WO2019165973A1 - Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same - Google Patents

Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same Download PDF

Info

Publication number
WO2019165973A1
WO2019165973A1 PCT/CN2019/076319 CN2019076319W WO2019165973A1 WO 2019165973 A1 WO2019165973 A1 WO 2019165973A1 CN 2019076319 W CN2019076319 W CN 2019076319W WO 2019165973 A1 WO2019165973 A1 WO 2019165973A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acids
polypeptide
nucleotides
sequence
Prior art date
Application number
PCT/CN2019/076319
Other languages
French (fr)
Inventor
Lan Tang
Nikolaj Spodsberg
Ye Liu
Brett Mcbrayer
Hanshu Ding
Christine KAI
Original Assignee
Novozymes A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes A/S filed Critical Novozymes A/S
Publication of WO2019165973A1 publication Critical patent/WO2019165973A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • a carbohydrate binding module having at least 75%sequence identity to amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14;
  • the beta-glucosidase is an Aspergillus fumigatus beta-glucosidase (e.g., recombinantly produced in Aspergillus oryzae as described in WO 02/095014) .
  • control sequences means nucleic acid sequences necessary for expression of a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention.
  • Each control sequence may be native (i.e., from the same gene) or heterologous (i.e., from a different gene) to the polynucleotide encoding the polypeptide or native or heterologous to each other.
  • control sequences include, but are not limited to, a leader, polyadenylation sequence, propeptide sequence, promoter, signal peptide sequence, and transcription terminator.
  • the control sequences include a promoter, and transcriptional and translational stop signals.
  • the control sequences may be provided with linkers for the purpose of introducing specific restriction sites facilitating ligation of the control sequences with the coding region of the polynucleotide encoding a polypeptide.
  • 59: 1739-1752 at a suitable temperature such as 40°C-80°C, e.g., 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, or 80°C, and a suitable pH such as 4-9, e.g., 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, or 9.0.
  • a suitable temperature such as 40°C-80°C, e.g., 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, or 80°C
  • a suitable pH such as 4-9, e.g., 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, or 9.0.
  • Very high stringency conditions means prehybridization and hybridization at 42°C in 5X SSPE, 0.3%SDS, 200 micrograms/ml sheared and denatured salmon sperm DNA, and 50%formamide for 12 to 24 hours, followed by washing three times each for 15 minutes using 0.2X SSC, 0.2%SDS at 70°C.
  • nucleic acid construct means a nucleic acid molecule, either single-or double-stranded, which is isolated from a naturally occurring gene or is modified to contain segments of nucleic acids in a manner that would not otherwise exist in nature or which is synthetic, which comprises one or more control sequences.
  • other peroxides may also be decomposed by these enzymes.
  • Sequence identity The relatedness between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences is described by the parameter “sequence identity” .
  • amino acid changes may be of a minor nature, that is conservative amino acid substitutions or insertions that do not significantly affect the folding and/or activity of the protein; small deletions, typically of 1-30 amino acids; small amino-or carboxyl-terminal extensions, such as an amino-terminal methionine residue; a small linker peptide of up to 20-25 residues; or a small extension that facilitates purification by changing net charge or another function, such as a poly-histidine tract, an antigenic epitope or a binding domain.
  • the catalytic domains comprise amino acid sequences that differ by up to 10 amino acids, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, from amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18.
  • amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2 amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 451 of SEQ ID NO: 6
  • amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8 amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10
  • amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12 amino acids 26 to 458 of SEQ ID
  • the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
  • the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof.
  • the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13 or the cDNA sequence thereof.
  • the catalytic domain may be from a hydrolase, isomerase, ligase, lyase, oxidoreductase, or transferase, e.g., an aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycosyltransferase, deoxyribonuclease, endoglucanase, esterase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamylase, alpha-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, pectinolytic enzyme, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, proteolytic
  • the present invention also relates to isolated polynucleotides encoding a polypeptide, a catalytic domain, or carbohydrate binding module of the present invention, as described herein.
  • E. coli trc promoter (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315) , Streptomyces coelicolor agarase gene (dagA) , and prokaryotic beta-lactamase gene (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) , as well as the tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25) .
  • Useful signal peptides for yeast host cells are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae alpha-factor and Saccharomyces cerevisiae invertase. Other useful signal peptide coding sequences are described by Romanos et al., 1992, supra.
  • origins of replication for use in a yeast host cell are the 2 micron origin of replication, ARS1, ARS4, the combination of ARS1 and CEN3, and the combination of ARS4 and CEN6.
  • the recombinant host cell comprises at least two copies, e.g., three, four, or five, of the polynucleotide of the present invention.
  • the bacterial host cell may be any Bacillus cell including, but not limited to, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, and Bacillus thuringiensis cells.
  • the bacterial host cell may also be any Streptomyces cell including, but not limited to, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, and Streptomyces lividans cells.
  • the fungal host cell may be a filamentous fungal cell.
  • “Filamentous fungi” include all filamentous forms of the subdivision Eumycota and Oomycota (as defined by Hawksworth et al., 1995, supra) .
  • the filamentous fungi are generally characterized by a mycelial wall composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan, and other complex polysaccharides. Vegetative growth is by hyphal elongation and carbon catabolism is obligately aerobic. In contrast, vegetative growth by yeasts such as Saccharomyces cerevisiae is by budding of a unicellular thallus and carbon catabolism may be fermentative.
  • the polypeptide may be detected using methods known in the art that are specific for the polypeptides. These detection methods include, but are not limited to, use of specific antibodies, formation of an enzyme product, or disappearance of an enzyme substrate. For example, an enzyme assay may be used to determine the activity of the polypeptide.
  • dicot plants are tobacco, legumes, such as lupins, potato, sugar beet, pea, bean and soybean, and cruciferous plants (family Brassicaceae) , such as cauliflower, rape seed, and the closely related model organism Arabidopsis thaliana.
  • the transgenic plant or plant cell expressing the polypeptide or domain may be constructed in accordance with methods known in the art.
  • the plant or plant cell is constructed by incorporating one or more expression constructs encoding the polypeptide or domain into the plant host genome or chloroplast genome and propagating the resulting modified plant or plant cell into a transgenic plant or plant cell.
  • the storage protein napA promoter from Brassica napus, or any other seed specific promoter known in the art, e.g., as described in WO 91/14772.
  • the promoter may be a leaf specific promoter such as the rbcs promoter from rice or tomato (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000) , the chlorella virus adenine methyltransferase gene promoter (Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93) , the aldP gene promoter from rice (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet.
  • Plants may be generated through a process of backcross conversion.
  • plants include plants referred to as a backcross converted genotype, line, inbred, or hybrid.
  • the mutant cell may be constructed by reducing or eliminating expression of the polynucleotide using methods well known in the art, for example, insertions, disruptions, replacements, or deletions.
  • the polynucleotide is inactivated.
  • the polynucleotide to be modified or inactivated may be, for example, the coding region or a part thereof essential for activity, or a regulatory element required for expression of the coding region.
  • An example of such a regulatory or control sequence may be a promoter sequence or a functional part thereof, i.e., a part that is sufficient for affecting expression of the polynucleotide.
  • Other control sequences for possible modification include, but are not limited to, a leader, polyadenylation sequence, propeptide sequence, signal peptide sequence, transcription terminator, and transcriptional activator.
  • the present invention relates to a protein product essentially free from cellobiohydrolases activity that is produced by a method of the present invention.
  • the cell-killed whole broth or composition may contain the unfractionated contents of the fermentation materials derived at the end of the fermentation.
  • the cell-killed whole broth or composition contains the spent culture medium and cell debris present after the microbial cells (e.g., filamentous fungal cells) are grown to saturation, incubated under carbon-limiting conditions to allow protein synthesis.
  • the cell-killed whole broth or composition contains the spent cell culture medium, extracellular enzymes, and killed filamentous fungal cells.
  • the microbial cells present in the cell-killed whole broth or composition can be permeabilized and/or lysed using methods known in the art.
  • the present invention also relates to compositions comprising a polypeptide of the present invention.
  • the compositions are enriched in the polypeptide.
  • any pretreatment process known in the art can be used to disrupt plant cell wall components of the cellulosic material (Chandra et al., 2007, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. 108: 67-93; Galbe and Zacchi, 2007, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks and Zeeman, 2009, Bioresource Technology 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686; Taherzadeh and Karimi, 2008, Int. J. Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang and Wyman, 2008, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40) .
  • Residence time for the steam pretreatment is preferably 1-60 minutes, e.g., 1-30 minutes, 1-20 minutes, 3-12 minutes, or 4-10 minutes, where the optimal residence time depends on the temperature and optional addition of a chemical catalyst.
  • Steam pretreatment allows for relatively high solids loadings, so that the cellulosic material is generally only moist during the pretreatment.
  • the steam pretreatment is often combined with an explosive discharge of the material after the pretreatment, which is known as steam explosion, that is, rapid flashing to atmospheric pressure and turbulent flow of the material to increase the accessible surface area by fragmentation (Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; U.S. Patent Application No.
  • Chemical Pretreatment refers to any chemical pretreatment that promotes the separation and/or release of cellulose, hemicellulose, and/or lignin. Such a pretreatment can convert crystalline cellulose to amorphous cellulose.
  • suitable chemical pretreatment processes include, for example, dilute acid pretreatment, lime pretreatment, wet oxidation, ammonia fiber/freeze expansion (AFEX) , ammonia percolation (APR) , ionic liquid, and organosolv pretreatments.
  • alkaline pretreatments include, but are not limited to, sodium hydroxide, lime, wet oxidation, ammonia percolation (APR) , and ammonia fiber/freeze expansion (AFEX) pretreatment.
  • APR ammonia percolation
  • AFEX ammonia fiber/freeze expansion
  • Wet oxidation is a thermal pretreatment performed typically at 180-200°C for 5-15 minutes with addition of an oxidative agent such as hydrogen peroxide or over-pressure of oxygen (Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technology 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin etal., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677) .
  • the pretreatment is performed preferably at 1-40%dry matter, e.g., 2-30%dry matter or 5-20%dry matter, and often the initial pH is increased by the addition of alkali such as sodium carbonate.
  • the cellulosic material can be pretreated both physically (mechanically) and chemically. Mechanical or physical pretreatment can be coupled with steaming/steam explosion, hydrothermolysis, dilute or mild acid treatment, high temperature, high pressure treatment, irradiation (e.g., microwave irradiation) , or combinations thereof.
  • high pressure means pressure in the range of preferably about 100 to about 400 psi, e.g., about 150 to about 250 psi.
  • high temperature means temperature in the range of about 100 to about 300°C, e.g., about 140 to about 200°C.
  • the saccharification is performed in the presence of dissolved oxygen at a concentration of at least 0.5%of the saturation level.
  • Oxygen is added to the vessel in order to achieve the desired concentration of dissolved oxygen during saccharification. Maintaining the dissolved oxygen level within a desired range can be accomplished by aeration of the vessel, tank or the like by adding compressed air through a diffuser or sparger, or by other known methods of aeration. The aeration rate can be controlled on the basis of feedback from a dissolved oxygen sensor placed in the vessel/tank, or the system can run at a constant rate without feedback control. In the case of a hydrolysis train consisting of a plurality of vessels/tanks connected in series, aeration can be implemented in one or more or all of the vessels/tanks. Oxygen aeration systems are well known in the art. According to the invention any suitable aeration system may be used. Commercial aeration systems are designed by, e.g., Chemineer, Derby, England, and build by, e.g., Paul Mueller Company, MO, USA.
  • the enzyme compositions can comprise any protein useful in degrading the cellulosic material.
  • the hemicellulase is preferably one or more (e.g., several) enzymes selected from the group consisting of an acetylmannan esterase, an acetylxylan esterase, an arabinanase, an arabinofuranosidase, a coumaric acid esterase, a feruloyl esterase, a galactosidase, a glucuronidase, a glucuronoyl esterase, a mannanase, a mannosidase, a xylanase, and a xylosidase.
  • the oxidoreductase is preferably one or more (e.g., several) enzymes selected from the group consisting of a catalase, a laccase, and a peroxidase.
  • the enzyme composition comprises an endoglucanase I, an endoglucanase II, or a combination of an endoglucanase I and an endoglucanase II, an AA9 polypeptide, and a cellobiohydrolase I, a cellobiohydrolase II, or a combination of a cellobiohydrolase I and a cellobiohydrolase II.
  • the enzyme composition comprises an endoglucanase, a beta-glucosidase, and an AA9 polypeptide.
  • the enzyme composition comprises a beta-glucosidase, an AA9 polypeptide, and a cellobiohydrolase.
  • the term “obtained” also means herein that the enzyme may have been produced recombinantly in a host organism employing methods described herein, wherein the recombinantly produced enzyme is either native or foreign to the host organism or has a modified amino acid sequence, e.g., having one or more (e.g., several) amino acids that are deleted, inserted and/or substituted, i.e., a recombinantly produced enzyme that is a mutant and/or a fragment of a native amino acid sequence or an enzyme produced by nucleic acid shuffling processes known in the art.
  • a native enzyme are natural variants and within the meaning of a foreign enzyme are variants obtained by, e.g., site-directed mutagenesis or shuffling.
  • cellobiohydrolases useful in the present invention include, but are not limited to, Aspergillus aculeatus cellobiohydrolase II (WO 2011/059740) , Aspergillus fumigatus cellobiohydrolase I (WO 2013/028928) , Aspergillus fumigatus cellobiohydrolase II (WO 2013/028928) , Chaetomium thermophilum cellobiohydrolase I, Chaetomium thermophilum cellobiohydrolase II, Humicola insolens cellobiohydrolase I, Myceliophthora thermophila cellobiohydrolase II (WO 2009/042871) , Penicillium occitanis cellobiohydrolase I (GenBank: AY690482) , Talaromyces emersonii cellobiohydrolase I (GenBank: AF439936) , Thielavia hyrcanie cellobiohydrolase II (WO 2010/141325)
  • such a compound is added at a molar ratio of the compound to glucosyl units of cellulose of about 10 -6 to about 10, e.g., about 10 -6 to about 7.5, about 10 -6 to about 5, about 10 -6 to about 2.5, about 10 -6 to about 1, about 10 -5 to about 1, about 10 -5 to about 10 -1 , about 10 -4 to about 10 -1 , about 10 -3 to about 10 -1 , or about 10 -3 to about 10 -2 .
  • beta-xylosidases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, beta-xylosidases from Neurospora crassa (SwissProt: Q7SOW4) , Trichoderma reesei (UniProtKB/TrEMBL: Q92458) , Talaromyces emersonii (SwissProt: Q8X212) , and Talaromyces thermophilus (GeneSeqP: BAA22816) .
  • acetylxylan esterases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, acetylxylan esterases from Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918) , Chaetomium globosum (UniProt: Q2GWX4) , Chaetomium gracile (GeneSeqP: AAB82124) , Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709) , Hypocrea jecorina (WO 2005/001036) , Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880) , Neurospora crassa (UniProt: q7s259) , Phaeosphaeria nodorum (UniProt: Q0UHJ1) , and Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846) .
  • alpha-glucuronidases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, alpha-glucuronidases from Aspergillus clavatus (UniProt: alcc12) , Aspergillus fumigatus (SwissProt: Q4WW45) , Aspergillus niger (UniProt: Q96WX9) , Aspergillus terreus (SwissProt: Q0CJP9) , Humicola insolens (WO 2010/014706) , Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565) , Talaromyces emersonii (UniProt: Q8X211) , and Trichoderma reesei (UniProt: Q99024) .
  • alpha-glucuronidases from Aspergillus clavatus (UniProt: alcc12) , Aspergillus fumigatus (S
  • “Fermenting microorganism” refers to any microorganism, including bacterial and fungal organisms, suitable for use in a desired fermentation process to produce a fermentation product.
  • the fermenting organism can be hexose and/or pentose fermenting organisms, or a combination thereof. Both hexose and pentose fermenting organisms are well known in the art.
  • Suitable fermenting microorganisms can ferment, i.e., convert, sugars, such as glucose, xylose, xylulose, arabinose, maltose, mannose, galactose, and/or oligosaccharides, directly or indirectly into the desired fermentation product. Examples of bacterial and fungal fermenting organisms producing ethanol are described by Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.
  • fermenting microorganisms that can ferment hexose sugars include bacterial and fungal organisms, such as yeast.
  • yeast include strains of Candida, Kluyveromyces, and Saccharomyces, e.g., Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus, and Saccharomyces cerevisiae.
  • Xylose fermenting yeast include strains of Candida, preferably C. sheatae or C. sonorensis; and strains of Pichia, e.g., P. stipitis, such as P. stipitis CBS 5773.
  • Pentose fermenting yeast include strains of Pachysolen, preferably P. tannophilus.
  • Organisms not capable of fermenting pentose sugars, such as xylose and arabinose may be genetically modified to do so by methods known in the art.
  • Other fermenting organisms include strains of Bacillus, such as Bacillus coagulans; Candida, such as C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis, and C. scehatae; Clostridium, such as C. acetobutylicum, C. thermocellum, and C. phytofermentans; E. coli, especially E.
  • the fermenting microorganism has been genetically modified to provide the ability to ferment pentose sugars, such as xylose utilizing, arabinose utilizing, and xylose and arabinose co-utilizing microorganisms.
  • the fermenting organism comprises a polynucleotide encoding a polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention.
  • the fermenting organism comprises one or more polynucleotides encoding one or more cellulolytic enzymes, hemicellulolytic enzymes, and accessory enzymes described herein.
  • a fermentation product can be any substance derived from the fermentation.
  • the fermentation product can be, without limitation, an alcohol (e.g., arabinitol, n-butanol, isobutanol, ethanol, glycerol, methanol, ethylene glycol, 1, 3-propanediol [propylene glycol] , butanediol, glycerin, sorbitol, and xylitol) ; an alkane (e.g., pentane, hexane, heptane, octane, nonane, decane, undecane, and dodecane) , a cycloalkane (e.g., cyclopentane, cyclohexane, cycloheptane, and cyclooctane) , an alkene (e.g., pentene, hexene, heptene, and o
  • the polynucleotide encoding the signal peptide is nucleotides 1 to 57 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1 to 54 of SEQ ID NO: 3, nucleotides 1 to 54 of SEQ ID NO: 5, nucleotides 1 to 57 of SEQ ID NO: 7, nucleotides 1 to 60 of SEQ ID NO: 9, nucleotides 1 to 54 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 1 to 75 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 1 to 75 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 1 to 75 of SEQ ID NO: 17.
  • Fungal strain NN054749 was isolated from a soil sample collected from China, China in 2012 by plate dilution with PDA plates at pH 7, 10°C and then purified by transferring a single conidium onto a PDA plate.
  • the strain NN054749 was identified as Penicillium wellingtonense, based on both morphological characteristics and ITS rDNA sequence.
  • TBE buffer was composed of 50 mM Tris base-50 mM boric acid-1 mM disodium EDTA.
  • YPG medium was composed of 4 g of yeast extract, 15 g of glucose, 1 g of KH 2 PO 4 , 0.5 g of MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, and deionized water to 1 liter.
  • YPM medium was composed of 2%yeast extract, 2%peptone, and 1%maltose in deionized water.
  • Penicillium wellingtonense NN054749 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 25°C in the darkness.
  • Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 11 days at 25°C with shaking at 160 rpm.
  • the extracted genomic DNA samples of Valsaria rubricosa NN047346, Penicillium sp. NN058240, Neosartorya massa CBS117265, Perenniporia tephropora NN047366, Penicillium adametzii NN058257, Talaromyces verruculosus NN046799, and Penicillium viticola NN058407 were genome sequenced using an MiSeq System (lllumina, Inc. ) .
  • the raw reads were assembled using the Spades program (Anton Bankevich et al., 2012, Journal of Computational Biology, 19 (5) : 455-477) .
  • the assembled sequences were analyzed using standard bioinformatics methods for gene identification and function prediction.
  • GeneMark-ES fungal version (Ter-Hovhannisyan V et al., 2008, Genome Research 18 (12) : 1979-1990) was used for gene prediction.
  • Blastall version 2.2.10 (Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology, 215 (3) : 403-410, and HMMER version 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBI) ) were used to predict function based on structural homology.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Example 3 Cloning of cellobiohydrolase I or cellobiohydrolase II gene into an Aspergillus oryzae expression vector
  • NN058240 Macrophomina phaseolina NN057877, Neosartorya massa CBS117265, Perenniporia tephropora NN047366, Penicillium adametzii NN058257, Talaromyces verruculosus NN046799, Penicillium viticola NN058407, and Penicillium wellingtonense NN054749, respectively, for expression cloning.
  • Lowercase characters of the forward primers primers 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, and 17 represent the coding region of each gene and lowercase characters of the reverse primers, primers 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18, represent the downstream region of the CDS of each gene.
  • Bold characters represent a region homologous to insertion sites of Aspergillus oryzae expression vector pCaHj505 (WO 2013/029496) .
  • the 4 underlined letters in the forward primers represent the Kozak sequence, which plays a major role in the initiation of translation process.
  • a High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes Oy) was used for amplification by PCR of the cellobiohydrolase genes from the genomic DNA prepared in Example 1.
  • An CF Dry-down PCR Cloning Kit (BD Biosciences) was used to clone each fragment into plasmid pCaHj505 except for GH6_Nmas which was cloned into plasmid pDAu222 (WO 2013/024021 ) using Bam HI and Xho I restriction sites.
  • the expression vector pCaHj505 contains the Aspergillus oryzae TAKA-amylase promoter and the Aspergillus nigerglucoamylase terminator.
  • the PCR was performed with the primer pair primers 5 and 6 and the genomic DNA of Macrophomina phaseolina NN057877 as the template.
  • a similar program as described above was used for denaturing at 98°C for 1 minute; 10 cycles each of denaturing at 98°C for 30 seconds, annealing at 70°C for 30 seconds, with a 1°C decrease per cycle, and elongation at 72°C for 2 minutes; 25 cycles each at 98°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, and 72°C for 2 minutes; and a final extension at 72°C for 7 minutes.
  • the heat block then went to a 4°C soak cycle.
  • a similar program to that described above was used for denaturing at 98°C for 1 minute; 10 cycles each of denaturing at 98°C for 30 seconds, annealing at 70°C for 30 seconds, with a 1 °C decrease per cycle, and elongation at 72°C for 2.5 minutes; 25 cycles each at 98°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, and 72°C for 2.5 minutes; and a final extension at 72°C for 7 minutes.
  • the heat block then went to a 4°C soak cycle.
  • NA2-tpi is a modified promoter from the gene encoding the Aspergillus niger neutral alpha-amylase in which the untranslated leader has been replaced by an untranslated leader from the gene encoding the Aspergillus nidulans triose phosphate isomerase.
  • PCS whole slurry PCS
  • Wheat straw was pretreated by steam explosion and used unwashed. Hydrolysis of the pretreated wheat straw (PWS) was conducted in a total reaction volume of 0.18 ml in 96-well plates. The hydrolysis was performed with 30 mg of insoluble PWS solids containing 100 mM sodium acetate pH 5.0 buffer and various protein loadings of various enzyme compositions (expressed as mg protein per gram of cellulose) . Enzyme compositions were prepared and then added simultaneously to all wells of the plate in a volume ranging from 20 ⁇ l to 50 ⁇ l, for a final volume of 0.2-0.50 ml in each reaction. The plate was then sealed using an ALPS-300 TM plate heat sealer, mixed thoroughly, and incubated at a specific temperature for 72 hours.
  • PWS pretreated wheat straw
  • a Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II (GENESEQP: AZY49446) was prepared recombinantly in Aspergillus oryzae as described in WO 2012/103288.
  • the filtered broth of the T. leycettanus GH6 cellobiohydrolase II was concentrated and buffer exchanged into 20 mM Tris pH 8.0 using a 400 ml G-25 column (GE Healthcare) .
  • the fractions were pooled, and ammonia sulfate and Tris were added to the desalted protein to a final concentration of 1.2 M ammonia sulfate and 20 mM Tris pH 8.0.
  • a Talaromyces leycettanus GH10 xylanase (GENESEQP: BAK46118) was prepared recombinantly according to WO 2013/019827 using Aspergillus oryzae as a host.
  • the filtered broth of the Talaromyces leycettanus GH10 xylanase was concentrated and desalted into 50 mM sodium acetate pH 5, 100 mM NaCl using a 200 with 10 kDa molecular weight cut-off tangential flow membrane.
  • the protein concentration for each of the monocomponents described above except the Aspergillus fumigatus Cel3A beta-glucosidase 4M variant was determined using a Microplate BCA TM Protein Assay Kit (Thermo Fischer Scientific) in which bovine serum albumin was used as a protein standard.
  • An enzyme composition was prepared composed of each monocomponent as follows: 44.1%Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I, 15.9%Thermoascus aurantiacus GH5 endoglucanase II, 19.5%Penicillium sp.
  • the assay was performed as described in Example 8.
  • the reactions with the PCS (20%total solids) were conducted for 70 hours at 50°C, 55°C, and 60°C in 100 mM sodium acetate pH 5.0 buffer. All reactions were performed in quadruplicate with mixing at 200 rpm throughout the hydrolysis.
  • GH6 cellobiohydrolase II yielded higher cellulose conversion at 50°C and 55°C and lower cellulose conversion at 60°C compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II at 50°C and 55°C.
  • Valsaria rubricosa GH6 cellobiohydrolase II (Example 7) and Penicillium species GH6 cellobiohydrolase II (Example 7) were added individually to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II (Example 11) and compared to the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II (Example 10) added to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II using PWS as substrate (Example 9) at 50°C, 55°C, and 60°C. Each cellobiohydrolase II was added individually at 1.84 mg enzyme protein per g cellulose to 6.16 mg enzyme protein of the cellulase enzyme composition without cellobiohydrolase II per g cellulose.
  • the assay was performed as described in Example 9.
  • the reactions with PWS (15%total solids) were conducted for 70 hours at 50°C, 55°C, and 60°C in 100 mM sodium acetate pH 5.0 buffer. All reactions were performed in quadruplicate with mixing at 200 rpm throughout the hydrolysis.
  • the Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I (GENESEQP: AZY49536) was prepared recombinantly in Aspergillus oryzae as described in WO 2012/103288.
  • the filtered broth of the Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I was concentrated and buffer exchanged into 20 mM Tris pH 8.0 using a 400 ml G-25 column. The fractions were pooled, and ammonia sulfate and Tris were added to the desalted protein to a final concentration of 1.2 M ammonia sulfate and 20 mM Tris pH 8.0.
  • the protein was loaded onto a PHENYL SEPHAROSE TM 6 Fast Flow column (high sub) equilibrated in 20 mM Tris pH 8.0 with 1.2 M ammonium sulfate, and bound proteins were eluted with 20 mM Tris pH 8.0 with no ammonium sulfate. Fractions were analyzed by 8-16%Tris-HCl SDS-PAGE gels, and pooled. The pooled protein was buffer exchanged into 20 mM Tris pH8.0 buffer using a 200 with 10 kDa molecular weight cut-off tangential flow membrane. Protein concentration was determined using absorbance at 280 nm using a NANODROP TM 1000 Spectrophotometer with an extinction coefficient determined according to Gill and Von Hippel, 1989, supra.
  • the protein concentration for each of the monocomponents except the Aspergillus fumigatus Cel3A beta-glucosidase 4M variant was determined using a Microplate BCA TM Protein Assay Kit in which bovine serum albumin was used as a protein standard.
  • An enzyme composition was prepared composed of each monocomponent as follows: 40%Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II, 16%Thermoascus aurantiacus GH5 endoglucanase II, 24%Penicillium sp.
  • the enzyme composition is designated herein as “cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase I” .
  • the results shown in Table 4 demonstrated that the cellulase enzyme composition containing the Macrophomina phaseolina GH6 cellobiohydrolase II yielded slightly higher cellulose conversion at 50°C and lower cellulose conversion at 55°C and 60°C compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II.
  • the cellulase enzyme composition containing the Neosartorya massa GH6 cellobiohydrolase II yielded higher cellulose conversion at 50°C, slightly higher conversion at 55°C, and slightly lower cellulose conversion at 60°C compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II.
  • the cellulase enzyme composition containing the Perenniporia tephropora GH6 cellobiohydrolase II yielded similar cellulose conversion at 50°C and lower cellulose conversion at 55°C and 60°C compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II.
  • the cellulase enzyme composition containing the Penicillium adametzii GH6 cellobiohydrolase II yielded slightly higher cellulose conversion at 50°C and lower cellulose conversion at 55°C and 60°C compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II.
  • Example 17 Comparison of the effect of Talaromyces verruculosus, Penicillium viticola, and Penicillium wellingtonense against Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I on the hydrolysis of unwashed PWS by a cellulase enzyme composition
  • the GH7 CBHI enzymes from Talaromyces verruculosus, Penicillium viticola, and Penicillium wellingtonense were added to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase I (Example 15) and compared to the Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I (Example 14) added to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase I using PWS as substrate (Example 9) at 50°C, 55°C, and 60°C.
  • Each cellobiohydrolase I was added individually at 1.95 mg enzyme protein per g cellulose to 5.21 mg enzyme protein of the cellulase enzyme composition without cellobiohydrolase I per g cellulose. Hydrolysis was performed at pH 5.0 for 72 hours according to Example 9.
  • Paragraph 1 An isolated or purified polypeptide having cellobiohydrolase activity, selected from the group consisting of:
  • the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the mature polypeptide of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
  • Paragraph 9 The polypeptide of paragraph 8, further comprising a carbohydrate binding module.
  • Paragraph 11 The polypeptide of any one of paragraphs 8-10, wherein the catalytic domain is encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO:
  • Paragraph 13 The polypeptide of any one of paragraphs 8-12, wherein the catalytic domain comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18.
  • Paragraph 14 The polypeptide of any one of paragraphs 8-12, wherein the catalytic domain is a variant of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions.
  • Paragraph 15 The polypeptide of any one of paragraphs 8-14, wherein the catalytic domain is a fragment of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18, wherein the fragment has cellobiohydrolase activity.
  • Paragraph 27 A nucleic acid construct or expression vector comprising the polynucleotide of paragraph 26, wherein the polynucleotide is operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide in an expression host.
  • Paragraph 29 The recombinant host cell of paragraph 28, wherein the polypeptide is heterologous to the recombinant host cell.
  • Paragraph 38 The method of paragraph 37, further comprising recovering the polypeptide.
  • Paragraph 40 A method of producing a polypeptide having cellobiohydrolase activity, comprising cultivating the transgenic plant or plant cell of paragraph 39 under conditions conducive for production of the polypeptide.
  • Paragraph 42 A method of producing a mutant of a parent cell, comprising inactivating a polynucleotide encoding the polypeptide of any one of paragraphs 1-24, which results in the mutant producing less of the polypeptide than the parent cell.
  • Paragraph 43 A mutant cell produced by the method of paragraph 42.
  • Paragraph 52 A whole broth formulation or cell culture composition comprising the polypeptide of any one of paragraphs 1-24.
  • Paragraph 55 The process of paragraph 53 or 54, wherein the enzyme composition further comprises one or more enzymes selected from the group consisting of a cellulase, an AA9 polypeptide, a hemicellulase, a cellulose inducible protein (CIP) , an esterase, an expansin, a ligninolytic enzyme, an oxidoreductase, a pectinase, a protease, and a swollenin.
  • a cellulase an AA9 polypeptide
  • a hemicellulase a cellulose inducible protein (CIP)
  • an esterase an expansin
  • a ligninolytic enzyme an oxidoreductase
  • pectinase a pectinase
  • protease aswollenin.
  • Paragraph 62 The process of paragraph 61, wherein the cellulosic material is pretreated.
  • Paragraph 63 The process of paragraph 61 or 62, wherein the enzyme composition further comprises one or more enzymes selected from the group consisting of a cellulase, an AA9 polypeptide, a hemicellulase, a CIP, an esterase, an expansin, a ligninolytic enzyme, an oxidoreductase, a pectinase, a protease, and a swollenin.
  • Paragraph 68 A process of fermenting a cellulosic material, comprising: fermenting the cellulosic material with one or more fermenting microorganisms, wherein the cellulosic material is saccharified with an enzyme composition comprising the polypeptide having cellobiohydrolase activity of any one of paragraphs 1-24.
  • Paragraph 71 The process of paragraph 69 or 70, wherein the fermentation product is an alcohol, an alkane, a cycloalkane, an alkene, an amino acid, a gas, isoprene, a ketone, an organic acid, or polyketide.

Abstract

Provided are isolated polypeptides having cellobiohydrolase activity, catalytic domains, carbohydrate binding modules and polynucleotides encoding the polypeptides, catalytic domains or carbohydrate binding modules. Also provided are nucleic acid constructs, vectors, and host cells comprising the polynucleotides as well as methods of producing and using the polypeptides, catalytic domains or carbohydrate binding modules.

