CN104011067B - 具有葡糖淀粉酶活性的多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性且具有改善的特性的多肽，和涉及包含适用于生产食品、饮料(例如啤酒)、饲料或者生物燃料的这些多肽的组合物。还描述了适用于大规模蛋白质纯化程序的用于分离葡糖淀粉酶的改进和成本效益好的方法。此外，公开了例如在酿造工艺中与根据本发明的葡糖淀粉酶有关的不同方法和用途。

Description

具有葡糖淀粉酶活性的多肽及其制备方法
序列表的引用
所附的是包括SEQ ID NO：1-17的序列表，其全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性且具有改善的特性的多肽，和涉及包含适用于生产食品、饮料(例如啤酒)、饲料或者生物燃料的这些多肽的组合物。还描述了适用于大规模蛋白质纯化程序的用于分离葡糖淀粉酶的改进的和成本效益好的方法。此外，公开了例如在酿造工艺中与根据本发明的葡糖淀粉酶有关的不同方法和用途。
背景技术
葡糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是淀粉水解外切作用糖酶，其催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原末端移除连续的葡萄糖单位。葡糖淀粉酶可水解淀粉(如直链淀粉和支链淀粉)的直链的和分支的糖苷键。
葡糖淀粉酶由多种细菌、真菌和植物的株系产生。某些真菌葡糖淀粉酶例如从曲霉菌属(Aspergillus)的菌株产生和分泌。
其他真菌(例如红曲霉(Monascus))在发酵食品的制备中具有悠久的传统。例如，红曲霉菌株在中国和日本已用于制造豆腐。历史上，真菌主要用作食品添加剂。通常使该生物体在稻米上生长，干燥并研磨，并且作为“红米”(RotReis)添加到肉制品。多种食物成分也由红曲霉物种产生。例如，在家庭和工业中使用的色素由紫红曲霉(Monascuspurpureus)产生。
红曲霉还用作替代药物。例如，红曲米是受紫红曲霉感染的稻米，它是被认识到能降低血液胆固醇的天然食品。活性组分HMG-CoA还原酶抑制剂可降低总的血液胆固醇以及血液LDL胆固醇水平，甚至可逆转冠状动 脉疾病。由紫红曲霉制得的产品被称为莫那可林K(Monacolin K)或红曲胶囊(Cholestin)(华茂公司(Pharmanex))。
也已提出将红曲霉发酵提取物充当抗癌药物，如美国专利申请公布No.2004/0081663 A1中所公开的。如美国专利No.6,613,365所公开的，描述了高粱红曲霉(Monascuskaoliang)在动物饲料中的用途。
JP2007097462描述了培养紫红曲霉以产生液体曲(用于制作发酵食品/饮料)，其具有可检测的葡糖淀粉酶活性。
美国专利No.4.870,014描述了来自糖化酵母(S.diastaticus)的不耐热葡糖淀粉酶的克隆，以及其在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的表达以供在酿造的发酵步骤期间使用。美国专利No.4.318,989描述了从树脂枝孢霉(Cladosporium resinae)产生葡糖淀粉酶(葡糖淀粉酶和外切支链淀粉酶)以供在酿造的发酵步骤期间使用的方法。
公认的是，葡糖淀粉酶是十分重要的商品酶并且已用于需要对淀粉进行水解(例如，用于从淀粉产生葡萄糖和其他单糖)的广泛的各种应用中。然而，大部分商品葡糖淀粉酶由黑曲霉(Aspergillus niger)的真菌菌株产生。
来自这些真菌源的分泌的蛋白产物的很大一部分为α-淀粉酶，当目标是分离葡糖淀粉酶时其为不期望的产物。这些不需要的酶和其他背景蛋白质产物的存在减慢了分离所需葡糖淀粉酶的过程，并且不可避免地减小每批次的总产率。因此，仍然需要制备和分离高品质产率的葡糖淀粉酶，同时减少制备过程中的不需要的产物。
已公开了来自高粱红曲霉的两种形式的葡糖淀粉酶的纯化和特性(Iizuka etal.，(1977)，J.Gen.Appl.Microbiol.，23(5)：217-230(Iizuka等人，1977年，《普通与应用微生物学杂志》，第23卷，第5期，第217-230页)；Iizuka et al.，(1978)，J.Gen.Appl.Microbiol.，24：185-192(Iizuka等人，1978年，《普通与应用微生物学杂志》，第24卷，第185-192页))。两种葡糖淀粉酶据称在最高至50℃下是稳定的，但是在约60℃-70℃的温度下葡糖淀粉酶活性急剧下降。两种形式的葡糖淀粉酶的序列在此文章中或在随后的出版物中均未公开。
在淀粉衍生的碳水化合物的水解中使用葡糖淀粉酶在酿造工业中越来越重要，特别是用于生产高发酵度(有时称为低卡路里)啤酒。出于与产 品稳定性和法规有关的原因，重要的是在最终啤酒中所添加的酶活性被除去/灭活。遗憾的是，当葡糖淀粉酶源自通常来源曲霉属菌种(Aspergillus spp.)，例如黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori)；腐质霉属菌种(Humicola spp.)；篮状菌属菌种(Talaromyces spp.)，例如埃默森篮状菌(T.emersonii)；阿太菌属菌种(Athelia spp.)，例如罗氏阿太菌(A.rolfsii)；青霉属菌种(Penicillium spp.)，例如产黄青霉(P.chrysogenum)，并且所述酶在酿造过程中被添加到发酵容器(FV)中时，由于所述酶的热稳定性，该要求难以满足。
虽然将葡糖淀粉酶添加到糖化醪制备容器中，或在麦芽汁煮沸前的任何阶段添加，可以避免该问题，但是这引入了其他实际困难。美国专利No.4,666,718描述了采用包括酿造酶葡糖淀粉酶的反应器的酿造工艺，该酿造酶葡糖淀粉酶固定在固体载体上，由此可从产物回收酶。美国专利No.5,422,267A描述了采用表达重组葡糖淀粉酶的基因工程酵母的酿造工艺，但是其中该酶由酵母分泌。
因此，仍然需要例如具有葡糖淀粉酶活性的组合物形式的多肽，其可添加到使用常规设备来制备发酵饮料(例如啤酒)的常规工艺中的任何阶段，并且其活性可从最终产物安全地除去。
将例如组合物形式的具有葡糖淀粉酶活性的多肽添加到在制备发酵饮料中使用的发酵容器(FV)中是特别有效的。益处为例如酶剂量降低、淀粉向可发酵碳水化合物的转化增加(例如因为异麦芽糖产生量低)，以及酵母应激降低。这种方法并不常用的原因是，活性酶于是可存在于最终产物中，如上所述这是不期望的。市售葡糖淀粉酶一般是热稳定的，并且在发酵饮料的巴氏灭菌过程中施加的能量不足以使酶失活。因此，还需要不耐热的葡糖淀粉酶，其可在发酵之后通过巴氏灭菌来灭活。
发明内容
本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，其选自：
a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；
b)由以下编码的多肽：i)在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中包含的核酸序列、或ii)i)的cDNA序列、或iii)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的序列、或iv)在至少低严格性条件下与i)、ii)、或iii)的互补链杂交的多核苷酸；
c)包含氨基酸序列中的一种或多种氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽；
d)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3或6的成熟多肽编码序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；和
e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。
本发明还涉及包含能够编码本发明的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还涉及能够表达本发明的多肽的核酸。本发明还涉及表达载体例如重组表达载体，以及宿主细胞如包含该核酸或能够表达本发明的多肽的重组宿主细胞。本发明还涉及具有本发明的多肽的异源表达的宿主细胞。本发明还涉及分离、制备和/或表达本发明的多肽的方法。
本发明还涉及包含本发明的一种或多种多肽的组合物。
本发明还涉及本发明的多肽或组合物在发酵中的用途，其中在发酵步骤之前或期间添加所述多肽或组合物。
本发明还涉及本发明的不耐热多肽用于提高酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖的产量的用途。
本发明还涉及包括在发酵步骤之前或期间添加本发明的多肽或组合物的方法。
本发明还涉及发酵饮料，其中该发酵饮料由本发明的方法制得。
