 2024-04-23 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2017205535A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2018026868A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2018085370A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Novozymes A/S Processes for reducing production of primeverose during enzymatic saccharification of lignocellulosic material
WO2018098381A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Novozymes A/S Improved yeast for ethanol production
EP3551759A1 (en) 2016-12-06 2019-10-16 Novozymes A/S Improved processes for production of ethanol from xylose-containing cellulosic substrates using engineered yeast strains
US11091753B2 (en) 2017-05-31 2021-08-17 Novozymes A/S Xylose fermenting yeast strains and processes thereof for ethanol production
AU2018275794A1 (en) 2017-06-02 2019-12-05 Novozymes A/S Improved yeast for ethanol production
EP4015524A1 (en) 2017-06-28 2022-06-22 Novozymes A/S Polypeptides having trehalase activity and polynucleotides encoding same
CN111094562A (zh) 2017-08-08 2020-05-01 诺维信公司 具有海藻糖酶活性的多肽及其在产生发酵产物的方法中的用途
CN113286871A (zh) 2018-01-29 2021-08-20 诺维信公司 用于乙醇生产的氮利用提高的微生物
CA3107124A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Novozymes A/S Improved yeast for ethanol production
WO2019201765A1 (en) 2018-04-20 2019-10-24 Renescience A/S Method for determining chemical compounds in waste
CA3103868A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 Ecolab Usa Inc. Compositions comprising enzyme and quaternary ammonium compounds
US11370998B2 (en) 2018-06-14 2022-06-28 Ecolab Usa Inc. Synergistic cellulase-surfactant interactions for degradation of bacterial cellulose
CN112601818A (zh) 2018-07-25 2021-04-02 诺维信公司 用于生产乙醇的表达酶的酵母
US11807889B2 (en) 2018-10-08 2023-11-07 Novozymes A/S Yeast expressing a heterologous phospholipase for ethanol production
EP3894565A1 (en) 2018-12-12 2021-10-20 Novozymes A/S Methods for increasing the productivity of a filamentous fungal cell in the production of a polypeptide
BR112021011384A2 (pt) 2018-12-12 2022-05-17 Novozymes As Polipeptídeo isolado, composição de enzimas, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, método de produção de um polipeptídeo, planta, parte da planta ou célula da planta transgênica, e, processos para degradação de um material celulósico ou hemicelulósico, para produção de um produto de fermentação e de fermentação de um material celulósico ou hemicelulósico
BR112021017085A2 (pt) 2019-04-02 2022-02-08 Novozymes As Processo de produção de um produto de fermentação
WO2021021458A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Novozymes A/S Microorganisms with improved nitrogen transport for ethanol production
BR112021026477A2 (pt) 2019-08-06 2022-02-08 Novozymes As Célula hospedeira recombinante, métodos de produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido ou contendo celulose, de produção do polipeptídeo maduro, de produção de um derivado de uma célula hospedeira recombinante e de produção de etanol, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, composição, e, uso de uma célula hospedeira recombinante
US20220340943A1 (en) 2019-09-10 2022-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
EP4031661A1 (en) 2019-09-16 2022-07-27 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity and polynucleotides encoding same
AU2020402990A1 (en) 2019-12-10 2022-06-09 Novozymes A/S Microorganism for improved pentose fermentation
US20230242960A1 (en) 2020-01-24 2023-08-03 Novozymes A/S Mutants of a filamentous fungal cell having increased productivity in the production of a polypeptide
EP4103709A2 (en) 2020-02-10 2022-12-21 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
MX2023002490A (es) 2020-09-04 2023-03-09 Novozymes As Organismo fermentador mejorado para la produccion de etanol.
US20230399632A1 (en) 2020-11-02 2023-12-14 Novozymes A/S Glucoamylase Variants and Polynucleotides Encoding Same
WO2022096517A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Renescience A/S Method for sanitizing waste
WO2022096406A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Renescience A/S Method for enzymatic and/or microbial processing of waste comprising recirculation of process water
CA3213845A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
BR112023020357A2 (pt) 2021-04-06 2023-11-21 Dsm Ip Assets Bv Composição de enzima
US20240182936A1 (en) 2021-04-06 2024-06-06 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2022214460A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Process for the preparation of a sugar product and a fermentation product
WO2022261003A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Novozymes A/S Engineered microorganism for improved ethanol fermentation
WO2024064901A2 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Novozymes A/S Improved fermenting organism for ethanol production
WO2024113151A1 (en) 2022-11-29 2024-06-06 Ecolab Usa Inc. A controlled release cleansing tablet containing biological actives
WO2024115642A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Renescience A/S Method for production of hydrogen gas from waste