Description

POLYPEPTIDES HAVING CELLOBIOHYDROLASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME
Reference to a Sequence Listing
This application contains a Sequence Listing in computer readable form, which is incorporated herein by reference.
Background of the Invention Field of the Invention
The present invention relates to polypeptides having cellobiohydrolase activity, cellobiohydrolase catalytic domains, and carbohydrate binding modules, and polynucleotides encoding the polypeptides, cellobiohydrolase catalytic domains, and carbohydrate binding modules, and to nucleic acid constructs, vectors, and host cells comprising the polynucleotides as well as methods of producing and using the polypeptides, cellobiohydrolase catalytic domains, and carbohydrate binding modules.
Description of the Related Art
Cellulose is a polymer of the simple sugar glucose covalently linked by beta-1, 4-bonds. Many microorganisms produce enzymes that hydrolyze beta-linked glucans. These enzymes include endoglucanases, cellobiohydrolases, and beta-glucosidases. Endoglucanases digest the cellulose polymer at random locations, opening it to attack by cellobiohydrolases. Cellobiohydrolases sequentially release molecules of cellobiose from the ends of the cellulose polymer. Cellobiose is a water-soluble beta-1, 4-linked dimer of glucose. Beta-glucosidases hydrolyze cellobiose to glucose.
The conversion of lignocellulosic feedstocks into ethanol has the advantages of the ready availability of large amounts of feedstock, the desirability of avoiding burning or land filling the materials, and the cleanliness of the ethanol fuel. Wood, agricultural residues, herbaceous crops, and municipal solid wastes have been considered as feedstocks for ethanol production. These materials primarily consist of cellulose, hemicellulose, and lignin. Once the lignocellulose is converted to fermentable sugars, e.g., glucose, the fermentable sugars can easily be fermented by yeast into ethanol.
There is a need in the art for new cellobiohydrolases that can increase the efficiency of the saccharification of lignocellulosic feedstocks.
The present invention provides polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding the polypeptides.
Summary of the Invention
The present invention provides isolated or purified polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding the polypeptides.
Accordingly, the present invention relates to isolated or purified polypeptides having cellobiohydrolase activity selected from the group consisting of:
(a) a polypeptide having at least 75%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 14;
(b) a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17, or the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11;
(c) a polypeptide encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or SEQ ID NO: 13;
(d) a variant of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more (e.g., several) positions; and
(e) a fragment of the polypeptide of (a) , (b) , (c) , or (d) that has cellobiohydrolase activity;
wherein the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ  ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the mature polypeptide of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
The present invention also relates to isolated or purified polypeptides comprising a catalytic domain having cellobiohydrolase activity selected from the group consisting of:
(a) a catalytic domain having at least 75%sequence identity to amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14;
(b) a catalytic domain encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17;
(c) a catalytic domain encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence identity to nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13;
(d) a variant of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or  more (e.g., several) positions; and
(e) a fragment of the catalytic domain of (a) , (b) , (c) , or (d) that has cellobiohydrolase activity;
wherein the catalytic domain of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the catalytic domain of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
The present invention also relates to isolated or purified polypeptides comprising a carbohydrate binding module selected from the group consisting of:
(a) a carbohydrate binding module having at least 75%sequence identity to amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14;
(b) a carbohydrate binding module encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17;
(c) a carbohydrate binding module encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence identity to nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13;
(d) a variant of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of  SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more (e.g., several) positions; and
(e) a fragment of the carbohydrate binding module of (a) , (b) , (c) , or (d) that has carbohydrate binding activity.
The present invention also relates to isolated or purified polynucleotides encoding the polypeptides of the present invention; nucleic acid constructs; recombinant expression vectors; recombinant host cells comprising the polynucleotides; and methods of producing the polypeptides.
The present invention also relates to processes for degrading a cellulosic material, comprising: treating the cellulosic material with an enzyme composition comprising a polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention. In one aspect, the processes further comprise recovering the degraded cellulosic material.
The present invention also relates to processes of producing a fermentation product, comprising: (a) saccharifying a cellulosic material with an enzyme composition comprising a polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention; (b) fermenting the saccharified cellulosic material with one or more (e.g., several) fermenting microorganisms to produce the fermentation product; and (c) recovering the fermentation product from the fermentation.
The present invention also relates to processes of fermenting a cellulosic material, comprising: fermenting the cellulosic material with one or more (e.g., several) fermenting microorganisms, wherein the cellulosic material is saccharified with an enzyme composition comprising a polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention. In one aspect, the fermenting of the cellulosic material produces a fermentation product. In another aspect, the processes further comprise recovering the fermentation product from the fermentation.
The present invention also relates to isolated or purified polynucleotides encoding a signal peptide comprising or consisting of amino acids 1 to 19 of SEQ ID NO: 2, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 4, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 6, amino acids 1 to 19 of SEQ ID NO: 8, amino acids 1 to 20 of SEQ ID NO: 10, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 12, amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 14, amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 18, each of which is operably linked to a gene encoding a protein, wherein the gene is foreign to the polynucleotide encoding the signal peptide; nucleic acid  constructs, expression vectors, and recombinant host cells comprising the polynucleotides; and methods of producing a protein.
Definitions
In accordance with this detailed description, the following definitions apply. Note that the singular forms "a, " "an, " and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise.
Reference to “about” a value or parameter herein includes aspects that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to “about X” includes the aspect “X” .
Unless defined otherwise or clearly indicated by context, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.
Acetylxylan esterase: The term “acetylxylan esterase” means a carboxylesterase (EC 3.1.1.72) that catalyzes the hydrolysis of acetyl groups from polymeric xylan, acetylated xylose, acetylated glucose, alpha-napthyl acetate, and p-nitrophenyl acetate. Acetylxylan esterase activity can be determined using 0.5 mM p-nitrophenylacetate as substrate in 50 mM sodium acetate pH 5.0 containing 0.01%TWEEN TM 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) . One unit of acetylxylan esterase is defined as the amount of enzyme capable of releasing 1 μmole of p-nitrophenolate anion per minute at pH 5, 25℃.
Alpha-L-arabinofuranosidase: The term “alpha-L-arabinofuranosidase” means an alpha-L-arabinofuranoside arabinofuranohydrolase (EC 3.2.1.55) that catalyzes the hydrolysis of terminal non-reducing alpha-L-arabinofuranoside residues in alpha-L-arabinosides. The enzyme acts on alpha-L-arabinofuranosides, alpha-L-arabinans containing (1, 3) -and/or (1, 5) -linkages, arabinoxylans, and arabinogalactans. Alpha-L-arabinofuranosidase is also known as arabinosidase, alpha-arabinosidase, alpha-L-arabinosidase, alpha-arabinofuranosidase, polysaccharide alpha-L-arabinofuranosidase, alpha-L-arabinofuranoside hydrolase, L-arabinosidase, or alpha-L-arabinanase. Alpha-L-arabinofuranosidase activity can be determined using 5 mg of medium viscosity wheat arabinoxylan (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Ireland) per ml of 100 mM sodium acetate pH 5 in a total volume of 200 μl for 30 minutes at 40℃ followed by arabinose analysis by
Figure PCTCN2019076319-appb-000001
HPX-87H column chromatography (Bio-Rad Laboratories, Inc. ) .
Alpha-glucuronidase: The term “alpha-glucuronidase” means an alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase (EC 3.2.1.139) that catalyzes the hydrolysis of an alpha-D-glucuronoside to D-glucuronate and an alcohol. Alpha-glucuronidase activity can be  determined according to de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. One unit of alpha-glucuronidase equals the amount of enzyme capable of releasing 1 μmole of glucuronic or 4-O-methylglucuronic acid per minute at pH 5, 40℃.
Auxiliary Activity 9 polypeptide: The term “Auxiliary Activity 9 polypeptide” or “AA9 polypeptide” means a polypeptide classified as a lytic polysaccharide monooxygenase (Quinlan et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 15079-15084; Phillips et al., 2011, ACS Chem. Biol. 6: 1399-1406; Li et al., 2012, Structure 20: 1051-1061) . AA9 polypeptides were formerly classified into the glycoside hydrolase Family 61 (GH61) according to Henrissat, 1991, Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat and Bairoch, 1996, Biochem. J. 316: 695-696.
AA9 polypeptides enhance the hydrolysis of a cellulosic material by an enzyme having cellulolytic activity. Cellulolytic enhancing activity can be determined by measuring the increase in reducing sugars or the increase of the total of cellobiose and glucose from the hydrolysis of a cellulosic material by cellulolytic enzyme under the following conditions: 1-50 mg of total protein/g of cellulose in pretreated corn stover (PCS) , wherein total protein is comprised of 50-99.5%w/w cellulolytic enzyme protein and 0.5-50%w/w protein of an AA9 polypeptide for 1-7 days at a suitable temperature, such as 40℃-80℃, e.g., 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, or 80℃ and a suitable pH, such as 4-9, e.g., 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, or 9.0, compared to a control hydrolysis with equal total protein loading without cellulolytic enhancing activity (1-50 mg of cellulolytic protein/g of cellulose in PCS) .
AA9 polypeptide enhancing activity can be determined using a mixture of CELLUCLAST TM 1.5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) and beta-glucosidase as the source of the cellulolytic activity, wherein the beta-glucosidase is present at a weight of at least 2-5%protein of the cellulase protein loading. In one aspect, the beta-glucosidase is an Aspergillus oryzae beta-glucosidase (e.g., recombinantly produced in Aspergillus oryzae according to WO 02/095014) . In another aspect, the beta-glucosidase is an Aspergillus fumigatus beta-glucosidase (e.g., recombinantly produced in Aspergillus oryzae as described in WO 02/095014) .
AA9 polypeptide enhancing activity can also be determined by incubating an AA9 polypeptide with 0.5%phosphoric acid swollen cellulose (PASC) , 100 mM sodium acetate pH 5, 1 mM MnSO 4, 0.1%gallic acid, 0.025 mg/ml of Aspergillus fumigatus beta-glucosidase, and 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000002
X-100 (4- (1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol) for 24-96 hours at 40℃ followed by determination of the glucose released from the PASC.
AA9 polypeptide enhancing activity can also be determined according to WO 2013/028928 for high temperature compositions.
AA9 polypeptides enhance the hydrolysis of a cellulosic material catalyzed by enzyme  having cellulolytic activity by reducing the amount of cellulolytic enzyme required to reach the same degree of hydrolysis preferably at least 1.01-fold, e.g., at least 1.05-fold, at least 1.10-fold, at least 1.25-fold, at least 1.5-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, or at least 20-fold.
The AA9 polypeptide can be used in the presence of a soluble activating divalent metal cation according to WO 2008/151043 or WO 2012/122518, e.g., manganese or copper.
The AA9 polypeptide can also be used in the presence of a dioxy compound, a bicylic compound, a heterocyclic compound, a nitrogen-containing compound, a quinone compound, a sulfur-containing compound, or a liquor obtained from a pretreated cellulosic material such as pretreated corn stover (WO 2012/021394, WO 2012/021395, WO 2012/021396, WO 2012/021399, WO 2012/021400, WO 2012/021401, WO 2012/021408, and WO 2012/021410) .
Beta-glucosidase: The term “beta-glucosidase” means a beta-D-glucoside glucohydrolase (E.C. 3.2.1.21) that catalyzes the hydrolysis of terminal non-reducing beta-D-glucose residues with the release of beta-D-glucose. Beta-glucosidase activity can be determined using p-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside as substrate according to the procedure of Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. One unit of beta-glucosidase is defined as 1.0 μmole of p-nitrophenolate anion produced per minute at 25℃, pH 4.8 from 1 mM p-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside as substrate in 50 mM sodium citrate containing 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000003
20.
Beta-xylosidase: The term “beta-xylosidase” means a beta-D-xyloside xylohydrolase (E.C. 3.2.1.37) that catalyzes the exo-hydrolysis of short beta (1→4) -xylooligosaccharides to remove successive D-xylose residues from non-reducing termini. Beta-xylosidase activity can be determined using 1 mM p-nitrophenyl-beta-D-xyloside as substrate in 100 mM sodium citrate containing 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000004
20 at pH 5, 40℃. One unit of beta-xylosidase is defined as 1.0 μmole of p-nitrophenolate anion produced per minute at 40℃, pH 5 from 1 mM p-nitrophenyl-beta-D-xyloside in 100 mM sodium citrate containing 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000005
20.
Carbohydrate binding module: The term “carbohydrate binding module” means a domain within a carbohydrate-active enzyme that provides carbohydrate-binding activity (Boraston et al., 2004, Biochem. J. 383: 769-781) . A majority of known carbohydrate binding modules (CBMs) are contiguous amino acid sequences with a discrete fold. The carbohydrate binding module (CBM) is typically found either at the N-terminal or at the C-terminal extremity of an enzyme. Some CBMs are known to have specificity for cellulose.
Catalase: The term “catalase” means a hydrogen-peroxide: hydrogen-peroxide oxidoreductase (E.C. 1.11.1.6 or E.C. 1.11.1.21) that catalyzes the conversion of two  hydrogen peroxides to oxygen and two waters.
Catalase activity can be determined by monitoring the degradation of hydrogen peroxide at 240 nm based on the following reaction:
2H 2O 2 → 2H 2O + O 2
The reaction is conducted in 50 mM phosphate pH 7 at 25℃ with 10.3 mM substrate (H 2O 2) . Absorbance is monitored spectrophotometrically within 16-24 seconds, which should correspond to an absorbance reduction from 0.45 to 0.4. One catalase activity unit can be expressed as one μmole of H 2O 2 degraded per minute at pH 7.0 and 25℃.
Catalytic domain: The term “catalytic domain” means the region of an enzyme containing the catalytic machinery of the enzyme.
cDNA: The term "cDNA" means a DNA molecule that can be prepared by reverse transcription from a mature, spliced, mRNA molecule obtained from a eukaryotic or prokaryotic cell. cDNA lacks intron sequences that may be present in the corresponding genomic DNA. The initial, primary RNA transcript is a precursor to mRNA that is processed through a series of steps, including splicing, before appearing as mature spliced mRNA.
Cellobiohydrolase: The term “cellobiohydrolase” means a 1, 4-beta-D-glucan cellobiohydrolase (E.C. 3.2.1.91 and E.C. 3.2.1.176) that catalyzes the hydrolysis of 1, 4-beta-D-glucosidic linkages in cellulose, cellooligosaccharides, or any beta-1, 4-linked glucose containing polymer, releasing cellobiose from the reducing end (cellobiohydrolase I) or non-reducing end (cellobiohydrolase II) of the chain (Teeri, 1997, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178) . Cellobiohydrolase activity can be determined according to the procedures described by Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288; and Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581.
Cellulolytic enzyme or cellulase: The term “cellulolytic enzyme” or “cellulase” means one or more (e.g., several) enzymes that hydrolyze a cellulosic material. Such enzymes include endoglucanase (s) , cellobiohydrolase (s) , beta-glucosidase (s) , or combinations thereof. The two basic approaches for measuring cellulolytic enzyme activity include: (1) measuring the total cellulolytic enzyme activity, and (2) measuring the individual cellulolytic enzyme activities (endoglucanases, cellobiohydrolases, and beta-glucosidases) as reviewed in Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. Total cellulolytic enzyme activity can be measured using insoluble substrates, including Whatman
Figure PCTCN2019076319-appb-000006
filter paper, microcrystalline cellulose, bacterial cellulose, algal cellulose, cotton, pretreated lignocellulose, etc. The most common total cellulolytic activity assay is the filter paper assay using Whatman
Figure PCTCN2019076319-appb-000007
filter paper  as the substrate. The assay was established by the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem. 59: 257-68) .
Cellulolytic enzyme activity can be determined by measuring the increase in production/release of sugars during hydrolysis of a cellulosic material by cellulolytic enzyme (s) under the following conditions: 1-50 mg of cellulolytic enzyme protein/g of cellulose in pretreated corn stover (PCS) (or other pretreated cellulosic material) for 3-7 days at a suitable temperature such as 40℃-80℃, e.g., 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, or 80℃, and a suitable pH, such as 4-9, e.g., 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, or 9.0, compared to a control hydrolysis without addition of cellulolytic enzyme protein. Typical conditions are 1 ml reactions, washed or unwashed PCS, 5%insoluble solids (dry weight) , 50 mM sodium acetate pH 5, 1 mM MnSO 4, 50℃, 55℃, or 60℃, 72 hours, sugar analysis by 
Figure PCTCN2019076319-appb-000008
HPX-87H column chromatography (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) .
Cellulosic material: The term “cellulosic material” means any material containing cellulose. The predominant polysaccharide in the primary cell wall of biomass is cellulose, the second most abundant is hemicellulose, and the third is pectin. The secondary cell wall, produced after the cell has stopped growing, also contains polysaccharides and is strengthened by polymeric lignin covalently cross-linked to hemicellulose. Cellulose is a homopolymer of anhydrocellobiose and thus a linear beta- (1-4) -D-glucan, while hemicelluloses include a variety of compounds, such as xylans, xyloglucans, arabinoxylans, and mannans in complex branched structures with a spectrum of substituents. Although generally polymorphous, cellulose is found in plant tissue primarily as an insoluble crystalline matrix of parallel glucan chains. Hemicelluloses usually hydrogen bond to cellulose, as well as to other hemicelluloses, which help stabilize the cell wall matrix.
Cellulose is generally found, for example, in the stems, leaves, hulls, husks, and cobs of plants or leaves, branches, and wood of trees. The cellulosic material can be, but is not limited to, agricultural residue, herbaceous material (including energy crops) , municipal solid waste, pulp and paper mill residue, waste paper, and wood (including forestry residue) (see, for example, Wiselogel et al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor) , pp. 105-118, Taylor &Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, New York) . It is understood herein that the cellulose may be in the form of lignocellulose, a plant cell wall material containing lignin, cellulose, and hemicellulose in a  mixed matrix. In one aspect, the cellulosic material is any biomass material. In another aspect, the cellulosic material is lignocellulose, which comprises cellulose, hemicelluloses, and lignin.
In an embodiment, the cellulosic material is agricultural residue, herbaceous material (including energy crops) , municipal solid waste, pulp and paper mill residue, waste paper, or wood (including forestry residue) .
In another embodiment, the cellulosic material is arundo, bagasse, bamboo, corn cob, corn fiber, corn stover, miscanthus, rice straw, sugar cane straw, switchgrass, or wheat straw.
In another embodiment, the cellulosic material is aspen, eucalyptus, fir, pine, poplar, spruce, or willow.
In another embodiment, the cellulosic material is algal cellulose, bacterial cellulose, cotton linter, filter paper, microcrystalline cellulose (e.g., 
Figure PCTCN2019076319-appb-000009
) , or phosphoric-acid treated cellulose.
In another embodiment, the cellulosic material is an aquatic biomass. As used herein the term "aquatic biomass" means biomass produced in an aquatic environment by a photosynthesis process. The aquatic biomass can be algae, emergent plants, floating-leaf plants, or submerged plants.
The cellulosic material may be used as is or may be subjected to pretreatment, using conventional methods known in the art, as described herein. In a preferred aspect, the cellulosic material is pretreated.
Coding sequence: The term “coding sequence” means a polynucleotide, which directly specifies the amino acid sequence of a polypeptide. The boundaries of the coding sequence are generally determined by an open reading frame, which begins with a start codon, such as ATG, GTG, or TTG, and ends with a stop codon, such as TAA, TAG, or TGA. The coding sequence may be a genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, or a combination thereof.
Control sequences: The term “control sequences” means nucleic acid sequences necessary for expression of a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention. Each control sequence may be native (i.e., from the same gene) or heterologous (i.e., from a different gene) to the polynucleotide encoding the polypeptide or native or heterologous to each other. Such control sequences include, but are not limited to, a leader, polyadenylation sequence, propeptide sequence, promoter, signal peptide sequence, and transcription terminator. At a minimum, the control sequences include a promoter, and transcriptional and translational stop signals. The control sequences may be provided with linkers for the purpose of introducing specific restriction sites facilitating ligation of the control sequences with the coding region of the polynucleotide encoding a polypeptide.
Dissolved Oxygen Saturation Level: The saturation level of oxygen is determined at the standard partial pressure (0.21 atmosphere) of oxygen. The saturation level at the standard partial pressure of oxygen is dependent on the temperature and solute concentrations. In an embodiment where the temperature during hydrolysis is 50℃, the saturation level would typically be in the range of 5-5.5 mg oxygen per kg slurry, depending on the solute concentrations. Hence, a concentration of dissolved oxygen of 0.5 to 10%of the saturation level at 50℃ corresponds to an amount of dissolved oxygen in a range from 0.025 ppm (0.5 x 5/100) to 0.55 ppm (10 x 5.5/100) , such as, e.g., 0.05 to 0.165 ppm, and a concentration of dissolved oxygen of 10-70%of the saturation level at 50℃ corresponds to an amount of dissolved oxygen in a range from 0.50 ppm (10 x 5/100) to 3.85 ppm (70 x 5.5/100) , such as, e.g., 1 to 2 ppm. In an embodiment, oxygen is added in an amount in the range of 0.5 to 5 ppm, such as 0.5 to 4.5 ppm, 0.5 to 4 ppm, 0.5 to 3.5 ppm, 0.5 to 3 ppm, 0.5 to 2.5 ppm, or 0.5 to 2 ppm.
Endoglucanase: The term “endoglucanase” means a 4- (1, 3; 1, 4) -beta-D-glucan 4-glucanohydrolase (E.C. 3.2.1.4) that catalyzes endohydrolysis of 1, 4-beta-D-glycosidic linkages in cellulose, cellulose derivatives (such as carboxymethyl cellulose and hydroxyethyl cellulose) , lichenin, beta-1, 4 bonds in mixed beta-1, 3-1, 4 glucans such as cereal beta-D-glucans or xyloglucans, and other plant material containing cellulosic components. Endoglucanase activity can be determined by measuring reduction in substrate viscosity or increase in reducing ends determined by a reducing sugar assay (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481) . Endoglucanase activity can also be determined using carboxymethyl cellulose (CMC) as substrate according to the procedure of Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, at pH 5, 40℃.
Feruloyl esterase: The term “feruloyl esterase” means a 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl-sugar hydrolase (EC 3.1.1.73) that catalyzes the hydrolysis of 4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl (feruloyl) groups from esterified sugar, which is usually arabinose in natural biomass substrates, to produce ferulate (4-hydroxy-3-methoxycinnamate) . Feruloyl esterase (FAE) is also known as ferulic acid esterase, hydroxycinnamoyl esterase, FAE-III, cinnamoyl ester hydrolase, FAEA, cinnAE, FAE-I, or FAE-II. Feruloyl esterase activity can be determined using 0.5 mM p-nitrophenylferulate as substrate in 50 mM sodium acetate pH 5.0. One unit of feruloyl esterase equals the amount of enzyme capable of releasing 1 μmole of p-nitrophenolate anion per minute at pH 5, 25℃.
Expression: The term “expression” means any step involved in the production of a polypeptide including, but not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.
Expression vector: The term “expression vector” means a linear or circular DNA molecule that comprises a polynucleotide encoding a polypeptide and is operably linked to control sequences that provide for its expression.
Fragment: The term “fragment” means a polypeptide, a catalytic domain, or a carbohydrate binding module having one or more (e.g., several) amino acids absent from the amino and/or carboxyl terminus of a mature polypeptide or domain; wherein the fragment has cellobiohydrolase or carbohydrate binding activity. In some embodiments, a fragment contains at least 85%, at least 90%, or at least 95%of the amino acid residues of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, or 18; or the catalytic domain thereof; or the carbohydrate binding module thereof.
Fusion polypeptide: The term “fusion polypeptide” is a polypeptide in which one polypeptide is fused at the N-terminus or the C-terminus of the polypeptide of the present invention. A fusion polypeptide is produced by fusing a polynucleotide encoding another polypeptide to a polynucleotide of the present invention. Techniques for producing fusion polypeptides are known in the art, and include ligating the coding sequences encoding the polypeptides so that they are in frame and that expression of the fusion polypeptide is under control of the same promoter (s) and terminator. Fusion polypeptides may also be constructed using intein technology in which fusion polypeptides are created post-translationally (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779) . A fusion polypeptide can further comprise a cleavage site between the two polypeptides. Upon secretion of the fusion protein, the site is cleaved releasing the two polypeptides. Examples of cleavage sites include, but are not limited to, the sites disclosed in Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Hemicellulolytic enzyme or hemicellulase: The term “hemicellulolytic enzyme” or “hemicellulase” means one or more (e.g., several) enzymes that hydrolyze a hemicellulosic material. See, for example, Shallom and Shoham, 2003, Current Opinion In Microbiology 6 (3) : 219-228) . Hemicellulases are key components in the degradation of plant biomass. Examples of hemicellulases include, but are not limited to, an acetylmannan esterase, an acetylxylan esterase, an arabinanase, an arabinofuranosidase, a coumaric acid esterase, a feruloyl esterase, a galactosidase, a glucuronidase, a glucuronoyl esterase, a mannanase, a  mannosidase, a xylanase, and a xylosidase. The substrates for these enzymes, hemicelluloses, are a heterogeneous group of branched and linear polysaccharides that are bound via hydrogen bonds to the cellulose microfibrils in the plant cell wall, crosslinking them into a robust network. Hemicelluloses are also covalently attached to lignin, forming together with cellulose a highly complex structure. The variable structure and organization of hemicelluloses require the concerted action of many enzymes for its complete degradation. The catalytic modules of hemicellulases are either glycoside hydrolases (GHs) that hydrolyze glycosidic bonds, or carbohydrate esterases (CEs) , which hydrolyze ester linkages of acetate or ferulic acid side groups. These catalytic modules, based on homology of their primary sequence, can be assigned into GH and CE families. Some families, with an overall similar fold, can be further grouped into clans, marked alphabetically (e.g., GH-A) . A most informative and updated classification of these and other carbohydrate active enzymes is available in the Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy) database. Hemicellulolytic enzyme activities can be measured according to Ghose and Bisaria, 1987, Pure &Appl. Chem. 59: 1739-1752, at a suitable temperature such as 40℃-80℃, e.g., 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, or 80℃, and a suitable pH such as 4-9, e.g., 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, or 9.0.
Hemicellulosic material: The term “hemicellulosic material” means any material comprising hemicelluloses. Hemicelluloses include xylan, glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan, and xyloglucan. These polysaccharides contain many different sugar monomers. Sugar monomers in hemicellulose can include xylose, mannose, galactose, rhamnose, and arabinose. Hemicelluloses contain most of the D-pentose sugars. Xylose is in most cases the sugar monomer present in the largest amount, although in softwoods mannose can be the most abundant sugar. Xylan contains a backbone of beta- (1-4) -linked xylose residues. Xylans of terrestrial plants are heteropolymers possessing a beta- (1-4) -D-xylopyranose backbone, which is branched by short carbohydrate chains. They comprise D-glucuronic acid or its 4-O-methyl ether, L-arabinose, and/or various oligosaccharides, composed of D-xylose, L-arabinose, D-or L-galactose, and D-glucose. Xylan-type polysaccharides can be divided into homoxylans and heteroxylans, which include glucuronoxylans, (arabino) glucuronoxylans, (glucurono) arabinoxylans, arabinoxylans, and complex heteroxylans. See, for example, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67. Hemicellulosic material is also known herein as “xylan-containing material” .
Sources for hemicellulosic material are essentially the same as those for cellulosic material described herein.
In the processes of the present invention, any material containing hemicellulose may  be used. In a preferred aspect, the hemicellulosic material is lignocellulose.
Heterologous: The term "heterologous" means, with respect to a host cell, that a polypeptide or nucleic acid is not naturally occurring in the host cell. The term "heterologous" means, with respect to a polypeptide or nucleic acid, that a control sequence, e.g., promoter, or domain of a polypeptide or nucleic acid is not naturally associated with the polypeptide or nucleic acid, i.e., the control sequence is from a gene other than the gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18, or the mature polypeptide thereof.
Host cell: The term "host cell" means any microbial or plant cell into which a nucleic acid construct or expression vector comprising a polynucleotide of the present invention has been introduced. Methods for introduction include but are not limited to protoplast fusion, transfection, transformation, electroporation, conjugation, and transduction. In some embodiments, the host cell is an isolated recombinant host cell that is partially or completely separated from at least one other component with, including but not limited to, for example, proteins, nucleic acids, cells, etc.
Hybrid polypeptide: The term “hybrid polypeptide” means a polypeptide comprising domains from two or more polypeptides, e.g., a binding module from one polypeptide and a catalytic domain from another polypeptide. The domains may be fused at the N-terminus or the C-terminus.
Hybridization: The term "hybridization" means the pairing of substantially complementary strands of nucleic acids, using standard Southern blotting procedures. Hybridization may be performed under medium, medium-high, high or very high stringency conditions. Medium stringency conditions means prehybridization and hybridization at 42℃ in 5X SSPE, 0.3%SDS, 200 micrograms/ml sheared and denatured salmon sperm DNA, and 35%formamide for 12 to 24 hours, followed by washing three times each for 15 minutes using 0.2X SSC, 0.2%SDS at 55℃. Medium-high stringency conditions means prehybridization and hybridization at 42℃ in 5X SSPE, 0.3%SDS, 200 micrograms/ml sheared and denatured salmon sperm DNA, and 35%formamide for 12 to 24 hours, followed by washing three times each for 15 minutes using 0.2X SSC, 0.2%SDS at 60℃. High stringency conditions means prehybridization and hybridization at 42℃ in 5X SSPE, 0.3%SDS, 200 micrograms/ml sheared and denatured salmon sperm DNA, and 50%formamide for 12 to 24 hours, followed by washing three times each for 15 minutes using 0.2X SSC, 0.2%SDS at 65℃. Very high stringency conditions means prehybridization and hybridization at 42℃ in 5X SSPE, 0.3%SDS, 200 micrograms/ml sheared and denatured salmon sperm DNA, and 50%formamide  for 12 to 24 hours, followed by washing three times each for 15 minutes using 0.2X SSC, 0.2%SDS at 70℃.
Isolated: The term “isolated” means a polypeptide, nucleic acid, cell, or other specified material or component that is separated from at least one other material or component with which it is naturally associated as found in nature, including but not limited to, for example, other proteins, nucleic acids, cells, etc. An isolated polypeptide includes, but is not limited to, a culture broth containing the secreted polypeptide.
Laccase: The term “laccase” means a benzenediol: oxygen oxidoreductase (E.C. 1.10.3.2) that catalyzes the following reaction: 1, 2-or 1, 4-benzenediol + O 2 = 1, 2-or 1, 4-benzosemiquinone + 2 H 2O.
Laccase activity can be determined by the oxidation of syringaldazine (4, 4′- [azinobis (methanylylidene) ] bis (2, 6-dimethoxyphenol) ) to the corresponding quinone 4, 4′- [azobis (methanylylidene] ) bis (2, 6-dimethoxycyclohexa-2, 5-dien-1-one) by laccase. The reaction (shown below) is detected by an increase in absorbance at 530 nm.
Figure PCTCN2019076319-appb-000010
The reaction is conducted in 23 mM MES pH 5.5 at 30℃ with 19 μM substrate (syringaldazine) and 1 g/L polyethylene glycol (PEG) 6000. The sample is placed in a spectrophotometer and the change in absorbance is measured at 530 nm every 15 seconds up to 90 seconds. One laccase unit is the amount of enzyme that catalyzes the conversion of 1 μmole syringaldazine per minute under the specified analytical conditions.
Mature polypeptide: The term “mature polypeptide” means a polypeptide in its final form following translation and any post-translational modifications, such as N-terminal processing, C-terminal truncation, glycosylation, phosphorylation, and removal of signal peptides.
In one aspect, the mature polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2. In another aspect, the mature polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4. In another aspect, the mature polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6. In another aspect, the mature polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8. In another aspect, the mature polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 10. In another aspect, the mature polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 12. In another aspect, the mature polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 14. In another aspect, the mature  polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 16. In another aspect, the mature polypeptide is the mature polypeptide of SEQ ID NO: 18.
It is known in the art that a host cell may produce a mixture of two of more different mature polypeptides (i.e., with a different C-terminal and/or N-terminal amino acid) expressed by the same polynucleotide. It is also known in the art that different host cells can process polypeptides differently, and thus, one host cell expressing a polynucleotide may produce a different mature polypeptide (e.g., having a different C-terminal and/or N-terminal amino acid) as compared to another host cell expressing the same polynucleotide. In one aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 20 to 450 of SEQ ID NO: 2. In another aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 19 to 470 of SEQ ID NO: 4. In another aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 19 to 451 of SEQ ID NO: 6. In another aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 20 to 450 of SEQ ID NO: 8. In another aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 21 to 452 of SEQ ID NO: 10. In another aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 19 to 456 of SEQ ID NO: 12. In another aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 26 to 523 of SEQ ID NO: 14. In another aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 26 to 543 of SEQ ID NO: 16. In another aspect, a mature polypeptide comprises amino acids 26 to 547 of SEQ ID NO: 18.
Mature polypeptide coding sequence: The term “mature polypeptide coding sequence” means a polynucleotide that encodes a mature polypeptide having cellobiohydrolase activity.
In one aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 58 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof. In another aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 55 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the eDNA sequence thereof. In another aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 55 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof. In another aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 58 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof. In another aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 61 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof. In another aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 55 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof. In another aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 76 to 1569 of SEQ ID NO: 13. In another aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 76 to 1629 of SEQ ID NO: 15. In another aspect, the mature polypeptide coding sequence is nucleotides 76 to 1641 of SEQ ID NO: 17.
Native: The term "native" means a nucleic acid or polypeptide naturally occurring in a host cell.
Nucleic acid construct: The term "nucleic acid construct" means a nucleic acid molecule, either single-or double-stranded, which is isolated from a naturally occurring gene or is modified to contain segments of nucleic acids in a manner that would not otherwise exist in nature or which is synthetic, which comprises one or more control sequences.
Operably linked: The term “operably linked” means a configuration in which a control sequence is placed at an appropriate position relative to the coding sequence of a polynucleotide such that the control sequence directs expression of the coding sequence.
Peroxidase: The term “peroxidase” means an enzyme that converts a peroxide, e.g., hydrogen peroxide, to a less oxidative species, e.g., water. It is understood herein that a peroxidase encompasses a peroxide-decomposing enzyme. The term “peroxide-decomposing enzyme” is defined herein as a donor: peroxide oxidoreductase (E.C. number 1.11.1. x, wherein x=1-3, 5, 7-19, or 21) that catalyzes the reaction reduced substrate (2e -) + ROOR’ → oxidized substrate + ROH + R’OH; such as horseradish peroxidase that catalyzes the reaction phenol + H 2O 2 → quinone + H 2O, and catalase that catalyzes the reaction H 2O 2 + H 2O 2 → O 2 + 2H 2O. In addition to hydrogen peroxide, other peroxides may also be decomposed by these enzymes.
Peroxidase activity can be determined by measuring the oxidation of 2, 2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) by a peroxidase in the presence of hydrogen peroxide as shown below. The reaction product ABTS ox forms a blue-green color which can be quantified at 418 nm.
H 2O 2 + 2ABTS red + 2H +→ 2H 2O + 2ABTS ox
The reaction is conducted in 0.1 M phosphate pH 7 at 30℃ with 1.67 mM substrate (ABTS) , 1.5 g/L
Figure PCTCN2019076319-appb-000011
X-405, 0.88 mM hydrogen peroxide, and approximately 0.040 units enzyme per mi. The sample is placed in a spectrophotometer and the change in absorbance is measured at 418 nm from 15 seconds up to 60 seconds. One peroxidase unit can be expressed as the amount of enzyme required to catalyze the conversion of 1 μmole of hydrogen peroxide per minute under the specified analytical conditions.
Pretreated cellulosic material: The term “pretreated cellulosic material” means a cellulosic material derived from biomass by treatment with heat and dilute sulfuric acid, alkaline pretreatment, neutral pretreatment, or any pretreatment known in the art.
Pretreated corn stover: The term “Pretreated Corn Stover” or “PCS” means a cellulosic material derived from corn stover by treatment with heat and dilute sulfuric acid, alkaline pretreatment, neutral pretreatment, or any pretreatment known in the art.
Pretreated wheat straw: The term “Pretreated Wheat Straw” or “PWS” means a cellulosic material derived from wheat straw by treatment with heat and dilute sulfuric acid,  alkaline pretreatment, neutral pretreatment, or any pretreatment known in the art.
Purified: The term “purified” means a nucleic acid or polypeptide that is substantially free from other components as determined by analytical techniques well known in the art (e.g., a purified polypeptide or nucleic acid may form a discrete band in an electrophoretic gel, chromatographic eluate, and/or a media subjected to density gradient centrifugation) . A purified nucleic acid or polypeptide is at least about 50%pure, usually at least about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99%, about 99.5%, about 99.6%, about 99.7%, about 99.8%or more pure (e.g., percent by weight on a molar basis) . In a related sense, a composition is enriched for a molecule when there is a substantial increase in the concentration of the molecule after application of a purification or enrichment technique. The term "enriched" refers to a compound, polypeptide, cell, nucleic acid, amino acid, or other specified material or component that is present in a composition at a relative or absolute concentration that is higher than a starting composition.
Recombinant: The term "recombinant, " when used in reference to a subject cell, nucleic acid, protein or vector, means that the subject has been modified from its native state. Thus, for example, recombinant cells express genes that are not found within the native (non-recombinant) form of the cell, or express native genes at different levels or under different conditions than found in nature. Recombinant nucleic acids differ from a native sequence by one or more nucleotides and/or are operably linked to heterologous sequences, e.g., a heterologous promoter in an expression vector. Recombinant proteins may differ from a native sequence by one or more amino acids and/or are fused with heterologous sequences. A vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide is a recombinant vector. The term “recombinant” is synonymous with “genetically modified” and “transgenic” .
Sequence identity: The relatedness between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences is described by the parameter “sequence identity” .
For purposes of the present invention, the sequence identity between two amino acid sequences is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the Needle program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) , preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 (EMBOSS version of BLOSUM62) substitution matrix. The output of Needle labeled “longest identity” (obtained using the -nobrief option) is used as the percent identity and is calculated as follows:
(Identical Residues x 100) / (Length of Alignment -Total Number of Gaps in Alignment)
For purposes of the present invention, the sequence identity between two deoxyribonucleotide sequences is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra) , preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix. The output of Needle labeled “longest identity” (obtained using the -nobrief option) is used as the percent identity and is calculated as follows:
(Identical Deoxyribonucleotides x 100) / (Length of Alignment -Total Number of Gaps in Alignment)
Subsequence: The term “subsequence” means a polynucleotide having one or more (e.g., several) nucleotides absent from the 5′ and/or 3′ end of a mature polypeptide coding sequence; wherein the subsequence encodes a fragment having cellobiohydrolase activity. In one aspect, a subsequence of a mature polypeptide coding sequence contains at least 85%, at least 90%, or at least 95%of the nucleotides of the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, or 17; or the catalytic domain coding sequence thereof; or the carbohydrate binding module coding sequence thereof.
Variant: The term “variant” means a polypeptide having cellobiohydrolase activity comprising an alteration, i.e., a substitution, insertion, and/or deletion, at one or more (e.g., several) positions. A substitution means replacement of the amino acid occupying a position with a different amino acid; a deletion means removal of the amino acid occupying a position; and an insertion means adding an amino acid adjacent to and immediately following the amino acid occupying a position.
Wild-type: The term "wild-type" in reference to an amino acid sequence or nucleic acid sequence means that the amino acid sequence or nucleic acid sequence is a native or naturally-occurring sequence. As used herein, the term "naturally-occurring" refers to anything (e.g., proteins, amino acids, or nucleic acid sequences) that is found in nature. Conversely, the term "non-naturally occurring" refers to anything that is not found in nature (e.g., recombinant nucleic acids and protein sequences produced in the laboratory or modification of the wild-type sequence) .
Xylan-containing material: The term “xylan-containing material” means any material comprising a plant cell wall polysaccharide containing a backbone of beta- (1-4) -linked xylose residues. Xylans of terrestrial plants are heteropolymers possessing a beta- (1-4) -D-xylopyranose backbone, which is branched by short carbohydrate chains. They comprise D-glucuronic acid or its 4-O-methyl ether, L-arabinose, and/or various oligosaccharides,  composed of D-xylose, L-arabinose, D-or L-galactose, and D-glucose. Xylan-type polysaccharides can be divided into homoxylans and heteroxylans, which include glucuronoxylans, (arabino) glucuronoxylans, (glucurono) arabinoxylans, arabinoxylans, and complex heteroxylans. See, for example, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.
In the processes of the present invention, any material containing xylan may be used. In a preferred aspect, the xylan-containing material is lignocellulose.
Xylan degrading activity or xylanolytic activity: The term “xylan degrading activity” or “xylanolytic activity” means a biological activity that hydrolyzes xylan-containing material. The two basic approaches for measuring xylanolytic activity include: (1) measuring the total xylanolytic activity, and (2) measuring the individual xylanolytic activities (e.g., endoxylanases, beta-xylosidases, arabinofuranosidases, alpha-glucuronidases, acetylxylan esterases, feruloyl esterases, and alpha-glucuronyl esterases) . Recent progress in assays of xylanolytic enzymes was summarized in several publications including Biely and Puchard, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86 (11) : 1636-1647; Spanikova and Biely, 2006, FEBS Letters 580 (19) : 4597-4601; Herrmann et al., 1997, Biochemical Journal 321: 375-381.
Total xylan degrading activity can be measured by determining the reducing sugars formed from various types of xylan, including, for example, oat spelt, beechwood, and larchwood xylans, or by photometric determination of dyed xylan fragments released from various covalently dyed xylans. A common total xylanolytic activity assay is based on production of reducing sugars from polymeric 4-O-methyl glucuronoxylan as described in Bailey et al., 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23 (3) : 257-270. Xylanase activity can also be determined with 0.2%AZCL-arabinoxylan as substrate in 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000012
X-100 and 200 mM sodium phosphate pH 6 at 37℃. One unit of xylanase activity is defined as 1.0 μmole of azurine produced per minute at 37℃, pH 6 from 0.2%AZCL-arabinoxylan as substrate in 200 mM sodium phosphate pH 6.
Xylan degrading activity can be determined by measuring the increase in hydrolysis of birchwood xylan (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) by xylan-degrading enzyme (s) under the following typical conditions: 1 ml reactions, 5 mg/ml substrate (total solids) , 5 mg of xylanolytic protein/g of substrate, 50 mM sodium acetate pH 5, 50℃, 24 hours, sugar analysis using p-hydroxybenzoic acid hydrazide (PHBAH) assay as described by Lever, 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279.
Xylanase: The term “xylanase” means a 1, 4-beta-D-xylan-xylohydrolase (E.C. 3.2.1.8) that catalyzes the endohydrolysis of 1, 4-beta-D-xylosidic linkages in xylans. Xylanase activity can be determined with 0.2%AZCL-arabinoxylan as substrate in 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000013
X-100 and 200 mM sodium phosphate pH 6 at 37℃. One unit of xylanase activity is defined as 1.0 μmole  of azurine produced per minute at 37℃, pH 6 from 0.2%AZCL-arabinoxylan as substrate in 200 mM sodium phosphate pH 6.
Detailed Description of the Invention
Polypeptides Having Cellobiohydrolase Activity
In some embodiments, the present invention relates to isolated polypeptides having a sequence identity of at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2; at least 85%, e.g., at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 16; at least 90%, e.g., at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6; at least 91%, e.g., at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 12; at least 96%, e.g., at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 18; or at least 98%, e.g., at least 99%, or 100%to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 14; which have cellobiohydrolase activity; wherein the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the mature polypeptide of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
In one aspect, the polypeptides differ by up to 10 amino acids, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, from the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18.
In one embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of,  or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the polypeptide preferably comprises, consists essentially of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or the mature polypeptide thereof, or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In some embodiments, the present invention relates to isolated polypeptides having cellobiohydrolase activity encoded by polynucleotides that hybridize under medium stringency conditions, medium-high stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions with the full-length complement of the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, orSEQ ID NO: 17, or the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) .
The polynucleotide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17, or the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11, or a subsequence thereof, as well as the polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18, or a fragment thereof, may be used to design nucleic  acid probes to identify and clone DNA encoding polypeptides having cellobiohydrolase activity from strains of different genera or species according to methods well known in the art. Such probes can be used for hybridization with the genomic DNA or cDNA of a cell of interest, following standard Southern blotting procedures, in order to identify and isolate the corresponding gene therein. Such probes can be considerably shorter than the entire sequence, but should be at least 15, e.g., at least 25, at least 35, or at least 70 nucleotides in length. Preferably, the nucleic acid probe is at least 100 nucleotides in length, e.g., at least 200 nucleotides, at least 300 nucleotides, at least 400 nucleotides, at least 500 nucleotides, at least 600 nucleotides, at least 700 nucleotides, at least 800 nucleotides, or at least 900 nucleotides in length. Both DNA and RNA probes can be used. The probes are typically labeled for detecting the corresponding gene (for example, with  32P,  3H,  35S, biotin, or avidin) . Such probes are encompassed by the present invention.