本发明还涉及生产食品、饲料或饮料产品(例如醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，例如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁)的方法，所述方法包括用本发明的多肽或组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。
本发明还涉及试剂盒，其包含本发明的多肽或组合物；以及所述多肽或组合物的使用说明书。
附图说明
图1示出了包括高粱红曲霉在内的多种野生型真菌菌株的发酵液的SDS-PAGE分析。
图2示出了高粱红曲霉的发酵液的SDS-PAGE分析，其示出了两条蛋白条带，其中一个条带的尺寸类似于其他丝状真菌的葡糖淀粉酶的尺寸范围(62kDa)，而第二条带为约49kDa。
图3示出了高粱红曲霉的发酵液样品的另一个SDS-PAGE分析，其示出了约62kDa的蛋白条带。
图4示出了与黑曲霉的发酵液(右边样品)相比，高粱红曲霉的发酵液(左边样品)的SDS-PAGE分析。黑曲霉的发酵液(右边样品)包含分泌的α-淀粉酶，而高粱红曲霉的发酵液(左边样品)仅示出了葡糖淀粉酶。
图5示出了与来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(AnGA)相比，在来自高粱红曲霉的葡糖淀粉酶(MkGA)的存在下乙醇产生的速率和产率。当剂量同样地为0.325葡糖淀粉酶单位/g液化淀粉的干固形物(DS)时，用MkGA产生乙醇的速率比用AnGA产生乙醇的速率快。当剂量为0.4葡糖淀粉酶单位/g DS时，用MkGA产生乙醇的速率甚至更快。无论剂量或酶如何，最终乙醇产率是相当的。
图6示出了在来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(AnGA)或来自高粱红曲霉的葡糖淀粉酶(MkGA)的存在下，液化淀粉的酵母发酵之后剩余的不溶性残余淀粉的量。葡糖淀粉酶的剂量：在左侧试管中每克液化淀粉干固形物325单位AnGA；在中央和右侧试管中分别为每克液化淀粉干固形物325单位和400单位MkGA。
图7示出了在175小时的时间段内，在存在或不存在X4或相等数量的高粱红曲霉葡糖淀粉酶(MkGA)单位的情况下，在麦芽汁的酵母发酵过程中的重量损失。对照没有酶。
图8示出了添加了MkGA I、MkGA II、X4及未添加酶的发酵麦芽汁的HPLC碳水化合物分析。列出的组分在发酵过程的不同时间点，通过HPLC(Phenomenex RSO寡糖柱、RI检测器)由乙醇、甘油和葡萄糖的外标进行定量(％w/v)。
图9示出了在72℃下，A)MkGA I、B)MkGA II和C)X4(使用β-D-麦芽糖苷底物)的残余葡糖淀粉酶活性与巴氏灭菌时间和巴氏灭菌单位(PU)的函数关系。在皇家比尔森啤酒(Royal Pilsner)(实心方形)、百威比尔森啤酒(Budweiser Pilsner)(三角形)、纽卡斯尔棕啤(Newcastle Brown ale)(实心圆形)、Thisted bryghus波特酒(Thistedbryghus Porter)(方形)啤酒和pH(4.7)的0.1M乙酸钠(虚线)中测量残余葡糖淀粉酶活性。结果示为2次测定的平均值。
图10为MkGA I/II基因组和CDS序列的示意性图谱。
图11为不同高粱红曲霉葡糖淀粉酶序列的5个表达质粒的示意性图谱和目的载体pTTT-pyrG13的示意性图谱。
图12示出了表达如下不同高粱红曲霉GA编码序列的红褐肉座菌(Hypocreajecorina)发酵样品的SDS-PAGE：1，MkGA II基因组克隆；2，MkGA II cDNA克隆；3，MkGA I基因组克隆；4，MkGA I cDNA克隆；5，从上游ATG开始的MkGA I基因组克隆；6，受体菌株。在10％SDS-PAGE上的每泳道上样20μl的经过滤的培养样品。GA特异性条带用箭头来指示。
图13示出了表达两种不同高粱红曲霉GA编码序列(MkGAI和MkGAII)的红褐肉座菌发酵样品和两种纯化的来自高粱红曲霉的GA的SDS-PAGE。
图14示出了使用麦芽浸膏麦芽汁对施加到FV的具有相似活性(10M-GAU)的所列GA(发酵物、纯化的蛋白质和产物)所测定的RDF值。结果为2次测定的平均值。误差条为±标准偏差。
具体实施方式
葡糖淀粉酶在要求淀粉水解的广泛应用中是商业上重要的酶。本文所公开的是基于高粱红曲霉来源葡糖淀粉酶MkGA I和MkGA II的表征具有葡糖淀粉酶活性的多肽，其包含从高粱红曲霉纯化的编码葡糖淀粉酶MkGA I和MkGA II的氨基酸序列和DNA序列。还描述了适用于大规模蛋白质纯化程序的用于分离本文所公开的葡糖淀粉酶或其变体的改进的和成本效益好的方法。
此外，本文描述了来自高粱红曲霉的两种葡糖淀粉酶中的特别一者MkGA I及其变体在例如啤酒发酵过程中添加到发酵容器中是非常有用的，因为该酶的合适的不耐热性使得通过巴氏灭菌来灭活成为可能。
巴氏灭菌实验已经以实验室规模、中试规模和全规模对啤酒进行，以评估在酿造过程中使本文所述的多肽失活的能力。在全规模的隧道式巴氏灭菌器中对含葡糖淀粉酶的瓶装啤酒验证实验室规模的巴氏灭菌(数据未示出)。已证实MkGA I显著地比若干其他受试葡糖淀粉酶更不耐热，并且可作为用小于50个单位(PU)完全灭活的唯一受试葡糖淀粉酶，50个单位(PU)为普通啤酒的巴氏灭菌的平均上限。MkGA I和MKGA II在缓冲液中的热稳定性之前已有研究(Iizuka et al.，(1977)，J.Gen.Appl.Microbiol.，23(5)：217-230(Iizuka等人，1977年，《普通与应用微生物学杂志》，第23卷，第5期，第217-230页)；Iizukaet al.，(1978)，J.Gen.Appl.Microbiol.，24：185-192(Iizuka等人，1978年，《普通与应用微生物学杂志》，第24卷，第185-192页))，然而据观察，与缓冲溶液相比，MkGA I在啤酒中的稳定性更低。与之前使用的0.1M乙酸钠缓冲液(pH 4.7)相比，MkGA I在各种脱气啤酒(pH4.3-4.6)中的热稳定性显著更小(Iizuka et al.，(1977)，J.Gen.Appl.Microbiol.，23(5)：217-230(Iizuka等人，1977年，《普通与应用微生物学杂志》，第23卷，第5期，第217-230页)；Iizuka et al.，(1978)，J.Gen.Appl.Microbiol.，24：185-192(Iizuka等人，1978年，《普通与应用微生物学杂志》，第24卷，第185-192页))，这导致小于50PU就使MkGA I在啤酒中完全灭活，但在乙酸缓冲液中没有完全失活。因此，本发明人出乎意料地发现，MkGA I在啤酒中足够不耐热而可通过巴氏灭菌完全灭活，而同时在整个啤酒发酵过程中保持高性能。
然而，MkGA I在高粱红曲霉中的低表达使其在商业上没有吸引力。因此，本发明人进一步鉴定了包含特定信号肽序列的MkGA I的基因组DNA序列，其一起使例如MkGA I和MkGA II能够异源表达，例如在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达。
1.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton et al.，Dictionary of MicrobiologyAnd Molecular Biology，2nded.，John Wiley and Sons，New York(1994)(Singleton等人，《微生物学与分子生物学词典》，第2版，约翰威立父子出版公司，纽约，1994年)和Hale &Markham，The Harper Collins Dictionary Of Biology，Harper Perennial，N.Y.(1991)(Hale和Marham，《哈普柯林斯生物学词典》，哈珀永久出版社，纽约，1991年)为技术人员提供了本文所用许多术语的通用意义。为了清楚和引用方便起见，在下文中还是定义了某些术语。
如本文所用，术语“葡糖淀粉酶”(EC 3.2.1.3)是指催化从淀粉和相关寡糖及多糖的非还原末端释放D-葡萄糖的酶。
如本文所用，术语“MkGA”是指从高粱红曲霉的发酵产生的两种葡糖淀粉酶变体MkGA I和MkGA II的混合物。
如本文所用，术语“MkGA I”是指来自高粱红曲霉的没有淀粉结合域(SBD)的较小葡糖淀粉酶变体。
如本文所用，术语“MkGA II”是指来自高粱红曲霉的具有淀粉结合域(SBD)的葡糖淀粉酶变体。
如本文所用，涉及核酸或多肽序列的“同源序列”和“序列同一性”是指当进行最佳比对以便比较时与核酸序列或多肽序列具有约至少100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少88％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％、或至少45％序列同一性，其中候选核酸序列或多肽序列的功能基本上跟与候选同源序列相比较的核酸序列或多肽序列相同。在一些实施例中，同源序列具有至少约85％和100％之间的序列同一性，而在其他实施例中，存在约90％和100％之间的序列同一性，并且在其他实施例中，存在至少约95％和100％的序列同一性。
