CN102994475A - α淀粉酶及表达α淀粉酶的重组菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种α淀粉酶及表达α淀粉酶的重组菌株，所述的α淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1。用于表达α淀粉酶的黑曲霉P11，其保藏编号为CGMCC No.6513。本发明所得到的重组菌种能够表达棒曲霉α淀粉酶AclaP11，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的淀粉酶的酶活力。同时，所得重组α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了AclaP11的应用领域。

Description

α淀粉酶及表达α淀粉酶的重组菌株

技术领域

本发明属于淀粉酶的分离表达技术领域，具体涉及一种来源于棒曲霉(Aspergillus clavatus)的α淀粉酶，以及该α淀粉酶在丝状真菌宿主细胞(诸如黑曲霉(Aspergillus niger)中的异源表达。 

背景技术

α淀粉酶(E.C.3.2.1.1)能够催化寡糖和多糖中的1,4-α-糖苷键的内水解，其以随机的方式作用于淀粉、糖原以及相关多糖和寡糖，释放出α构型的还原基团。目前α淀粉酶广泛的用于多种工业用途，例如烘焙糕点、酿酒、玉米浆和乙醇生产以及醋发酵等领域。 

α淀粉酶的来源非常广泛，可以从动物、植物和微生物中分离出来。其中微生物来源的淀粉酶具有来源丰富、性能多样和易于工业化生产的特点，可满足多种工业应用需求，在工业上的应用也最为广泛。在现代工业的淀粉质处理过程中，微生物淀粉酶的水解方法已经彻底取代传统的化学水解方法。虽然有多种微生物可以产生α淀粉酶，包括丝状真菌、酵母、细菌和放线菌等。但是，目前能够满足工业应用需求的α淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌，细菌α淀粉酶通常来源于芽孢杆菌属(Bacillus)，真菌α淀粉酶通常来源于曲霉菌属(Aspergillus)。其中由真菌产生的α淀粉酶即称为真菌α淀粉酶。 

在目前已报道的文献中，可以粗略的按酶学性质或作用条件将真菌α淀粉酶分为3种类型：(1)中性真菌α淀粉酶：与细菌α淀粉酶不同，真菌α淀粉酶的来源相对较少，大多数真菌α淀粉酶的作用温度和pH都比较温和，如最适作用pH在5.0～5.5之间，最适作用温度为50～55℃左右，当温度超过60℃酶开始失活。目前商品化生产最多、应用也最为广泛的来源于米曲霉(变种)的α淀粉酶即属于这一酶种。(2)耐热或耐酸性真菌α淀粉酶：此类酶在pH 2.5～4.5之间，作用温度在超过60℃时仍具有良好的热稳定性。与中性真菌α淀粉酶相比，耐热或耐酸性真菌α淀粉酶可以简化液化、糖化过程，减少制糖等淀粉深加工过程中染菌几率并降低相应生产成本。这部分酶种目前工业上已经开始生产使用，且具有很大的开发利用潜力。(3)具有生淀粉酶活力的真菌：α淀粉酶该酶种除具有水解可溶性淀粉或其他糊化淀粉能力外，还具有生淀粉水解能力，在生料酒精行业的同步糖化发酵(SSF)中，与糖化酶配合使用，可以大幅度提高淀粉的利用速率和效率，并有效提高酒精产率。 

已报道有多种α淀粉酶基因在不同宿主中得到表达，其中真菌α淀粉酶基 因的异源表达主要集中在真核表达系统。与原核表达系统(如大肠杆菌表达系统或芽孢杆菌表达系统等)相比，真核表达系统在表达真核来源的异源蛋白时具有很大的优势，如翻译后加工修饰(如糖基化、二硫键的形成)、内含子的识别、信号肽的剪除和肽链的正确折叠与分泌等。此外，有多种真菌表达系统被美国FDA列为GRAS(generally recognized as safe)菌株，使得对一些食品或医药用异源蛋白的生产和应用更易获得相关机构的认可和批准。 

目前，有大量来自曲霉属（Aspergillus）的α淀粉酶已经被报道并用于工业生产，但是仅有极少数文献报道来源于棒曲霉(A.clavatus)α淀粉酶。本发明从棒曲霉中克隆得到了一种α淀粉酶，并在黑曲霉中克隆表达，且酶活力大大高于其在野生型中的酶活。另外，由于棒曲霉被认为是有毒菌株，而黑曲霉则被认为是安全菌（GRAS），因此本发明扩大棒曲霉的应用范围（如食品领域）。 