A genomic DNA or cDNA library prepared from such other strains may be screened for DNA that hybridizes with the probes described above and encodes a polypeptide having cellobiohydrolase activity. Genomic or other DNA from such other strains may be separated by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or other separation techniques. DNA from the libraries or the separated DNA may be transferred to and immobilized on nitrocellulose or other suitable carrier material. In order to identify a clone or DNA that hybridizes with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17, or the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11, or a subsequence thereof, the carrier material is used in a Southern blot.
For purposes of the present invention, hybridization indicates that the polynucleotides hybridize to a labeled nucleic acid probe corresponding to (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17; (ii) the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17; (iii) the cDNA sequence of the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11; (iv) the full-length complement thereof; or (v) a subsequence thereof; under medium to very high stringency conditions. Molecules to which the nucleic acid probe hybridizes under these conditions can be detected using, for example, X-ray film or any other detection means known in the art.
In some embodiments, the nucleic acid probe is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or  SEQ ID NO: 17; the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11; or the mature polypeptide coding sequence thereof. In another aspect, the nucleic acid probe is a polynucleotide that encodes the polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18; the mature polypeptide thereof; or a fragment thereof.
In some embodiments, the present invention relates to isolated polypeptides having cellobiohydrolase activity encoded by polynucleotides having a sequence identity of at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%, e.g., at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or SEQ ID NO: 15; at least 90%, e.g., at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%, e.g., at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%, e.g., at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 17; or at least 98%, e.g., at least 99%or 100%to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or SEQ ID NO: 13.
In some embodiments, the present invention relates to variants of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more (e.g., several) positions. In one aspect, the number of amino acid substitutions, deletions and/or insertions introduced into the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18 is up to 10, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
The amino acid changes may be of a minor nature, that is conservative amino acid substitutions or insertions that do not significantly affect the folding and/or activity of the  protein; small deletions, typically of 1-30 amino acids; small amino-or carboxyl-terminal extensions, such as an amino-terminal methionine residue; a small linker peptide of up to 20-25 residues; or a small extension that facilitates purification by changing net charge or another function, such as a poly-histidine tract, an antigenic epitope or a binding domain.
Essential amino acids in a polypeptide can be identified according to procedures known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine-scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) . In the latter technique, single alanine mutations are introduced at every residue in the molecule, and the resultant molecules are tested for cellobiohydrolase activity to identify amino acid residues that are critical to the activity of the molecule. See also, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. The active site of the enzyme or other biological interaction can also be determined by physical analysis of structure, as determined by such techniques as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction, or photoaffinity labeling, in conjunction with mutation of putative contact site amino acids. See, for example, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. The identity of essential amino acids can also be inferred from an alignment with a related polypeptide.
Single or multiple amino acid substitutions, deletions, and/or insertions can be made and tested using known methods of mutagenesis, recombination, and/or shuffling, followed by a relevant screening procedure, such as those disclosed by Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; or WO 95/22625. Other methods that can be used include error-prone PCR, phage display (e.g., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204) , and region-directed mutagenesis (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127) .
Mutagenesis/shuffling methods can be combined with high-throughput, automated screening methods to detect activity of cloned, mutagenized polypeptides expressed by host cells (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896) . Mutagenized DNA molecules that encode active polypeptides can be recovered from the host cells and rapidly sequenced using standard methods in the art. These methods allow the rapid determination of the importance of individual amino acid residues in a polypeptide.
In some embodiments, the polypeptide contains at least 85%, at least 90%, or at least 95%of the amino acid residues of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, or 18; or the catalytic domain thereof; or the carbohydrate binding module thereof.
The polypeptide may be a hybrid polypeptide or a fusion polypeptide.
Sources of Polypeptides Having Cellobiohydrolase Activity
A polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention may be obtained from microorganisms of any genus. For purposes of the present invention, the term “obtained from” as used herein in connection with a given source shall mean that the polypeptide encoded by a polynucleotide is produced by the source or by a strain in which the polynucleotide from the source has been inserted. In one aspect, the polypeptide obtained from a given source is secreted extracellularly.
In another aspect, the polypeptide is a Macrophomina polypeptide, e.g., a polypeptide obtained from Macrophomina phaseolina.
In another aspect, the polypeptide is a Neosartorya polypeptide, e.g., a polypeptide obtained from Neosartorya massa.
In another aspect, the polypeptide is a Penicillium polypeptide, e.g., a polypeptide obtained from Penicillium adametzii, Penicillium viticola, or Penicillium wellingtonense.
In another aspect, the polypeptide is a Perenniporia polypeptide, e.g., a polypeptide obtained from Perenniporia tephropora.
In another aspect, the polypeptide is a Talaromyces polypeptide, e.g., a polypeptide obtained from Talaromyces verruculosus.
In another aspect, the polypeptide is a Valsaria polypeptide, e.g., a polypeptide obtained from Valsaria rubricosa.
It will be understood that for the aforementioned species, the invention encompasses both the perfect and imperfect states, and other taxonomic equivalents, e.g., anamorphs, regardless of the species name by which they are known. Those skilled in the art will readily recognize the identity of appropriate equivalents.
Strains of these species are readily accessible to the public in a number of culture collections, such as the American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikreorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , and Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .
The polypeptides may be identified and obtained from other sources including microorganisms isolated from nature (e.g., soil, composts, water, etc. ) or DNA samples obtained directly from natural materials (e.g., soil, composts, water, etc. ) using the above-mentioned probes. Techniques for isolating microorganisms and DNA directly from natural habitats are well known in the art. A polynucleotide encoding the polypeptide may then be obtained by similarly screening a genomic DNA or cDNA library of another microorganism or  mixed DNA sample. Once a polynucleotide encoding a polypeptide has been detected with the probe (s) , the polynucleotide can be isolated or cloned by utilizing techniques that are known to those of ordinary skill in the art (see, e.g., Sambrook et al., 1989, supra) .
Catalytic Domains
In some embodiments, the present invention also relates to catalytic domains with cellobiohydrolase activity having a sequence identity of at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2; at least 85%, e.g., at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16; at least 90%, e.g., at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6; at least 91%, e.g., at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12; at least 96%, e.g., at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18; at least 98%, e.g., at least 99%, or 100%to amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14; wherein the catalytic domain of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the catalytic domain of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
In one aspect, the catalytic domains comprise amino acid sequences that differ by up to 10 amino acids, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, from amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18.
In one embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4; or is a fragment thereof having  cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In another embodiment, the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18; or is a fragment thereof having cellobiohydrolase activity.
In some embodiments, the present invention also relates to catalytic domains encoded by polynucleotides that hybridize under medium stringency conditions, medium-high stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17 (Sambrook et al., 1989, supra) .
In some embodiments, the present invention also relates to catalytic domains encoded by polynucleotides having a sequence identity of at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least  88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%, e.g., at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15; at least 90%, e.g., at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%, e.g., at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%, e.g., at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%, e.g., at least 99%, or 100%to nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13.
In one embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the catalytic domain preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17.
In some embodiments, the present invention also relates to catalytic domain variants of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more (e.g., several) positions. In one aspect, the number of amino acid substitutions, deletions and/or insertions introduced into the sequence of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18 is up to 10, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, or 10.
In another aspect, a polypeptide comprising a catalytic domain of the present invention may further comprise a carbohydrate binding module.
Carbohydrate Binding Modules
In some embodiments, the present invention also relates to polypeptides comprising a catalytic domain and a carbohydrate binding module, wherein the carbohydrate binding module has a sequence identity of at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2; at least 85%, e.g., at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16; at least 90%, e.g., at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6; at least 91%, e.g., at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12; at least 96%, e.g., at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to amino acids 512 to 547 of  SEQ ID NO: 18; or at least 98%, e.g., at least 99%, or 100%to amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14. In one aspect, the carbohydrate binding modules comprise amino acid sequences that differ by up to 10 amino acids, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, from amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18.
The polypeptides may further comprise a linker between the catalytic domain and the carbohydrate binding module.
In one embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In another embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In another embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In another embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In another embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In another embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In another embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In another embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In another embodiment, the carbohydrate binding module preferably comprises,  consists essentially of, or consists of amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18; or is a fragment thereof having carbohydrate binding activity.
In some embodiments, the present invention also relates to carbohydrate binding modules encoded by polynucleotides that hybridize under medium stringency conditions, medium-high stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17 (Sambrook et al., 1989, supra) .
In some embodiments, the present invention also relates to carbohydrate binding modules encoded by polynucleotides having a sequence identity of at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%, e.g., at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15; at least 90%, e.g., at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%, e.g., at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%, e.g., at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%, e.g., at least 99%, or 100%to nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13.
In one embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module  preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13 or the cDNA sequence thereof.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15.
In another embodiment, the polynucleotide encoding the carbohydrate binding module preferably comprises, consists essentially of, or consists of nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17.
In some embodiments, the present invention also relates to carbohydrate binding module variants of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more (e.g., several) positions. In one aspect, the number of amino acid substitutions, deletions and/or insertions introduced into the sequence of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18 is up to 10, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, or 10.
The catalytic domain may be from a hydrolase, isomerase, ligase, lyase, oxidoreductase, or transferase, e.g., an aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycosyltransferase, deoxyribonuclease, endoglucanase, esterase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamylase, alpha-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, pectinolytic enzyme, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, proteolytic enzyme, ribonuclease, transglutaminase, xylanase, or beta-xylosidase. The polynucleotide encoding the catalytic domain may be obtained from any prokaryotic, eukaryotic, or other source.
Polynucleotides
The present invention also relates to isolated polynucleotides encoding a polypeptide, a catalytic domain, or carbohydrate binding module of the present invention, as described herein.
The techniques used to isolate or clone a polynucleotide are known in the art and include isolation from genomic DNA or cDNA, or a combination thereof. The cloning of the polynucleotides from genomic DNA can be effected, e.g., by using the polymerase chain reaction (PCR) or antibody screening of expression libraries to detect cloned DNA fragments with shared structural features. See, e.g., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Other nucleic acid amplification procedures such as ligase chain reaction (LCR) , ligation activated transcription (LAT) and polynucleotide-based amplification (NASBA) may be used. The polynucleotides may be cloned from a strain of Macrophomina, Neosartorta, Penicillium, Perenniporia, Talaromyces, or Valsaria, or a related organism and thus, for example, may be a species variant of the polypeptide encoding region of the polynucleotide.
Modification of a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention may be necessary for synthesizing polypeptides substantially similar to the polypeptide. The term “substantially similar” to the polypeptide refers to non-naturally occurring forms of the polypeptide. These polypeptides may differ in some engineered way from the polypeptide isolated from its native source, e.g., variants that differ in specific activity, thermostability, pH optimum, or the like. The variants may be constructed on the basis of the polynucleotide presented as the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17, or the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11, e.g., a subsequence thereof, and/or by  introduction of nucleotide substitutions that do not result in a change in the amino acid sequence of the polypeptide, but which correspond to the codon usage of the host organism intended for production of the enzyme, or by introduction of nucleotide substitutions that may give rise to a different amino acid sequence. For a general description of nucleotide substitution, see, e.g., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Nucleic Acid Constructs
The present invention also relates to nucleic acid constructs comprising a polynucleotide of the present invention, wherein the polynucleotide is preferably operably linked to one or more control sequences that direct the expression of the coding sequence in a suitable host cell under conditions compatible with the control sequences.
The polynucleotide may be manipulated in a variety of ways to provide for expression of the polypeptide. Manipulation of the polynucleotide prior to its insertion into a vector may be desirable or necessary depending on the expression vector. The techniques for modifying polynucleotides utilizing recombinant DNA methods are well known in the art.
The control sequence may be a promoter, a polynucleotide that is recognized by a host cell for expression of a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention. The promoter contains transcriptional control sequences that mediate the expression of the polypeptide. The promoter may be any polynucleotide that shows transcriptional activity in the host cell including mutant, truncated, and hybrid promoters, and may be obtained from genes encoding extracellular or intracellular polypeptides either homologous or heterologous to the host cell.
Examples of suitable promoters for directing transcription of the nucleic acid constructs of the present invention in a bacterial host cell are the promoters obtained from the Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase gene (amyQ) , Bacillus licheniformis alpha-amylase gene (amyL) , Bacillus licheniformis penicillinase gene (penP) , Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene (amyM) , Bacillus subtilis levansucrase gene (sacB) , Bacillus subtilis xylA and xylB genes, Bacillus thuringiensis crylllA gene (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107) , E. coli lac operon, E. coli trc promoter (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315) , Streptomyces coelicolor agarase gene (dagA) , and prokaryotic beta-lactamase gene (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) , as well as the tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25) . Further promoters are described in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; and in Sambrook et al., 1989, supra. Examples of tandem promoters are disclosed in WO 99/43835.
Examples of suitable promoters for directing transcription of the nucleic acid constructs of the present invention in a filamentous fungal host cell are promoters obtained from the genes for Aspergillus nidulans acetamidase, Aspergillus niger neutral alpha-amylase, Aspergillus niger acid stable alpha-amylase, Aspergillus niger or Aspergillus awamori glucoamylase (glaA) , Aspergillus oryzae TAKA amylase, Aspergillus oryzae alkaline protease, Aspergillus oryzae triose phosphate isomerase, Fusarium oxysporum trypsin-like protease (WO 96/00787) , Fusarium venenatum amyloglucosidase (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900) , Rhizomucor miehei lipase, Rhizomucor miehei aspartic proteinase, Trichoderma reesei beta-glucosidase, Trichoderma reesei cellobiohydrolase I, Trichoderma reesei cellobiohydrolase II, Trichoderma reesei endoglucanase I, Trichoderma reesei endoglucanase II, Trichoderma reesei endoglucanase III, Trichoderma reesei endoglucanase V, Trichoderma reesei xylanase I, Trichoderma reesei xylanase II, Trichoderma reesei xylanase III, Trichoderma reesei beta-xylosidase, and Trichoderma reesei translation elongation factor, as well as the NA2-tpi promoter (a modified promoter from an Aspergillus neutral alpha-amylase gene in which the untranslated leader has been replaced by an untranslated leader from an Aspergillus triose phosphate isomerase gene; non-limiting examples include modified promoters from an Aspergillus niger neutral alpha-amylase gene in which the untranslated leader has been replaced by an untranslated leader from an Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae triose phosphate isomerase gene) ; and mutant, truncated, and hybrid promoters thereof. Other promoters are described in U.S. Patent No. 6,011,147.
In a yeast host, useful promoters are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1) , Saccharomyces cerevisiae galactokinase (GAL1) , Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (ADH1, ADH2/GAP) , Saccharomyces cerevisiae triose phosphate isomerase (TPI) , Saccharomyces cerevisiae metallothionein (CUP1) , and Saccharomyces cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase. Other useful promoters for yeast host cells are described by Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
The control sequence may also be a transcription terminator, which is recognized by a host cell to terminate transcription. The terminator is operably linked to the 3’-terminus of the polynucleotide encoding the polypeptide. Any terminator that is functional in the host cell may be used in the present invention.
Preferred terminators for bacterial host cells are obtained from the genes for Bacillus clausii alkaline protease (apri) , Bacillus licheniformis alpha-amylase (amyL ) , and Escherichia coli ribosomal RNA (rrnB) .
Preferred terminators for filamentous fungal host cells are obtained from the genes for Aspergillus nidulans acetamidase, Aspergillus nidulans anthranilate synthase, Aspergillus niger glucoamylase, Aspergillus niger alpha-glucosidase, Aspergillus oryzae TAKA amylase, Fusarium oxysporum trypsin-like protease, Trichoderma reesei beta-glucosidase, Trichoderma reesei cellobiohydrolase I, Trichoderma reesei cellobiohydrolase II, Trichoderma reesei endoglucanase I, Trichoderma reesei endoglucanase II, Trichoderma reesei endoglucanase III, Trichoderma reesei endoglucanase V, Trichoderma reesei xylanase I, Trichoderma reesei xylanase II, Trichoderma reesei xylanase III, Trichoderma reesei beta-xylosidase, and Trichoderma reesei translation elongation factor.
Preferred terminators for yeast host cells are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase, Saccharomyces cerevisiae cytochrome C (CYC1) , and Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Other useful terminators for yeast host cells are described by Romanos et al., 1992, supra.
The control sequence may also be an mRNA stabilizer region downstream of a promoter and upstream of the coding sequence of a gene which increases expression of the gene.
Examples of suitable mRNA stabilizer regions are obtained from a Bacillus thuringiensis crylllA gene (WO 94/25612) and a Bacillus subtilis SP82 gene (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471) .
The control sequence may also be a leader, a nontranslated region of an mRNA that is important for translation by the host cell. The leader is operably linked to the 5’-terminus of the polynucleotide encoding the polypeptide. Any leader that is functional in the host cell may be used.
Preferred leaders for filamentous fungal host cells are obtained from the genes for Aspergillus oryzae TAKA amylase and Aspergillus nidulans triose phosphate isomerase.
Suitable leaders for yeast host cells are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1) , Saccharomyces cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase, Saccharomyces cerevisiae alpha-factor, and Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (ADH2/GAP) .
The control sequence may also be a polyadenylation sequence, a sequence operably linked to the 3’-terminus of the polynucleotide and, when transcribed, is recognized by the host cell as a signal to add polyadenosine residues to transcribed mRNA. Any polyadenylation sequence that is functional in the host cell may be used.
Preferred polyadenylation sequences for filamentous fungal host cells are obtained from the genes for Aspergillus nidulans anthranilate synthase, Aspergillus niger glucoamylase,  Aspergillus niger alpha-glucosidase, Aspergillus oryzae TAKA amylase, and Fusarium oxysporum trypsin-like protease.
Useful polyadenylation sequences for yeast host cells are described by Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
The control sequence may also be a signal peptide coding region that encodes a signal peptide linked to the N-terminus of a polypeptide and directs the polypeptide into the cell’s secretory pathway. The 5’-end of the coding sequence of the polynucleotide may inherently contain a signal peptide coding sequence naturally linked in translation reading frame with the segment of the coding sequence that encodes the polypeptide. Alternatively, the 5’-end of the coding sequence may contain a signal peptide coding sequence that is heterologous to the coding sequence. A heterologous signal peptide coding sequence may be required where the coding sequence does not naturally contain a signal peptide coding sequence. Alternatively, a heterologous signal peptide coding sequence may simply replace the natural signal peptide coding sequence in order to enhance secretion of the polypeptide. However, any signal peptide coding sequence that directs the expressed polypeptide into the secretory pathway of a host cell may be used.
Effective signal peptide coding sequences for bacterial host cells are the signal peptide coding sequences obtained from the genes for Bacillus NCIB 11837 maltogenic amylase, Bacillus licheniformis subtilisin, Bacillus licheniformis beta-lactamase, Bacillus stearothermophilus alpha-amylase, Bacillus stearothermophilus neutral proteases (nprT, nprS, nprM) , and Bacillus subtilis prsA. Further signal peptides are described by Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Effective signal peptide coding sequences for filamentous fungal host cells are the signal peptide coding sequences obtained from the genes for Aspergillus niger neutral amylase, Aspergillus niger glucoamylase, Aspergillus oryzae TAKA amylase, Humicola insolens cellulase, Humicola insolens endoglucanase V, Humicola lanuginosa lipase, and Rhizomucor miehei aspartic proteinase.
Useful signal peptides for yeast host cells are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae alpha-factor and Saccharomyces cerevisiae invertase. Other useful signal peptide coding sequences are described by Romanos et al., 1992, supra.
The control sequence may also be a propeptide coding sequence that encodes a propeptide positioned at the N-terminus of a polypeptide. The resultant polypeptide is known as a proenzyme or propolypeptide (or a zymogen in some cases) . A propolypeptide is generally inactive and can be converted to an active polypeptide by catalytic or autocatalytic cleavage of the propeptide from the propolypeptide. The propeptide coding sequence may be  obtained from the genes for Bacillus subtilis alkaline protease (aprE) , Bacillus subtilis neutral protease (nprT) , Myceliophthora thermophila laccase (WO 95/33836) , Rhizomucor miehei aspartic proteinase, and Saccharomyces cerevisiae alpha-factor.
Where both signal peptide and propeptide sequences are present, the propeptide sequence is positioned next to the N-terminus of a polypeptide and the signal peptide sequence is positioned next to the N-terminus of the propeptide sequence.
It may also be desirable to add regulatory sequences that regulate expression of the polypeptide relative to the growth of the host cell. Examples of regulatory sequences are those that cause expression of the gene to be turned on or off in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. Regulatory sequences in prokaryotic systems include the lac, tac, and trp operator systems. In yeast, the ADH2 system or GAL1 system may be used. In filamentous fungi, the Aspergillus niger glucoamylase promoter, Aspergillus oryzae TAKA alpha-amylase promoter, and Aspergillus oryzae glucoamylase promoter, Trichoderma reesei cellobiohydrolase I promoter, and Trichoderma reesei cellobiohydrolase II promoter may be used. Other examples of regulatory sequences are those that allow for gene amplification. In eukaryotic systems, these regulatory sequences include the dihydrofolate reductase gene that is amplified in the presence of methotrexate, and the metallothionein genes that are amplified with heavy metals. In these cases, the polynucleotide encoding the polypeptide would be operably linked to the regulatory sequence.
Expression Vectors
The present invention also relates to recombinant expression vectors comprising a polynucleotide of the present invention, a promoter, and transcriptional and translational stop signals. The various nucleotide and control sequences may be joined together to produce a recombinant expression vector that may include one or more convenient restriction sites to allow for insertion or substitution of the polynucleotide encoding the polypeptide at such sites. Alternatively, the polynucleotide may be expressed by inserting the polynucleotide or a nucleic acid construct comprising the polynucleotide into an appropriate vector for expression. In creating the expression vector, the coding sequence is located in the vector so that the coding sequence is operably linked with the appropriate control sequences for expression.
The recombinant expression vector may be any vector (e.g., a plasmid or virus) that can be conveniently subjected to recombinant DNA procedures and can bring about expression of the polynucleotide. The choice of the vector will typically depend on the compatibility of the vector with the host cell into which the vector is to be introduced. The vector may be a linear or closed circular plasmid.
The vector may be an autonomously replicating vector, i.e., a vector that exists as an extrachromosomal entity, the replication of which is independent of chromosomal replication, e.g., a plasmid, an extrachromosomal element, a minichromosome, or an artificial chromosome. The vector may contain any means for assuring self-replication. Alternatively, the vector may be one that, when introduced into the host cell, is integrated into the genome and replicated together with the chromosome (s) into which it has been integrated. Furthermore, a single vector or plasmid or two or more vectors or plasmids that together contain the total DNA to be introduced into the genome of the host cell, or a transposon, may be used.
The vector preferably contains one or more selectable markers that permit easy selection of transformed, transfected, transduced, or the like cells. A selectable marker is a gene the product of which provides for biocide or viral resistance, resistance to heavy metals, prototrophy to auxotrophs, and the like.
Examples of bacterial selectable markers are Bacillus licheniformis or Bacillus subtilis dal genes, or markers that confer antibiotic resistance such as ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, neomycin, spectinomycin, or tetracycline resistance. Suitable markers for yeast host cells include, but are not limited to, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, and URA3. Selectable markers for use in a filamentous fungal host cell include, but are not limited to, adeA (phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase) , adeB (phosphoribosyl-aminoimidazole synthase) , amdS (acetamidase) , argB (ornithine carbamoyltransferase) , bar (phosphinothricin acetyltransferase) , hph (hygromycin phosphotransferase) , niaD (nitrate reductase) , pyrG (orotidine-5’-phosphate decarboxylase) , sC (sulfate adenyltransferase) , and trpC (anthranilate synthase) , as well as equivalents thereof. Preferred for use in an Aspergillus cell are Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae amdS and pyrG genes and a Streptomyces hygroscopicus bar gene. Preferred for use in a Trichoderma cell are adeA, adeB, amdS, hph, and pyrG genes.
The selectable marker may be a dual selectable marker system as described in WO 2010/039889. In one aspect, the dual selectable marker is a hph-tk dual selectable marker system.
The vector preferably contains an element (s) that permits integration of the vector into the host cell′s genome or autonomous replication of the vector in the cell independent of the genome.
For integration into the host cell genome, the vector may rely on the polynucleotide’s sequence encoding the polypeptide or any other element of the vector for integration into the genome by homologous or non-homologous recombination. Alternatively, the vector may  contain additional polynucleotides for directing integration by homologous recombination into the genome of the host cell at a precise location (s) in the chromosome (s) . To increase the likelihood of integration at a precise location, the integrational elements should contain a sufficient number of nucleic acids, such as 100 to 10,000 base pairs, 400 to 10,000 base pairs, and 800 to 10,000 base pairs, which have a high degree of sequence identity to the corresponding target sequence to enhance the probability of homologous recombination. The integrational elements may be any sequence that is homologous with the target sequence in the genome of the host cell. Furthermore, the integrational elements may be non-encoding or encoding polynucleotides. On the other hand, the vector may be integrated into the genome of the host cell by non-homologous recombination.
For autonomous replication, the vector may further comprise an origin of replication enabling the vector to replicate autonomously in the host cell in question. The origin of replication may be any plasmid replicator mediating autonomous replication that functions in a cell. The term “origin of replication” or “plasmid replicator” means a polynucleotide that enables a plasmid or vector to replicate in vivo.
Examples of bacterial origins of replication are the origins of replication of plasmids pBR322, pUC19, pACYC177, and pACYC184 permitting replication in E. coli, and pUB110, pE194, pTA1060, and pAMβ1 permitting replication in Bacillus.
Examples of origins of replication for use in a yeast host cell are the 2 micron origin of replication, ARS1, ARS4, the combination of ARS1 and CEN3, and the combination of ARS4 and CEN6.
Examples of origins of replication useful in a filamentous fungal cell are AMA1 and ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883) . Isolation of the AMA1 gene and construction of plasmids or vectors comprising the gene can be accomplished according to the methods disclosed in WO 00/24883.
More than one copy of a polynucleotide of the present invention may be inserted into a host cell to increase production of a polypeptide. An increase in the copy number of the polynucleotide can be obtained by integrating at least one additional copy of the sequence into the host cell genome or by including an amplifiable selectable marker gene with the polynucleotide where cells containing amplified copies of the selectable marker gene, and thereby additional copies of the polynucleotide, can be selected for by cultivating the cells in the presence of the appropriate selectable agent.
The procedures used to ligate the elements described above to construct the recombinant expression vectors of the present invention are well known to one skilled in the  art (see, e.g., Sambrook et al., 1989, supra) .
Host Cells
The present invention also relates to recombinant host cells, comprising a polynucleotide of the present invention operably linked to one or more control sequences that direct the production of a polypeptide of the present invention. A construct or vector comprising a polynucleotide is introduced into a host cell so that the construct or vector is maintained as a chromosomal integrant or as a self-replicating extra-chromosomal vector as described earlier. The term "host cell" encompasses any progeny of a parent cell that is not identical to the parent cell due to mutations that occur during replication. The choice of a host cell will to a large extent depend upon the gene encoding the polypeptide and its source.
In some embodiments, the polypeptide is heterologous to the recombinant host cell.
In some embodiments, at least one of the one or more control sequences is heterologous to the polynucleotide encoding the polypeptide.
In some embodiments, the recombinant host cell comprises at least two copies, e.g., three, four, or five, of the polynucleotide of the present invention.
The host cell may be any microbial or plant cell useful in the recombinant production of a polypeptide of the present invention, e.g., a prokaryotic cell or a fungal cell.
The prokaryotic host cell may be any Gram-positive or Gram-negative bacterium. Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, and Streptomyces. Gram-negative bacteria include, but are not limited to, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, and Ureaplasma.
The bacterial host cell may be any Bacillus cell including, but not limited to, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, and Bacillus thuringiensis cells.
The bacterial host cell may also be any Streptococcus cell including, but not limited to, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, and Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus cells.
The bacterial host cell may also be any Streptomyces cell including, but not limited to, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, and Streptomyces lividans cells.
The introduction of DNA into a Bacillus cell may be effected by protoplast transformation (see, e.g., Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115) , competent cell transformation (see, e.g., Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221) , electroporation (see, e.g., Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) , or conjugation (see, e.g., Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278) . The introduction of DNA into an E. coli cell may be effected by protoplast transformation (see, e.g., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) or electroporation (see, e.g., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145) . The introduction of DNA into a Streptomyces cell may be effected by protoplast transformation, electroporation (see, e.g., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405) , conjugation (see, e.g., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) , or transduction (see, e.g., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294) . The introduction of DNA into a Pseudomonas cell may be effected by electroporation (see, e.g., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) or conjugation (see, e.g., Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57) . The introduction of DNA into a Streptococcus cell may be effected by natural competence (see, e.g., Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297) , protoplast transformation (see, e.g., Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207) , electroporation (see, e.g., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) , or conjugation (see, e.g., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436) . However, any method known in the art for introducing DNA into a host cell can be used.
The host cell may be a fungal cell. “Fungi” as used herein includes the phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, and Zygomycota as well as the Oomycota and all mitosporic fungi (as defined by Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) .
The fungal host cell may be a yeast cell. “Yeast” as used herein includes ascosporogenous yeast (Endomycetales) , basidiosporogenous yeast, and yeast belonging to the Fungi Imperfecti (Blastomycetes) . Since the classification of yeast may change in the future, for the purposes of this invention, yeast shall be defined as described in Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) .
The yeast host cell may be a Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, or Yarrowia cell, such as a Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, or Yarrowia lipolytica cell.
The fungal host cell may be a filamentous fungal cell. “Filamentous fungi” include all filamentous forms of the subdivision Eumycota and Oomycota (as defined by Hawksworth et al., 1995, supra) . The filamentous fungi are generally characterized by a mycelial wall composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan, and other complex polysaccharides. Vegetative growth is by hyphal elongation and carbon catabolism is obligately aerobic. In contrast, vegetative growth by yeasts such as Saccharomyces cerevisiae is by budding of a unicellular thallus and carbon catabolism may be fermentative.
The filamentous fungal host cell may be an Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, or Trichoderma cell.
For example, the filamentous fungal host cell may be an Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Talaromyces emersonii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, or Trichoderma viride cell.
Fungal cells may be transformed by a process involving protoplast formation, transformation of the protoplasts, and regeneration of the cell wall in a manner known per se. Suitable procedures for transformation of Aspergillus and Trichoderma host cells are described in EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, and Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Suitable methods for transforming  Fusarium species are described by Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, and WO 96/00787. Yeast may be transformed using the procedures described by Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Methods of Production
The present invention also relates to methods of producing a polypeptide of the present invention, comprising (a) cultivating a cell, which in its wild-type form produces the polypeptide, under conditions conducive for production of the polypeptide; and optionally, (b) recovering the polypeptide. In one aspect, the cell is a Macrophomina cell. In another aspect, the cell is a Macrophomina phaseolina cell. In another aspect, the cell is Macrophomina phaseolina cell. In another aspect, the cell is a Neosartorya cell. In another aspect, the cell is a Neosartorya massa cell. In another aspect, the cell is Neosartorya massa CBS117265. In another aspect, the cell is a Penicillium cell. In another aspect, the cell is a Penicillium adametzii cell. In another aspect, the cell is a Penicillium viticola cell. In another aspect, the cell is a Penicillium wellingtonense cell. In another aspect, the cell is a Perenniporia cell. In another aspect, the cell is a Perenniporia tephropora cell. In another aspect, the cell is a Talaromyces cell. In another aspect, the cell is a Talaromyces verruculosus cell. In another aspect, the cell is a Valsaria cell. In another aspect, the cell is a Valsaria rubricosa cell.
The present invention also relates to methods of producing a polypeptide of the present invention, comprising (a) cultivating a recombinant host cell of the present invention under conditions conducive for production of the polypeptide; and optionally, (b) recovering the polypeptide.
The host cells are cultivated in a nutrient medium suitable for production of the polypeptide using methods known in the art. For example, the cells may be cultivated by shake flask cultivation, or small-scale or large-scale fermentation (including continuous, batch, fed-batch, or solid-state fermentations) in laboratory or industrial fermentors in a suitable medium and under conditions allowing the polypeptide to be expressed and/or isolated. The cultivation takes place in a suitable nutrient medium comprising carbon and nitrogen sources and inorganic salts, using procedures known in the art. Suitable media are available from commercial suppliers or may be prepared according to published compositions (e.g., in catalogues of the American Type Culture Collection) . If the polypeptide is secreted into the nutrient medium, the polypeptide can be recovered directly from the medium. If the polypeptide  is not secreted, it can be recovered from cell lysates.
The polypeptide may be detected using methods known in the art that are specific for the polypeptides. These detection methods include, but are not limited to, use of specific antibodies, formation of an enzyme product, or disappearance of an enzyme substrate. For example, an enzyme assay may be used to determine the activity of the polypeptide.
The polypeptide may be recovered using methods known in the art. For example, the polypeptide may be recovered from the fermentation medium by conventional procedures including, but not limited to, collection, centrifugation, filtration, extraction, spray-drying, evaporation, or precipitation. In one aspect, a whole fermentation broth comprising the polypeptide is recovered.
The polypeptide may be purified by a variety of procedures known in the art including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, chromatofocusing, and size exclusion) , electrophoretic procedures (e.g., preparative isoelectric focusing) , differential solubility (e.g., ammonium sulfate precipitation) , SDS-PAGE, or extraction (see, e.g., Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) to obtain substantially pure polypeptides.
Plants
The present invention also relates to isolated plants, e.g., a transgenic plant, plant part, or plant cell, comprising a polynucleotide of the present invention so as to express and produce a polypeptide or domain in recoverable quantities. The polypeptide or domain may be recovered from the plant or plant part. Alternatively, the plant or plant part containing the polypeptide or domain may be used as such for improving the quality of a food or feed, e.g., improving nutritional value, palatability, and rheological properties, or to destroy an antinutritive factor.
The transgenic plant can be dicotyledonous (a dicot) or monocotyledonous (a monocot) . Examples of monocot plants are grasses, such as meadow grass (blue grass, Poa) , forage grass such as Festuca, Lolium, temperate grass, such as Agrostis, and cereals, e.g., wheat, oats, rye, barley, rice, sorghum, and maize (corn) .
Examples of dicot plants are tobacco, legumes, such as lupins, potato, sugar beet, pea, bean and soybean, and cruciferous plants (family Brassicaceae) , such as cauliflower, rape seed, and the closely related model organism Arabidopsis thaliana.
Examples of plant parts are stem, callus, leaves, root, fruits, seeds, and tubers as well as the individual tissues comprising these parts, e.g., epidermis, mesophyll, parenchyme, vascular tissues, meristems. Specific plant cell compartments, such as chloroplasts,  apoplasts, mitochondria, vacuoles, peroxisomes and cytoplasm are also considered to be a plant part. Furthermore, any plant cell, whatever the tissue origin, is considered to be a plant part. Likewise, plant parts such as specific tissues and cells isolated to facilitate the utilization of the invention are also considered plant parts, e.g., embryos, endosperms, aleurone and seed coats.
Also included within the scope of the present invention are the progeny of such plants, plant parts, and plant cells.
The transgenic plant or plant cell expressing the polypeptide or domain may be constructed in accordance with methods known in the art. In short, the plant or plant cell is constructed by incorporating one or more expression constructs encoding the polypeptide or domain into the plant host genome or chloroplast genome and propagating the resulting modified plant or plant cell into a transgenic plant or plant cell.
The expression construct is conveniently a nucleic acid construct that comprises a polynucleotide encoding a polypeptide or domain, wherein the polynucleotide is preferably operably linked with appropriate regulatory sequences required for expression of the polynucleotide in the plant or plant part of choice. Furthermore, the expression construct may comprise a selectable marker useful for identifying plant cells into which the expression construct has been integrated and DNA sequences necessary for introduction of the construct into the plant in question (the latter depends on the DNA introduction method to be used) .
The choice of regulatory sequences, such as promoter and terminator sequences and optionally signal or transit sequences, is determined, for example, on the basis of when, where, and how the polypeptide or domain is desired to be expressed (Sticklen, 2008, Nature Reviews 9: 433-443) . For instance, the expression of the gene encoding a polypeptide or domain may be constitutive or inducible, or may be developmental, stage or tissue specific, and the gene product may be targeted to a specific tissue or plant part such as seeds or leaves. Regulatory sequences are, for example, described by Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
For constitutive expression, the 35S-CaMV, the maize ubiquitin 1, or the rice actin 1 promoter may be used (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165) . Organ-specific promoters may be, for example, a promoter from storage sink tissues such as seeds, potato tubers, and fruits (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) , or from metabolic sink tissues such as meristems (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878) , a seed specific promoter such as the glutelin, prolamin, globulin, or albumin promoter from rice (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889) , a Vicia faba promoter from the legumin B4 and the  unknown seed protein gene from Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711) , a promoter from a seed oil body protein (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941) , the storage protein napA promoter from Brassica napus, or any other seed specific promoter known in the art, e.g., as described in WO 91/14772. Furthermore, the promoter may be a leaf specific promoter such as the rbcs promoter from rice or tomato (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000) , the chlorella virus adenine methyltransferase gene promoter (Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93) , the aldP gene promoter from rice (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674) , or a wound inducible promoter such as the potato pin2 promoter (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588) . Likewise, the promoter may be induced by abiotic treatments such as temperature, drought, or alterations in salinity or induced by exogenously applied substances that activate the promoter, e.g., ethanol, oestrogens, plant hormones such as ethylene, abscisic acid, and gibberellic acid, and heavy metals.
A promoter enhancer element may also be used to achieve higher expression of a polypeptide or domain in the plant. For instance, the promoter enhancer element may be an intron that is placed between the promoter and the polynucleotide encoding a polypeptide or domain. For instance, Xu et al., 1993, supra, disclose the use of the first intron of the rice actin 1 gene to enhance expression.
The selectable marker gene and any other parts of the expression construct may be chosen from those available in the art.
The nucleic acid construct is incorporated into the plant genome according to conventional techniques known in the art, including Agrobacterium-mediated transformation, virus-mediated transformation, microinjection, particle bombardment, biolistic transformation, and electroporation (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274) .
Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer is a method for generating transgenic dicots (for a review, see Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) and for transforming monocots, although other transformation methods may be used for these plants. A method for generating transgenic monocots is particle bombardment (microscopic gold or tungsten particles coated with the transforming DNA) of embryonic calli or developing embryos (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674) . An alternative method for transformation of monocots is based on protoplast transformation as described by Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Additional transformation methods include those described in U.S. Patent Nos. 6,395,966 and 7,151,204 (both of which are herein  incorporated by reference in their entirety) .
Following transformation, the transformants having incorporated the expression construct are selected and regenerated into whole plants according to methods well known in the art. Often the transformation procedure is designed for the selective elimination of selection genes either during regeneration or in the following generations by using, for example, co-transformation with two separate T-DNA constructs or site-specific excision of the selection gene by a specific recombinase.
In addition to direct transformation of a particular plant genotype with a construct of the present invention, transgenic plants may be made by crossing a plant having the construct to a second plant lacking the construct. For example, a construct encoding a polypeptide or domain can be introduced into a particular plant variety by crossing, without the need for ever directly transforming a plant of that given variety. Therefore, the present invention encompasses not only a plant directly regenerated from cells which have been transformed in accordance with the present invention, but also the progeny of such plants. As used herein, progeny may refer to the offspring of any generation of a parent plant prepared in accordance with the present invention. Such progeny may include a DNA construct prepared in accordance with the present invention. Crossing results in the introduction of a transgene into a plant line by cross pollinating a starting line with a donor plant line. Non-limiting examples of such steps are described in U.S. Patent No. 7,151,204.