使用本领域中已知的标准技术来测定同源性(参见例如Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)(Smith和Waterman，《应用数学进展》，第2卷，第482页，1981年)；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页，1970年)；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)(Pearson和Lipman，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页，1988年)；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机集团(Genetics Computer Group，Madison，WI))中的程序，例如GAP、BESTHT、FASTA和TFASTA；和Devereux el al.，Nucleic Acid Res.，12：387-395(1984)(Devereux等人，《核酸研究》，第12卷，第387-395页，1984年))。
“核酸序列同一性百分数(％)”或“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为候选序列中的核苷酸残基或氨基酸残基与起始序列的核苷酸残基或氨基酸残基相同的百分数。可在起始序列的整个长度上测量序列同一性。
通过已知的序列比对方法来测定同源序列。通常使用的比对方法为Altschul等人所描述的BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)(Altschul等人，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页，1990年)；和Karlin et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993)(Karin等人，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5787页，1993年))。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul et al，Meth.Enzymol.266：460-480(1996)(Altschul等人，《酶学方法》，第266卷，第460-480页，1996年))。WU-BLAST-2使用数个搜索参数，其中大多数被设置为默认值。可调节的参数设定为以下值：重叠跨越(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字长阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态的值，并且取决于具体序列的组成和据以对所关注序列进行检索的具体数据库的组成而由程序本身确立。然而，可调节所述值以增加灵敏度。
氨基酸序列同一性百分数值是由匹配的相同残基的数目除以比对区域中“较长”序列的残基总数来确定。所述“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(忽略由WU-Blast-2引入以使比对得分最大化的空位)。
其他方法可用于比对序列。可用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化形式(Feng andDoolittle，J.Mol.Evol.35：351-360(1987)(Feng和Doolittle，《分子进化杂志》，第35卷，第351-360页，1987年))。该方法类似于Higgins和Sharp所描述的方法(Higgins andSharp，CABIOS 5：151-153(1989)(Higgins和Sharp，《计算 机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页，1989年))。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重＝3.00，默认空位长度权重＝0.10，以及加权的末端空位。
在另一个方面，一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的同一性百分数通过使用具有如下默认设置的蛋白质-蛋白质Blast搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)来测定：得分矩阵：blosum62，非冗余蛋白质序列数据库和blast算法
术语“最佳比对”是指给出最高同一性百分数得分的比对。
如本文所用，术语“葡糖淀粉酶变体”或“变体”是用来指这样的葡糖淀粉酶，其类似于葡糖淀粉酶序列(例如高粱红曲霉葡糖淀粉酶I和II序列)，但在其氨基酸序列中具有至少一个使其在序列上不同于葡糖淀粉酶I和/或II的取代、缺失或插入。在一些情况下，对其进行操纵和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一个使其在序列上不同于葡糖淀粉酶I和/或II的取代、缺失或插入。
如本文所用，术语“催化结构域”是指多肽的结构区域，其含有用于催化底物水解的活性位点。
术语“连接区”是指通常具有3至40个氨基酸残基的短氨基酸序列，其将包含淀粉结合结构域的氨基酸序列与包含催化结构域的氨基酸序列共价结合。
术语“淀粉结合域”(SBD)是指优先结合淀粉底物的氨基酸序列。本领域的技术人员熟知如何鉴定SBD-该SBD为碳水化合物结合模块(CBM)的例子，并且CBM已通过使用基于序列的分类系统被分类为CBM家族(http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding- Modules.html)。此外，本领域的 技术人员熟知使用生淀粉或β-环糊精亲合色谱法来分离包含例如SBD的材料(Hamilton et al.(2000)Enzyme and Microbial Technology 26p561-567(Hamilton等人，2000年，《酶与微生物技术》，第26卷，第561-567页))。在一个方面，SBD的结构域定义取自Pfam数据库(http://pfam.sanger.ac.uk/或www.sanger.ac.uk/resources/databases/pfam.html)，该蛋白质结构域家族数据库根据序列相似性产生。因此，在一个方面，SBD由Pfam数据库中的碳水化合物结合模块20家族定义。
如本文所用，术语“片段”被定义为这样的多肽，其从例如SEQ ID NO：3或6的多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一种或多种(若干)氨基酸；其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一个方面，该片段从SEQ ID NO：3的氨基末端缺失了一种或多种(若干)氨基酸。在一个方面，与野生型相比，并且就MkGA I而言还与MkGA II相比，该多肽在N端或C端中包含较少残基。
在一个方面，本文所述的多肽具有至多480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、495、500、505、507、515、525、535、545、555、565或573个氨基酸残基。
如本文所用，术语“截短的”是指这样的多肽，其与野生型蛋白质(或另一种变体)相比未达到其完全翻译长度，并且因此丢失了存在于野生型蛋白质中的一些氨基酸。截短通常由提前终止突变而导致，但是也可由另一种机制引起-例如翻译后修饰。
如本文所用，术语“突变序列”和“突变基因”可互换使用，是指在出现于宿主细胞的亲本序列中的至少一个密码子中具有变更的多核苷酸序列。突变序列的表达产物是相对于葡糖淀粉酶I和/或II具有变更的氨基酸序列的变体蛋白质。表达产物可具有变更的功能能力(例如增强的酶活性或更高的热稳定性)。
如本文所用，在多肽的语境中，术语“特性”或其语法上的等价物是指多肽的任何可被选择或检测的特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、KM、KCAT、KCAT/KM比、蛋白质折叠、结合底物的能力和被分泌的能力。
如本文所用，在核酸的语境中，术语“特性”或其语法上的等价物是指核酸的任何可被选择或检测的特征或属性。这些特性包括但不限于影响基因转录的特性(例如，启动子强度或启动子识别)、影响RNA加工的特性(例如，RNA剪接和RNA稳定性)、影响翻译的特性(例如，调节mRNA与核糖体蛋白的结合)。
术语“热稳定的”和“耐热的”是指本公开的葡糖淀粉酶变体，其在淀粉底物水解过程中的常见条件下(例如同时暴露于改变的温度)，在暴露于一定的温度达给定时间段后可保留特定量的酶活性。