发明内容

本发明的目的是提供一种α淀粉酶及表达α淀粉酶的菌株，以弥补现有技术的不足。 

本发明筛选出的α淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其一种编码mRNA序列为SEQ ID NO:2。 

在第二个方面，本发明涉及酶组合物，其包含上述的α淀粉酶。 

本发明另一个方面涉及用于表达上述α淀粉酶的曲霉菌株； 

一种表达α淀粉酶的黑曲霉（Aspergillus niger）P11菌株，已于2012年9月4日保存在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC No.6513。 

本发明所得到的重组菌种能够表达棒曲霉α淀粉酶AclaP11，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活（AclaP11在野生菌种无可检测到的酶活），且高于宿主菌黑曲霉自身表达的淀粉酶的酶活力。同时，所得重组α淀粉酶是由食品安全菌（GRAS）黑曲霉分泌所得，扩大了AclaP11的应用领域。 

附图说明

图1：本发明使用的pGm质粒图谱； 

图2：蛋白SDS-PAGE凝胶图，显示了黑曲霉转化子的AclaP11的表达情况，以及野生菌和宿主菌黑曲霉G1的蛋白表达情况，其中泳道1所示为蛋白标准分子量标记，由左至右为116.0kD，66.2kD，45kD和35kD；泳道2所示为黑曲霉宿主G1在发酵5d后的蛋白表达情况；泳道3所示为野生菌的蛋白表达情况，其无可检测到的蛋白表达。所示为泳道4AclaP11淀粉酶表达情况，在55kDa处可以看到清晰蛋白条带。 

图3：黑曲霉转化子表达的AclaP11的pH稳定性； 

图4：黑曲霉转化子表达的AclaP11的温度稳定性。 

具体实施方式

本发明用到了在遗传工程和分子生物学领域中常用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)等参考书中所记载的技术。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，本领域的普通技术人员可以选用已公开的技术来实施本发明实施例中记载的方案。 

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，3nd Ed.(Singleton et al.,2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale et al.,2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释，具体如下： 

如本文所用，术语“淀粉”指植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何物质，包括具有(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数字。具体而言，该术语指任何基于植物的物质，包括但不限于谷物、草、块茎和根，更具体而言，小麦、燕麦、玉米、黑麦、稻、高粱、糠、木薯、粟、马铃薯和甘薯。 

如本文所用，术语“α淀粉酶”指催化1,4-α-糖苷键水解的酶。这些酶也被描述为在含有1,4-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖中完成1,4-α-D-糖苷键的外切或内切水解的酶。另一个用于描述这些酶的术语是“糖原酶(glycogenase)”。 

如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体是，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰，或者所述细胞来自于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因，但这些基因异常表达、表达不足或者完全不表达。 

如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。 

如本文所用，术语“信号序列”表示结合与蛋白质N-末端部分的氨基酸序列，其促进成熟形式的蛋白质分泌至细胞外。信号序列的定义是一种功能性定义。成熟形式的胞外蛋白缺少信号序列，其在分泌过程中被切除。 

如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。 

如本文所用，术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。 

除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。 

如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。 

如本文所用，术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。 

如本文所用，术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。 

如本文所用，术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。 

如本文所用，当描述蛋白或编码它们的基因是，用于该基因的术语一般用斜体表示(例如编码AclaP11淀粉酶的基因可以表示为AclaP11)。用于蛋白的术语一般不用斜体表示(例如，由AclaP11基因编码的淀粉酶可以表示为AclaP11)。 

如本文所用，术语“来源(derived)”涵盖了术语“源自(originated from)”、“获得(obtained)”、“可获得自(obtainable from)”以及“分离自(isolated from)”，且如本文所用，其表示由核苷酸序列编码的多肽由天然存在该核苷酸的细胞或者已被插入该核苷酸序列的细胞产生。 

如本文所用，术语“可操纵的连接(operably linked)”至并列关系，其中原件允许它们在功能上相互关联的方式排布。例如。如果启动子控制某序列的转录，则该启动子被可操纵地连接于该编码序列。 

如本文所用，术语“选择性标记(selective marker)”指能够在宿主中表达的基因，其使得能够方便地选择那些含导入的核酸或载体的宿主。 

与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，当被连配时，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。所述连配以及同源性或同一性百分比可以用本领域已知的任何合适的软件程序确定，例如BLAST (Altschul et al.Basic local alignment search tool.Journal of Molecular Biology,1990,215(3):403-410)。由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。 