Plants may be generated through a process of backcross conversion. For example, plants include plants referred to as a backcross converted genotype, line, inbred, or hybrid.
Genetic markers may be used to assist in the introgression of one or more transgenes of the invention from one genetic background into another. Marker assisted selection offers advantages relative to conventional breeding in that it can be used to avoid errors caused by phenotypic variations. Further, genetic markers may provide data regarding the relative degree of elite germplasm in the individual progeny of a particular cross. For example, when a plant with a desired trait which otherwise has a non-agronomically desirable genetic background is crossed to an elite parent, genetic markers may be used to select progeny which not only possess the trait of interest, but also have a relatively large proportion of the desired germplasm. In this way, the number of generations required to introgress one or more traits into a particular genetic background is minimized.
The present invention also relates to methods of producing a polypeptide or domain of the present invention comprising (a) cultivating a transgenic plant or a plant cell comprising a polynucleotide encoding the polypeptide or domain under conditions conducive for production of the polypeptide or domain; and (b) recovering the polypeptide or domain.
Removal or Reduction of Cellobiohydrolase Activity
The present invention also relates to methods of producing a mutant of a parent cell, which comprises disrupting or deleting a polynucleotide, or a portion thereof, encoding a polypeptide of the present invention, which results in the mutant cell producing less of the polypeptide than the parent cell when cultivated under the same conditions.
The mutant cell may be constructed by reducing or eliminating expression of the polynucleotide using methods well known in the art, for example, insertions, disruptions, replacements, or deletions. In a preferred aspect, the polynucleotide is inactivated. The polynucleotide to be modified or inactivated may be, for example, the coding region or a part thereof essential for activity, or a regulatory element required for expression of the coding region. An example of such a regulatory or control sequence may be a promoter sequence or a functional part thereof, i.e., a part that is sufficient for affecting expression of the polynucleotide. Other control sequences for possible modification include, but are not limited to, a leader, polyadenylation sequence, propeptide sequence, signal peptide sequence, transcription terminator, and transcriptional activator.
Modification or inactivation of the polynucleotide may be performed by subjecting the parent cell to mutagenesis and selecting for mutant cells in which expression of the polynucleotide has been reduced or eliminated. The mutagenesis, which may be specific or random, may be performed, for example, by use of a suitable physical or chemical mutagenizing agent, by use of a suitable oligonucleotide, or by subjecting the DNA sequence to PCR generated mutagenesis. Furthermore, the mutagenesis may be performed by use of any combination of these mutagenizing agents.
Examples of a physical or chemical mutagenizing agent suitable for the present purpose include ultraviolet (UV) irradiation, hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) , O-methyl hydroxylamine, nitrous acid, ethyl methane sulphonate (EMS) , sodium bisulphite, formic acid, and nucleotide analogues.
When such agents are used, the mutagenesis is typically performed by incubating the parent cell to be mutagenized in the presence of the mutagenizing agent of choice under suitable conditions, and screening and/or selecting for mutant cells exhibiting reduced or no expression of the gene.
Modification or inactivation of the polynucleotide may be accomplished by insertion, substitution, or deletion of one or more nucleotides in the gene or a regulatory element required for transcription or translation thereof. For example, nucleotides may be inserted or removed so as to result in the introduction of a stop codon, the removal of the start codon, or  a change in the open reading frame. Such modification or inactivation may be accomplished by site-directed mutagenesis or PCR generated mutagenesis in accordance with methods known in the art. Although, in principle, the modification may be performed in vivo, i.e., directly on the cell expressing the polynucleotide to be modified, it is preferred that the modification be performed in vitro as exemplified below.
An example of a convenient way to eliminate or reduce expression of a polynucleotide is based on techniques of gene replacement, gene deletion, or gene disruption. For example, in the gene disruption method, a nucleic acid sequence corresponding to the endogenous polynucleotide is mutagenized in vitro to produce a defective nucleic acid sequence that is then transformed into the parent cell to produce a defective gene. By homologous recombination, the defective nucleic acid sequence replaces the endogenous polynucleotide. It may be desirable that the defective polynucleotide also encodes a marker that may be used for selection of transformants in which the polynucleotide has been modified or destroyed. In an aspect, the polynucleotide is disrupted with a selectable marker such as those described herein.
The present invention further relates to a mutant cell of a parent cell that comprises a disruption or deletion of a polynucleotide encoding the polypeptide or a control sequence thereof or a silenced gene encoding the polypeptide, which results in the mutant cell producing less of the polypeptide or no polypeptide compared to the parent cell.
The polypeptide-deficient mutant cells are particularly useful as host cells for expression of native and heterologous polypeptides. Therefore, the present invention further relates to methods of producing a native or heterologous polypeptide, comprising (a) cultivating the mutant cell under conditions conducive for production of the polypeptide; and (b) recovering the polypeptide. The term "heterologous polypeptides" means polypeptides that are not native to the host cell, e.g., a variant of a native protein. The host cell may comprise more than one copy of a polynucleotide encoding the native or heterologous polypeptide.
The methods used for cultivation and purification of the product of interest may be performed by methods known in the art.
The methods of the present invention for producing an essentially cellobiohydrolase-free product are of particular interest in the production of polypeptides, in particular, fungal proteins such as enzymes. The cellobiohydrolase-deficient cells may also be used to express heterologous proteins of pharmaceutical interest such as hormones, growth factors, receptors, and the like.
In a further aspect, the present invention relates to a protein product essentially free from cellobiohydrolases activity that is produced by a method of the present invention.
Fermentation Broth Formulations or Cell Compositions
The present invention also relates to a fermentation broth formulation or a cell composition comprising a polypeptide of the present invention. The fermentation broth formulation or the cell composition further comprises additional ingredients used in the fermentation process, such as, for example, cells (including, the host cells containing the gene encoding the polypeptide of the present invention which are used to produce the polypeptide of interest) , cell debris, biomass, fermentation media and/or fermentation products. In some embodiments, the composition is a cell-killed whole broth containing organic acid (s) , killed cells and/or cell debris, and culture medium.
The term "fermentation broth" as used herein refers to a preparation produced by cellular fermentation that undergoes no or minimal recovery and/or purification. For example, fermentation broths are produced when microbial cultures are grown to saturation, incubated under carbon-limiting conditions to allow protein synthesis (e.g., expression of enzymes by host cells) and secretion into cell culture medium. The fermentation broth can contain unfractionated or fractionated contents of the fermentation materials derived at the end of the fermentation. Typically, the fermentation broth is unfractionated and comprises the spent culture medium and cell debris present after the microbial cells (e.g., filamentous fungal cells) are removed, e.g., by centrifugation. In some embodiments, the fermentation broth contains spent cell culture medium, extracellular enzymes, and viable and/or nonviable microbial cells.
In some embodiments, the fermentation broth formulation or the cell composition comprises a first organic acid component comprising at least one 1-5 carbon organic acid and/or a salt thereof and a second organic acid component comprising at least one 6 or more carbon organic acid and/or a salt thereof. In some embodiments, the first organic acid component is acetic acid, formic acid, propionic acid, a salt thereof, or a mixture of two or more of the foregoing and the second organic acid component is benzoic acid, cyclohexanecarboxylic acid, 4-methylvaleric acid, phenylacetic acid, a salt thereof, or a mixture of two or more of the foregoing.
In one aspect, the composition contains an organic acid (s) , and optionally further contains killed cells and/or cell debris. In some embodiments, the killed cells and/or cell debris are removed from a cell-killed whole broth to provide a composition that is free of these components.
The fermentation broth formulation or the cell composition may further comprise a preservative and/or anti-microbial (e.g., bacteriostatic) agent, including, but not limited to, sorbitol, sodium chloride, potassium sorbate, and others known in the art.
The fermentation broth formulation or the cell composition may further comprise multiple enzymatic activities, such as one or more (e.g., several) enzymes selected from the group consisting of a cellulase, a hemicellulase, an AA9 polypeptide, a cellulose inducible protein (CIP) , a catalase, an esterase, an expansin, a laccase, a Iigninolytic enzyme, a pectinase, a peroxidase, a protease, and a swollenin. The fermentation broth formulations or cell compositions may also comprise one or more (e.g., several) enzymes selected from the group consisting of a hydrolase, an isomerase, a ligase, a lyase, an oxidoreductase, or a transferase, e.g., an alpha-galactosidase, alpha-glucosidase, aminopeptidase, amylase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xylosidase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycosyltransferase, deoxyribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamylase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, pectinolytic enzyme, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, proteolytic enzyme, ribonuclease, transglutaminase, or xylanase.
The cell-killed whole broth or composition may contain the unfractionated contents of the fermentation materials derived at the end of the fermentation. Typically, the cell-killed whole broth or composition contains the spent culture medium and cell debris present after the microbial cells (e.g., filamentous fungal cells) are grown to saturation, incubated under carbon-limiting conditions to allow protein synthesis. In some embodiments, the cell-killed whole broth or composition contains the spent cell culture medium, extracellular enzymes, and killed filamentous fungal cells. In some embodiments, the microbial cells present in the cell-killed whole broth or composition can be permeabilized and/or lysed using methods known in the art.
A whole broth or cell composition as described herein is typically a liquid, but may contain insoluble components, such as killed cells, cell debris, culture media components, and/or insoluble enzyme (s) . In some embodiments, insoluble components may be removed to provide a clarified liquid composition.
The whole broth formulations and cell compositions of the present invention may be produced by a method described in WO 90/15861 or WO 2010/096673.
Enzyme Compositions
The present invention also relates to compositions comprising a polypeptide of the present invention. Preferably, the compositions are enriched in the polypeptide.
The compositions may comprise a polypeptide of the present invention as the major enzymatic component, e.g., a mono-component composition. Alternatively, the compositions may comprise multiple enzymatic activities, such as one or more (e.g., several) enzymes  selected from the group consisting of a cellulase, a hemicellulase, an AA9 polypeptide, a cellulose inducible protein (ClP) , a catalase, an esterase, an expansin, a laccase, a ligninolytic enzyme, a pectinase, a peroxidase, a protease, and a swollenin. The compositions may also comprise one or more (e.g., several) enzymes selected from the group consisting of a hydrolase, an isomerase, a ligase, a lyase, an oxidoreductase, or a transferase, e.g., an alpha-galactosidase, alpha-glucosidase, aminopeptidase, amylase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xylosidase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycosyltransferase, deoxyribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamylase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, pectinolytic enzyme, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, proteolytic enzyme, ribonuclease, transglutaminase, or xylanase.
The compositions may be prepared in accordance with methods known in the art and may be in the form of a liquid or a dry composition. The compositions may be stabilized in accordance with methods known in the art.
Uses
The present invention is also directed to the following processes for using the polypeptides having cellobiohydrolase activity, or compositions thereof.
The present invention also relates to processes for degrading a cellulosic material, comprising: treating the cellulosic material with an enzyme composition comprising a polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention. In one aspect, the processes further comprise recovering the degraded cellulosic material. Soluble products from the degradation of the cellulosic material can be separated from insoluble cellulosic material using methods known in the art such as, for example, centrifugation, filtration, or gravity settling.
The present invention also relates to processes of producing a fermentation product, comprising: (a) saccharifying a cellulosic material with an enzyme composition comprising a polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention; (b) fermenting the saccharified cellulosic material with one or more (e.g., several) fermenting microorganisms to produce the fermentation product; and (c) recovering the fermentation product from the fermentation.
The present invention also relates to processes of fermenting a cellulosic material, comprising: fermenting the cellulosic material with one or more (e.g., several) fermenting microorganisms, wherein the cellulosic material is saccharified with an enzyme composition comprising a polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention. In one  aspect, the fermenting of the cellulosic material produces a fermentation product. In another aspect, the processes further comprise recovering the fermentation product from the fermentation.
The processes of the present invention can be used to saccharify the cellulosic material to fermentable sugars and to convert the fermentable sugars to many useful fermentation products, e.g., fuel (ethanol, n-butanol, isobutanol, biodiesel, jet fuel) and/or platform chemicals (e.g., acids, alcohols, ketones, gases, oils, and the like) . The production of a desired fermentation product from the cellulosic material typically involves pretreatment, enzymatic hydrolysis (saccharification) , and fermentation.
The processing of the cellulosic material according to the present invention can be accomplished using methods conventional in the art. Moreover, the processes of the present invention can be implemented using any conventional biomass processing apparatus configured to operate in accordance with the invention.
Hydrolysis (saccharification) and fermentation, separate or simultaneous, include, but are not limited to, separate hydrolysis and fermentation (SHF) ; simultaneous saccharification and fermentation (SSF) ; simultaneous saccharification and co-fermentation (SSCF) ; hybrid hydrolysis and fermentation (HHF) ; separate hydrolysis and co-fermentation (SHCF) ; hybrid hydrolysis and co-fermentation (HHCF) ; and direct microbial conversion (DMC) , also sometimes called consolidated bioprocessing (CBP) . SHF uses separate process steps to first enzymatically hydrolyze the cellulosic material to fermentable sugars, e.g., glucose, cellobiose, and pentose monomers, and then ferment the fermentable sugars to ethanol. In SSF, the enzymatic hydrolysis of the cellulosic material and the fermentation of sugars to ethanol are combined in one step (Philippidis, G.P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.E., ed., Taylor &Francis, Washington, DC, 179-212) . SSCF involves the co-fermentation of multiple sugars (Sheehan and Himmel, 1999, Biotechnol. Prog. 15: 817-827) . HHF involves a separate hydrolysis step, and in addition a simultaneous saccharification and hydrolysis step, which can be carried out in the same reactor. The steps in an HHF process can be carried out at different temperatures, i.e., high temperature enzymatic saccharification followed by SSF at a lower temperature that the fermentation strain can tolerate. DMC combines all three processes (enzyme production, hydrolysis, and fermentation) in one or more (e.g., several) steps where the same organism is used to produce the enzymes for conversion of the cellulosic material to fermentable sugars and to convert the fermentable sugars into a final product (Lynd et al., 2002, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577) . It is understood herein that any method known in the art comprising pretreatment, enzymatic hydrolysis (saccharification) ,  fermentation, or a combination thereof, can be used in the practicing the processes of the present invention.
A conventional apparatus can include a fed-batch stirred reactor, a batch stirred reactor, a continuous flow stirred reactor with ultrafiltration, and/or a continuous plug-flow column reactor (de Castilhos Corazza et al., 2003, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov and Sinitsyn, 1985, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352) , an attrition reactor (Ryu and Lee, 1983, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65) . Additional reactor types include fluidized bed, upflow blanket, immobilized, and extruder type reactors for hydrolysis and/or fermentation.
Pretreatment. In practicing the processes of the present invention, any pretreatment process known in the art can be used to disrupt plant cell wall components of the cellulosic material (Chandra et al., 2007, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. 108: 67-93; Galbe and Zacchi, 2007, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks and Zeeman, 2009, Bioresource Technology 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686; Taherzadeh and Karimi, 2008, Int. J. Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang and Wyman, 2008, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40) .
The cellulosic material can also be subjected to particle size reduction, sieving, pre-soaking, wetting, washing, and/or conditioning prior to pretreatment using methods known in the art.
Conventional pretreatments include, but are not limited to, steam pretreatment (with or without explosion) , dilute acid pretreatment, hot water pretreatment, alkaline pretreatment, lime pretreatment, wet oxidation, wet explosion, ammonia fiber explosion, organosolv pretreatment, and biological pretreatment. Additional pretreatments include ammonia percolation, ultrasound, electroporation, microwave, supercritical CO 2, supercritical H 2O, ozone, ionic liquid, and gamma irradiation pretreatments.
The cellulosic material can be pretreated before hydrolysis and/or fermentation. Pretreatment is preferably performed prior to the hydrolysis. Alternatively, the pretreatment can be carried out simultaneously with enzyme hydrolysis to release fermentable sugars, such as glucose, xylose, and/or cellobiose. In most cases the pretreatment step itself results in some conversion of biomass to fermentable sugars (even in absence of enzymes) .
Steam Pretreatment. In steam pretreatment, the cellulosic material is heated to disrupt the plant cell wall components, including lignin, hemicellulose, and cellulose to make the cellulose and other fractions, e.g., hemicellulose, accessible to enzymes. The cellulosic material is passed to or through a reaction vessel where steam is injected to increase the temperature to the required temperature and pressure and is retained therein for the desired reaction time. Steam pretreatment is preferably performed at 140-250℃, e.g., 160-200℃ or  170-190℃, where the optimal temperature range depends on optional addition of a chemical catalyst. Residence time for the steam pretreatment is preferably 1-60 minutes, e.g., 1-30 minutes, 1-20 minutes, 3-12 minutes, or 4-10 minutes, where the optimal residence time depends on the temperature and optional addition of a chemical catalyst. Steam pretreatment allows for relatively high solids loadings, so that the cellulosic material is generally only moist during the pretreatment. The steam pretreatment is often combined with an explosive discharge of the material after the pretreatment, which is known as steam explosion, that is, rapid flashing to atmospheric pressure and turbulent flow of the material to increase the accessible surface area by fragmentation (Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; U.S. Patent Application No. 2002/0164730) . During steam pretreatment, hemicellulose acetyl groups are cleaved and the resulting acid autocatalyzes partial hydrolysis of the hemicellulose to monosaccharides and oligosaccharides. Lignin is removed to only a limited extent.
Chemical Pretreatment. The term “chemical treatment” refers to any chemical pretreatment that promotes the separation and/or release of cellulose, hemicellulose, and/or lignin. Such a pretreatment can convert crystalline cellulose to amorphous cellulose. Examples of suitable chemical pretreatment processes include, for example, dilute acid pretreatment, lime pretreatment, wet oxidation, ammonia fiber/freeze expansion (AFEX) , ammonia percolation (APR) , ionic liquid, and organosolv pretreatments.
A chemical catalyst such as H 2SO 4 or SO 2 (typically 0.3 to 5%w/w) is sometimes added prior to steam pretreatment, which decreases the time and temperature, increases the recovery, and improves enzymatic hydrolysis (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762) . In dilute acid pretreatment, the cellulosic material is mixed with dilute acid, typically H 2SO 4, and water to form a slurry, heated by steam to the desired temperature, and after a residence time flashed to atmospheric pressure. The dilute acid pretreatment can be performed with a number of reactor designs, e.g., plug-flow reactors, counter-current reactors, or continuous counter-current shrinking bed reactors (Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Schell et al., 2004, Bioresource Technology 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115) .
Several methods of pretreatment under alkaline conditions can also be used. These alkaline pretreatments include, but are not limited to, sodium hydroxide, lime, wet oxidation, ammonia percolation (APR) , and ammonia fiber/freeze expansion (AFEX) pretreatment.
Lime pretreatment is performed with calcium oxide or calcium hydroxide at temperatures of 85-150℃ and residence times from 1 hour to several days (Wyman et al., 2005, Bioresource  Technology 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686) . WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, and WO 2006/110901 disclose pretreatment methods using ammonia.
Wet oxidation is a thermal pretreatment performed typically at 180-200℃ for 5-15 minutes with addition of an oxidative agent such as hydrogen peroxide or over-pressure of oxygen (Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technology 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin etal., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677) . The pretreatment is performed preferably at 1-40%dry matter, e.g., 2-30%dry matter or 5-20%dry matter, and often the initial pH is increased by the addition of alkali such as sodium carbonate.
A modification of the wet oxidation pretreatment method, known as wet explosion (combination of wet oxidation and steam explosion) can handle dry matter up to 30%. In wet explosion, the oxidizing agent is introduced during pretreatment after a certain residence time. The pretreatment is then ended by flashing to atmospheric pressure (WO 2006/032282) .
Ammonia fiber expansion (AFEX) involves treating the cellulosic material with liquid or gaseous ammonia at moderate temperatures such as 90-150℃ and high pressure such as 17-20 bar for 5-10 minutes, where the dry matter content can be as high as 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technology 96: 2014-2018) . During AFEX pretreatment cellulose and hemicelluloses remain relatively intact. Lignin-carbohydrate complexes are cleaved.
Organosolv pretreatment delignifies the cellulosic material by extraction using aqueous ethanol (40-60%ethanol) at 160-200℃ for 30-60 minutes (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230) . Sulphuric acid is usually added as a catalyst. In organosolv pretreatment, the majority of hemicellulose and lignin is removed.
Other examples of suitable pretreatment methods are described by Schell et al., 2003, Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108: 69-85, and Mosier et al., 2005, Bioresource Technology96: 673-686, and U.S. Published Application 2002/0164730.
In one aspect, the chemical pretreatment is preferably carried out as a dilute acid treatment, and more preferably as a continuous dilute acid treatment. The acid is typically sulfuric acid, but other acids can also be used, such as acetic acid, citric acid, nitric acid, phosphoric acid, tartaric acid, succinic acid, hydrogen chloride, or mixtures thereof. Mild acid treatment is conducted in the pH range of preferably 1-5, e.g., 1-4 or 1-2.5. In one aspect, the acid concentration is in the range from preferably 0.01 to 10 wt. %acid, e.g., 0.05 to 5 wt. %acid or  0.1 to 2 wt. %acid. The acid is contacted with the cellulosic material and held at a temperature in the range of preferably 140-200℃, e.g., 165-190℃, for periods ranging from 1 to 60 minutes.
In another aspect, pretreatment takes place in an aqueous slurry. In preferred aspects, the cellulosic material is present during pretreatment in amounts preferably between 10-80 wt. %, e.g., 20-70 wt. %or 30-60 wt. %, such as around 40 wt. %. The pretreated cellulosic material can be unwashed or washed using any method known in the art, e.g., washed with water.
Mechanical Pretreatment or Physical Pretreatment: The term “mechanical pretreatment” or “physical pretreatment” refers to any pretreatment that promotes size reduction of particles. For example, such pretreatment can involve various types of grinding or milling (e.g., dry milling, wet milling, or vibratory ball milling) .
The cellulosic material can be pretreated both physically (mechanically) and chemically. Mechanical or physical pretreatment can be coupled with steaming/steam explosion, hydrothermolysis, dilute or mild acid treatment, high temperature, high pressure treatment, irradiation (e.g., microwave irradiation) , or combinations thereof. In one aspect, high pressure means pressure in the range of preferably about 100 to about 400 psi, e.g., about 150 to about 250 psi. In another aspect, high temperature means temperature in the range of about 100 to about 300℃, e.g., about 140 to about 200℃. In a preferred aspect, mechanical or physical pretreatment is performed in a batch-process using a steam gun hydrolyzer system that uses high pressure and high temperature as defined above, e.g., a Sunds Hydrolyzer available from Sunds Defibrator AB, Sweden. The physical and chemical pretreatments can be carried out sequentially or simultaneously, as desired.
Accordingly, in a preferred aspect, the cellulosic material is subjected to physical (mechanical) or chemical pretreatment, or any combination thereof, to promote the separation and/or release of cellulose, hemicellulose, and/or lignin.
Biological Pretreatment. The term “biological pretreatment” refers to any biological pretreatment that promotes the separation and/or release of cellulose, hemicellulose, and/or lignin from the cellulosic material. Biological pretreatment techniques can involve applying lignin-solubilizing microorganisms and/or enzymes (see, for example, Hsu, T. -A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.E., ed., Taylor &Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J.D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M.E., Baker, J.O., and Overend, R.P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C.S., Cao, N.J., Du, J., and Tsao, G.T., 1999, Ethanol production  from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; and Vallander and Eriksson, 1990, Adv. Biochem. Eng. /Biotechnol. 42: 63-95) .
Saccharification. In the hydrolysis step, also known as saccharification, the cellulosic material, e.g., pretreated, is hydrolyzed to break down cellulose and/or hemicellulose to fermentable sugars, such as glucose, cellobiose, xylose, xylulose, arabinose, mannose, galactose, and/or soluble oligosaccharides. The hydrolysis is performed enzymatically by one or more enzyme compositions in one or more stages. The hydrolysis can be carried out as a batch process or series of batch processes. The hydrolysis can be carried out as a fed batch or continuous process, or series of fed batch or continuous processes, where the cellulosic material is fed gradually to, for example, a hydrolysis solution containing an enzyme composition. In an embodiment the saccharification is a continuous saccharification in which a cellulosic material and a cellulolytic enzyme composition are added at different intervals throughout the saccharification and the hydrolysate is removed at different intervals throughout the saccharification. The removal of the hydrolysate may occur prior to, simultaneously with, or after the addition of the cellulosic material and the cellulolytic enzyme composition.
Enzymatic hydrolysis is preferably carried out in a suitable aqueous environment under conditions that can be readily determined by one skilled in the art. In one aspect, hydrolysis is performed under conditions suitable for the activity of the enzymes (s) , i.e., optimal for the enzyme (s) .
The saccharification is generally performed in stirred-tank reactors or fermentors under controlled pH, temperature, and mixing conditions. Suitable process time, temperature and pH conditions can readily be determined by one skilled in the art. For example, the total saccharification time can last up to 200 hours, but is typically performed for preferably about 4 to about 120 hours, e.g., about 12 to about 96 hours or about 24 to about 72 hours. The temperature is in the range of preferably about 25℃ to about 80℃, e.g., about 30℃ to about 70℃, about 40℃ to about 60℃, or about 50℃ to about 55℃. The pH is in the range of preferably about 3 to about 9, e.g., about 3.5 to about 8, about 4 to about 7, about 4.2 to about 6, or about 4.3 to about 5.5.
The dry solids content is in the range of preferably about 5 to about 50 wt. %, e.g., about 10 to about 40 wt. %or about 20 to about 30 wt. %.
In one aspect, the saccharification is performed in the presence of dissolved oxygen at a concentration of at least 0.5%of the saturation level.
In an embodiment of the invention the dissolved oxygen concentration during  saccharification is in the range of at least 0.5%up to 30%of the saturation level, such as at least 1%up to 25%, at least 1%up to 20%, at least 1%up to 15%, at least 1%up to 10%, at least 1%up to 5%, and at least 1%up to 3%of the saturation level. In a preferred embodiment, the dissolved oxygen concentration is maintained at a concentration of at least 0.5%up to 30%of the saturation level, such as at least 1%up to 25%, at least 1%up to 20%, at least 1%up to 15%, at least 1%up to 10%, at least 1%up to 5%, and at least 1%up to 3%of the saturation level during at least 25%of the saccharification period, such as at least 50%or at least 75%of the saccharification period. When the enzyme composition comprises an oxidoreductase the dissolved oxygen concentration may be higher up to 70%of the saturation level.
Oxygen is added to the vessel in order to achieve the desired concentration of dissolved oxygen during saccharification. Maintaining the dissolved oxygen level within a desired range can be accomplished by aeration of the vessel, tank or the like by adding compressed air through a diffuser or sparger, or by other known methods of aeration. The aeration rate can be controlled on the basis of feedback from a dissolved oxygen sensor placed in the vessel/tank, or the system can run at a constant rate without feedback control. In the case of a hydrolysis train consisting of a plurality of vessels/tanks connected in series, aeration can be implemented in one or more or all of the vessels/tanks. Oxygen aeration systems are well known in the art. According to the invention any suitable aeration system may be used. Commercial aeration systems are designed by, e.g., Chemineer, Derby, England, and build by, e.g., Paul Mueller Company, MO, USA.
The enzyme compositions can comprise any protein useful in degrading the cellulosic material.
In one aspect, the enzyme composition comprises or further comprises one or more (e.g., several) proteins selected from the group consisting of a cellulase, an AA9 polypeptide, a hemicellulase, an esterase, an expansin, a ligninolytic enzyme, an oxidoreductase, a pectinase, a protease, and a swollenin. In another aspect, the cellulase is preferably one or more (e.g., several) enzymes selected from the group consisting of an endoglucanase, a cellobiohydrolase, and a beta-glucosidase. In another aspect, the hemicellulase is preferably one or more (e.g., several) enzymes selected from the group consisting of an acetylmannan esterase, an acetylxylan esterase, an arabinanase, an arabinofuranosidase, a coumaric acid esterase, a feruloyl esterase, a galactosidase, a glucuronidase, a glucuronoyl esterase, a mannanase, a mannosidase, a xylanase, and a xylosidase. In another aspect, the oxidoreductase is preferably one or more (e.g., several) enzymes selected from the group consisting of a catalase, a laccase, and a peroxidase.
In another aspect, the enzyme composition comprises one or more (e.g., several) cellulolytic enzymes. In another aspect, the enzyme composition comprises or further comprises one or more (e.g., several) hemicellulolytic enzymes. In another aspect, the enzyme composition comprises one or more (e.g., several) cellulolytic enzymes and one or more (e.g., several) hemicellulolytic enzymes. In another aspect, the enzyme composition comprises one or more (e.g., several) enzymes selected from the group of cellulolytic enzymes and hemicellulolytic enzymes. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase. In another aspect, the enzyme composition comprises a cellobiohydrolase. In another aspect, the enzyme composition comprises a beta-glucosidase. In another aspect, the enzyme composition comprises an AA9 polypeptide. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase and an AA9 polypeptide. In another aspect, the enzyme composition comprises a cellobiohydrolase and an AA9 polypeptide. In another aspect, the enzyme composition comprises a beta-glucosidase and an AA9 polypeptide. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase and a cellobiohydrolase. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase I, an endoglucanase II, or a combination of an endoglucanase I and an endoglucanase II, and a cellobiohydrolase I, a cellobiohydrolase II, or a combination of a cellobiohydrolase I and a cellobiohydrolase II. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase and a beta-glucosidase. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase I, an endoglucanase II, or a combination of an endoglucanase I and an endoglucanase II, and a beta-glucosidase. In another aspect, the enzyme composition comprises a beta-glucosidase and a cellobiohydrolase. In another aspect, the enzyme composition comprises a beta-glucosidase and a cellobiohydrolase I, a cellobiohydrolase II, or a combination of a cellobiohydrolase I and a cellobiohydrolase II. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase, an AA9 polypeptide, and a cellobiohydrolase. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase I, an endoglucanase II, or a combination of an endoglucanase I and an endoglucanase II, an AA9 polypeptide, and a cellobiohydrolase I, a cellobiohydrolase II, or a combination of a cellobiohydrolase I and a cellobiohydrolase II. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase, a beta-glucosidase, and an AA9 polypeptide. In another aspect, the enzyme composition comprises a beta-glucosidase, an AA9 polypeptide, and a cellobiohydrolase. In another aspect, the enzyme composition comprises a beta-glucosidase, an AA9 polypeptide, and a cellobiohydrolase I, a cellobiohydrolase II, or a combination of a cellobiohydrolase I and a cellobiohydrolase II. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase, a beta-glucosidase, and a cellobiohydrolase. In another aspect,  the enzyme composition comprises an endoglucanase I, an endoglucanase II, or a combination of an endoglucanase I and an endoglucanase II, a beta-glucosidase, and a cellobiohydrolase I, a cellobiohydrolase II, or a combination of a cellobiohydrolase I and a cellobiohydrolase II. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase, a cellobiohydrolase, a beta-glucosidase, and an AA9 polypeptide. In another aspect, the enzyme composition comprises an endoglucanase I, an endoglucanase II, or a combination of an endoglucanase I and an endoglucanase II, a beta-glucosidase, an AA9 polypeptide, and a cellobiohydrolase I, a cellobiohydrolase II, or a combination of a cellobiohydrolase I and a cellobiohydrolase II.
In another aspect, the enzyme composition comprises an acetylmannan esterase. In another aspect, the enzyme composition comprises an acetylxylan esterase. In another aspect, the enzyme composition comprises an arabinanase (e.g., alpha-L-arabinanase) . In another aspect, the enzyme composition comprises an arabinofuranosidase (e.g., alpha-L-arabinofuranosidase) . In another aspect, the enzyme composition comprises a coumaric acid esterase. In another aspect, the enzyme composition comprises a feruloyl esterase. In another aspect, the enzyme composition comprises a galactosidase (e.g., alpha-galactosidase and/or beta-galactosidase) . In another aspect, the enzyme composition comprises a glucuronidase (e.g., alpha-D-glucuronidase) . In another aspect, the enzyme composition comprises a glucuronoyl esterase. In another aspect, the enzyme composition comprises a mannanase. In another aspect, the enzyme composition comprises a mannosidase (e.g., beta-mannosidase) . In another aspect, the enzyme composition comprises a xylanase. In an embodiment, the xylanase is a Family 10 xylanase. In another embodiment, the xylanase is a Family 11 xylanase. In another aspect, the enzyme composition comprises a xylosidase (e.g., beta-xylosidase) .
In another aspect, the enzyme composition comprises an esterase. In another aspect, the enzyme composition comprises an expansin. In another aspect, the enzyme composition comprises a ligninolytic enzyme. In an embodiment, the ligninolytic enzyme is a manganese peroxidase. In another embodiment, the ligninolytic enzyme is a lignin peroxidase. In another embodiment, the ligninolytic enzyme is a H 2O 2-producing enzyme. In another aspect, the enzyme composition comprises a pectinase. In another aspect, the enzyme composition comprises an oxidoreductase. In an embodiment, the oxidoreductase is a catalase. In another embodiment, the oxidoreductase is a laccase. In another embodiment, the oxidoreductase is a peroxidase. In another aspect, the enzyme composition comprises a protease. In another aspect, the enzyme composition comprises a swollenin.
In the processes of the present invention, the enzyme (s) can be added prior to or  during saccharification, saccharification and fermentation, or fermentation.
One or more (e.g., several) components of the enzyme composition may be native proteins, recombinant proteins, or a combination of native proteins and recombinant proteins. For example, one or more (e.g., several) components may be native proteins of a cell, which is used as a host cell to express recombinantly one or more (e.g., several) other components of the enzyme composition. It is understood herein that the recombinant proteins may be heterologous (e.g., foreign) and/or native to the host cell. One or more (e.g., several) components of the enzyme composition may be produced as monocomponents, which are then combined to form the enzyme composition. The enzyme composition may be a combination of multicomponent and monocomponent protein preparations.
The enzymes used in the processes of the present invention may be in any form suitable for use, such as, for example, a fermentation broth formulation or a cell composition, a cell lysate with or without cellular debris, a semi-purified or purified enzyme preparation, or a host cell as a source of the enzymes. The enzyme composition may be a dry powder or granulate, a non-dusting granulate, a liquid, a stabilized liquid, or a stabilized protected enzyme. Liquid enzyme preparations may, for instance, be stabilized by adding stabilizers such as a sugar, a sugar alcohol or another polyol, and/or lactic acid or another organic acid according to established processes.
The optimum amounts of the enzymes and polypeptides having cellobiohydrolase activity depend on several factors including, but not limited to, the mixture of cellulolytic enzymes and/or hemicellulolytic enzymes, the cellulosic material, the concentration of cellulosic material, the pretreatment (s) of the cellulosic material, temperature, time, pH, and inclusion of a fermenting organism (e.g., for Simultaneous Saccharification and Fermentation) .
In one aspect, an effective amount of cellulolytic or hemicellulolytic enzyme to the cellulosic material is about 0.5 to about 50 mg, e.g., about 0.5 to about 40 mg, about 0.5 to about 25 mg, about 0.75 to about 20 mg, about 0.75 to about 15 mg, about 0.5 to about 10 mg, or about 2.5 to about 10 mg per g of the cellulosic material.
In another aspect, an effective amount of a polypeptide having cellobiohydrolase activity to the cellulosic material is about 0.01 to about 50.0 mg, e.g., about 0.01 to about 40 mg, about 0.01 to about 30 mg, about 0.01 to about 20 mg, about 0.01 to about 10 mg, about 0.01 to about 5 mg, about 0.025 to about 1.5 mg, about 0.05 to about 1.25 mg, about 0.075 to about 1.25 mg, about 0.1 to about 1.25 mg, about 0.15 to about 1.25 mg, or about 0.25 to about 1.0 mg per g of the cellulosic material.
In another aspect, an effective amount of a polypeptide having cellobiohydrolase activity to cellulolytic or hemicellulolytic enzyme is about 0.005 to about 1.0 g, e.g., about 0.01  to about 1.0 g, about 0.15 to about 0.75 g, about 0.15 to about 0.5 g, about 0.1 to about 0.5 g, about 0.1 to about 0.25 g, or about 0.05 to about 0.2 g per g of cellulolytic or hemicellulolytic enzyme.
The polypeptides having cellulolytic enzyme activity or hemicellulolytic enzyme activity as well as other proteins/polypeptides useful in the degradation of the cellulosic material, e.g., AA9 polypeptides can be derived or obtained from any suitable origin, including, archaeal, bacterial, fungal, yeast, plant, or animal origin. The term “obtained” also means herein that the enzyme may have been produced recombinantly in a host organism employing methods described herein, wherein the recombinantly produced enzyme is either native or foreign to the host organism or has a modified amino acid sequence, e.g., having one or more (e.g., several) amino acids that are deleted, inserted and/or substituted, i.e., a recombinantly produced enzyme that is a mutant and/or a fragment of a native amino acid sequence or an enzyme produced by nucleic acid shuffling processes known in the art. Encompassed within the meaning of a native enzyme are natural variants and within the meaning of a foreign enzyme are variants obtained by, e.g., site-directed mutagenesis or shuffling.
Each polypeptide may be a bacterial polypeptide. For example, each polypeptide may be a Gram-positive bacterial polypeptide having enzyme activity, or a Gram-negative bacterial polypeptide having enzyme activity.
Each polypeptide may also be a fungal polypeptide, e.g., a yeast polypeptide or a filamentous fungal polypeptide.
Chemically modified or protein engineered mutants of polypeptides may also be used.
One or more (e.g., several) components of the enzyme composition may be a recombinant component, i.e., produced by cloning of a DNA sequence encoding the single component and subsequent cell transformed with the DNA sequence and expressed in a host (see, for example, WO 91/17243 and WO 91/17244) . The host can be a heterologous host (enzyme is foreign to host) , but the host may under certain conditions also be a homologous host (enzyme is native to host) . Monocomponent cellulolytic proteins may also be prepared by purifying such a protein from a fermentation broth.
In one aspect, the one or more (e.g., several) cellulolytic enzymes comprise a commercial cellulolytic enzyme preparation. Examples of commercial cellulolytic enzyme preparations suitable for use in the present invention include, for example, 
Figure PCTCN2019076319-appb-000014
CTec (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000015
CTec2 (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000016
CTec3 (Novozymes A/S) , CELLUCLAST TM (Novozymes A/S) , NOVOZYM TM 188 (Novozymes A/S) , SPEZYME TM CP (Genencor Int. ) , ACCELLERASE TM TRIO (DuPont) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000017
NL (DSM) ; 
Figure PCTCN2019076319-appb-000018
S/L 100 (DSM) , ROHAMENT TM 7069 W (
Figure PCTCN2019076319-appb-000019
GmbH) , or
Figure PCTCN2019076319-appb-000020
CMAX3 TM  (Dyadic International, Inc. ) . The cellulolytic enzyme preparation is added in an amount effective from about 0.001 to about 5.0 wt. %of solids, e.g., about 0.025 to about 4.0 wt. %of solids or about 0.005 to about 2.0 wt. %of solids.
Examples of bacterial endoglucanases that can be used in the processes of the present invention, include, but are not limited to, Acidothermus cellulolyticus endoglucanase (WO 91/05039; WO 93/15186; U.S. Patent No. 5,275,944; WO 96/02551; U.S. Patent No. 5,536,655; WO 00/70031; WO 05/093050) , Erwinia carotovara endoglucanase (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14) , Thermobifida fusca endoglucanase III (WO 05/093050) , and Thermobifida fusca endoglucanase V (WO 05/093050) .
Examples of fungal endoglucanases that can be used in the present invention, include, but are not limited to, Trichoderma reesei endoglucanase I (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, Trichoderma reesei Cel7B endoglucanase I (GenBank: M15665) , Trichoderma reesei endoglucanase II (Saloheimo et al., 1988, Gene 63: 11-22) , Trichoderma reesei Cel5A endoglucanase II (GenBank: M19373) , Trichoderma reesei endoglucanase III (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, GenBank: AB003694) , Trichoderma reesei endoglucanase V (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, GenBank: Z33381) , Aspergillus aculeatus endoglucanase (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884) , Aspergillus kawachii endoglucanase (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439) , Fusarium oxysporum endoglucanase (GenBank: L29381) , Humicola grisea var. thermoidea endoglucanase (GenBank: AB003107) , Melanocarpus albomyces endoglucanase (GenBank: MAL515703) , Neurospora crassa endoglucanase (GenBank: XM_324477) , Humicola insolens endoglucanase V, Myceliophthora thermophila CBS 117.65 endoglucanase, Thermoascus aurantiacus endoglucanase I (GenBank: AF487830) , Trichoderma reesei strain No. VTT-D-80133 endoglucanase (GenBank: M15665) , and Penicillium pinophilum endoglucanase (WO 2012/062220) .
Examples of cellobiohydrolases useful in the present invention include, but are not limited to, Aspergillus aculeatus cellobiohydrolase II (WO 2011/059740) , Aspergillus fumigatus cellobiohydrolase I (WO 2013/028928) , Aspergillus fumigatus cellobiohydrolase II (WO 2013/028928) , Chaetomium thermophilum cellobiohydrolase I, Chaetomium thermophilum cellobiohydrolase II, Humicola insolens cellobiohydrolase I, Myceliophthora thermophila cellobiohydrolase II (WO 2009/042871) , Penicillium occitanis cellobiohydrolase I (GenBank: AY690482) , Talaromyces emersonii cellobiohydrolase I (GenBank: AF439936) , Thielavia hyrcanie cellobiohydrolase II (WO 2010/141325) , Thielavia terrestris cellobiohydrolase II (CEL6A, WO 2006/074435) , Trichoderma reesei cellobiohydrolase I, Trichoderma reesei cellobiohydrolase II, and Trichophaea saccata cellobiohydrolase II (WO  2010/057086) .
Examples of beta-glucosidases useful in the present invention include, but are not limited to, beta-glucosidases from Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288) , Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499) , Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980) , Aspergillus oryzae (WO 02/095014) , Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 and WO 2010/088387) , Thielavia terrestris (WO 2011/035029) , and Trichophaea saccata (WO 2007/019442) .
Other useful endoglucanases, cellobiohydrolases, and beta-glucosidases are disclosed in numerous Glycosyl Hydrolase families using the classification according to Henrissat, 1991, Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat and Bairoch, 1996, Biochem. J. 316: 695-696.
In the processes of the present invention, any AA9 polypeptide can be used as a component of the enzyme composition.
Examples of AA9 polypeptides useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, AA9 polypeptides from Thielavia terrestris (WO 2005/074647, WO 2008/148131, and WO 2011/035027) , Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 and WO 2010/065830) , Trichoderma reesei (WO 2007/089290 and WO 2012/149344) , Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868, and WO 2009/033071) , Aspergillus fumigatus (WO 2010/138754) , Penicillium pinophilum (WO 2011/005867) , Thermoascus sp. (WO 2011/039319) , Penicillium sp. (WO 2011/041397 and WO 2012/000892) , Thermoascus crustaceous (WO 2011/041504) , Aspergillus aculeatus (WO 2012/030799) , Thermomyces lanuginosus (WO 2012/113340, WO 2012/129699, WO 2012/130964, and WO 2012/129699) , Aurantiporus alborubescens (WO 2012/122477) , Trichophaea saccata (WO 2012/122477) , Penicillium thomii (WO 2012/122477) , Talaromyces stipitatus (WO 2012/135659) , Humicola insolens (WO 2012/146171) , Malbranchea cinnamomea (WO 2012/101206) , Talaromyces leycettanus (WO 2012/101206) , Chaetomium thermophilum (WO 2012/101206) , Talaromyces thermophilus (WO 2012/129697 and WO 2012/130950) , Acrophialophora fusispora (WO 2013/043910) , and Corynascus sepedonium (WO 2013/043910) .
In one aspect, the AA9 polypeptide is used in the presence of a soluble activating divalent metal cation according to WO 2008/151043 or WO 2012/122518, e.g., manganese or copper.
In another aspect, the AA9 polypeptide is used in the presence of a dioxy compound, a bicylic compound, a heterocyclic compound, a nitrogen-containing compound, a quinone compound, a sulfur-containing compound, or a liquor obtained from a pretreated cellulosic  material such as pretreated corn stover (WO 2012/021394, WO 2012/021395, WO 2012/021396, WO 2012/021399, WO 2012/021400, WO 2012/021401, WO 2012/021408, and WO 2012/021410) .
In one aspect, such a compound is added at a molar ratio of the compound to glucosyl units of cellulose of about 10 -6 to about 10, e.g., about 10 -6 to about 7.5, about 10 -6 to about 5, about 10 -6 to about 2.5, about 10 -6 to about 1, about 10 -5 to about 1, about 10 -5 to about 10 -1, about 10 -4 to about 10 -1, about 10 -3 to about 10 -1, or about 10 -3 to about 10 -2. In another aspect, an effective amount of such a compound is about 0.1 μM to about 1 M, e.g., about 0.5 μM to about 0.75 M, about 0.75 μM to about 0.5 M, about 1 μM to about 0.25 M, about 1 μM to about 0.1 M, about 5 μM to about 50 mM, about 10 μM to about 25 mM, about 50 μM to about 25 mM, about 10 μM to about 10 mM, about 5 μM to about 5 mM, or about 0.1 mM to about 1 mM.
The term “liquor” means the solution phase, either aqueous, organic, or a combination thereof, arising from treatment of a lignocellulose and/or hemicellulose material in a slurry, or monosaccharides thereof, e.g., xylose, arabinose, mannose, etc., under conditions as described in WO 2012/021401, and the soluble contents thereof. A liquor for cellulolytic enhancement of an AA9 polypeptide can be produced by treating a lignocellulose or hemicellulose material (or feedstock) by applying heat and/or pressure, optionally in the presence of a catalyst, e.g., acid, optionally in the presence of an organic solvent, and optionally in combination with physical disruption of the material, and then separating the solution from the residual solids. Such conditions determine the degree of cellulolytic enhancement obtainable through the combination of liquor and an AA9 polypeptide during hydrolysis of a cellulosic substrate by a cellulolytic enzyme preparation. The liquor can be separated from the treated material using a method standard in the art, such as filtration, sedimentation, or centrifugation.
In one aspect, an effective amount of the liquor to cellulose is about 10 -6 to about 10 g per g of cellulose, e.g., about 10 -6 to about 7.5 g, about 10 -6 to about 5 g, about 10 -6 to about 2.5 g, about 10 -6 to about 1 g, about 10 -5 to about 1 g, about 10 -5 to about 10 -1 g, about 10 -4 to about 10 -1 g, about 10 -3 to about 10 -1 g, or about 10 -3 to about 10 -2 g per g of cellulose.
In one aspect, the one or more (e.g., several) hemicellulolytic enzymes comprise a commercial hemicellulolytic enzyme preparation. Examples of commercial hemicellulolytic enzyme preparations suitable for use in the present invention include, for example, SHEARZYME TM (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000021