在诸如热稳定性的特性的语境中，术语“增强的稳定性”是指与葡糖淀粉酶I和/或II相比，随时间推移经测量仍然保持较高的催化活性或淀粉水解活性。
术语“不耐热葡糖淀粉酶”是指本公开的葡糖淀粉酶，其在酿造过程的产物的巴氏灭菌期间常见的条件下，在暴露于一定的温度达给定时间段后失去可检测的水解酶活性。巴氏灭菌的精确条件(例如巴氏灭菌单位)将取决于通过酿造过程生产的啤酒的类型。巴氏灭菌的啤酒中不耐热葡糖淀粉酶的可检测水解活性的损失可使用本文所述的葡糖淀粉酶测定法来检测，并且可由通过该测定法测得的活性的损失来定义。不耐热葡糖淀粉酶的例子为具有SEQ ID NO：6的葡糖淀粉酶。
术语“比活性”定义为每毫克葡糖淀粉酶蛋白的活性。在一些实施例中，葡糖淀粉酶的活性通过乙醇测定法来测定，并且以从淀粉底物产生的葡萄糖的量表示。在一些实施例中，可使用Caliper测定法来测定蛋白质浓度。
术语“活性的”和“生物学活性的”是指与特定蛋白质相关的生物学活性。因此，给定蛋白质的生物学活性是指本领域技术人员通常归于该蛋白质的任何生物学活性。例如，与葡糖淀粉酶相关的酶活性是水解活性，因此有活性的葡糖淀粉酶具有水解活性。
如本文所用，术语“葡糖淀粉酶活性”是指催化从淀粉和相关寡糖及多糖的非还原末端释放D-葡萄糖的酶的活性。具体地讲，可通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法来测定葡糖淀粉酶活性(参见Goto et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.58：49-54(1994)(Goto等人，《生物科学生物技术和生物化学》，第58卷，第49-54页，1994年))。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的多聚形式的核苷酸，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
如本文所用，术语“DNA构建体”、“转化DNA”和“表达载体”可互换使用，指用于将序列引入宿主细胞或生物体中的DNA。可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其它合适的技术在体外产生所述DNA。DNA构建体、转化DNA或重组表达盒可被掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列外，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达盒部分还包括待转录的核酸序列和启动子。在一些实施例中，表达载体具有将异源DNA片段掺入宿主细胞中并使其表达的能力。
如本文所用，术语“载体”是指多核苷酸构建体，其被设计用于将核酸引入一个或多个细胞类型中。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。
如本文所用，在将核酸序列引入细胞中的语境中，术语“引入”是指任何适于将核酸序列转移进细胞中的方法。此类用于引入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导。
如本文所用，术语“转化的”和“稳定转化的”是指具有非天然(异源)多核苷酸序列的细胞，所述多核苷酸序列被整合进其基因组中或作为被保持至少两代的附加型质粒。
如本文所用，术语“可选标记”和“选择性标记”是指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如基因)，其使得能容易地选择含有该载体的那些宿主。通常，可选标记是这样的基因，其赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势，以使得可以将含有外源DNA的细胞与在转化过程中未接受任何外源序列的细胞区分开。
如本文所用，术语“启动子”是指起到引导下游基因的转录的作用的核酸序列。启动子以及其它转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)是表达给定基因所必需的。通常，转录和翻译调控序列包括但不限 于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活物序列。
当将核酸置于与另一核酸序列存在功能性关系中时，其为“有效连接”(operablylinked)的。例如，如果编码分泌前导序列(即信号肽)的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白(preprotein)的话，则其可与该多肽的DNA有效连接。通常，“有效连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情形中，其为连续的且在阅读相中。
如本文所用，术语“基因”是指多核苷酸(例如DNA区段)，其编码多肽且包括编码区之前和之后的区域，以及各个编码区段(外显子)之间的居间序列(内含子)。
如本文所用，“直系同源物”和“直系同源基因”是指不同物种中通过物种形成而从共同的先祖基因(即同源基因)进化而来的基因。通常，直系同源物在进化的过程中保留了相同的功能。对直系同源物的鉴别可用于可靠地预测新测序的基因组中的基因功能。
如本文所用，“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指因基因组内的复制而相关联的基因。直系同源物在进化的过程中保留相同的功能，而旁系同源物进化出新的功能，虽然一些功能通常与原始的功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，它们都是丝氨酸蛋白酶并一起出现在相同的物种中。
如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。
如果一条核酸序列与参考核酸序列在中等至高严格性杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则该核酸序列被认为是与该参考核酸序列“可选择性杂交”。杂交条件是基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格性”通常发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm 5℃)下；“高严格性”在约低于该Tm 5-10℃下；“中度严格性”在约低于探针的Tm 10-20℃下；而“低严格性”在约低于该Tm 20-25℃下。功能上，最大严格性条件可用于鉴别与杂交探针有严格同一性或接近严格同一性的序列；而中度或低严格性杂交可用于鉴别或检测多核苷酸序列同源物。
中等和高严格性杂交条件是本领域所熟知的。高严格性条件的例子包括在约42℃下，在50％甲酰胺、5×SSC、5×邓哈特溶液(Denhardt′s solution)、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，然后在室温下，在2×SSC和0.5％SDS中洗涤两次，并且在42℃下，在0.1×SSC和0.5％SDS中再洗涤两次。中度严格性条件的例子包括在37℃下，在包含20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑鱼精子DNA的溶液中过夜温育，然后在约37-50℃下，在1×SSC中洗涤过滤器。本领域的技术人员了解如何根据需要来调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等的因素。
如本文所用，“重组的”包括指通过引入异源或同源核酸序列而被修饰的细胞或载体，或是指所述细胞源自经如此修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞可表达未在天然(非重组)形式的细胞中以相同形式存在的基因，或者因人为故意干预而可表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
在一个实施例中，在至少一个密码子和/或核苷酸中用位点饱和诱变产生突变的DNA序列。在另一个实施例中，对于两个或更多个密码子进行位点饱和诱变。在又一个的实施例中，突变DNA序列与葡糖淀粉酶I和/或IIDNA序列具有大于约50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、或大于98％同一性。在替代实施例中，可使用任何已知的诱变程序(例如辐射、亚硝基胍等)在体内产生突变DNA。然后可分离所需的DNA序列并将其用于本文所提供的方法中。
如本文所用，“异源蛋白”是指不在宿主细胞中天然出现的蛋白质或多肽。
如果酶在宿主细胞中的表达水平高于其在相应野生型细胞中的表达水平，则该酶在该宿主细胞中“过表达”。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的三字母代码遵照生物化学命名联合委员会(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN))的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