如本文所用，术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码α淀粉酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。 

如本文所用，术语“丝状真菌”指所有丝状形式的真菌亚门生物(参见INTRODUCTORY MYCOLOGY，4th Ed.(Alexopoulos,2007)和AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI,10th Ed.(Kirk et al.,2008))。这些真菌的特征是带有由几丁质、纤维素和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明所述的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延伸来完成的，碳代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲代细胞可以使，但不限于，曲霉属某种(Aspergillus sp.)(例如棒曲霉(A.clavatus)、烟曲霉(A.fumigatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黄曲霉(A.flavus)，土曲霉(A.terreus)和米曲霉(A.oryzae))、青霉属某种(Penicillium sp.)(例如产黄青霉(P.chrysogenum))、新萨托菌属某种(Neosartorya sp.)(例如费希新萨托菌(N.fischeri))、粘帚霉菌属某种(Gliocladium sp.)(例如粉红粘帚霉(G.roseum))、木霉属某种(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei)、绿色木霉(T.viride)、康宁木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum))、腐质霉属某种(Humicola sp.)(例如特异腐质霉(H.insolens)和灰腐质霉(H.grisea))、金孢霉属某种(Chrysosporium sp.)、镰刀菌属某种(Fusarium sp.)、脉孢霉属某种(Neurospora sp.)、肉座菌属某种(Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种(Emericella sp.)的细胞。 

如本文所用，术语“曲霉”或“曲霉属某种”指以前或目前被分类为曲霉属的任何真菌属。 

如本文所用，术语“培养”指使一群微生物细胞在适当条件下在液体或固体培养基中生长。 

如本文所用，有关多核苷酸或蛋白质的术语“异源”指在宿主细胞中并非天然存在的多核苷酸或蛋白质。该术语意图包含由天然发生的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。 

如本文所用，有关多核苷酸或蛋白质的术语“内源”至在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。 

如本文所用，有关细胞所用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”表示该细胞含有非天然的(例如异源的)核酸序列，所述核酸序列被整合入其基因组或者作为被保持多代的附加体质粒。 

在关于将核酸序列中插入细胞中的上下文中，术语“导入”表示“转染”、“转化”或“转导”，包括表示将核酸序列整合入真核或原核细胞，其中该核酸序列可以被整合入该细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转变成自发复制子或者被瞬时表达(例如转染的mRNA)。 

如本文所用，术语“酶活力单位”指在特定条件下每给定的时间内产生给定量的产物的酶量。在一些实施方式中，术语“淀粉酶活力单位”(CU)被定义为在给定的温度及pH条件下，在过量热稳定性α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)存在的条件下，每分钟从non-reducing-end blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside(BPNPG7)底物中释放1微摩尔对硝基苯酚(p-nitrophenol)所需的酶量。 

“CGMCC”指中国普通微生物菌种保藏管理中心，北京100101，中国， 

“ATCC”指美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA 20108，USA， 

“NRRL”美国北方农业研究所培养物保藏中心，Peoria，IL 61604，USA， 

重组表达的酶和宿主细胞：

在本发明的一些实施方式中，微生物被遗传改造以表达异源α淀粉酶，优选的宿主细胞是丝状真菌细胞。 

一些优选的真菌宿主细胞包括构巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本木霉(A.japonicus)、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和茄腐镰刀菌(F.solani)。 

在一些实施方式中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属某种的菌株。有用的曲霉宿主菌株包括但不限于构巢曲霉(Yelton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81:1470-1474;Mullaney et al.,Mol.Gen.Genet.,1985,199:37-45;Johnstone et al.EMBO J.,1985,4:1307-1311)；黑曲霉(Kelly et al.,EMBO J.，1985,4:475-479)；泡盛曲霉(NRRL 3112、UVK 143f(USP 5364770)、ATCC 22342、ATCC 44733和ATCC 14331)和米曲霉(ATCC 11490)。在进一步的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是黑曲霉菌株。 

当下面的描述特别提及α淀粉酶时诸如AclaP11，本领域的技术人员将容易理解，相同或相似的方法适用于可用于将分别编码其它的α淀粉酶的多核苷酸导入宿主细胞的DNA构建物和载体。 