HTec (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000022
HTec2 (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000023
HTec3 (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000024
 (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000025
 (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000026
HC (Novozymes A/S) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000027
Xylanase (Genencor) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000028
XY (Genencor) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000029
XC (Genencor) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000030
TX-200A (AB Enzymes) , HSP 6000 Xylanase (DSM) , DEPOL TM 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK) , DEPOL TM 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK) , and DEPOL TM 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK) , ALTERNA FUEL 100P (Dyadic) , and ALTERNA FUEL 200P (Dyadic) .
Examples of xylanases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, xylanases from Aspergillus aculeatus (GeneSeqP: AAR63790; WO 94/21785) , Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256) , Penicillium pinophilum (WO 2011/041405) , Penicillium sp. (WO 2010/126772) , Thermomyces lanuginosus (GeneSeqP: BAA22485) , Talaromyces thermophilus (GeneSeqP: BAA22834) , Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210) , and Trichophaea saccata (WO 2011/057083) .
Examples of beta-xylosidases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, beta-xylosidases from Neurospora crassa (SwissProt: Q7SOW4) , Trichoderma reesei (UniProtKB/TrEMBL: Q92458) , Talaromyces emersonii (SwissProt: Q8X212) , and Talaromyces thermophilus (GeneSeqP: BAA22816) .
Examples of acetylxylan esterases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, acetylxylan esterases from Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918) , Chaetomium globosum (UniProt: Q2GWX4) , Chaetomium gracile (GeneSeqP: AAB82124) , Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709) , Hypocrea jecorina (WO 2005/001036) , Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880) , Neurospora crassa (UniProt: q7s259) , Phaeosphaeria nodorum (UniProt: Q0UHJ1) , and Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846) .
Examples of feruloyl esterases (ferulic acid esterases) useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, feruloyl esterases form Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122) , Neosartorya fischeri (UniProt: A1D9T4) , Neurospora crassa (UniProt: Q9HGR3) , Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) , and Thielavia terrestris (WO 2010/053838 and WO 2010/065448) .
Examples of arabinofuranosidases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, arabinofuranosidases from Aspergillus niger (GeneSeqP: AAR94170) , Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 and WO 2009/073383) , and M. giganteus (WO 2006/114094) .
Examples of alpha-glucuronidases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, alpha-glucuronidases from Aspergillus clavatus (UniProt: alcc12) , Aspergillus fumigatus (SwissProt: Q4WW45) , Aspergillus niger (UniProt: Q96WX9) , Aspergillus terreus (SwissProt: Q0CJP9) , Humicola insolens (WO  2010/014706) , Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565) , Talaromyces emersonii (UniProt: Q8X211) , and Trichoderma reesei (UniProt: Q99024) .
Examples of oxidoreductases useful in the processes of the present invention include, but are not limited to, Aspergillus lentilus catalase, Aspergillus fumigatus catalase, Aspergillus niger catalase, Aspergillus oryzae catalase, Humicola insolens catalase, Neurospora crassa catalase, Penicillium emersonii catalase, Scytalidium thermophilum catalase, Talaromyces stipitatus catalase, Thermoascus aurantiacus catalase, Coprinus cinereus laccase, Myceliophthora thermophila laccase, Polyporus pinsitus laccase, Pycnoporus cinnabarinus laccase, Rhizoctonia solani laccase, Streptomyces coelicolor laccase, Coprinus cinereus peroxidase, Soy peroxidase, Royal palm peroxidase.
The polypeptides having enzyme activity used in the processes of the present invention may be produced by fermentation of the above-noted microbial strains on a nutrient medium containing suitable carbon and nitrogen sources and inorganic salts, using procedures known in the art (see, e.g., Bennett, J.W. and LaSure, L. (eds. ) , More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991) . Suitable media are available from commercial suppliers or may be prepared according to published compositions (e.g., in catalogues of the American Type Culture Collection) . Temperature ranges and other conditions suitable for growth and enzyme production are known in the art (see, e.g., Bailey, J.E., and Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986) .
The fermentation can be any method of cultivation of a cell resulting in the expression or isolation of an enzyme or protein. Fermentation may, therefore, be understood as comprising shake flask cultivation, or small-or large-scale fermentation (including continuous, batch, fed-batch, or solid-state fermentations) in laboratory or industrial fermentors performed in a suitable medium and under conditions allowing the enzyme to be expressed or isolated. The resulting enzymes produced by the methods described above may be recovered from the fermentation medium and purified by conventional procedures.
Fermentation. The fermentable sugars obtained from the hydrolyzed cellulosic material can be fermented by one or more (e.g., several) fermenting microorganisms capable of fermenting the sugars directly or indirectly into a desired fermentation product. “Fermentation” or “fermentation process” refers to any fermentation process or any process comprising a fermentation step. Fermentation processes also include fermentation processes used in the consumable alcohol industry (e.g., beer and wine) , dairy industry (e.g., fermented dairy products) , leather industry, and tobacco industry. The fermentation conditions depend on the desired fermentation product and fermenting organism and can easily be determined by one  skilled in the art.
In the fermentation step, sugars, released from the cellulosic material as a result of the pretreatment and enzymatic hydrolysis steps, are fermented to a product, e.g., ethanol, by a fermenting organism, such as yeast. Hydrolysis (saccharification) and fermentation can be separate or simultaneous.
Any suitable hydrolyzed cellulosic material can be used in the fermentation step in practicing the present invention. The material is generally selected based on economics, i.e., costs per equivalent sugar potential, and recalcitrance to enzymatic conversion.
The term “fermentation medium” is understood herein to refer to a medium before the fermenting microorganism (s) is (are) added, such as, a medium resulting from a saccharification process, as well as a medium used in a simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) .
“Fermenting microorganism” refers to any microorganism, including bacterial and fungal organisms, suitable for use in a desired fermentation process to produce a fermentation product. The fermenting organism can be hexose and/or pentose fermenting organisms, or a combination thereof. Both hexose and pentose fermenting organisms are well known in the art. Suitable fermenting microorganisms can ferment, i.e., convert, sugars, such as glucose, xylose, xylulose, arabinose, maltose, mannose, galactose, and/or oligosaccharides, directly or indirectly into the desired fermentation product. Examples of bacterial and fungal fermenting organisms producing ethanol are described by Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.
Examples of fermenting microorganisms that can ferment hexose sugars include bacterial and fungal organisms, such as yeast. Yeast include strains of Candida, Kluyveromyces, and Saccharomyces, e.g., Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus, and Saccharomyces cerevisiae.
Examples of fermenting organisms that can ferment pentose sugars in their native state include bacterial and fungal organisms, such as some yeast. Xylose fermenting yeast include strains of Candida, preferably C. sheatae or C. sonorensis; and strains of Pichia, e.g., P. stipitis, such as P. stipitis CBS 5773. Pentose fermenting yeast include strains of Pachysolen, preferably P. tannophilus. Organisms not capable of fermenting pentose sugars, such as xylose and arabinose, may be genetically modified to do so by methods known in the art.
Examples of bacteria that can efficiently ferment hexose and pentose to ethanol include, for example, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum, and Zymomonas mobilis (Philippidis, G.P., 1996, Cellulose bioconversion  technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.E., ed., Taylor &Francis, Washington, DC, 179-212) .
Other fermenting organisms include strains of Bacillus, such as Bacillus coagulans; Candida, such as C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis, and C. scehatae; Clostridium, such as C. acetobutylicum, C. thermocellum, and C. phytofermentans; E. coli, especially E. coli strains that have been genetically modified to improve the yield of ethanol; Geobacillus sp.; Hansenula, such as Hansenula anomala; Klebsiella, such as K. oxytoca; Kluyveromyces, such as K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, and K. fragilis; Schizosaccharomyces, such as S. pombe; Thermoanaerobacter, such as Thermoanaerobacter saccharolyticum; and Zymomonas, such as Zymomonas mobilis.
Commercially available yeast suitable for ethanol production include, e.g., 
Figure PCTCN2019076319-appb-000031
AFT and XR (Lallemand Specialities, Inc., USA) , ETHANOL
Figure PCTCN2019076319-appb-000032
yeast (Lesaffre et Compagnie, France) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000033
 (AB Mauri Food Inc., USA) , 
Figure PCTCN2019076319-appb-000034
 (Rymco International AG, Denmark) , GERT STRAND TM (Gert Strand AB, Sweden) , and SUPERSTART TM and 
Figure PCTCN2019076319-appb-000035
fresh yeast (Lallemand Specialities, Inc., USA) .
In an aspect, the fermenting microorganism has been genetically modified to provide the ability to ferment pentose sugars, such as xylose utilizing, arabinose utilizing, and xylose and arabinose co-utilizing microorganisms.
The cloning of heterologous genes into various fermenting microorganisms has led to the construction of organisms capable of converting hexoses and pentoses to ethanol (co-fermentation) (Chen and Ho, 1993, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 03/062430) .
In one aspect, the fermenting organism comprises a polynucleotide encoding a polypeptide having cellobiohydrolase activity of the present invention.
In another aspect, the fermenting organism comprises one or more polynucleotides encoding one or more cellulolytic enzymes, hemicellulolytic enzymes, and accessory enzymes described herein.
It is well known in the art that the organisms described above can also be used to produce other substances, as described herein.
The fermenting microorganism is typically added to the degraded cellulosic material or hydrolysate and the fermentation is performed for about 8 to about 96 hours, e.g., about 24 to about 60 hours. The temperature is typically between about 26℃ to about 60℃, e.g., about 32℃ or 50℃, and about pH 3 to about pH 8, e.g., pH 4-5, 6, or 7.
In one aspect, the yeast and/or another microorganism are applied to the degraded cellulosic material and the fermentation is performed for about 12 to about 96 hours, such as typically 24-60 hours. In another aspect, the temperature is preferably between about 20℃ to about 60℃, e.g., about 25℃ to about 50℃, about 32℃ to about 50℃, or about 32℃ to about 50℃, and the pH is generally from about pH 3 to about pH 7, e.g., about pH 4 to about pH 7. However, some fermenting organisms, e.g., bacteria, have higher fermentation temperature optima. Yeast or another microorganism is preferably applied in amounts of approximately 10 5 to 10 12, preferably from approximately 10 7 to 10 10, especially approximately 2 x 10 8 viable cell count per ml of fermentation broth. Further guidance in respect of using yeast for fermentation can be found in, e.g., “The Alcohol Textbook” (Editors K. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999) , which is hereby incorporated by reference.
A fermentation stimulator can be used in combination with any of the processes described herein to further improve the fermentation process, and in particular, the performance of the fermenting microorganism, such as, rate enhancement and ethanol yield. A “fermentation stimulator” refers to stimulators for growth of the fermenting microorganisms, in particular, yeast. Preferred fermentation stimulators for growth include vitamins and minerals. Examples of vitamins include multivitamins, biotin, pantothenate, nicotinic acid, meso-inositol, thiamine, pyridoxine, para-aminobenzoic acid, folic acid, riboflavin, and Vitamins A, B, C, D, and E. See, for example, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002) , which is hereby incorporated by reference. Examples of minerals include minerals and mineral salts that can supply nutrients comprising P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, and Cu.
Fermentation products: A fermentation product can be any substance derived from the fermentation. The fermentation product can be, without limitation, an alcohol (e.g., arabinitol, n-butanol, isobutanol, ethanol, glycerol, methanol, ethylene glycol, 1, 3-propanediol [propylene glycol] , butanediol, glycerin, sorbitol, and xylitol) ; an alkane (e.g., pentane, hexane, heptane, octane, nonane, decane, undecane, and dodecane) , a cycloalkane (e.g., cyclopentane, cyclohexane, cycloheptane, and cyclooctane) , an alkene (e.g., pentene, hexene, heptene, and octene) ; an amino acid (e.g., aspartic acid, glutamic acid, glycine, lysine, serine, and  threonine) ; a gas (e.g., methane, hydrogen (H 2) , carbon dioxide (CO 2) , and carbon monoxide (CO) ) ; isoprene; a ketone (e.g., acetone) ; an organic acid (e.g., acetic acid, acetonic acid, adipic acid, ascorbic acid, citric acid, 2, 5-diketo-D-gluconic acid, formic acid, fumaric acid, glucaric acid, gluconic acid, glucuronic acid, glutaric acid, 3-hydroxypropionic acid, itaconic acid, lactic acid, malic acid, malonic acid, oxalic acid, oxaloacetic acid, propionic acid, succinic acid, and xylonic acid) ; and polyketide.
In one aspect, the fermentation product is an alcohol. The term “alcohol” encompasses a substance that contains one or more hydroxyl moieties. The alcohol can be, but is not limited to, n-butanol, isobutanol, ethanol, methanol, arabinitol, butanediol, ethylene glycol, glycerin, glycerol, 1, 3-propanediol, sorbitol, xylitol. See, for example, Gong et al., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira and Jonas, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam and Singh, 1995, Process Biochemistry 30 (2) : 117-124; Ezeji et al., 2003, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6) : 595-603.
In another aspect, the fermentation product is an alkane. The alkane may be an unbranched or a branched alkane. The alkane can be, but is not limited to, pentane, hexane, heptane, octane, nonane, decane, undecane, or dodecane.
In another aspect, the fermentation product is a cycloalkane. The cycloalkane can be, but is not limited to, cyclopentane, cyclohexane, cycloheptane, or cyclooctane.
In another aspect, the fermentation product is an alkene. The alkene may be an unbranched or a branched alkene. The alkene can be, but is not limited to, pentene, hexene, heptene, or octene.
In another aspect, the fermentation product is an amino acid. The organic acid can be, but is not limited to, aspartic acid, glutamic acid, glycine, lysine, serine, or threonine. See, for example, Richard and Margaritis, 2004, Biotechnology and Bioengineering 87 (4) : 501-515.
In another aspect, the fermentation product is a gas. The gas can be, but is not limited to, methane, H 2, CO 2, or CO. See, for example, Kataoka et al., 1997, Water Science and Technology 36 (6-7) : 41-47; and Gunaseelan, 1997, Biomass and Bioenergy 13 (1-2) : 83-114.
In another aspect, the fermentation product is isoprene.
In another aspect, the fermentation product is a ketone. The term “ketone” encompasses a substance that contains one or more ketone moieties. The ketone can be, but is not limited to, acetone.
In another aspect, the fermentation product is an organic acid. The organic acid can be, but is not limited to, acetic acid, acetonic acid, adipic acid, ascorbic acid, citric acid, 2, 5- diketo-D-gluconic acid, formic acid, fumaric acid, glucaric acid, gluconic acid, glucuronic acid, glutaric acid, 3-hydroxypropionic acid, itaconic acid, lactic acid, malic acid, malonic acid, oxalic acid, propionic acid, succinic acid, or xylonic acid. See, for example, Chen and Lee, 1997, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.
In another aspect, the fermentation product is polyketide.
Recovery. The fermentation product (s) can be optionally recovered from the fermentation medium using any method known in the art including, but not limited to, chromatography, electrophoretic procedures, differential solubility, distillation, or extraction. For example, alcohol is separated from the fermented cellulosic material and purified by conventional methods of distillation. Ethanol with a purity of up to about 96 vol. %can be obtained, which can be used as, for example, fuel ethanol, drinking ethanol, i.e., potable neutral spirits, or industrial ethanol.
Signal Peptides
The present invention also relates to an isolated polynucleotide encoding a signal peptide comprising or consisting of amino acids 1 to 19 of SEQ ID NO: 2, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 4, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 6, amino acids 1 to 19 of SEQ ID NO: 8, amino acids 1 to 20 of SEQ ID NO: 10, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 12, amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 14, amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 18. The polynucleotides may further comprise a gene encoding a protein, which is operably linked to the signal peptide. The protein is preferably heterologous to the signal peptide. In one aspect, the polynucleotide encoding the signal peptide is nucleotides 1 to 57 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1 to 54 of SEQ ID NO: 3, nucleotides 1 to 54 of SEQ ID NO: 5, nucleotides 1 to 57 of SEQ ID NO: 7, nucleotides 1 to 60 of SEQ ID NO: 9, nucleotides 1 to 54 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 1 to 75 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 1 to 75 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 1 to 75 of SEQ ID NO: 17.
The present invention also relates to nucleic acid constructs, expression vectors and recombinant host cells comprising such polynucleotides.
The present invention also relates to methods of producing a protein, comprising (a) cultivating a recombinant host cell comprising such polynucleotide; and optionally (b) recovering the protein.
The protein may be native or heterologous to a host cell. The term “protein” is not meant herein to refer to a specific length of the encoded product and, therefore, encompasses peptides, oligopeptides, and polypeptides. The term “protein” also encompasses two or more polypeptides combined to form the encoded product. The proteins also include hybrid  polypeptides and fused polypeptides.
Preferably, the protein is a hormone, enzyme, receptor or portion thereof, antibody or portion thereof, or reporter. For example, the protein may be a hydrolase, isomerase, ligase, lyase, oxidoreductase, or transferase, e.g., an alpha-galactosidase, alpha-glucosidase, aminopeptidase, amylase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xylosidase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycosyltransferase, deoxyribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamylase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, pectinolytic enzyme, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, proteolytic enzyme, ribonuclease, transglutaminase, or xylanase.
The gene may be obtained from any prokaryotic, eukaryotic, or other source.
The present invention is further described by the following examples that should not be construed as limiting the scope of the invention.
Examples
Strains
Aspergillus oryzae MT3568 is an amdS (acetamidase) gene disrupted derivative of A. oryzae JaL355 (WO 02/40694) in which pyrG auxotrophy was restored in the process of knocking out the Aspergillus oryzae acetamidase (AMDS) gene.
Fungal strain NN047346 was isolated from a soil sample collected from China in 1998 by plate dilution using YG medium at pH 7, 45℃ and then purified by transferring a single conidium onto a PDA plate. The strain NN047346 was identified as Valsaria rubricosa based on both morphological characteristics and ITS rDNA sequence.
Fungal strain NN058240 was isolated from a soil sample collected from Guizhou province, China in 2014 by plate dilution using PDA plates at pH 3, 25℃ and then purified by transferring a single conidium onto a PDA plate. The strain NN058240 was identified as Penicillium sp. based on both morphological characteristics and internal transcribed spacer (ITS) rDNA sequence.
Fungal strain NN057877 was obtained through a collaboration with Professor Cai Lei of the Institute of Microbiology, CAS, in 2014. The strain was collected from China. The strain NN057877 was identified as Macrophomina phaseolina based on both morphological characteristics and ITS rDNA sequence.
Fungal strain Neosartorya massa CBS117265 was purchased from the CBS-KNAW Collections, Utrecht, The Netherlands. Identity was confirmed based on ITS rDNA sequence.
Fungal strain NN047366 was isolated from a soil sample collected from China in 1998 by plate dilution using PDA plates at pH 7, 37℃ and then purified by transferring a single conidium onto a PDA plate. The strain NN047366 was identified as Perenniporia tephropora based on both morphological characteristics and ITS rDNA sequence.
Fungal strain NN058257 was isolated from a soil sample collected from Guizhou province, China in 2014 by plate dilution using PDA plates at pH 3, 25℃ and then purified by transferring a single conidium onto a PDA plate. The strain NN058257 was identified as Penicillium adametzii based on both morphological characteristics and ITS rDNA sequence.
Fungal strain NN046799 was isolated from a soil sample collected from China in 1998 by plate dilution using YG medium at pH 7, 37℃ and then purified by transferring a single conidium onto a PDA plate. The strain NN046799 was identified as Talaromyces verruculosus based on both morphological characteristics and ITS rDNA sequence.
Fungal strain NN058407 was isolated from a soil sample collected from Guizhou province, China in 2014 by plate dilution using PDA plates at pH 3, 25℃ and then purified by transferring a single conidium onto a PDA plate. The strain NN058407 was identified as Penicillium viticola based on both morphological characteristics and ITS rDNA sequence.
Fungal strain NN054749 was isolated from a soil sample collected from Tibet, China in 2012 by plate dilution with PDA plates at pH 7, 10℃ and then purified by transferring a single conidium onto a PDA plate. The strain NN054749 was identified as Penicillium wellingtonense, based on both morphological characteristics and ITS rDNA sequence.
Media and Solutions
Dap4C medium was composed of 20 g of dextrose, 10 g of maltose, 11 g of MgSO 4. 7H 2O, 1 g of KH 2PO 4, 2 g of citric acid, 5.2 g of K 3PO 4. H 2O, 0.5 g of yeast extract (Difco) , 1 ml of antifoam, 0.5 ml of KU6 trace metals solution, 2.5 g of CaCO 3, and deionized water to 1 liter. The medium was sterilized by autoclaving at 15 psi for 15 minutes (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A, 1998) . Before use, 3.5 ml of sterile 50% (NH 4)  2HPO 4 and 5 ml of sterile 20%lactic acid were added per 150 ml.
KU6 trace metals solution was composed of 0.13 g of NiCl 2, 2.5 g of CuSO 4·5H 2O, 13.9 g of FeSO 4·7H 2O, 8.45 g of MnSO 4·H 2O, 6.8 g of ZnCl 2, 3 g of citric acid, and deionized water to 1 liter.
LB medium was composed of 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 10 g of sodium chloride, and deionized water to 1 liter.
LB plates were composed of 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, 15 g of Bacto agar, and deionized water to 1 liter.
PDA plates were composed of potato infusion made by boiling 300 g of sliced potatoes (washed but unpeeled) in water for 30 minutes and then decanting or straining the broth through cheesecloth. Distilled water was then added until the total volume of the suspension was one liter, followed by 20 g (w/v) of dextrose and 20 g (w/v) of agar powder. The medium was sterilized by autoclaving at 15 psi for 15 minutes (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A, 1998) .
Terrific Broth medium was composed of 24 g of yeast extract, 20 g of tryptone, and 4 ml glycerol (87%) in 900 ml deionized water. The medium was sterilized by autoclaving at 15 psi for 15 minutes and allowed to cool to 60℃ before adding 100 ml of sterile phosphate buffer (0.17 M KH 2PO 4, 0.72 M K 2HPO 4) .
TBE buffer was composed of 50 mM Tris base-50 mM boric acid-1 mM disodium EDTA.
YG medium was composed of 0.5%yeast extract and 1%glucose in deionized water.
YPG medium was composed of 4 g of yeast extract, 15 g of glucose, 1 g of KH 2PO 4, 0.5 g of MgSO 4·7H 2O, and deionized water to 1 liter.
YPM medium was composed of 2%yeast extract, 2%peptone, and 1%maltose in deionized water.
Example 1: Genomic DNA extraction from Valsaria rubricosa NN047346, Penicillium sp. NN058240, Macrophomina phaseolina NN057877, Neosartorya massa CBS117265, Perenniporia tephropora NN047366, Penicillium adametzii NN058257, Talaromyces verruculosus NN046799, Penicillium viticola NN058407, and Penicillium wellingtonense NN054749
Valsaria rubricosa NN047346 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 37℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 5 days at 37℃ with shaking at 160 rpm.
Penicillium sp. NN058240 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 25℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 4 days at 25℃ with shaking at 160 rpm.
Macrophomina phaseolina NN057877 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 37℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 3 days at 37℃ with shaking at 160 rpm.
Neosartorya massa CBS117265 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7  days at 37℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 4 days at 37℃ with shaking at 160 rpm.
Perenniporia tephropora NN047366 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 37℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 4 days at 37℃ with shaking at 160 rpm.
Penicillium adametzii NN058257 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 25℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 4 days at 25℃ with shaking at 160 rpm.
Talaromyces verruculosus NN046799 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 37℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 2 days at 37℃ with shaking at 160 rpm.
Penicillium viticola NN058407 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 25℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 4 days at 25℃ with shaking at 160 rpm.
Penicillium wellingtonense NN054749 was inoculated onto a PDA plate and incubated for 7 days at 25℃ in the darkness. Several mycelia-PDA plugs were inoculated into 500 ml shake flasks containing 100 ml of YPG medium. The flasks were incubated for 11 days at 25℃ with shaking at 160 rpm.
The mycelia of each strain were collected separately by filtration through 
Figure PCTCN2019076319-appb-000036
 (Calbiochem) and frozen under liquid nitrogen. Frozen mycelia were ground, by a mortar and a pestle, to a fine powder, and genomic DNA was isolated using a
Figure PCTCN2019076319-appb-000037
Plant Maxi Kit (QIAGEN GmbH) following the manufacturer’s instructions.
Example 2: Genome sequencing, assembly and annotation
The extracted genomic DNA samples of Valsaria rubricosa NN047346, Penicillium sp. NN058240, Neosartorya massa CBS117265, Perenniporia tephropora NN047366, Penicillium adametzii NN058257, Talaromyces verruculosus NN046799, and Penicillium viticola NN058407 were genome sequenced using an
Figure PCTCN2019076319-appb-000038
MiSeq System (lllumina, Inc. ) . The raw reads were assembled using the Spades program (Anton Bankevich et al., 2012, Journal of Computational Biology, 19 (5) : 455-477) .
The extracted genomic DNA samples of Macrophomina phaseolina NN057877 and Penicillium wellingtonense NN054749 were genome sequenced using an
Figure PCTCN2019076319-appb-000039
MiSeq System. The raw reads were assembled using the Idba program (Peng et al., 2010, Research in Computational Molecular Biology, 6044: 426-440. Springer Berlin Heidelberg) .
The assembled sequences were analyzed using standard bioinformatics methods for gene identification and function prediction. GeneMark-ES fungal version (Ter-Hovhannisyan V et al., 2008, Genome Research 18 (12) : 1979-1990) was used for gene prediction. Blastall version 2.2.10 (Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology, 215 (3) : 403-410, and HMMER version 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBI) ) were used to predict function based on structural homology. The cellobiohydrolase I and cellobiohydrolase II genes were identified directly by analysis of the Blast results. The Agene program (Munch and Krogh, 2006, BMC Bioinformatics, 7: 263) and SignalP program (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering, 10: 1-6) were used to identify start codons. SignalP program was further used to predict signal peptides. Pepstats (Rice et al., 2000, Trends Genet, 16 (6) : 276-277) was used to predict isoelectric points and molecular weights.
Example 3: Cloning of cellobiohydrolase I or cellobiohydrolase II gene into an Aspergillus oryzae expression vector
Six cellobiohydrolase II genes, GH6_Varu (SEQ ID NO: 1 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 2 for the deduced amino acid sequence) , GH6_Pen (SEQ ID NO: 3 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 4 for the deduced amino acid sequence) , GH6_Mapha (SEQ ID NO: 5 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 6 for the deduced amino acid sequence) , GH6_Nmas (SEQ ID NO: 7 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 8 for the deduced amino acid sequence) , GH6_Pete (SEQ ID NO: 9 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 10 for the deduced amino acid sequence) , and GH6_Pead (SEQ ID NO: 11 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 12 for the deduced amino acid sequence) and three cellobiohydrolase I genes, GH7_Tave (SEQ ID NO: 13 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 14 for the deduced amino acid sequence) , GH7_Pv1 (SEQ ID NO: 15 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 16 for the deduced amino acid sequence) , and GH7_Pewe (SEQ ID NO: 17 for the DNA sequence and SEQ ID NO: 18 for the deduced amino acid sequence) were selected from Valsaria rubricosa NN047346, Penicillium sp. NN058240, Macrophomina phaseolina NN057877, Neosartorya massa CBS117265, Perenniporia tephropora NN047366, Penicillium adametzii NN058257, Talaromyces verruculosus NN046799, Penicillium viticola NN058407, and Penicillium wellingtonense NN054749, respectively, for expression cloning.
Based on the DNA information obtained from genome sequencing, oligonucleotide  primers, shown below in Table 1, were designed to amplify the coding sequences of the cellobiohydrolase I and II genes from the genomic DNA of Valsaria rubricosa NN047346, Penicillium sp. NN058240, Macrophomina phaseolina NN057877, Neosartorya massa CBS117265, Perenniporia tephropora NN047366, Penicillium adametzii NN058257, Talaromyces verruculosus NN046799, Penicillium viticola NN058407, and Penicillium wellingtonense NN054749. The primers were synthesized by Invitrogen, Beijing, China or LGC Biosearch Technologies (formerly DNA Technology) , Risskov, Denmark.
Table 1
Figure PCTCN2019076319-appb-000040
Lowercase characters of the forward primers, primers 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, and 17 represent the coding region of each gene and lowercase characters of the reverse primers, primers 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 18, represent the downstream region of the CDS of each gene. Bold characters represent a region homologous to insertion sites of Aspergillus oryzae expression vector pCaHj505 (WO 2013/029496) . The 4 underlined letters in the forward primers represent the Kozak sequence, which plays a major role in the initiation of translation  process.
A
Figure PCTCN2019076319-appb-000041
High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes Oy) was used for amplification by PCR of the cellobiohydrolase genes from the genomic DNA prepared in Example 1. An
Figure PCTCN2019076319-appb-000042
CF Dry-down PCR Cloning Kit (BD Biosciences) was used to clone each fragment into plasmid pCaHj505 except for GH6_Nmas which was cloned into plasmid pDAu222 (WO 2013/024021 ) using Bam HI and Xho I restriction sites. The expression vector pCaHj505 contains the Aspergillus oryzae TAKA-amylase promoter and the Aspergillus nigerglucoamylase terminator. The vector pCaHj505 also contains pUC19 derived sequences for selection and propagation in E. coli, and an Aspergillus nidulans amdS gene, which encodes an acetamidase gene for selection of an amdS + Aspergillus transformant. Plasmid pCaHj505 or plasmid pDAu222 was linearized by digestion with Bam HI and Xho I, isolated by 1.0%agarose gel electrophoresis using TBE buffer, and purified using an ILLUSTRA TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) following the manufacturer′s instructions.
For amplification of the GH6_Pen and GH6_Pead cellobiohydrolase II genes and the GH7_Pv1 and GH7_Pewe cellobiohydrolase I genes, four individual PCRs were performed with the primer pair primers 3 and 4, primers 9 and 10, primers 13 and 14, and primers 15 and 16, respectively, and the genomic DNA of Penicillium sp. NN058240, Penicillium adametzii NN058257, Penicillium viticola NN058407, and Penicillium wellingtonense NN054749 as template, respectively. In brief, 20 picomoles of each of the primer pair were used in a PCR composed of 2 μl of genomic DNA, 10 μl of 5X
Figure PCTCN2019076319-appb-000043
GC Buffer (Finnzymes Oy) , 1.5 μl of DMSO, 1.5 μl of 2.5 mM each of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, and 0.6 unit of PHUSION TM High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes Oy) in a final volume of 50 μl with deionized water. The amplification was performed using a Peltier Thermal Cycler (MJ Research Inc. ) programmed for denaturing at 98℃ for 1 minute; 10 cycles each of denaturing at 98℃ for 30 seconds, annealing at 68℃ for 30 seconds, with a 1℃ decrease per cycle, and elongation at 72℃ for 2 minutes; 25 cycles each at 98℃ for 30 seconds, 58℃ for 30 seconds, and 72℃ for 2 minutes; and a final extension at 72℃ for 7 minutes. The heat block then went to a 4℃ soak cycle.
For amplification of the GH6_Mapha cellobiohydrolase II gene, the PCR was performed with the primer pair primers 5 and 6 and the genomic DNA of Macrophomina phaseolina NN057877 as the template. A similar program as described above was used for denaturing at 98℃ for 1 minute; 10 cycles each of denaturing at 98℃ for 30 seconds, annealing at 70℃ for 30 seconds, with a 1℃ decrease per cycle, and elongation at 72℃ for 2 minutes; 25 cycles each at 98℃ for 30 seconds, 60℃ for 30 seconds, and 72℃ for 2  minutes; and a final extension at 72℃ for 7 minutes. The heat block then went to a 4℃ soak cycle.
For amplification of the GH7_Tave cellobiohydrolase I gene and the GH6_Varu and GH6_Pete cellobiohydrolase II genes, 3 individual PCRs were performed with the primer pair primers 11 and 12, primers 1 and 2, or primers 7 and 8, respectively, and the genomic DNA of Valsaria rubricosa NN047346, Talaromyces verruculosus NN046799, and Perenniporia tephropora NN047366 as template, respectively. A similar program to that described above was used for denaturing at 98℃ for 1 minute; 10 cycles each of denaturing at 98℃ for 30 seconds, annealing at 70℃ for 30 seconds, with a 1 ℃ decrease per cycle, and elongation at 72℃ for 2.5 minutes; 25 cycles each at 98℃ for 30 seconds, 60℃ for 30 seconds, and 72℃ for 2.5 minutes; and a final extension at 72℃ for 7 minutes. The heat block then went to a 4℃ soak cycle.
For amplification of the GH6_Nmas gene, a PCR was performed with the primer pair primers 17 and 18 the genomic DNA of Neosartorya massa CBS117265 as template. In brief, 10 picomoles of the primer pair were used in a PCR composed of 1 μl of genomic DNA, 10 μl of 5X
Figure PCTCN2019076319-appb-000044
HF Buffer (Finnzymes Oy) , 1 μl of 2.5 mM each of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, and 0.3 unit of PHUSION TM High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes Oy) in a final volume of 50 μl with deionized water. The amplification was performed using a Peltier Thermal Cycler (MJ Research Inc. ) programmed for denaturing at 95℃ for 2 minutes; 35 cycles each of denaturing at 98℃ for 10 seconds, annealing at 60℃ for 30 seconds, and elongation at 72℃ for 2.5 minutes; and a final extension at 72℃ for 10 minutes. The heat block then went to a 12℃ soak cycle.
The PCR products, ranging in size from approximately 1.6 kb to approximately 1.9 kb, were purified from solution by using an ILLUSTRA TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit.
Except for GH6_Nmas, the purified PCR products of the cellobiohydrolase I or cellobiohydrolase II coding sequences were then ligated to the linearized plasmid pCaHj505 separately by using an IN-FUSION TM Dry-down PCR Cloning Kit, resulting in p505-GH6_Varu, p505-GH6_Pen, p505-GH6_Mapha, p505-GH6_Pete, p505-GH6_Pead, p505-GH7_Tave, p505-GH7_Pv1, and p505-GH7_Pewe, in which transcription of the cellobiohydrolase I and cellobiohydrolase II genes were under the control of a promoter from the gene for Aspergillus oryzae alpha-amylase. Briefly, 8 individual ligation reactions were set up. For each reaction, the pellet of an IN-FUSION TM Dry Down mix was suspended in 2 μl of double distilled water and 1 μl was added to 0.5 μl or 0.8 μl or 1 μl of linearized plasmid pCaHj505. Then 3.5 μl (GH6_Varu) or 3.2 μl (GH6_Pete, GH6_Pen, GH6_Pead, GH7_Pv1 and GH7_Pewe) or 3 μl  (GH7_Tave and GH6_Mapha) of each PCR product were added to the tube. The ligation reaction was incubated at 50℃ for 15 minutes.
All 5 μl of each ligation solution were used for transformation of E. coli TOP10 competent cell (TIANGEN Biotech (Beijing) Co. Ltd. ) . The ligation solution was added to 50 μl of frozen-thawed competent cells and kept on ice for 30 minutes. Then the cells were heat-shocked at 42℃ for 1 minute, and placed on ice for 2 minutes. Then, 200 μl of LB medium were added to the cells and incubated at 37℃ for 60 minutes with shaking at 600 rpm. Finally, all the cells were spread onto LB plates containing 100 μg of ampicillin per ml and incubated at 37℃ overnight.
Several colonies, normally 2-4, were picked for sequencing using a 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems Inc. ) . After the sequences were confirmed, the colony with correct insertion of each gene was inoculated into 3 ml of LB medium containing 100 μg of ampicillin per ml, and incubated at 37℃ overnight with shaking at 200 rpm for plasmid DNA extraction with a
Figure PCTCN2019076319-appb-000045
Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH) by following the manufacturer’s instructions. Plasmid DNA of p505-GH6_Varu, p505-GH6_Pen, p505-GH6_Mapha, p505-GH6_Pete, p505-GH6_Pead, p505-GH7_Tave, p505-GH7_Pv1 and p505-GH7_Pewe were prepared for Aspergillus oryzae transformations in Example 5.
The purified PCR product of the GH6_Nmas cellobiohydrolase II coding sequence was ligated to the linearized plasmid pDau222 by using an IN-FUSION TM Dry-down PCR Cloning Kit, resulting in pDau222-GH6_Nmas in which transcription of the cellobiohydrolase II gene was under the control of a NA2-tpi double promoter. NA2-tpi is a modified promoter from the gene encoding the Aspergillus niger neutral alpha-amylase in which the untranslated leader has been replaced by an untranslated leader from the gene encoding the Aspergillus nidulans triose phosphate isomerase. Briefly, the ligation reaction was set up as follows. The pellet of an IN-FUSION TM Dry Down mix was suspended in 7 μl of double distilled water in a tube followed by addition of 1 μl of linearized plasmid pDau222. Then 2 μl of the GH6_Nmas PCR product were added to the tube. The ligation reaction was incubated at 37℃ for 15 minutes followed by 50℃ for 15 minutes.
Two μl of the ligation solution were used for transformation of E. coli TOP10 competent cell (Invitrogen/Fisher Scientific) . The ligation solution was added to 25 μl of frozen-thawed competent cells and kept on ice for 30 minutes. Then the cells were heat-shocked at 42℃ for 45 seconds, and placed on ice for 2 minutes. Then, 250 μl of Terrific Broth medium were added to the cells and incubated at 37℃ for 60 minutes with shaking at 600 rpm. Finally, 100 μl of the cells were spread onto LB plates containing 50 μg of ampicillin per ml and incubated at 37℃ overnight.
Two colonies were picked for sequencing using an 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems Inc. ) . After the sequence was confirmed, the colony with correct insertion of the gene was inoculated into 1.2 ml of Terrific Broth medium containing 50 μg of ampicillin per ml, and incubated at 37℃ overnight with shaking at 300 rpm for plasmid DNA extraction with a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000046
Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH) according to the manufacturer’s instructions.
Plasmid DNA of pDau22-GH6_Nmas was prepared for Aspergillus oryzae transformation in Example 5.
Example 4: Characterization of the cellobiohydrolase I and II genes
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Valsaria rubricosa cellobiohydrolase II (P43VYM) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. The genomic DNA sequence of 1563 bp (including the stop codon) contains 4 introns located at nucleotides 80 to 132, 202 to 252, 527 to 577, and 826 to 880 of SEQ ID NO: 1. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 450 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 60%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) , a signal peptide of 19 residues was predicted. The predicted mature protein contains 431 amino acids with a predicted molecular mass of 45 kDa and an isoelectric point of 4.3. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the N terminus (amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2) . The catalytic domain is amino acids 92 to 450.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Valsaria rubricosa cellobiohydrolase II (mature polypeptide) shares 74.25%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a glucanase from Paraphaeosphaeria sporulosa (UNIPROT: A0A177CR03) .
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Penicillium sp. cellobiohydrolase II (P448MV) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively. The genomic DNA sequence of 1744 bp (including the stop codon) contains 5 introns located at nucleotides 80 to 138, 208 to 274, 597 to 670, 925 to 991, and 1391 to 1454 of SEQ ID NO: 3. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 470 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 48%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, supra) , a signal peptide of 18 residues  was predicted. The predicted mature protein contains 452 amino acids with a predicted molecular mass of 48 kDa and an isoelectric point of 3.8. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the N terminus (amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4) . The catalytic domain is amino acids 108 to 470.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Penicillium sp. cellobiohydrolase II (mature polypeptide) shares 81.69%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a glucanase (protein name) from Talaromyces pinophilus (UNIPROT: A0A0K1JSQ8) .
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Macrophomina phaseolina cellobiohydrolase II (P43JQ2) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively. The genomic DNA sequence of 1583 bp (including the stop codon) contains 4 introns located at nucleotides 77 to 125, 195 to 252, 530 to 591, and 843 to 900 of SEQ ID NO: 5. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 451 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 59%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, supra) , a signal peptide of 18 residues was predicted. The predicted mature protein contains 433 amino acids with a predicted molecular mass of 45 kDa and an isoelectric point of 5.4. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the N terminus (amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6) . The catalytic domain is amino acids 92 to 451.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Macrophomina phaseolina cellobiohydrolase II (mature polypeptide) shares 87.73%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a glucanase from Botryosphaeria parva (UNIPROT: R1GET5) .
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Neosartorya massa cellobiohydrolase II (P43S41) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively. The genomic DNA sequence of 1692 bp (including the stop codon) contains 7 introns located at nucleotides 80 to 131, 201 to 246, 515 to 564, 819 to 866,  1005 to 1053, 1312 to 1358, and 1601 to 1647 of SEQ ID NO: 7. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 450 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 57%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, supra) , a signal peptide of 19 residues was predicted. The predicted mature protein contains 431 amino acids with a predicted molecular mass of 45 kDa and an isoelectric point of 4.6. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the N terminus (amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8) . The catalytic domain is amino acids 93 to 450.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Neosartorya massa cellobiohydrolase II (mature polypeptide) shares 97.1%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a glucanase from Aspergillus turcosus (SWISSPROT: A0A229YSU6. )
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Perenniporia tephropora cellobiohydrolase II (P44GFU) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, respectively. The genomic DNA sequence of 1535 bp (including the stop codon) contains 3 introns located at nucleotides 101 to 159, 227 to 280, and 426 to 488 of SEQ ID NO: 9. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 452 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 63%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, supra) , a signal peptide of 20 residues was predicted. The predicted mature protein contains 432 amino acids with a predicted molecular mass of 45 kDa and an isoelectric point of 4.1. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the N terminus (amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10) . The catalytic domain is amino acids 98 to 452.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Perenniporia tephropora cellobiohydrolase II (mature polypeptide) shares 84.03%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a Trametes versicolor 1, 4-beta-D-glucan cellobiohydrolase (GENESEQP: BBI91846, US8759040-B1) .
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Penicillium  adametzii cellobiohydrolase II (P448MX) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively. The genomic DNA sequence of 1817 bp (including the stop codon) contains 7 introns located at nucleotides 77 to 131, 201 to 257, 547 to 597, 852 to 906, 1045 to 1118, 1377 to 1462, and 1705 to 1772 of SEQ ID NO: 11. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 456 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 47%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, supra) , a signal peptide of 18 residues was predicted. The predicted mature protein contains 438 amino acids with a predicted molecular mass of 46 kDa and an isoelectric point of 4.3. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the N terminus (amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12) . The catalytic domain is amino acids 99 to 456.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Penicillium adametzii cellobiohydrolase II (mature polypeptide) shares 89.95%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a glucanase from Penicillium brasilianum (UNIPROT: A0A0F7TT91) .
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Talaromyces verruculosus cellobiohydrolase I (P43VWN) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, respectively. The genomic DNA sequence of 1572 bp (including the stop codon) contains no introns. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 523 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 54%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, supra) , a signal peptide of 25 residues was predicted. The predicted mature protein contains 498 amino acids with a predicted molecular mass of 52 kDa and an isoelectric point of 4.2. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the C terminus (amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14) . The catalytic domain is amino acids 26 to 458.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Penicillium adametzii cellobiohydrolase I (mature polypeptide) shares 95.98%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a cellobiohydrolase I from Penicillium verruculosum  (GENESEQP: AYI08421 RU2378372-C2. ) .
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Penicillium viticola cellobiohydrolase I (P448N3) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, respectively. The genomic DNA sequence of 1632 bp (including the stop codon) contains no introns. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 543 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 57%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, supra) , a signal peptide of 25 residues was predicted. The predicted mature protein contains 518 amino acids with a predicted molecular mass of 54 kDa and an isoelectric point of 4.0. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the C terminus (amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16) . The catalytic domain is amino acids 26 to 463.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Penicillium vitivolai cellobiohydrolase I (mature polypeptide) shares 83.5%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a glucanase from Penicillium glabrum (UNIPROT: G3KB95) .
The genomic DNA sequence and deduced amino acid sequence of the Penicillium wellingtonense cellobiohydrolase I (P448N9) encoding sequence are shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, respectively. The genomic DNA sequence of 1644 bp (including the stop codon) contains no introns. The genomic DNA fragment encodes a polypeptide of 547 amino acids. The %G+C content of the mature polypeptide coding sequence is 54%. Using the SignalP software program (Nielsen et al., 1997, supra) , a signal peptide of 25 residues was predicted. The predicted mature protein contains 522 amino acids with a predicted molecular mass of 55 kDa and an isoelectric point of 4.1. The protein contains a carbohydrate binding module of the CBM1 type at the C terminus (amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18) . The catalytic domain is amino acids 26 to 462.
A comparative alignment of mature cellobiohydrolase II amino acid sequences, without the signal peptides, was determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra) as implemented in the Needle program of EMBOSS with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 matrix. The alignment showed that the deduced amino acid sequence of the Penicillium wellingtonense cellobiohydrolase I (mature polypeptide) shares 94.23%identity (excluding gaps) to the deduced amino acid sequence of a cellulase (PeCBH1 protein) , SEQ ID 22 from  Penicillium sp. (GENESEQP: BAG38039, KR2012116765-A) .
Example 5: Expression of the cellobiohydrolase I or cellobiohydrolase II genes in Aspergillus oryzae MT3568
Aspergillus oryzae MT3568 protoplasts were prepared according to the method of Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. For the transformations, 3 μg of plasmid DNA of p505-GH6_Varu, p505-GH6_Pen, p505-GH6_Mapha, pDau22-GH6_Nmas, p505-GH6_Pete, p505-GH6_Pead, p505-GH7_Tave, p505-GH7_Pv1, or p505-GH7_Pewe were used to transform Aspergillus oryzae MT3568 separately. The transformations yielded several transformants each. Four transformants of each transformation were isolated and inoculated into 3 ml of YPM medium in 24-well plates and incubated at 30℃ with agitation at 150 rpm. After 3 days of incubation, 20 μl of supernatant from each culture were analyzed by SDS-PAGE using a
Figure PCTCN2019076319-appb-000047
Novex 4-12%Bis-Tris Gel with MES (Invitrogen Corporation) according to the manufacturer′s instructions. The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain (Expedeon Ltd. ) . SDS-PAGE profiles of the cultures showed that the majority of the transformants had a smeary recombinant protein band at 65 kDa, 85 kDa, 60 kDa, 65 kDa, 65 kDa, 70 kDa, 90 kDa, 80 kDa, and 70 kDa, for the cellobiohydrolase II from Valsaria rubricosa NN047346, Penicillium sp. NN058240, Macrophomina phaseolina NN057877, Neosartorya massa CBS117265, Perenniporia tephropora NN047366, and Penicillium adametzii NN058257 and the cellobiohydrolase I from Talaromyces verruculosus NN046799, Penicillium viticola NN058407, and Penicillium wellingtonense NN054749, respectively. The transformant with the highest expression level of each gene was designated as O13UA7, O23CCU, O82NP8, O82SY7, O23SHE, O23CCV, O13UA3, O241RG, and O241TC, respectively.
Example 6: Fermentations of Aspergillus oryzae expression strain O13UA7, O23CCU, O82NP8, O82SY7, O23SHE, O23CCV, O13UA3, O241RG, and O241TC
A slant of the expression strain A. oryzae O13UA7 was washed with 10 ml of YPM medium and inoculated into 4 flasks of 2-liter each containing 400 ml of YPM medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 80 rpm. The cultures were harvested on day 3 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane (Millipore) .
A slant of the expression strain A. oryzae O23CCU was washed with 10 ml of Dap4C medium and inoculated into 4 flasks of 2-liters each containing 400 ml of Dap4C medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 80 rpm. The cultures were harvested on day 5 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane.