本公开的变体通过如下命名法描述：[原始氨基酸残基/位置/取代的氨基酸残基]。例如，用亮氨酸取代位置76的精氨酸表示为R76L。当在本文中确定适合取代的位置而又没有提出具体的氨基酸时，应理解任何氨基酸残基都可取代在该位置中存在的氨基酸残基。
“原序列(prosequence)”是在信号序列与成熟蛋白质之间的为蛋白质分泌所必需的氨基酸序列。剪切原序列将产生成熟的活性蛋白质。
术语蛋白质或肽的“前体”形式是指具有与该蛋白质的氨基或羰基末端有效连接的原序列的成熟形式蛋白质。前体也可具有与原序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。前体还可具有涉及翻译后活性的额外的多核苷酸(例如，从其上被剪切的多核苷酸，该剪切留下成熟形式的蛋白质或肽)。
“宿主株系”或“宿主细胞”是指用于包含根据本公开的DNA的表达载体的适合宿主。
术语“源自”和“获自”不仅是指由所考虑的生物体的株系产生的或可由其产生的葡糖淀粉酶，还指由分离自这种株系的DNA序列编码并在含有这种DNA序列的宿主生物体中产生的葡糖淀粉酶。此外，该术语指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码且具有所考虑的葡糖淀粉酶的鉴别特征的葡糖淀粉酶。
在此定义范围内的“衍生物”通常以一定程度保留了在葡糖淀粉酶I和/或II中所观察到的特征性水解活性，所述程度使得所述衍生物可用于与所述野生型、天然或亲本形式相似的目的。葡糖淀粉酶的功能性衍生物涵盖具有本公开的葡糖淀粉酶的一般特征的天然存在的、合成的或重组产生的肽或肽片段。
术语“分离的”是指从天然环境中移出的物质(如果其天然存在的话)。“纯化的”蛋白质是指被至少部分纯化至同质的蛋白质。在一些实施例中，如通过SDS-PAGE所测定的，纯化的蛋白质可以是超过约10％纯，任选地超过约20％纯，以及任选地超过约30％纯。如通过SDS-PAGE所测定的，本发明的另外的方面涵盖高度纯化形式的蛋白质(即超过约40％纯、超过约60％纯、超过约80％纯、超过约90％纯、超过约95％纯、超过约97％纯、以及甚至超过约99％纯)。
如本文所用，术语“组合诱变”是指据以产生起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体含有一个或数个选自预定突变组的突变。此外，所述方法提供了手段来引入不是预定突变组的成员的随机突变。在一些实施例中，所述方法包括美国专利No.6,582,914中所示的那些，该专利以引用的方式并入本文。在替代实施例中，组合诱变方法涵盖可商购获得的试剂盒(例如，加利福尼亚州圣地亚哥Stratagene公司(Stratagene，San Diego，CA)的Multisite)。
如本文所用，术语“组合物”涉及根据本发明制备的例如饮料、食品或饲料成分形式的制品，并且可为溶液形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施予模式。固体形式可作为干燥酶粉末或者作为颗粒化酶。组合物可包含根据本发明的多肽、酶载体，以及任选的稳定剂和/或防腐剂。酶载体可选自甘油或水。该制品可包含稳定剂。稳定剂可选自无机盐类、多元醇类、糖类和它们的组合。此外，稳定剂可为无机盐，例如氯化钾。在另一个方面，多元醇是甘油、丙二醇或者山梨糖醇。糖是小分子碳水化合物，具体地讲是若干有甜味的小分子碳水化合物如葡萄糖、果糖和蔗糖中的任何一种。在又一个方面，该制品可包含防腐剂。在一个方面，防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸盐、山梨酸盐或者其他食品批准的防腐剂或者它们的混合物。
在本发明的上下文中，术语“发酵”是指通过使微生物在培养物中生长来提供组合物，例如发酵饮料和/或物质。在酶(如，葡糖淀粉酶)制备的上下文中，术语“发酵”是指涉及在微生物培养过程中制备酶的方法。在酿造的语境中，术语“发酵”是指麦芽汁中的糖被酿造啤酒用酵母中的酶转化为乙醇和二氧化碳，伴随其他发酵副产物的形成。
如本文所用，“制备发酵饮料(例如啤酒)的方法”一般包括以下步骤：制备糖化醪(例如基于谷粉)，过滤糖化醪以得到麦芽汁和废糟，以及发酵麦芽汁以得到发酵饮料。
如本文所用，术语“含有淀粉和/或糖的植物材料”是指可源自任何植物和植物部分的含有淀粉和/或糖的植物材料，所述植物和植物部分包括块茎、根、茎、叶和种子。例如，“包含淀粉和/或糖的植物材料”可为例如一种或多种谷类，如大麦、小麦、玉蜀黍、黑麦、高粱、粟或稻米以及它们的任何组合。包含淀粉和/或糖的植物材料可被处理，例如碾磨、发芽、 部分发芽或未发芽。未发芽的谷类也称“原粮”。非谷类含淀粉植物材料的例子包括例如块茎。
如本文所用，术语“谷粉”是指适于糖化醪制备的任何经处理的含有淀粉和/或糖的植物材料。如本文所设想的，谷粉可包含可源自任何植物和植物部分的任何含有淀粉和/或糖的植物材料，所述植物和植物部分包括块茎、根、茎、叶和种子。处理的例子包括研磨和/或碾磨，这通常提供比面粉更粗的材料。在本发明的语境中，谷粉可包含来自谷粒的经处理的材料，例如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻米、蜀黍、粟和高粱的谷粒，并且更优选地，至少10％、或更优选至少15％、甚至更优选至少25％、或最优选至少35％，例如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量)的麦芽汁的谷粉源自谷粒。在一些实施例中，谷粉可包含从木薯[Manihot esculenta]根获得的含有淀粉和/或糖的植物材料。谷粉可包含发芽的谷粒，如大麦麦芽。优选地，至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％，例如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量)的麦芽汁的谷粉源自发芽的谷粒。
如本文所用，术语“麦芽”被理解为任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。
在一个方面，当使用主要从与生产啤酒有关的选定大麦品种产生的麦芽时，麦芽对啤酒的整体特征和质量影响最大。第一，麦芽是啤酒中主要的风味剂。第二，麦芽提供可发酵糖的主要部分。第三，麦芽提供蛋白质，其将促成啤酒的酒体和泡沫特征。第四，麦芽在糖化醪制备过程中提供酶活性，任选地通过添加外源酶来补充。第五，麦芽废糟提供过滤介质以在糖化醪制备之后分离麦芽汁-通常通过滤清(lautering)或糖化醪过滤(mashfiltration)来分离。
如本文所用，术语“辅料”是指不是大麦麦芽的任何含有淀粉和/或糖的植物材料。作为辅料的例子，可以提及可用作淀粉来源的材料，例如普通玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、稻米、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘培谷类、谷类片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯和糖浆例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等等。淀粉将最终被转化为糊精和可发酵糖。在一个方 面，“辅料”包括从木薯[Manihot esculenta]根获得的含有淀粉和/或糖的植物材料。
如本文所用，术语“糖化醪”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或它们的组合的含水浆料，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。
如本文所用，术语“麦芽汁”是指在糖化醪制备过程中对谷粉进行提取后未发酵的液体流出物(run-off)。
如本文所用，术语“废糟”是指当对谷粉进行了提取且将麦芽汁从糖化醪中分离时剩余的沥干的固体。“废糟”可用作例如饲料。
如本文所用，术语麦芽汁中的“提取回收率”是指从谷粉(麦芽和/或辅料)提取的可溶性物质的总和，以基于干物质的百分数表示。
如本文所用，术语“啤酒花”涉及其在对啤酒质量(包括风味)作出显著贡献中的用途。具体地讲，啤酒花(或啤酒花组成物)给啤酒中加入想要的苦味化物质。此外，啤酒花可充当蛋白质沉淀剂，建立防腐剂并且有助于泡沫形成和稳定化。