根据本发明，包含编码α淀粉酶(诸如AawaP2)的核酸的DNA构建物被构建以便导入宿主细胞。在一些实施方式中，通过表达载体将DNA构建物导入宿主细胞，所述表达载体包括可操纵地连接于α淀粉酶(诸如AclaP11)编码序列的调控序列。 

载体可以是当被导入真菌宿主细胞是被整合进宿主细胞基因组并被复制的 任何载体。参考Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSG，<www.fgsc.net>)的载体列表。 

在一些实施方式中，编码α淀粉酶(AclaP11)的核酸被可操纵的连接于合适的启动子，该启动子在真菌宿主细胞中表现出转录活性。该启动子可以来源于编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白的基因。优选地，启动子是在曲霉宿主中有用的。有用的启动子的非限制性实例包括来源于编码泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)(Nunberg et al.,Mol.Cell Biol.,1984,4:2306-2315;USP 5364770;USP 6590078;Gwynne et al.,Nat.Biotechnol.,1987,5:713-719;Boel et al.,EMBO J.,1984,3:1581-1585)、黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶和黑曲霉中性α淀粉酶基因的启动子。在进一步的实施方式中，启动子是编码黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子。 

在一些实施方式中，α淀粉酶(AclaP11)的编码序列可操纵的连接于信号序列。编码信号序列的DNA优选地与将被表达的基因天然相关。在进一步的实施方式中，与α淀粉酶编码序列相连接的信号序列由编码α淀粉酶的基因编码(例如，AclaP11的信号序列由AclaP11基因编码)。 

在一些实施方式中，表达载体也包括终止序列。有用的终止子的非限制性实例包括编码黑曲霉、塔宾曲霉(A.tubingensis)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子(Nunberg et al.,Mol.Cell Biol.,1984,4:2306-2315和Boel et al.,EMBO J.,1984,3:1581-1585)。在进一步的实施方式中，终止序列是编码塔宾曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子。 

在一些实施方式中，表达载体包括选择性标记。优选的选择性标记的实例包括但不限于赋予抗微生物剂耐性的标记(例如潮霉素、博来霉素、氯霉素和腐草霉素)。赋予代谢优势的基因，诸如营养选择性标记，也可用于本发明，包括本领域已知的那些标记如amdS、argB和pry4。在进一步的实施方式中，选择性标记是构巢曲霉amdS基因，其编码乙酰胺酶，使被转化的细胞能够以乙酰胺为氮源进行生长。构巢曲霉amdS基因作为选择性标记的应用在Kelly et al.,EMBO J.,1985,4:475-479和Penttila et al.,Gene,1987,61:155-164中被描述。 

包含带有编码α淀粉酶的多核苷酸的DNA构建物的表达载体可以是能够在给定的真菌宿主生物中自我复制或整合进宿主DNA中的任何载体。在一些实施方式中，该表达载体是质粒。在进一步的实施方式中，表达载体中的启动子是编码黑曲霉糖化酶基因的启动子，终止子是是编码塔宾曲霉糖化酶基因的终止子，选择性标记是构巢曲霉amdS基因。 

用于将编码α淀粉酶(诸如AclaP11)的多核苷酸插入表达载体的方法是本领 域熟知的。一般是通过在方便的限制性位点进行酶切和连接反应来完成的。在一些实施方式中，所用的限制性酶切位点是AflII和NotI。在其他实施方式中，所用的限制性酶切位点是XhoI和XbaI。 

宿主细胞的转化、表达和培养：

将DNA构建物或载体导入宿主细胞包括各种技术诸如转化、电穿孔、核微注射、转导、转染(例如脂转染法介导的转染和DEAE-Dextrin介导的转染)、与磷酸钙温浴沉淀DNA、用DNA包被的微射弹进行高速轰击和原生质体融合。一般的转化技术是本领域已知的。对于转化曲霉菌株，参考Yelton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81:1470-1474和EP 238023。 

优选地，遗传稳定的转化子用载体系统构建，由此编码的α淀粉酶(诸如AclaP11)的核酸被稳定整合进宿主菌株染色体中，然后可以通过已知的技术纯化转化子。 

在一种非限制性实例中，包含amdS标记的稳定转化子通过其在含乙酰胺的固体培养基上更快的生长速度以及形成光滑的而非边缘粗糙的圆形克隆而与非稳定转化子相区别。此外，在一些情况下，进一步的稳定性测试可以通过使转化子在固体的非选择性培养基(即缺乏乙酰胺的培养基)上生长，从该培养基收获孢子，以及确定随后发芽并在含乙酰胺的选择性培养基上生长的这些孢子的百分比来进行。可选的，本领域已知的其他方法可以被用于选择转化子。 