A slant of the expression strain A. oryzae O82NP8 was washed with 10 ml of YPM medium and inoculated into 6 flasks of 2-liters each containing 400 ml of YPM medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 80 rpm. The cultures were harvested on day 3 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane.
A slant of the expression strain A. oryzae O82SY7 was washed with 10 ml of Dap4C medium and inoculated into two flasks of 500 ml each containing 150 ml of Dap4C medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 100 rpm. The cultures were harvested on day 4 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane.
A slant of the expression strain A. oryzae O23SHE was washed with 10 ml of Dap4C medium and inoculated into 1 flask of 2-liters containing 400 ml of Dap4C medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 80 rpm. The culture was harvested on day 3 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane.
A slant of the expression strain A. oryzae O23CCV was washed with 10 ml of Dap4C medium and inoculated into 4 flasks of 2-liters each containing 400 ml of Dap4C medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 80 rpm. The cultures were harvested on day 3 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane.
A slant of the expression strain A. oryzae O13UA3 was washed with 10 ml of YPM medium and inoculated into 5 flasks of 2-liters each containing 400 ml of YPM medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 80 rpm. The cultures were harvested on day 3 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane.
A slant of the expression strain A. oryzae O241RG was washed with 10 ml of Dap4C medium and inoculated into 4 flasks of 2-liters each containing 400 ml of Dap4C medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 80 rpm. The cultures were harvested on day 3 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane.
A slant of the expression strain A. oryzae O241TC was washed with 10 ml of Dap4C medium and inoculated into 5 flasks of 2-liters each containing 400 ml of Dap4C medium, which were incubated at 30℃ with shaking at 80 rpm. The cultures were harvested on day 3 and filtered using a 0.22 μm DURAPORE Membrane.
Example 7: Purification of cellobiohydrolases
Purification of recombinant Valsaria rubricosa cellobiohydrolase II from Aspergillus oryzae O13UA7. A 1600 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O13UA7 (Example 6) was precipitated with ammonium sulfate (80%saturation) . The protein was rs-dissolved in double distilled water, followed by adjusting the conductivity to 145 ms/cm with ammonium sulfate, and filtered through a 0.45 μm filter. The final volume was 80 ml. The  solution was applied to a 40 ml Phenyl
Figure PCTCN2019076319-appb-000048
6 Fast Flow column (GE Healthcare) and eluted with a linear 1.2-0 M ammonium sulfate gradient. Fractions were analyzed by SDS-PAGE using a
Figure PCTCN2019076319-appb-000049
4-12%Bis-Tris Gel with 50 mM MES (ThemoFisher Scientific) . The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain. Fractions containing a band at approximately 65 kDa were pooled and concentrated by ultrafiltration. The concentrated protein was desalted into 20 mM Tris pH 8.0 using an
Figure PCTCN2019076319-appb-000050
10 DG column (Bio-Rad Laboratories, Inc. ) according to the manufacturer’s instructions, and then equilibrated to 1 M ammonium sulfate. The protein was applied to a 15 ml PHENYL 
Figure PCTCN2019076319-appb-000051
High Performance column (GE Healthcare) , and the protein was eluted with a linear ammonium sulfate gradient (1 M to 0 M) . The protein was desalted into 20 mM MES pH 6.0 using an
Figure PCTCN2019076319-appb-000052
10 DG column. Protein concentration was determined based on absorbance at 280 nm using a NANODROP TM 1000 Spectrophotometer (ThermoFisher Scientific) with an extinction coefficient determined according to Gill and Von Hippel, 1989, Analytical Biochemistry 182: 319-326.
Purification of recombinant Penicillium sp. cellobiohydrolase II from Aspergillus oryzae O23CCU. A 1600 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O23CCU (Example 6) was precipitated with ammonium sulfate (80%saturation) . The protein was re-dissolved in double distilled water, followed by adjusting the conductivity to 145 ms/cm with ammonium sulfate, and filtered through a 0.45 μm filter. The final volume was 120 ml. The solution was applied to a 40 ml Phenyl
Figure PCTCN2019076319-appb-000053
6 Fast Flow column and eluted with a linear 1.2-0 M ammonium sulfate gradient. Fractions were analyzed by SDS-PAGE using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000054
4-12%Bis-Tris Gel with 50 mM MES. The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain. Fractions containing a band at approximately 80 kDa were pooled and concentrated by ultrafiltration. The concentrated protein was desalted into 20 mM Tris pH 8.0 using an
Figure PCTCN2019076319-appb-000055
10 DG column according to the manufacturer’s instructions, and then equilibrated to 1 M ammonium sulfate. The protein was applied to a 15 ml PHENYL
Figure PCTCN2019076319-appb-000056
High Performance column, and the protein was eluted with a linear ammonium sulfate gradient (1 M to 0 M) . The protein was desalted into 20 mM MES pH 6.0 using an
Figure PCTCN2019076319-appb-000057
10 DG column. Protein concentration was determined based on absorbance at 280 nm using a NANODROP TM 1000 Spectrophotometer with an extinction coefficient determined according to Gill and Von Hippel, 1989, supra.
Purification of recombinant Macrophomina phaseolina cellobiohydrolase II from Aspergillus oryzae O82NP8. A 3200 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O82NP8 (Example 6) was precipitated with ammonium sulfate (80%saturation) . The protein was re-dissolved in double distilled water, followed by adjusting the conductivity to 145 ms/cm  with ammonium sulfate, and filtered through a 0.45 μm filter. The final volume was 60 ml. The solution was applied to a 40 ml PHENYL
Figure PCTCN2019076319-appb-000058
6 Fast Flow column and eluted with a linear 1.2-0 M ammonium sulfate gradient. Fractions were analyzed by SDS-PAGE using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000059
4-12%Bis-Tris Gel with 50 mM MES. The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain. Fractions containing a band at approximately 50 kDa were pooled. Then the pooled solution was concentrated by ultrafiltration.
Purification of recombinant Neosartorya massa cellobiohydrolase II from Aspergillus oryzae O82SY7. A 250 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O82SY7 (Example 6) was adjusted to pH 7.5 and 1.8 M ammonium sulphate was added. The sample was applied to a 5 ml HITRAP TM Phenyl (HS) column (GE Healthcare) on an
Figure PCTCN2019076319-appb-000060
Explorer. Prior to loading, the column was equilibrated in 5 column volumes (CV) of 50 mM HEPES plus 1.8 M AMS pH 7. To remove unbound material, the column was washed with 5 CV of 50 mM HEPES plus 1.8 M AMS pH 7. The target protein was eluted from the column into a 10 ml loop using 50 mM HEPES plus 20%isopropanol pH 7. From the loop, the sample was loaded onto a desalting column (HIPREP TM 26/10 Desalting) , which had been equilibrated with 3 CV of 50 mM HEPES plus 100 mM NaCl pH 7.0. The target protein was eluted with 50 mM HEPES plus 100 mM NaCl pH 7.0 and relevant fractions were selected and pooled based on the chromatogram. The flow rate was 5 ml/min.
Purification of recombinant Perenniporia tephropora cellobiohydrolase II from Aspergillus oryzae O23SHE. A 400 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O23SHE (Example 6) was precipitated with ammonium sulfate (80%saturation) . The protein was re-dissolved in double distilled water, followed by adjusting the conductivity to 145 ms/cm with ammonium sulfate, and filtered through a 0.45 μm filter. The final volume was 30 ml. The solution was applied to a 40 ml PHENYL
Figure PCTCN2019076319-appb-000061
6 Fast Flow column and eluted with a linear 1.2-0 M ammonium sulfate gradient. Fractions were analyzed by SDS-PAGE using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000062
4-12%Bis-Tris Gel with 50 mM MES. The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain. Fractions containing a band at approximately 45 kDa were pooled and concentrated by ultrafiltration.
Purification of recombinant Penicillium adametzii cellobiohydrolase II from Aspergillus oryzae O23CCV. A 1600 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O23CCV (Example 6) was precipitated with ammonium sulfate (80%saturation) . The protein was re-dissolved in double distilled water, followed by adjusting the conductivity to 145 ms/cm with ammonium sulfate, and filtered through a 0.45 μm filter. The final volume was 30 ml. The solution was applied to a 40 ml PHENYL
Figure PCTCN2019076319-appb-000063
6 Fast Flow column and eluted with a linear 1.2-0 M ammonium sulfate gradient. Fractions were analyzed by SDS-PAGE using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000064
4-12%Bis-Tris Gel with 50 mM MES. The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain. Fractions containing a band at approximately 46 kDa were pooled and concentrated by ultrafiltration.
Purification of recombinant Talaromyces verruculosus cellobiohydrolase I from Aspergillus oryzae O13UA3. A 2000 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O13UA3 (Example 6) was precipitated with ammonium sulfate (80%saturation) . The protein was re-dissolved in double distilled water, followed by adjusting the conductivity to 145 ms/cm with ammonium sulfate, and filtered through a 0.45 μm filter. The final volume was 80 ml. The solution was applied to a 40 ml PHENYL
Figure PCTCN2019076319-appb-000065
6 Fast Flow column and eluted with a linear 1.2-0 M ammonium sulfate gradient. Fractions were analyzed by SDS-PAGE using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000066
4-12%Bis-Tris Gel with 50 mM MES. The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain. Fractions containing a band at approximately 90 kDa were pooled and concentrated by ultrafiltration.
Purification of recombinant Penicillium viticola cellobiohydrolase I from Aspergillus oryzae O241RG. An 800 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O241RG (Example 6) was precipitated with ammonium sulfate (80%saturation) . The protein was re-dissolved in double distilled water, followed by adjusting the conductivity to 145 ms/cm with ammonium sulfate, and filtered through a 0.45 μm filter. The final volume was 30 ml. The solution was applied to a 40 ml PHENYL
Figure PCTCN2019076319-appb-000067
6 Fast Flow column and eluted with a linear 1.2-0 M ammonium sulfate gradient. Fractions were analyzed by SDS-PAGE using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000068
4-12%Bis-Tris Gel with 50 mM MES. The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain. Fractions containing a band at approximately 54 kDa were pooled and concentrated by ultrafiltration.
Purification of recombinant Penicillium wellingtonense cellobiohydrolase I from Aspergillus oryzae O241TC. A 1200 ml volume of filtered supernatant of Aspergillus oryzae O241TC (Example 6) was precipitated with ammonium sulfate (80%saturation) . The protein was re-dissolved in double distilled water, followed by adjusting the conductivity to 145 ms/cm with ammonium sulfate, and filtered through a 0.45 μm filter. The final volume was 30 ml. The solution was applied to a 40 ml PHENYL
Figure PCTCN2019076319-appb-000069
6 Fast Flow column and eluted with a linear 1.2-0 M ammonium sulfate gradient. Fractions were analyzed by SDS-PAGE using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000070
4-12%Bis-Tris Gel with 50 mM MES. The resulting gel was stained with INSTANTBLUE TM Protein Stain. Fractions containing a band at approximately 55 kDa were pooled and concentrated by ultrafiltration.
Example 8: Pretreated corn stover hydrolysis assay
Corn stover was pretreated at the U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) using 1.4 wt %sulfuric acid at 165℃ and 107 psi for 8 minutes. The water-insoluble solids in the pretreated corn stover (PCS) contained 56.5%cellulose, 4.6%hemicellulose, and 28.4%lignin. Cellulose and hemicellulose were determined by a two-stage sulfuric acid hydrolysis with subsequent analysis of sugars by high performance liquid chromatography using NREL Standard Analytical Procedure #002. Lignin was determined gravimetrically after hydrolyzing the cellulose and hemicellulose fractions with sulfuric acid using NREL Standard Analytical Procedure #003.
Unmilled, unwashed PCS (whole slurry PCS; hereinafter “PCS” ) was prepared by adjusting the pH of the PCS to 5.0 by addition of 10 M NaOH with extensive mixing, and then autoclaving for 20 minutes at 120℃. The dry weight of the whole slurry PCS was 29%.
A 96-well plate was generated by machining a teflon plate of depth 1/4 inch with 96, cone-shaped wells, diameter 1/4 inch at the upper surface and diameter 1/8 inch at the lower surface. The center of each well was at an equivalent position to the center of a corresponding well in a standard g6-well microtiter plate, approximately 23/64 inch on center. The resulting volume of each well was approximately 135 μl. The g6-well aluminum plate is hereinafter referred to as the “fill plate” . The PCS was used to fill the holes in the fill plate by applying a suitable volume of the PCS to the upper surface of the plate, then using a spatula to spread the material over the surface and into the holes. Holes were deemed sufficiently full when the PCS extruded through the hole in the bottom surface, forming noodle-like tubes. A 
Figure PCTCN2019076319-appb-000071
Column Loader Scraper (Millipore) held perpendicular to the fill plate surface was used to scrape excess PCS from the top and bottom surfaces of the fill plate, leaving the surfaces of the PCS in each well flush with the surfaces of the fill plate. The fill plate was then placed on the top of a 2.2 ml deep well plate (Axygen) with the top surface adjacent to the open end of the well plate (e.g., the top of the well plate) , and the wells aligned with the PCS-filled holes in the fill plate. The fill plate was secured in this position, and the assembly centrifuged at 2500 rpm (1350 x g) for 5 minutes in a Sorvall Legend RT+ (Thermo Scientific) . Following centrifugation, the PCS had been transferred to the deep well plate. A 3 mm glass bead (Fisher Scientific) was placed in each well for mixing.
Hydrolysis of the PCS was conducted in a total reaction volume of 0.2 ml. The hydrolysis was performed with 20%of the PCS containing 100 mM sodium acetate pH 5.0 buffer and various protein loadings of various enzyme compositions (expressed as mg protein per gram of cellulose) . Enzyme compositions were prepared and then added simultaneously to all wells in a volume ranging from 20 μl to 50 μl, for a final volume of 0.2-0.50 ml in each reaction. The plate was then sealed using an ALPS-300 TM plate heat sealer (Abgene) , mixed  thoroughly, and incubated at a specific temperature for 72 hours.
Following hydrolysis, samples were filtered using a 0.45 μm
Figure PCTCN2019076319-appb-000072
96-well filter plate (Millipore) and filtrates analyzed for sugar content as described below. When not used immediately, filtered aliquots were frozen at -20℃. The sugar concentrations of samples diluted in 0.005 M H 2SO 4 were measured using a 4.6 x 250 mm
Figure PCTCN2019076319-appb-000073
HPX-87H column (Bio-Rad Laboratories, Inc. ) by elution with 0.05%w/w benzoic acid-0.005 M H 2SO 4 at 65℃ at a flow rate of 0.6 ml per minute, and quantitation by integration of the glucose signal from refractive index detection (
Figure PCTCN2019076319-appb-000074
1100 HPLC, Agilent Technologies) calibrated by pure glucose samples. The resultant glucose was used to calculate the percentage of cellulose conversion for each reaction.
Measured glucose concentrations were adjusted for the appropriate dilution factor. The net concentrations of enzymatically-produced glucose from the PCS were determined by adjusting the measured glucose concentrations for corresponding background glucose concentration in the PCS at zero-time point. All HPLC data processing was performed using MICROSOFT EXCEL TM software (Microsoft) .
The degree of cellulose conversion to glucose was calculated using the following equation: %cellulose conversion = (glucose concentration) / (glucose concentration in a limit digest) X 100. In order to calculate %glucose conversion, a 100%conversion point was set based on a cellulase control (100 mg of T. reesei cellulase supplemented with Thermoascus aurantiacus GH61A polypeptide, and
Figure PCTCN2019076319-appb-000075
HTec3 (Novozymes A/S) per gram cellulose. Quadruplicate data points were averaged and standard deviation was calculated.
Example 9: Pretreated wheat straw hydrolysis assay
Wheat straw was pretreated by steam explosion and used unwashed. Hydrolysis of the pretreated wheat straw (PWS) was conducted in a total reaction volume of 0.18 ml in 96-well plates. The hydrolysis was performed with 30 mg of insoluble PWS solids containing 100 mM sodium acetate pH 5.0 buffer and various protein loadings of various enzyme compositions (expressed as mg protein per gram of cellulose) . Enzyme compositions were prepared and then added simultaneously to all wells of the plate in a volume ranging from 20 μl to 50 μl, for a final volume of 0.2-0.50 ml in each reaction. The plate was then sealed using an ALPS-300 TM plate heat sealer, mixed thoroughly, and incubated at a specific temperature for 72 hours.
Following hydrolysis, samples were filtered using a 0.45 μm
Figure PCTCN2019076319-appb-000076
96-well filter plate and filtrates analyzed for sugar content as described below. When not used immediately, filtered aliquots were frozen at -20℃. The sugar concentrations of samples  diluted in 0.005 M H 2SO 4 were measured using a 4.6 x 250 mm
Figure PCTCN2019076319-appb-000077
HPX-87H column by elution with 0.05%w/w benzoic acid-0.005 M H 2SO 4 at 65℃ at a flow rate of 0.6 ml per minute, and quantitation by integration of the glucose signal from refractive index detection (
Figure PCTCN2019076319-appb-000078
1100 HPLC) calibrated by pure glucose samples. The resultant glucose was used to calculate the percentage of cellulose conversion to glucose for each reaction.
Measured glucose concentrations were adjusted for the appropriate dilution factor. The net concentrations of enzymatically-produced glucose from the PWS were determined by adjusting the measured sugar concentrations for corresponding background glucose concentration in the PWS at zero-time point. All HPLC data processing was performed using MICROSOFT EXCEL TM software (Microsoft) .
The degree of cellulose conversion to glucose was calculated using the following equation: %cellulose conversion = (glucose concentration) / (glucose concentration in a limit digest) X 100. In order to calculate %glucose conversion, a 100%conversion point was set based on a cellulase control (100 mg of T. reesei cellulase supplemented with Thermoascus aurantiacus GH61A polypeptide, and
Figure PCTCN2019076319-appb-000079
HTec3 (Novozymes A/S) per gram cellulose. Quadruplicate data points were averaged and standard deviation was calculated.
Example 10: Preparation of Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II
A Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II (GENESEQP: AZY49446) was prepared recombinantly in Aspergillus oryzae as described in WO 2012/103288. The filtered broth of the T. leycettanus GH6 cellobiohydrolase II was concentrated and buffer exchanged into 20 mM Tris pH 8.0 using a 400 ml
Figure PCTCN2019076319-appb-000080
G-25 column (GE Healthcare) . The fractions were pooled, and ammonia sulfate and Tris were added to the desalted protein to a final concentration of 1.2 M ammonia sulfate and 20 mM Tris pH 8.0. The protein was loaded onto a PHENYL SEPHAROSE TM 6 Fast Flow column (high sub) (GE Healthcare) equilibrated in 20 mM Tris pH 8.0 with 1.2 M ammonium sulfate, and bound proteins were eluted with 20 mM Tris pH 8.0 with no ammonium sulfate. Fractions were analyzed by 8-16%Tris-HCl SDS-PAGE gels (Bio-Rad Laboratories, Inc. ) and pooled. The pooled protein was buffer exchanged into 20 mM MES pH 6.0 using a
Figure PCTCN2019076319-appb-000081
200 with 10 kDa molecular weight cut-off tangential flow membrane (Sartorius) . Protein concentration was determined based on absorbance at 280 nm using a NANODROP TM 1000 Spectrophotometer with an extinction coefficient determined according to Gill and Von Hippel, 1989, supra.
Example 11: Preparation of an enzyme composition without cellobiohydrolase II
A Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I (GENESEQP: AZY49536) was prepared recombinantly in Aspergillus oryzae as described in WO 2012/103288. The filtered broth of the T. leycettanus GH7 cellobiohydrolase I was concentrated and desalted using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000082
200 with 10 kDa molecular weight cut-off tangential flow membrane) into 20 mM Tris buffer pH 8.0.
A Thermoascus aurantiacus Cel5A endoglucanase II (GENESEQP: AZI04862) was prepared recombinantly according to WO 2011/057140 using Aspergillus oryzae as a host. The filtered broth of the Thermoascus aurantiacus endoglucanase II was concentrated using a
Figure PCTCN2019076319-appb-000083
200 with 5 kDa molecular weight cut-off tangential flow membrane and desalted into 20 mM Tris buffer pH 8.0 using a 500 ml
Figure PCTCN2019076319-appb-000084
G-25 column.
A Penicillium sp. (emersonii) AA9A polypeptide (P245Q6) having cellulolytic enhancing activity (GENESEQP: BAL45395) was recombinantly prepared according to WO 2013/028928 using Trichoderma reesei as a host. The filtered broth was loaded onto a 60 ml Q
Figure PCTCN2019076319-appb-000085
High Performance (GE Healthcare) equilibrated in 20 mM Tris pH 8.0 and eluted using a linear gradient from 0 to 0.5 M sodium chloride. The pooled fractions were concentrated using a
Figure PCTCN2019076319-appb-000086
and desalted into 50 mM sodium acetate pH 8.0 containing 100 mM sodium chloride using a 500 ml
Figure PCTCN2019076319-appb-000087
G-25 column.
A Talaromyces leycettanus GH10 xylanase (GENESEQP: BAK46118) was prepared recombinantly according to WO 2013/019827 using Aspergillus oryzae as a host. The filtered broth of the Talaromyces leycettanus GH10 xylanase was concentrated and desalted into 50 mM sodium acetate pH 5, 100 mM NaCl using a 200 with 10 kDa molecular weight cut-off tangential flow membrane.
An Aspergillus fumigatus Cel3A beta-glucosidase 4M variant (GENESEQP: AZU67153) was recombinantly prepared according to WO 2012/044915. The filtered broth of Aspergillus fumigatus Cel3A beta-glucosidase 4M was concentrated and buffer exchanged using a tangential flow concentrator (Pall Filtron) equipped with a 10 kDa polyethersulfone membrane (Pall Filtron) with 50 mM sodium acetate pH 5.0 containing 100 mM sodium chloride. Protein concentration was determined using 4-nitrophenyl-beta-d-glucopyranoside (Sigma Chemical Co., Inc. ) as substrate and Aspergillus fumigatus Cel3A beta-glucosidase 4M 280 as a protein standard purified according to WO 2012/044915 with the protein concentration determined using the theoretical extinction coefficient and the absorbance of the protein at 280 nm. The p-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside (pNPG) assay was performed as follows: pNPG was dissolved in DMSO to make 100 mM stock solution. The 100 mM pNPG stock solution was diluted 100X in 50 mM sodium acetate buffer pH 5 with 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000089
20 to 1 mM pNPG containing 50 mM sodium acetate buffer pH 5  with 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000090
20. The protein was diluted at several concentrations in 50 mM sodium acetate buffer pH 5 with 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000091
20. Then, 20 μl of diluted protein were added to 100 pl of 1 mM pNPG containing 50 mM sodium acetate buffer pH 5 with 0.01%
Figure PCTCN2019076319-appb-000092
20. The reactions were incubated at 40℃ for 20 minutes, and reactions were stopped with 50 μl of 1 M sodium carbonate buffer pH 10. The absorbance was measured for p-nitrophenol (pNP) production at 405 nm.
A Talaromyces emersonii CBS 393.64 beta-xylosidase (GENESEQP: AZI04896) was prepared recombinantly according to Rasmussen et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering 94: 869-876 using Aspergillus oryzae JaL355 as a host (WO 2003/070956) . The filtered broth was concentrated and desalted with 50 mM sodium acetate pH 5.0 using a tangential flow concentrator equipped with a 10 kDa polyethersulfone membrane (Pall Filtron) .
The protein concentration for each of the monocomponents described above except the Aspergillus fumigatus Cel3A beta-glucosidase 4M variant (measured as described above) was determined using a Microplate BCA TM Protein Assay Kit (Thermo Fischer Scientific) in which bovine serum albumin was used as a protein standard. An enzyme composition was prepared composed of each monocomponent as follows: 44.1%Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I, 15.9%Thermoascus aurantiacus GH5 endoglucanase II, 19.5%Penicillium sp. (emersonii) GH61A polypeptide, 13%Talaromyces leycettanus GH10 xylanase, 6.5%Aspergillus fumigatus beta-glucosidase, and 3.9%Talaromyces emersonii beta-xylosidase. The enzyme composition is designated herein as “cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II” .
Example 12: Comparison of the effect of Valsaria rubricosa GH6 cellobiohydrolase II and Penicillium sp. GH6 cellobiohydrolase II to Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II on the hydrolysis of unwashed PCS by a cellulase enzyme composition
The Valsaria rubricosa GH6 cellobiohydrolase II (Example 7) and Penicillium sp. GH6 cellobiohydrolase II (Example 7) were added individually to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II (Example 11) and compared to the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II (Example 10) added to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II using PCS as substrate (Example 8) at 50℃, 55℃, and 60℃. Each cellobiohydrolase II was added individually at 1.84 mg enzyme protein per g cellulose to 6.16 mg enzyme protein of the cellulase enzyme composition without cellobiohydrolase II per g cellulose.
The assay was performed as described in Example 8. The reactions with the PCS  (20%total solids) were conducted for 70 hours at 50℃, 55℃, and 60℃ in 100 mM sodium acetate pH 5.0 buffer. All reactions were performed in quadruplicate with mixing at 200 rpm throughout the hydrolysis.
The results shown in Table 2 demonstrated that the cellulase enzyme composition containing the Valsaria rubricosa GH6 cellobiohydrolase II yielded significantly higher cellulose conversion at 50℃ and 55℃ and lower cellulose conversion at 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II. The cellulase enzyme composition containing the Penicillium sp. GH6 cellobiohydrolase II yielded higher cellulose conversion at 50℃ and 55℃ and lower cellulose conversion at 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II at 50℃ and 55℃.
Table 2. Comparison of the effect of Valsaria rubricosa CBHII and Penicillium sp. CBHII to Talaromyces leycettanus CBHII on the hydrolysis of pretreated corn stover (PCS) by a cellulase enzyme composition.
Figure PCTCN2019076319-appb-000093
Example 13: Comparison of the effect of Valsaria rubricosa GH6 cellobiohydrolase II and Penicillium sp. GH6 cellobiohydrolase II to Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II on the hydrolysis of PWS by a cellulase enzyme composition
The Valsaria rubricosa GH6 cellobiohydrolase II (Example 7) and Penicillium species GH6 cellobiohydrolase II (Example 7) were added individually to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II (Example 11) and compared to the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II (Example 10) added to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II using PWS as substrate (Example 9) at 50℃, 55℃, and 60℃. Each cellobiohydrolase II was added individually at 1.84 mg enzyme protein per g cellulose to 6.16 mg enzyme protein of the cellulase enzyme composition without cellobiohydrolase II per g cellulose.
The assay was performed as described in Example 9. The reactions with PWS (15%total solids) were conducted for 70 hours at 50℃, 55℃, and 60℃ in 100 mM sodium acetate pH 5.0 buffer. All reactions were performed in quadruplicate with mixing at 200 rpm throughout  the hydrolysis.
The results shown in Table 3 demonstrated that the cellulase enzyme composition containing the Valsaria rubricosa GH6 cellobiohydrolase II yielded higher cellulose conversion at 50℃ and 55℃ and lower cellulose conversion at 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II. The cellulase enzyme composition containing the Penicillium sp. GH6 cellobiohydrolase II yielded slightly higher cellulose conversion at 50℃ and 55℃ and lower cellulose conversion at 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II.
Table 3. Comparison of the effect of Valsaria rubricosa CBHII and Penicillium sp. CBHII to Talaromyces leycettanus CBHII on the hydrolysis of pretreated wheat straw (PWS) by a cellulase enzyme composition.
Figure PCTCN2019076319-appb-000094
Example 14: Preparation of Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I
The Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I (GENESEQP: AZY49536) was prepared recombinantly in Aspergillus oryzae as described in WO 2012/103288. The filtered broth of the Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I was concentrated and buffer exchanged into 20 mM Tris pH 8.0 using a 400 ml
Figure PCTCN2019076319-appb-000095
G-25 column. The fractions were pooled, and ammonia sulfate and Tris were added to the desalted protein to a final concentration of 1.2 M ammonia sulfate and 20 mM Tris pH 8.0. The protein was loaded onto a PHENYL SEPHAROSE TM 6 Fast Flow column (high sub) equilibrated in 20 mM Tris pH 8.0 with 1.2 M ammonium sulfate, and bound proteins were eluted with 20 mM Tris pH 8.0 with no ammonium sulfate. Fractions were analyzed by 8-16%Tris-HCl SDS-PAGE gels, and pooled. The pooled protein was buffer exchanged into 20 mM Tris pH8.0 buffer using a 
Figure PCTCN2019076319-appb-000096
200 with 10 kDa molecular weight cut-off tangential flow membrane. Protein concentration was determined using absorbance at 280 nm using a NANODROP TM 1000 Spectrophotometer with an extinction coefficient determined according to Gill and Von Hippel, 1989, supra.
Example 15: Preparation of an enzyme composition without cellobiohydrolase I
The Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II (GENESEQP: AZY49446) was prepared recombinantly in Aspergillus oryzae as described in WO 2012/103288. The filtered broth of the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II was concentrated and desalted using the
Figure PCTCN2019076319-appb-000097
200 with 10 kDa molecular weight cut-off tangential flow membrane into 20 mM Tris buffer pH 8.0.
The other enzyme components were prepared as described in Example 11.
The protein concentration for each of the monocomponents except the Aspergillus fumigatus Cel3A beta-glucosidase 4M variant (determined as described in Example 11) was determined using a Microplate BCA TM Protein Assay Kit in which bovine serum albumin was used as a protein standard. An enzyme composition was prepared composed of each monocomponent as follows: 40%Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II, 16%Thermoascus aurantiacus GH5 endoglucanase II, 24%Penicillium sp. (emersonii) GH61A polypeptide, 8%Talaromyces leycettanus GH10 xylanase, 8%Aspergillus fumigatus beta-glucosidase, and 5%Talaromyces emersonii beta-xylosidase. The enzyme composition is designated herein as “cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase I” .
Example 16: Comparison of the effect of GH6 cellobiohydrolase II enzymes from Macrophomina phaseolina, Neosartorya massa, Perenniporia tephropora, and Penicillium adametzii against Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II on the hydrolysis of PWS by a cellulase enzyme composition
The GH6 cellobiohydrolase II enzymes from Macrophomina phaseolina, Neosartorya massa, Perenniporia tephropora, and Penicillium adametzii (Example 7) were added separately to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II (Example 11) and compared to the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II (Example 10) added to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase II using PWS as substrate (Example 9) at 50℃, 55℃, and 60℃. Each cellobiohydrolase II was added individually at 1.30 mg enzyme protein per g cellulose to 5.21 mg enzyme protein of the cellulase enzyme composition without cellobiohydrolase II per g cellulose. Hydrolysis was performed at pH 5.0 for 72 hours according to Example 9.
The results shown in Table 4 demonstrated that the cellulase enzyme composition containing the Macrophomina phaseolina GH6 cellobiohydrolase II yielded slightly higher cellulose conversion at 50℃ and lower cellulose conversion at 55℃ and 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II. The cellulase enzyme composition containing the Neosartorya massa  GH6 cellobiohydrolase II yielded higher cellulose conversion at 50℃, slightly higher conversion at 55℃, and slightly lower cellulose conversion at 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II. The cellulase enzyme composition containing the Perenniporia tephropora GH6 cellobiohydrolase II yielded similar cellulose conversion at 50℃ and lower cellulose conversion at 55℃ and 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II. The cellulase enzyme composition containing the Penicillium adametzii GH6 cellobiohydrolase II yielded slightly higher cellulose conversion at 50℃ and lower cellulose conversion at 55℃ and 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH6 cellobiohydrolase II.
Table 4. Comparison of the effect of Macrophomina phaseolina CBHII, Neosartorya massa CBHII, Perenniporia tephropora CBHII, and Penicillium adametzii CBHII to Talaromyces leycettanus CBHII on the hydrolysis of pretreated wheat straw (PWS) by a cellulase enzyme composition.
Figure PCTCN2019076319-appb-000098
Example 17: Comparison of the effect of Talaromyces verruculosus, Penicillium viticola, and Penicillium wellingtonense against Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I on the hydrolysis of unwashed PWS by a cellulase enzyme composition
The GH7 CBHI enzymes from Talaromyces verruculosus, Penicillium viticola, and Penicillium wellingtonense (Example 7) were added to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase I (Example 15) and compared to the Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I (Example 14) added to the cellulolytic enzyme composition without cellobiohydrolase I using PWS as substrate (Example 9) at 50℃, 55℃, and 60℃. Each cellobiohydrolase I was added individually at 1.95 mg enzyme protein per g cellulose to 5.21 mg enzyme protein of the cellulase enzyme composition without cellobiohydrolase I per g cellulose. Hydrolysis was performed at pH 5.0 for 72 hours according to Example 9.
The results shown in Table 5 demonstrated that the cellulase enzyme composition  containing the Talaromyces verruculosus GH7 cellobiohydrolase I yielded significantly higher cellulose conversion at 50℃, higher cellulose conversion at 55℃, and similar cellulose conversion at 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I. The cellulase enzyme composition containing the Penicillium viticola GH7 cellobiohydrolase I yielded slightly higher cellulose conversion at 50℃ and lower cellulose conversion at 55℃ and 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I. The cellulase enzyme composition containing the Penicillium wellingtonense GH7 cellobiohydrolase I yielded lower cellulose conversion at 50℃, and significantly lower cellulose conversion at 55℃ and 60℃ compared to the cellulase enzyme composition containing the Talaromyces leycettanus GH7 cellobiohydrolase I.
Table 5. Comparison of the effect of Talaromyces verruculosus CBHI, Penicillium viticola CBHI, and Penicillium wellingtonense CBHI to Talaromyces leycettanus CBHII on the hydrolysis of pretreated wheat straw (PWS) by a cellulase enzyme composition.
Figure PCTCN2019076319-appb-000099
The present invention is further described by the following numbered paragraphs:
Paragraph 1. An isolated or purified polypeptide having cellobiohydrolase activity, selected from the group consisting of:
(a) a polypeptide having at least 75%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 14;
(b) a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9,  SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, orSEQ ID NO: 17, or the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11;
(c) a polypeptide encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or SEQ ID NO: 13;
(d) a variant of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions; and
(e) a fragment of the polypeptide of (a) , (b) , (c) , or (d) that has cellobiohydrolase activity;
wherein the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the mature polypeptide of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
Paragraph 2. The polypeptide of paragraph 1, having at least 75%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2; at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 16; at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6; at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to the mature  polypeptide of SEQ ID NO: 12; at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 18; or at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 14.
Paragraph 3. The polypeptide of paragraph 1 or 2, which is encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17, or the cDNAsequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, orSEQ ID NO: 11.
Paragraph 4. The polypeptide of any one of paragraphs 1-3, which is encoded by a polynucleotide having at least 75%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, SEQ ID NO: 9 or the eDNA sequence thereof, or SEQ ID NO: 15; at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 5 or the eDNA sequence thereof; at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 17; or at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or SEQ ID NO: 13.
Paragraph 5. The polypeptide of any one of paragraphs 1-4, comprising, consisting essentially of, or consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, orSEQ ID NO: 18 or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18.
Paragraph 6. The polypeptide of any one of paragraphs 1-4, which is a variant of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID  NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions.
Paragraph 7. The polypeptide of any one of paragraphs 1-6, which is a fragment of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18, wherein the fragment has cellobiohydrolase activity.
Paragraph 8. An isolated or purified polypeptide comprising a catalytic domain selected from the group consisting of:
(a) a catalytic domain having at least 75%sequence identity to amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14;
(b) a catalytic domain encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17;
(c) a catalytic domain encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence identity to nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13;
(d) a variant of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO:  8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions; and
(e) a fragment of the catalytic domain of (a) , (b) , (c) , or (d) that has cellobiohydrolase activity;
wherein the catalytic domain of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the catalytic domain of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
Paragraph 9. The polypeptide of paragraph 8, further comprising a carbohydrate binding module.
Paragraph 10. The polypeptide of paragraph 8 or 9, wherein the catalytic domain has at least 75%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2; at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16; at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6; at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12; at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14.
Paragraph 11. The polypeptide of any one of paragraphs 8-10, wherein the catalytic domain is encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO:  9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17.
Paragraph 12. The polypeptide of any one of paragraphs 8-11, wherein the catalytic domain is encoded by a polynucleotide having at least 75%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15; at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13.
Paragraph 13. The polypeptide of any one of paragraphs 8-12, wherein the catalytic domain comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18.
Paragraph 14. The polypeptide of any one of paragraphs 8-12, wherein the catalytic domain is a variant of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions.
Paragraph 15. The polypeptide of any one of paragraphs 8-14, wherein the catalytic domain is a fragment of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18, wherein the fragment has cellobiohydrolase activity.
Paragraph 16. An isolated or purified polypeptide comprising a carbohydrate binding module operably linked to a catalytic domain, wherein the carbohydrate binding module is selected from the group consisting of:
(a) a carbohydrate binding module having at least 75%sequence identity to amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14;
(b) a carbohydrate binding module encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17;
(c) a carbohydrate binding module encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence identity to nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13;
(d) a variant of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of  SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions; and
(e) a fragment of the carbohydrate binding module of (a) , (b) , (c) , or (d) that has carbohydrate binding activity.
Paragraph 17. The polypeptide of paragraph 16, wherein the catalytic domain is obtained from a hydrolase, isomerase, ligase, lyase, oxidoreductase, or transferase, e.g., an aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycosyltransferase, deoxyribonuclease, endoglucanase, esterase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamylase, alpha-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, pectinolytic enzyme, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, proteolytic enzyme, ribonuclease, transglutaminase, xylanase, or beta-xylosidase.
Paragraph 18. The polypeptide of paragraph 16 or 17, wherein the carbohydrate binding module has at least 75%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2; at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16; at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6; at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12; at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14.
Paragraph 19. The polypeptide of any one of paragraphs 16-18, wherein the carbohydrate binding module is encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO:  1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17.
Paragraph 20. The polypeptide of any one of paragraphs 16-19, wherein the carbohydrate binding module is encoded by a polynucleotide having at least 75%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15; at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13.
Paragraph 21. The polypeptide of any one of paragraphs 16-20, wherein the carbohydrate binding module comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18.
Paragraph 22. The polypeptide of any one of paragraphs 16-20, wherein the carbohydrate binding module is a variant of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57  of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions.
Paragraph 23. The polypeptide of any one of paragraphs 16-22, wherein the carbohydrate binding module is a fragment of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18, wherein the fragment has carbohydrate binding module activity.
Paragraph 24. A fusion polypeptide comprising the polypeptide of any one of paragraphs 1-23 and a second polypeptide.
Paragraph 25. A composition comprising the polypeptide of any one of paragraphs 1-24.
Paragraph 26. An isolated or purified polynucleotide encoding the polypeptide of any one of paragraphs 1-24.
Paragraph 27. A nucleic acid construct or expression vector comprising the polynucleotide of paragraph 26, wherein the polynucleotide is operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide in an expression host.
Paragraph 28. A recombinant host cell comprising the polynucleotide of paragraph 26 operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide.
Paragraph 29. The recombinant host cell of paragraph 28, wherein the polypeptide is heterologous to the recombinant host cell.
Paragraph 30. The recombinant host cell of paragraph 28 or 29, wherein at least one of the one or more control sequences is heterologous to the polynucleotide encoding the polypeptide.
Paragraph 31. The recombinant host cell of any one of paragraphs 28-30, which comprises at least two copies, e.g., three, four, or five, of the polynucleotide of paragraph 26.
Paragraph 32. The recombinant host cell of any one of paragraphs 28-31, which is a yeast recombinant host cell, e.g., a Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, or Yarrowia cell, such as a Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, or Yarrowia lipolytica cell.
Paragraph 33. The recombinant host cell of any one of paragraphs 28-31, which is a filamentous fungal recombinant host cell, e.g., an Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, or Trichoderma cell, in particular, an Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Talaromyces emersonii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, or Trichoderma viride cell.
Paragraph 34. The recombinant host cell of any one of paragraphs 28-31, which is a prokaryotic recombinant host cell, e.g., a Gram-positive cell selected from the group consisting of Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, or Streptomyces cells, or a Gram-negative bacteria selected from the group consisting of Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, and Ureaplasma cells, such as Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, and Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces  coelicolor, Streptomyces griseus, and Streptomyces lividans cells.
Paragraph 35. A method of producing the polypeptide of any one of paragraphs 1-24, comprising cultivating a cell, which in its wild-type form produces the polypeptide, under conditions conducive for production of the polypeptide.
Paragraph 36. The method of paragraph 35, further comprising recovering the polypeptide.
Paragraph 37. A method of producing a polypeptide having cellobiohydrolase activity, comprising cultivating the recombinant host cell of any one of paragraphs 28-34 under conditions conducive for production of the polypeptide.
Paragraph 38. The method of paragraph 37, further comprising recovering the polypeptide.
Paragraph 39. A transgenic plant, plant part or plant cell transformed with the polynucleotide of paragraph 28.
Paragraph 40. A method of producing a polypeptide having cellobiohydrolase activity, comprising cultivating the transgenic plant or plant cell of paragraph 39 under conditions conducive for production of the polypeptide.
Paragraph 41. The method of paragraph 40, further comprising recovering the polypeptide.
Paragraph 42. A method of producing a mutant of a parent cell, comprising inactivating a polynucleotide encoding the polypeptide of any one of paragraphs 1-24, which results in the mutant producing less of the polypeptide than the parent cell.
Paragraph 43. A mutant cell produced by the method of paragraph 42.
Paragraph 44. The mutant cell of paragraph 43, further comprising a gene encoding a native or heterologous protein.
Paragraph 45. A method of producing a protein, comprising cultivating the mutant cell of paragraph 43 or 44 under conditions conducive for production of the protein.
Paragraph 46. The method of paragraph 45, further comprising recovering the protein.
Paragraph 47. An isolated or purified polynucleotide encoding a signal peptide comprising or consisting of amino acids 1 to 19 of SEQ ID NO: 2, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 4, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 6, amino acids 1 to 19 of SEQ ID NO: 8, amino acids 1 to 20 of SEQ ID NO: 10, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 12, amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 14, amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 18, which is operably linked to a polynucleotide encoding a polypeptide which is heterologous to the signal peptide.
Paragraph 48. A nucleic acid construct or expression vector comprising the  polynucleotide of paragraph 47.
Paragraph 49. A recombinant host cell comprising the nucleic acid construct or expression vector of paragraph 48.
Paragraph 50. A method of producing a protein, comprising cultivating the recombinant host cell of paragraph 49 under conditions conducive for production of the protein.
Paragraph 51. The method of paragraph 50, further comprising recovering the protein.
Paragraph 52. A whole broth formulation or cell culture composition comprising the polypeptide of any one of paragraphs 1-24.
Paragraph 53. A process for degrading a cellulosic material, comprising: treating the cellulosic material with an enzyme composition comprising the polypeptide having cellobiohydrolase activity of any one of paragraphs 1-24.
Paragraph 54. The process of paragraph 53, wherein the cellulosic material is pretreated.
Paragraph 55. The process of paragraph 53 or 54, wherein the enzyme composition further comprises one or more enzymes selected from the group consisting of a cellulase, an AA9 polypeptide, a hemicellulase, a cellulose inducible protein (CIP) , an esterase, an expansin, a ligninolytic enzyme, an oxidoreductase, a pectinase, a protease, and a swollenin.
Paragraph 56. The process of paragraph 55, wherein the cellulase is one or more enzymes selected from the group consisting of an endoglucanase, a cellobiohydrolase, and a beta-glucosidase.
Paragraph 57. The process of paragraph 55, wherein the hemicellulase is one or more enzymes selected from the group consisting of a xylanase, an acetylxylan esterase, a feruloyl esterase, an arabinofuranosidase, a xylosidase, and a glucuronidase.
Paragraph 58. The process of any one of paragraphs 53-57, further comprising recovering the degraded cellulosic material.
Paragraph 59. The process of paragraph 58, wherein the degraded cellulosic material is a sugar.
Paragraph 60. The process of paragraph 59, wherein the sugar is selected from the group consisting of glucose, xylose, mannose, galactose, and arabinose.
Paragraph 61. A process for producing a fermentation product, comprising:
(a) saccharifying a cellulosic material with an enzyme composition comprising the polypeptide having cellobiohydrolase activity of any one of paragraphs 1-24;
(b) fermenting the saccharified cellulosic material with one or more fermenting microorganisms to produce the fermentation product; and
(c) recovering the fermentation product from the fermentation.
Paragraph 62. The process of paragraph 61, wherein the cellulosic material is pretreated.
Paragraph 63. The process of paragraph 61 or 62, wherein the enzyme composition further comprises one or more enzymes selected from the group consisting of a cellulase, an AA9 polypeptide, a hemicellulase, a CIP, an esterase, an expansin, a ligninolytic enzyme, an oxidoreductase, a pectinase, a protease, and a swollenin.
Paragraph 64. The process of paragraph 63, wherein the cellulase is one or more enzymes selected from the group consisting of an endoglucanase, a cellobiohydrolase, and a beta-glucosidase.
Paragraph 65. The process of paragraph 63, wherein the hemicellulase is one or more enzymes selected from the group consisting of a xylanase, an acetylxylan esterase, a feruloyl esterase, an arabinofuranosidase, a xylosidase, and a glucuronidase.
Paragraph 66. The process of any one of paragraphs 61-65, wherein steps (a) and (b) are performed simultaneously in a simultaneous saccharification and fermentation.
Paragraph 67. The process of any one of paragraphs 61-66, wherein the fermentation product is an alcohol, an alkane, a cycloalkane, an alkene, an amino acid, a gas, isoprene, a ketone, an organic acid, or polyketide.
Paragraph 68. A process of fermenting a cellulosic material, comprising: fermenting the cellulosic material with one or more fermenting microorganisms, wherein the cellulosic material is saccharified with an enzyme composition comprising the polypeptide having cellobiohydrolase activity of any one of paragraphs 1-24.
Paragraph 69. The process of paragraph 68, wherein the fermenting of the cellulosic material produces a fermentation product.
Paragraph 70. The process of paragraph 69, further comprising recovering the fermentation product from the fermentation.
Paragraph 71. The process of paragraph 69 or 70, wherein the fermentation product is an alcohol, an alkane, a cycloalkane, an alkene, an amino acid, a gas, isoprene, a ketone, an organic acid, or polyketide.
Paragraph 72. The process of any one of paragraphs 68-71, wherein the cellulosic material is pretreated before saccharification.
Paragraph 73. The process of any one of paragraphs 68-72, wherein the enzyme composition further comprises one or more enzymes selected from the group consisting of a cellulase, an AA9 polypeptide, a hemicellulase, a CIP, an esterase, an expansin, a ligninolytic enzyme, an oxidoreductase, a pectinase, a protease, and a swollenin.
Paragraph 74. The process of paragraph 73, wherein the cellulase is one or more  enzymes selected from the group consisting of an endoglucanase, a cellobiohydrolase, and a beta-glucosidase.
Paragraph 75. The process of paragraph 73, wherein the hemicellulase is one or more enzymes selected from the group consisting of a xylanase, an acetylxylan esterase, a feruloyl esterase, an arabinofuranosidase, a xylosidase, and a glucuronidase.
The invention described and claimed herein is not to be limited in scope by the specific aspects herein disclosed, since these aspects are intended as illustrations of several aspects of the invention. Any equivalent aspects are intended to be within the scope of this invention. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims. In the case of conflict, the present disclosure including definitions will control.