如本文所用，术语“饮料”和“饮料产品”包括啤酒，例如全麦芽啤酒、以“《德国啤酒纯净法》”(“Reinheitsgebot”)酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、贮藏啤酒、苦啤酒、发泡酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等。术语“饮料”或“饮料产品”还包括替代形式的谷来和麦芽饮料，例如水果味麦芽饮料，例如柑橘味(诸如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味)麦芽饮料，酒味麦芽饮料(例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒)，或咖啡味麦芽饮料(例如咖啡因味麦芽酒)等。在又一个方面，饮料或饮料产品为醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，诸如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁。
如本文所用，术语“麦芽饮料”包括诸如全麦啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、贮藏啤酒、苦啤酒、发泡酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、淡啤酒、轻啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无醇麦芽酒等的麦芽饮料。术语“麦芽饮料”还包括替代形式的麦芽饮料，例如水果味麦芽饮料，例如柑橘味(诸如柠檬、甜橙、 酸橙或浆果味)麦芽饮料，酒味麦芽饮料(例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒)，或咖啡味麦芽饮料(例如咖啡因味麦芽酒)等。
在本发明的语境中，术语“啤酒”意在包括任何通过含淀粉植物材料的发酵/酿造生产的发酵麦芽汁，因此具体地讲还包括专门从麦芽或辅料生产或者从麦芽和辅料的任何组合生产的啤酒。
啤酒可通过基本上相同的方法由各种含有淀粉和/或糖的植物材料(通常为谷物谷粒和/或麦芽)制成。谷粒淀粉被认为是葡萄糖均聚物，其中葡萄糖残基通过α-1，4键或α-1，6键连接，以前者为主。
如本文所用，术语“比尔森啤酒”是指浅色底部发酵贮藏啤酒(由比尔森麦芽制成)，其通常比普通(例如淡啤酒(helles))浅色贮藏啤酒具有更明显的啤酒花特征。
如本文所用，术语“轻啤酒、卡路里减少的啤酒或低卡路里啤酒”是指最近广泛普及的酿造饮料，特别是在美国市场中。如在美国所定义的，这些高发酵度的啤酒与制造商的“普通”啤酒相比，卡路里少大约30％。
如本文所用，术语“无醇啤酒”或“低醇啤酒”是指以体积计含有最多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％醇的啤酒。无醇啤酒可通过特殊方法(停止发酵)用特殊的非产醇的“酵母”来酿造，或通过传统方法来酿造，但是在酿造过程的终了阶段期间，醇(例如)通过真空蒸发、通过利用水和醇的不同沸点而被除去。
如本文所用，术语“低卡路里啤酒”或“具有低碳水化合物含量的啤酒”被定义为碳水化合物含量为0.75g/100g或更低且发酵度为约90％-92％的啤酒。
如本文所用，术语“巴氏灭菌”意指通过加热来杀灭水溶液中的微生物。在酿造工艺中实施巴氏灭菌通常是通过使用巴氏瞬时灭菌器或隧道式巴氏灭菌器。如本文所用，术语“巴氏灭菌单位或PU”是指对巴氏灭菌的定量度量。对于啤酒而言，一个巴氏灭菌单位(1PU)被定义为在60摄氏度下保热一分钟。可计算如下：
PU＝t×1.393^(T-60)，其中：
t＝在巴氏灭菌器中在巴氏灭菌温度下的时间(分钟)，
T＝巴氏灭菌器中的温度(摄氏度)，
[^(T-60)表示指数(T-60)]
取决于啤酒类型、原材料和微生物污染、酿造者和对啤酒风味的感知效果，可使用不同的最小PU。通常，对于啤酒巴氏灭菌，需要14-15PU。取决于巴氏灭菌的设备，巴氏灭菌温度通常在64-72摄氏度的范围内，相应地计算巴氏灭菌时间。其他信息可在如下文献中找到：“Technology Brewing and Malting”by Wolfgang Kunze of the Research andTeaching Institute of Brewing，Berlin(VLB)，3rd completely updated edition，2004，ISBN3-921690-49-8(柏林酿造研究学院的Wolfgang Kunze所著的《酿造和制麦技术》，第三完全更新版，2004年，ISBN 3-921690-49-8)。
在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定范围中的任何规定值或中间值与该规定范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围被涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中界限中任一者、界限均不或界限二者被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开文本中，但依据该规定范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开文本中。
在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然是可变的。尽管与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料可用于本发明的实施或测试，但现在将描述示例性的方法和材料。
如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物，除非文中另外明确指出。因此，例如，提到“基因”则包括多个这种候选物质，而提到“细胞”则包括提到一个或多个细胞以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。
本文述及的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文中没有任何部分应被理解为承认本公开不因为在先发明而有权先于此类出版物。
2.缩写
GA 葡糖淀粉酶
GAU 葡糖淀粉酶单位
wt％ 重量％
℃ 摄氏度
rpm 每分钟转数
aa或AA 氨基酸
bp 碱基对
kb 千碱基对
kD 千道尔顿
g或gm 克
μg 微克
mg 毫克
μl和μL 微升
ml和mL 毫升
mm 毫米
μm 微米
M 摩尔浓度
mM 毫摩尔浓度
μM 微摩尔浓度
U 单位
V 伏特
MW 分子量
sec或s 秒
min或m 分钟
hr或h 小时
DO 溶解氧
ABS 吸光度
EtOH 乙醇
PSS 生理盐水溶液
m/v 质量/体积
MTP 微量滴定板
N 正常
DP1 单糖
DP2 多糖
DP＞3 寡糖，聚合度大于3的糖
ppm 份每一百万份
SBD 淀粉结合结构域
CD 催化结构域
PCR 聚合酶链反应
WT 野生型
RDF 实际发酵度
SG 比重
PU 巴氏灭菌单位
MkGA I 高粱红曲霉葡糖淀粉酶I
MkGA II 高粱红曲霉葡糖淀粉酶II
H.jecorina 红褐肉座菌
T.reesei 里氏木霉
AnGA 黑曲霉
3.高粱红曲霉来源的葡糖淀粉酶
在一个实施例中，本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽选自：
a)包含氨基酸序列的多肽；所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；
b)由以下编码的多肽：i)在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中包含的核酸序列、或ii)i)的cDNA序列、或iii)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的序列、或iv)在至少低严格性条件下与i)、ii)、或iii)的互补链杂交的多核苷酸；
c)包含氨基酸序列中的一种或多种氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽；
d)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3或6的成熟多肽编码序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；和
e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。
在一个方面，本文所设想的多肽通过宿主细胞中的重组表达而获得。在又一个方面，本文所设想的多肽不具有淀粉结合域。