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5989870A (en) 1986-04-30 1999-11-23 Rohm Enzyme Finland Oy Method for cloning active promoters
NZ234059A (en) 1989-06-13 1992-05-26 Genencor Int Method of killing cells by acid treatment; composition therefor
US5110735A (en) 1989-09-26 1992-05-05 Midwest Research Institute Thermostable purified endoglucanase from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus
US5536655A (en) 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
US5275944A (en) 1989-09-26 1994-01-04 Midwest Research Institute Thermostable purified endoglucanas from acidothermus cellulolyticus ATCC 43068
DE69435154D1 (de) 1993-03-10 2008-12-04 Novozymes As Enzyme mit Xylanaseaktivität aus Aspergillus aculeatus
BR9507817A (pt) 1994-06-03 1997-09-16 Novo Nordisk Biotech Inc Construção de dna enzima vetor recombinante célula hospedeira recombinante lacase de ascomicete ou deuteromicete processos para obter uma enzima de lacase para melhorar o rendimento de enzima recombinante para polimerizar um substrato de lignina ou lignossulfato em soluç o para despolimerizar in situ a pasta kraft para oxidar corantes ou precursores de corantes para pintar cabelo e para polimerizar ou oxidar um composto fenólico ou anilina composição de corante e recipiente contendo a mesma
WO1996000787A1 (en) 1994-06-30 1996-01-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
DK0877801T3 (da) 1996-01-19 2005-08-29 Novozymes Biotech Inc Morfologiske mutanter af trådsvampe
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
DE69932345T2 (de) 1998-10-26 2007-07-19 Novozymes A/S Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
WO2000056900A2 (en) 1999-03-22 2000-09-28 Novo Nordisk Biotech, Inc. Promoter sequences derived from fusarium venenatum and uses thereof
CA2372594A1 (en) 1999-05-19 2000-11-23 Midwest Research Institute E1 endoglucanase variants y245g, y82r and w42r
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
WO2002030963A1 (en) 2000-10-12 2002-04-18 Exelixis, Inc. Human ect2 and methods of use
AU2002316785A1 (en) 2001-05-18 2002-12-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiase activity and polynucleotides encoding same
BR0306740A (pt) 2002-01-23 2004-12-28 Royal Nedalco B V Célula hospedeira transformada com um construto de ácido nucléico, molécula de ácido nucleico isolada, e, processos para a produção de etanol, e de um produto de fermentação
CN1836038B (zh) 2003-05-02 2011-04-06 诺维信股份有限公司 制备分泌型多肽的方法
EP1682656B1 (en) 2003-10-28 2013-09-18 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
ES2391826T3 (es) 2004-01-30 2012-11-30 Novozymes, Inc. Polipéptidos con actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que los codifican
EP1733033B1 (en) 2004-02-06 2012-06-20 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN101389645B (zh) 2004-02-12 2016-08-03 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
WO2005093050A2 (en) 2004-03-25 2005-10-06 Genencor International, Inc. Cellulase fusion protein and heterologous cellulase fusion construct encoding the same
DK176540B1 (da) 2004-09-24 2008-07-21 Cambi Bioethanol Aps Fremgangsmåde til behandling af biomasse og organisk affald med henblik på at udvinde önskede biologisk baserede produkter
WO2006110891A2 (en) 2005-04-12 2006-10-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical
CA2689910A1 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Novozymes, Inc. Compositions for degrading cellulosic material
US8647856B2 (en) 2008-09-30 2014-02-11 Novozymes Inc. Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of Fusarium venenatum
JP2012504390A (ja) 2008-09-30 2012-02-23 ノボザイムス，インコーポレイティド 糸状菌細胞におけるポジティブ及びネガティブ選択遺伝子の使用方法
WO2010059424A2 (en) * 2008-11-18 2010-05-27 Novozymes, Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
RU2560424C2 (ru) 2009-02-20 2015-08-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Способ получения состава ферментационного бульона
BR112012006982B1 (pt) 2009-09-29 2021-12-21 Novozymes, Inc. Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, construções de ácido nucleico, vetor de expressão, polipeptídeo isolado tendo atividade intensificadora celulolítica, polinucleotídeo isolado que codifica o mesmo, e, composição detergente
WO2011057086A1 (en) * 2009-11-06 2011-05-12 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CA2780179A1 (en) * 2009-11-06 2011-05-12 Novozymes, Inc. Compositions for saccharification of cellulosic material
BR122019011255B1 (pt) 2009-12-18 2020-12-01 Novozymes, Inc mutante de uma cepa de trichoderma reesei parental isolada, e, métodos para produzir um polipeptídeo e para obter um mutante de uma cepa de trichoderma reesei parental
US8927235B2 (en) * 2010-12-06 2015-01-06 Novozymes A/S Methods of hydrolyzing oligomers in hemicellulosic liquor
WO2012103322A1 (en) * 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
江宁: "《微生物生物技术》", 31 May 2008, 化学工业出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113015796A (zh) * 2018-10-29 2021-06-22 罗伯托·巴西 用于产生具有热稳定纤维素分解活性的植物细胞壁降解酶的转基因微藻

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019200618B2 (en) 2021-07-22
US20200354763A1 (en) 2020-11-12
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BR112014004186A2 (pt) 2017-03-21
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WO2013028928A1 (en) 2013-02-28
AU2012298725A1 (en) 2014-02-13
US10662456B2 (en) 2020-05-26
CN103890165A (zh) 2014-06-25
US20190153494A1 (en) 2019-05-23
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CA2846398A1 (en) 2013-02-28
EP2748305B1 (en) 2016-11-16

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