Claims (20)

  1. An isolated or purified polypeptide having cellobiohydrolase activity, selected from the group consisting of:
    (a) a polypeptide having at least 75%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 14;
    (b) a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, orSEQ ID NO: 17, orthe cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11;
    (c) a polypeptide encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 5 or the eDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence identity to the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or SEQ ID NO: 13;
    (d) a variant of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions; and
    (e) a fragment of the polypeptide of (a) , (b) , (c) , or (d) that has cellobiohydrolase activity;
    wherein the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ  ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the mature polypeptide of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
  2. The polypeptide of claim 1, comprising, consisting essentially of, or consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18 or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18.
  3. An isolated or purified polypeptide comprising a catalytic domain selected from the group consisting of:
    (a) a catalytic domain having at least 75%sequence identity to amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14;
    (b) a catalytic domain encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17;
    (c) a catalytic domain encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to nucleotides 378 to 1560 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to nucleotides 448 to 1741 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 405 to 1532 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 76 to 1389 of SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to nucleotides 381 to 1580 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to nucleotides 407 to 1814 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to nucleotides 76 to 1386 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence  identity to nucleotides 375 to 1689 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 76 to 1374 of SEQ ID NO: 13;
    (d) a variant of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions; and
    (e) a fragment of the catalytic domain of (a) , (b) , (c) , or (d) that has cellobiohydrolase activity;
    wherein the catalytic domain of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 has cellobiohydrolase II activity and the catalytic domain of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 18 has cellobiohydrolase I activity.
  4. The polypeptide of claim 3, further comprising a carbohydrate binding module.
  5. The polypeptide of claim 3 or 4, wherein the catalytic domain comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 92 to 450 of SEQ ID NO: 2, amino acids 108 to 470 of SEQ ID NO: 4, amino acids 92 to 451 of SEQ ID NO: 6, amino acids 93 to 450 of SEQ ID NO: 8, amino acids 98 to 452 of SEQ ID NO: 10, amino acids 99 to 456 of SEQ ID NO: 12, amino acids 26 to 458 of SEQ ID NO: 14, amino acids 26 to 463 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 26 to 462 of SEQ ID NO: 18.
  6. An isolated or purified polypeptide comprising a carbohydrate binding module operably linked to a catalytic domain, wherein the carbohydrate binding module is selected from the group consisting of:
    (a) a carbohydrate binding module having at least 75%sequence identity to amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2; at least 85%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16; at least 90%sequence identity to amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6; at least 91%sequence identity to amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12; at least 96%sequence identity to or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18; or at least 98%sequence identity to amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8 or amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14;
    (b) a carbohydrate binding module encoded by a polynucleotide that hybridizes  under very high stringency conditions with the full-length complement of nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13, nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15, or nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17;
    (c) a carbohydrate binding module encoded by a polynucleotide having at least 75%sequence identity to nucleotides 58 to 272 of SEQ ID NO: 1 or the cDNA sequence thereof; at least 85%sequence identity to nucleotides 55 to 291 of SEQ ID NO: 3 or the cDNA sequence thereof, nucleotides 61 to 284 of SEQ ID NO: 9 or the cDNA sequence thereof, or nucleotides 1522 to 1629 of SEQ ID NO: 15; at least 90%sequence identity to nucleotides 55 to 272 of SEQ ID NO: 5 or the cDNA sequence thereof; at least 91%sequence identity to nucleotides 55 to 274 of SEQ ID NO: 11 or the cDNA sequence thereof; at least 96%sequence identity to nucleotides 1534 to 1641 of SEQ ID NO: 17; or at least 98%sequence identity to nucleotides 58 to 269 of SEQ ID NO: 7 or the cDNA sequence thereof or nucleotides 1459 to 1569 of SEQ ID NO: 13;
    (d) a variant of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18 comprising a substitution, deletion, and/or insertion at one or more positions; and
    (e) a fragment of the carbohydrate binding module of (a) , (b) , (c) , or (d) that has carbohydrate binding activity.
  7. The polypeptide of claim 6, wherein the carbohydrate binding module comprises, consists essentially of, or consists of amino acids 20 to 56 of SEQ ID NO: 2, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 4, amino acids 19 to 55 of SEQ ID NO: 6, amino acids 20 to 57 of SEQ ID NO: 8, amino acids 21 to 57 of SEQ ID NO: 10, amino acids 19 to 54 of SEQ ID NO: 12, amino acids 487 to 523 of SEQ ID NO: 14, amino acids 508 to 543 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 512 to 547 of SEQ ID NO: 18.
  8. A composition, whole broth formulation, or cell culture composition comprising the polypeptide of any one of claims 1-7.
  9. An isolated or purified polynucleotide encoding the polypeptide of any one of claims 1-7.
  10. A recombinant host cell comprising the polynucleotide of claim 9 operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide.
  11. A method of producing the polypeptide of any one of claims 1-7, comprising (a) cultivating a cell, which in its wild-type form produces the polypeptide, under conditions conducive for production of the polypeptide, and optionally (b) recovering the polypeptide.
  12. A method of producing a polypeptide having cellobiohydrolase activity, comprising (a) cultivating the recombinant host cell of claim 10 under conditions conducive for production of the polypeptide, and optionally (b) recovering the polypeptide.
  13. A transgenic plant, plant part or plant cell transformed with the polynucleotide of claim 9.
  14. A method of producing a polypeptide having cellobiohydrolase activity, comprising (a) cultivating the transgenic plant or plant cell of claim 13 under conditions conducive for production of the polypeptide, and optionally (b) recovering the polypeptide.
  15. A method of producing a mutant of a parent cell, comprising inactivating a polynucleotide encoding the polypeptide of any one of claims 1-7, which results in the mutant producing less of the polypeptide than the parent cell.
  16. An isolated or purified polynucleotide encoding a signal peptide comprising or consisting of amino acids 1 to 19 of SEQ ID NO: 2, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 4, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 6, amino acids 1 to 19 of SEQ ID NO: 8, amino acids 1 to 20 of SEQ ID NO: 10, amino acids 1 to 18 of SEQ ID NO: 12, amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 14, amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 16, or amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 18, which is operably linked to a polynucleotide encoding a polypeptide which is heterologous to the signal peptide.
  17. A process for degrading a cellulosic material, comprising: treating the cellulosic material with an enzyme composition comprising the polypeptide having cellobiohydrolase  activity of any one of claims 1-7.
  18. A process for producing a fermentation product, comprising:
    (a) saccharifying a cellulosic material with an enzyme composition comprising the polypeptide having cellobiohydrolase activity of any one of claims 1-7;
    (b) fermenting the saccharified cellulosic material with one or more fermenting microorganisms to produce the fermentation product; and
    (c) recovering the fermentation product from the fermentation.
  19. A process of fermenting a cellulosic material, comprising: fermenting the cellulosic material with one or more fermenting microorganisms, wherein the cellulosic material is saccharified with an enzyme composition comprising the polypeptide having cellobiohydrolase activity of any one of claims 1-7.
  20. The process of any one of claims 17-19, wherein the enzyme composition further comprises one or more enzymes selected from the group consisting of a cellulase, an AA9 polypeptide, a hemicellulase, a CIP, an esterase, an expansin, a ligninolytic enzyme, an oxidoreductase, a pectinase, a protease, and a swollenin.
PCT/CN2019/076319 2018-02-28 2019-02-27 Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same WO2019165973A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2018/077569 2018-02-28
CN2018077569 2018-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019165973A1 true WO2019165973A1 (en) 2019-09-06