另一个方面涉及来自高粱红曲霉的葡糖淀粉酶的表征。葡糖淀粉酶由多至三个不同结构域组成，包括结构上保守的大约450个残基的催化域，其通常接有由30至80个残基组成的连接区，该连接区继而连接至大约100个残基的淀粉结合域。已经发现高粱红曲霉产生两种形式的葡糖淀粉酶，本文中表示为葡糖淀粉酶I和II(Iizuka et al.，(1977)，J.Gen.Appl.Microbiol.， 23(5)：217-230(Iizuka等人，1977年，《普通与应用微生物学杂志》，第23卷，第5期，第217-230页)；Iizuka et al.，(1978)，J.Gen.Appl.Microbiol.，24：185-192(Iizuka等人，1978年，《普通与应用微生物学杂志》，第24卷，第185-192页))。如本文所表征，葡糖淀粉酶I(MkGA I)具有以SEQ ID NO：6随附的氨基酸序列、编码葡糖淀粉酶I的相关基因组DNA序列(包括所鉴定的信号肽序列)(以SEQ ID NO：4随附)、和编码葡糖淀粉酶I的相关cDNA序列(以SEQ ID NO：5随附)。此外，葡糖淀粉酶II(MkGA II)在本文表征为具有以SEQ ID NO：3随附的氨基酸序列、编码葡糖淀粉酶II的相关基因组DNA序列(包括所鉴定的信号肽序列)(以SEQ ID NO：1随附)、和编码葡糖淀粉酶II的相关cDNA序列(以SEQ IDNO：2随附)。这些葡糖淀粉酶cDNA片段的序列分析结果表明，存在葡糖淀粉酶的两种不同变体。在本文称为葡糖淀粉酶II的第一较长变体编码具有淀粉结合域(SBD)的葡糖淀粉酶，而在本文称为葡糖淀粉酶I的第二较短变体编码无SBD的葡糖淀粉酶。两个变体之间的差别是在连接区末端处将催化核心与SBD分离的162个碱基对的空位。与具有581个残基(SEQ IDNO：3)的成熟MkGA II蛋白质相比，成熟MkGA I蛋白质包含480个残基(SEQ ID NO：6)。这两种蛋白是高度相似的，而在无空位比对中它们在以下8个位置处不同：459、473、474、475、476、477、479和480。在这些位置处，氨基酸组成如下：MkGA I：A459、C473、A474、A475、T476、P477、A479和V480，MkGA II：P459、S473、R474、P475、Y476、G477、G479和R480。在又一个方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中氨基酸序列包含至少一个或多个选自以下组的氨基酸残基：选自与SEQ ID NO：3或6中的第459位对应的位置处的A和P的氨基酸残基，选自与SEQ ID NO：3或6中的第473位对应的位置处的C和S的氨基酸残基，选自与SEQ ID NO：3或6中的第474位对应的位置处的A和R的氨基酸残基，选自与SEQ ID NO：3或6中的第475位对应的位置处的A和P的氨基酸残基，选自与SEQ ID NO：3或6中的第476位对应的位置处的T和Y的氨基酸残基，选自与SEQ ID NO：3或6中的第477位对应的位置处的P和G的氨基酸残基，选自与SEQ ID NO：6中的第479位对应的位置处的A和G的氨基酸残基和/或选自与SEQ ID NO：3或6中的第480位对应的位置处的V和R的氨基酸残基。
在一个方面，本文所述的多肽为这样的多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在又一个方面，本文所述的多肽包含SEQID NO：3或6的氨基酸序列或其具有葡糖淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列或其具有葡糖淀粉酶活性的片段组成。
在一个方面，本文所述的多肽的葡糖淀粉酶活性(GAU)为至少0.05GAU/mg、0.1GAU/mg、0.2GAU/mg、0.3GAU/mg、0.4GAU/mg、0.5GAU/mg、0.6GAU/mg、0.7GAU/mg、0.8GAU/mg、0.9GAU/mg、1GAU/mg、2GAU/mg、3GAU/mg、5GAU/mg或10GAU/mg。
在另一个方面，本文所述的多肽的葡糖淀粉酶活性(GAU)为0.05-10GAU/mg，例如0.1-5GAU/mg，例如0.5-4GAU/mg，例如0.7-3GAU/mg，或例如1-3GAU/mg。
在还又一个方面，本文所述的多肽包含SEQ ID NO：3或6的成熟多肽，或者由SEQID NO：3或6的成熟多肽组成。
在一个实施例中，基本上纯化的葡糖淀粉酶I或II可从高粱红曲霉的野生型、天然的、或换句话讲未修饰的菌株产生，所述菌株可提供非GMO(转基因生物)产生的葡糖淀粉酶。
又一个方面涉及编码高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II、或其任何变体的分离的多核苷酸，使得核苷酸取代、缺失或插入编码替代形式的葡糖淀粉酶，其保持葡糖淀粉酶I或II或其他宿主葡糖淀粉酶的生化特征。所述多核苷酸可通过本领域中已知的确立的技术制备。可以合成方式制备所述多核苷酸，例如通过自动化DNA合成仪。DNA序列可以是通过将片段连接在一起而制备的混合的基因组(或cDNA)和合成来源的。还可利用特异性引物，通过聚合酶链反应(PCR)来制备多核苷酸。一般来讲，此类技术可参考Minshull J.et al.，Methods 32(4)：416-427(2004)(Minshull J.等人，《方法学》，第32卷，第4期，第416-427页，2004年)。还可由许多商业公司(例如德国雷根斯堡的Geneart AG公司(Geneart AG，Regensburg，Germany))来合成DNA。
另一个实施例提供了包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列(i)与SEQ ID NO：1、2、4或5具有至少50％同一性，包括至少60％、 至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，和至少99％，或者(ii)在中度严格性至高严格性的条件下，能够与源自SEQID NO：1、2、4或5中所示的核苷酸序列的探针杂交，或者(iii)同与SEQ ID NO：1、2、4或5中所示的序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列互补。根据本发明可用的探针可包含SEQ ID NO：1、2、4或5的至少50、100、150、200、250、300个或更多个连续核苷酸。
这些分离的多核苷酸可编码本文所设想的葡糖淀粉酶，其包含与SEQ ID NO：3或6具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。提供了表达载体，其可包含本文所述的任何多核苷酸。本发明还公开了编码本文所提供的变体葡糖淀粉酶的DNA的片段(即部分)。这些片段可用于获得部分长度的DNA片段，其能够用于分离或鉴定编码本文通篇所述的成熟葡糖淀粉酶的多核苷酸。
在还另一个实施例中，葡糖淀粉酶变体可插入到生物体中，例如具有改变的热稳定性(例如更高的热稳定性)和/或提高的比活性的变体。
葡糖淀粉酶分子中结构的保守性与所有葡糖淀粉酶的活性的保守性和保守作用机制相关。鉴于这种较高的同源性，本文所设想的葡糖淀粉酶的位点特异性变体可导致改变的功能，并且预期具有其他葡糖淀粉酶变体中的类似的结构性结果，因此具有功能性结果。
如本文所设想的，葡糖淀粉酶变体可具有在与高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II(分别为SEQ ID NO：6和3)中特别鉴定的残基“等价”的位置处的氨基酸取代。
“结构同一性”决定氨基酸残基是否是等价的。结构同一性是当将两个结构(三维和氨基酸结构)进行比对时一对一的拓扑等价。如果葡糖淀粉酶的残基(氨基酸)位置与高粱红曲霉葡糖淀粉酶中的特定残基或该残基的部分同源(即在一级或三级结构中在位置上相对应)或类似(具有相同或相似的功能能力以结合、反应或在化学上相互作用)，则其“等价”于高粱红曲霉葡糖淀粉酶的残基。
为了确立与一级结构的同一性，可将特定葡糖淀粉酶的氨基酸序列与高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II序列直接进行比较，特别是与在序列已知的葡糖淀粉酶中已知不变的残基组进行比较。在将保守残基进行比对、允许 必要的插入和缺失以维持比对(即避免通过随意的缺失和插入而消除保守残基)后，与高粱红曲霉葡糖淀粉酶一级序列中的特定氨基酸等价的残基被限定。等价残基可由与高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II的100％保守性来定义。然而，大于75％或低至50％的保守残基的比对也可足以定义等价残基，特别是当包括基于结构同一性的比对时。
结构同一性涉及鉴别两个结构之间的等价残基。对于已通过X射线晶体学确定了其三级结构的酶，可通过确定三级结构水平上的同源性(结构同一性)来定义“等价残基”。等价残基定义为这样的残基：比对后，对其而言，高粱红曲霉葡糖淀粉酶的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子(N对N、CA对CA、C对C以及O对O)的原子坐标偏差在0.13nm以及任选在0.1nm之内。比对是在已将最佳模型进行取向和定位以使所考虑的葡糖淀粉酶的非氢蛋白质原子的原子坐标与高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II达到最大重叠后实现。最佳模型是对于可获得的最高分辨率下的实验衍射数据给出最低R因子的晶体模型。