在一些实施方式中，用于转化的曲霉属某种的制备包括来自真菌菌丝体的原生质体的制备(参见Campbell et al.,Curr.Genet.,16:53-56)。菌丝体是从萌发的营养孢子获得的。将菌丝体用消化细胞壁的酶处理，产生原生质体。然后通过悬浮培养基中存在的渗透压稳定剂对原生质体加以保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁和类似物。通常这些稳定剂的浓度在0.8～1.2M之间变化。 

宿主菌株对DNA的摄入可以由钙离子浓度决定。一般而言，10～10mM的CaCl₂可以被用在社区摄取溶液中。在摄取溶液中除了对钙离子的需求，一般被包括的其他化合物是缓冲体系诸如TE缓冲液(10mM Tris(pH 7.4)和1mM EDTA)或10mM MOPS(pH 6.0)缓冲液和聚乙二醇(PEG)。 

通常在转化中使用含有宿主细胞或原生质体诸如曲霉属某种的原生质体或细胞的悬浮液，所述原生质体或细胞已经以约10⁷个/mL的密度经过渗透性处理。在一些实施方式中，将大约100μL体积的这些原生质体或细胞的适当溶液(例如1.2M山梨醇和50mM CaCl₂)与期望的DNA混合。在一些实施方式中，将高浓度的PEG加入摄取溶液中。可以向原生质体悬浮液中加入0.1～1体积的 25%PEG 4000。然而，优选地向原生质体悬浮液中加入大约0.25体积。添加剂诸如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾和类似物也可以被加入到摄取溶液中并帮助转化。类似的方法可以用于其他真菌宿主细胞(参考USP 6022725和6268328)。 

一般的，然后将混合物在大约0℃温浴10～30min。向混合物中加入额外的PEG以进一步加强对所需基因或DNA序列的摄取。在一些实施方式中，加入转化混合物的5至15倍体积的25%PEG 4000。但是，更多或更少的体积都可能是合适的。25%PEG 4000优选地是转化混合物体积的大约10倍。加入PEG后，可以将转化混合物在室温温浴或者在冰上冰浴，然后加入山梨醇和CaCl₂溶液。然后将原生质体悬浮液进一步加入到熔化的小量等份生长培养基中。当生长培养基包括生长选择条件(例如乙酰胺或抗生素)是，其仅允许转化子生长。 

一般而言，细胞被培养在含生理盐和营养剂的标准培养基中(参见Pourquie et al.,BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION,Academic Press,1988,71-86和Ilmen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1997,63:1298-1306)。普通的商业配置培养基(例如Yeast Malt Extract(YM)肉汤、Luria Bertani(LB)肉汤和Sabouraud Dextrose(SD)肉汤)也可以用于本发明。 

培养条件也是标准的(例如将培养物在摇床培养器中，在合适的培养基中大约30℃下温浴直至达到所需的α淀粉酶(诸如AclaP11)表达水平)。给定的丝状真菌的培养条件是本领域已知的并且可以在科学文献中和/或从该真菌的来源诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和真菌遗传学保存中心(FGSC)找到。 

酶表达的分析和酶活力的测定：

当下面的描述特别提及α淀粉酶时诸如AclaP11，本领域的技术人员将容易理解，相同或相似的方法适用于AclaP15表达的分析和酶活力的测定。 

为了评价α淀粉酶(诸如AclaP11)的表达，可以在蛋白水平或核酸水平进行分析。可以应用的分析方法包括Northern印迹、斑点印迹(DNA或RNA分析)、Southern印迹、放射自显影、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)和含有适当标记的探针(基于核酸编码序列)进行的原位杂交。此外，基因表达可以通过免疫学方法，诸如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或者组织培养基的免疫试验。例如通过Western印迹或ELISA来评估。这样的免疫试验可以用于定性地和定量地评价α淀粉酶(诸如AclaP11)的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的，并且用于实施此类方法的许多试剂是可商业获得的。在一些实施方式中，α淀粉酶(诸如AclaP11)的表达的通过SDS-PAGE进行分析。 