Family

ID=67805626

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2019/076319 WO2019165973A1 (en) 2018-02-28 2019-02-27 Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2019165973A1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103998605A (en) * 2011-12-20 2014-08-20 诺维信股份有限公司 Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103998605A (en) * 2011-12-20 2014-08-20 诺维信股份有限公司 Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PROTEIN 12 July 2017 (2017-07-12), "Cellobiohydrolase, putative [Aspergillus fischeri NRRL 181]", XP055634723, retrieved from NCBI Database accession no. XP_001258843 *
DATABASE PROTEIN 20 January 2015 (2015-01-20), "cellobiohydrolase I Cel7A [Talaromyces cellulolyticus]", XP055634758, retrieved from NCBI Database accession no. GAM33347 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11208641B2 (en) Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US10017755B2 (en) Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US9714417B2 (en) Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP3433358B1 (en) Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US10479984B2 (en) Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US10577594B2 (en) Polypeptides having arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding same
US20220025348A1 (en) Polypeptides Having Xylanase Activity And Polynucleotides Encoding Same
US20170369860A1 (en) Endoglucanase Variants and Polynucleotides Encoding Same
US11053489B2 (en) Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US10519520B2 (en) Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2019165973A1 (en) Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US20200087645A1 (en) Polypeptides Having Xylanase Activity And Polynucleotides Encoding Same
WO2018026868A1 (en) Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2017205535A1 (en) Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US20180216089A1 (en) Polypeptides Having Beta-Xylosidase Activity And Polynucleotides Encoding Same
US20160208301A1 (en) Polypeptides Having Xylanase Activity And Polynucleotides Encoding Same
EP3237633A2 (en) Endoglucanase variants and polynucleotides encoding same

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19761553

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19761553

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1