α淀粉酶(诸如AclaP11)的活力可以通过Miller,Anal.Chem.,1959,31: 426-428中所述的DNS法来测量。酶活力也可以通过测定单位时间液化可溶性淀粉的能力来进行测定(参考GB 8275-2009和GB/T 24401-2009)。在一些实施方式中，α淀粉酶(诸如AclaP11)的活力通过使用α淀粉酶活力测定试剂盒(Megazyme)进行测定。 

下面结合具体实施例对本发明的α淀粉酶和重组菌株进行描述。 

在以下的公开内容和实验部分中，应用下列缩略语： 

AclaP11(具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的α淀粉酶)、℃(摄氏度)、rpm(每分钟的转速)、dlH₂O(去离子水，Milli-Q过滤)、kD(千道尔顿)、g(克)、mg(毫克)、μg(微克)、cm(厘米)、μm(微米)、L(升)、mL(毫升)、μL(微升)、M(摩尔浓度)、mM(毫摩尔浓度)、CU(酶活单位)、min(分钟)、h(小时)、d(天)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)，SDS(十二烷基硫酸钠)、PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、MOPS(吗啉丙磺酸)。 

实施例1克隆α淀粉酶基因AclaP11 

按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从棒曲霉CGMCC 3.5289过夜培养物中提取基因组DNA。 

根据NCBI上的编号为XM_001271888的序列设计PCR引物，用于克隆棒曲霉中的AclaP11基因的正向引物AclaP11-F序列如下： 

5’-ACGGCCTTAAGAAGATGCCTCGGATTTGGTCCTC 

(下划线所示序列为AflII酶切位点)， 

反向引物AclaP11-R序列为： 

5’-ATTGCGGCCGCAGCTCAAGCACAGATCTTGCTTC 

(下划线所示序列为NotI酶切位点)。 

将该基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)从棒曲霉基因组DNA中扩增出来。 

扩增条件： 

第一步：98℃保持3min。 

第二步：98℃保持10s，然后72℃保持75s，此步骤重复30次。 

第三步：72℃保持10min。 

使用凝胶纯化试剂盒将上述PCR产物纯化，用限制性内切酶AflII和NotI(Fermentas)对纯化了的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶AflII和NotI对质粒pGm（遗传图谱如图1）进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干 克隆进行测序(Invitrogen)。 

按照制造商的说明书，使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。所得质粒为pGm-AclaP11，测得的核苷酸序列为SEQ ID NO:2,其翻译的氨基酸（蛋白）序列为SEQ ID NO:1。 

实施例2：PEG介导的原生质体融合转化黑曲霉 

吸取黑曲霉G1孢子悬浮液于CMA平板中心(9cm培养皿)，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200mL CMA液体培养基中，在30℃、200rpm的条件培养14～16h。 

用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，在30℃、200rpm的条件下温浴1～2h，用显微镜观察检测原生质体化进展。 

用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL，在4000rpm条件下离心8min以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在1×10⁷个/mL。 

在冰上，将100μL上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化反应用1管。加入10μg质粒。加入12.5μL溶液C，温和混匀后再冰上放置20min。 

将MMSA顶层琼脂试管熔化并保持在55℃。从冰中移出上述15mL离心管，并向管中加入1mL溶液C和2mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入1mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上，并将平板在30℃下培养7～10d。 

溶液A：2.5mL 1M K₂HPO₄，2.5mL 1M KH₂PO₄，48.156g MgSO₄，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 

溶液B：5mL 1M Tris(pH 7.5)，2.77g CaCl₂，109.32g山梨醇，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 

溶液C：250g PEG 4000，2.77g CaCl₂，5mL 1M Tris(pH 7.5)，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 

原生质体化溶液：将0.6g裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum，Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 

MMSA平板：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl(Sigma)，0.52g KCl，1.52g  KH₂PO₄，218.5g山梨醇，1mL痕量元素(见下)，20g琼脂，加入dlH₂O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL 40%葡萄糖和2.5mL 20%MgSO₄。 

MMSA顶层琼脂试管：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl(Sigma)，0.52g KCl，1.52g KH₂PO₄，218.5g山梨醇，1ml痕量元素(见下)，10g低熔点琼脂糖，加入dlH₂O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL 40%葡萄糖和2.5mL 20%MgSO₄，之后立即分装于无菌试管中，每管10mL。 

痕量元素：在250mL dlH₂O中加入1g FeSO₄·7H₂O，8.8g ZnSO₄·7H₂O，0.4g CuSO₄·5H₂O，0.15g MnSO₄·4H₂O，0.1g Na₂B₄O₇·10H₂O，50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH₂O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 

CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入dlH₂O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。 

CMA液体培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，加入dlH₂O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。 

待平板上长出菌落后，挑选25个菌落，按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从其过夜培养物中提取基因组DNA。按实施例1中所述实验步骤进行PCR验证，对所得PCR产物进行测序。所得阳性克隆的孢子悬浮液接种于25mL TSB发酵培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养3d，所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000×g条件下离心10min，收集上清液。所得上清液即为酶液。将酶液在浓度为8%的SDS-PAGE胶上进行电泳，对在55kD出有明显条带的阳性克隆进行酶活检测。按照制造商的说明书，用α淀粉酶活力测定试剂盒(Megazyme)测定酶液中淀粉酶活力。选取酶活力最高者作为P11淀粉酶重组菌进行进一步研究。将黑曲霉P11（Aspergillus Niger）已于2012年9月4日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC No.6513。 

实施例3：表达棒曲霉α淀粉酶AclaP11的黑曲霉的发酵和酶的表达 

AclaP11淀粉酶在黑曲霉中的表达和其最适pH值、温度的测定 

将表达AclaP11淀粉酶的黑曲霉转化子的孢子悬浮液接种于25mL TSB发酵培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养5d。所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000×g条件下离心10min，收集上清液。所得上清液即为AclaP11淀粉酶酶液。将酶液在浓度为8%的SDS-PAGE胶上进行电泳(图2)。 

电泳结果显示在55kD处可以看到明显条带，而野生菌没有可见的蛋白条带，宿主菌G1有条带，但表达量明显小于重组菌的表达量。 

按照制造商的说明书，用α淀粉酶活力测定试剂盒(Megazyme)测定酶液中淀粉酶活力。在pH 5.4，40℃条件下，AclaP11的酶活(CU/mL)为335.3CU/mL，宿主菌G1的酶活为46CU/mL，野生菌的酶活为0CU/mL。重组酶AclaP11酶活明显高于宿主菌和野生菌所产酶的酶活。 

配制一系列pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 2.4，pH 3.0，pH 3.6，pH 4.2，pH 4.8，pH 5.4，pH 6.0，pH 6.6，pH 7.2，pH 7.8)。酶液用上述不同pH值得缓冲液稀释至合适的浓度，在40℃下，按照制造商的说明书，用α淀粉酶活力测定试剂盒(Megazyme)测定酶液中淀粉酶活力。图3说明了黑曲霉转化子表达的AclaP11的pH稳定性。 

结果显示AclaP11的最适pH为6.0。 

酶液用上述实验确定的最适pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释至合适的浓度，按照制造商的说明书，在不同温度下(30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃)，用α淀粉酶活力测定试剂盒测定酶液中淀粉酶活力。图4说明了黑曲霉转化子表达的AclaP11的温度稳定性，结果显示AclaP11最适反应温度为50℃。 

实施例4：表达α淀粉酶AclaP11的应用实例 

采用一次发酵法工艺制作面包。面包粉选用鹏泰的面包基础粉（未加任何添加剂）；安琪牌面包酵母；加伦牌起酥油。通过研究面包硬度的变化与α淀粉酶添加量之间的关系，发现α淀粉酶AclaP11有一定的抗老化效果。研究发现，在添加范围为0.1-0.5ml/100g面粉时，α淀粉酶AclaP11可以明显地增加面包的比容，减小面包皮和面包心的硬度，改善面包质地，提高面包的焙烤品质。α淀粉酶能改进面包的体积，改良面包的口感，使面包等产品体积更大，颗粒更柔软，对提高面包的品质有着重要的意义。本发明为α淀粉酶作为面包添加剂应用到面包工业中提供了一定的理论依据。 

Claims (6)

1.一种α淀粉酶，其特征在于所述的α淀粉酶氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种核苷酸，其特征在于所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的α淀粉酶。

3.如权利要求2所述的核苷酸，其序列为SEQ ID NO:2。

4.一种酶组合物，其特征在于所述的酶组合物包含有权利要求1所述的α淀粉酶。

5.曲霉菌株，其特征在于，所述的曲霉菌株用于表达权利要求1所述的α淀粉酶。

6.如权利要求5所述的曲霉菌株，其特征在于所述的曲霉菌株为黑曲霉P11其保藏编号为CGMCC No.6513。

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