功能上类似于高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II的特定残基的等价残基被定义为酶的这样的氨基酸，它们可采取某种构象，使得它们以确定的且归因于高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II的特定残基的方式改变、修饰或促成蛋白质结构、底物结合或催化作用。此外，它们是酶(可通过X射线晶体学获得其三级结构)的这样的残基，其占据类似的位置达到这样的程度，即尽管给定残基的主链原子可能不满足基于占据同源位置的等价标准，但该残基的至少两个侧链原子的原子坐标与高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II的相应侧链原子偏差在0.13nm内。在一些实施例中，本文所设想的变体葡糖淀粉酶可与SEQ ID NO：3或6的高粱红曲霉葡糖淀粉酶氨基酸序列具有至少50％序列同一性、至少60％序列同一性、至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少88％序列同一性、至少90％序列同一性、至少93％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一 性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性，以及至少99％序列同一性。
在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体将具有不止一个氨基酸取代。例如，与高粱红曲霉葡糖淀粉酶I或II相比，变体可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体包含在与非保守氨基酸的区域对应的位置中的至少一个氨基酸位置中的取代、缺失或插入。如本文所设想的，葡糖淀粉酶变体可具有在成熟蛋白质序列中的任何位置中的取代、缺失或插入。
如本文所设想的，可使用表达载体以酶的形式表达编码葡糖淀粉酶或葡糖淀粉酶变体的DNA序列，该表达载体通常包含编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选的阻遏基因或各种激活基因的控制序列。携带编码本文所设想的葡糖淀粉酶的DNA序列的重组表达载体可为任何可方便地进行重组DNA程序的载体。该载体可以是这样的载体，其当被引入到高粱红曲霉中时，整合到基因组中并且与其被整合到的染色体一起被复制。例如，可用编码葡糖淀粉酶的DNA构建体转化真菌细胞，并且将该DNA构建体以一个或多个拷贝整合到宿主染色体中。这种整合一般被认为是一个优势，因为DNA序列更有可能被稳定地保持。可根据常规方法来进行DNA构建体向宿主染色体中的整合，例如通过同源或异源重组来进行。
在并入了使用载体的实施例中，DNA序列应有效连接到合适的启动子序列。启动子可为任何在高粱红曲霉中显示转录活性的DNA序列，并且可源自编码与高粱红曲霉同源或异源的蛋白质的基因。指导编码葡糖淀粉酶变体的DNA序列的转录的合适启动子的例子为(仅以非限制性例子的方式)源自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、里氏木霉(T.reesei)纤维二糖水解酶I、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、或构巢曲霉(A.nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶A的基因的那些启动子。所设想的任何表达载体还可包含合适的转录终止子和多腺苷酸化序列，该多腺苷酸化序列有效连接到编码葡糖淀粉酶或变体的DNA序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适当地源自与启动子相同的来源。载体还可包含任何促成或实现载体在真菌宿主中复制的DNA序 列。载体还可包含另外的基因，其产物可弥补真菌宿主中的缺陷。例如，可并入选择性标记以提供药物抗性。如本文所设想的，分别用于连接编码葡糖淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件，并且将它们插入到含有复制必需的信息的合适载体中的所有程序，是本领域的技术人员可理解的。
在一个方面，本发明涉及具有本文所述的多肽的异源表达的宿主细胞，例如木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉)的真菌细胞。在另一个方面，真菌细胞为红褐肉座菌物种。
在一个方面，宿主细胞包含质粒或表达载体，或者优选地用质粒或表达载体转化，因此能够表达本文所设想的多肽。在一个方面，表达载体包含核酸，并且本文所设想的表达载体或质粒可包含源自木霉属的启动子(例如里氏木霉cbhI来源启动子)，和/或源自木霉属的终止子(例如里氏木霉cbhI来源终止子)，和/或一个或多个选择性标记(例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS和pyrG)，和/或一个或多个端粒区，其允许在宿主细胞中维持非染色体质粒。
在一个方面，本发明涉及分离本文所述的多肽的方法，该方法包括以下步骤：在具有所述多肽的异源表达的宿主细胞中诱导所述多肽的合成；回收由所述宿主细胞分泌的细胞外蛋白质；以及任选地纯化所述多肽。在另一个实施例中，葡糖淀粉酶可由经遗传修饰的高粱红曲霉产生。例如，高粱红曲霉可被遗传修饰以便产生富集或过表达的葡糖淀粉酶。提取方法可包括以下所提供的实验性例子中所描述的那些方法，或者通过本领域的技术人员所理解的从培养物提取葡糖淀粉酶的任何其他方式进行的那些方法。在一个实施例中，葡糖淀粉酶可由经遗传修饰的高粱红曲霉菌株过量产生，该菌株具有葡糖淀粉酶基因的多个拷贝。在另一个实施例中，真菌菌株可被遗传修饰以使其他分泌的酶失活。在又一个实施例中，葡糖淀粉酶基因的一个或多个拷贝可有效连接到不同的启动子，例如来自另一个基因的高效启动子区域。在还另一个实施例中，真菌菌株可为蛋白酶缺陷菌株或蛋白酶缺失菌株。
又一个方面涉及适用于大规模蛋白质纯化程序的用于分离葡糖淀粉酶I和II的改进和成本效益好的方法。在一个实施例中，该方法包括以下步骤：使高粱红曲霉的培养物生长，以及诱导葡糖淀粉酶的合成。编码葡糖 淀粉酶的DNA序列可为天然的或未修饰的序列，或者其可为修饰的序列。根据本领域的技术人员所理解的标准方法和程序，高粱红曲霉可通过涉及原生质体形成和原生质体转化然后是细胞壁的再生的方法来转化。也可使用任何转化高粱红曲霉的标准方法。用于培养高粱红曲霉的培养基可为任何常规的适于使真菌宿主生长并且诱导葡糖淀粉酶或其变体的表达的培养基。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公布的配方制备。从高粱红曲霉分泌的葡糖淀粉酶或其变体可便利地通过标准程序从培养基回收，所述标准程序包括通过离心或过滤从培养基分离细胞，以及借助于盐(例如硫酸铵)沉淀出培养基的蛋白质组分，然后使用色谱程序，例如离子交换色谱法、亲和色谱法等。因为葡糖淀粉酶是由高粱红曲霉分泌的仅有的优势酶，所以除去不需要的酶(例如α-淀粉酶)的任何额外分离步骤均得以减至最少或是不必要的。通过使得不必从其他不需要的蛋白质组分分离葡糖淀粉酶，建立了显著高效并且节约成本的程序。此外，高粱红曲霉宿主提供至少与其他葡糖淀粉酶宿主细胞类似的葡糖淀粉酶产率，而在另一个实施例中，与史载葡糖淀粉酶宿主细胞相比，将高粱红曲霉用作宿主提供了葡糖淀粉酶或其变体的更大产率。
在一个方面，本发明涉及分离本文所述的多肽的方法，该方法包括以下步骤：在具有所述多肽的异源表达的宿主细胞中诱导所述多肽的合成；回收由所述宿主细胞分泌的细胞外蛋白质；以及任选地纯化所述多肽。
通过本领域的技术人员所理解的标准方法来测定本文所设想的任何葡糖淀粉酶的活性和/或比活性。
4.组合物和用途
例如，本文所设想的葡糖淀粉酶可用于组合物中，该组合物包括但不限于淀粉水解和糖化组合物、清洁和洗涤剂组合物(例如衣物洗涤剂、盘碟洗涤剂和硬质表面清洁组合物)、乙醇发酵组合物，和动物饲料组合物。此外，这些葡糖淀粉酶可用于烘焙应用(例如面包和蛋糕生产)、酿造、医疗保健、纺织物、环境废物转化过程、生物制浆加工，和生物质转化应用。
在一些实施例中，包含本文所设想的葡糖淀粉酶的组合物将任选地与下述酶中的任一种组合使用或者与下述酶以任何组合使用：α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉 酶、纤维素酶、半纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶、乙酰乳酸脱羧酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶，以及其他葡糖淀粉酶。
在一些实施例中，组合物将包含所述一种或多种其他酶。在一些实施例中，组合物将包含所述一种或多种其他酶，所述酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
在另一个实施例中，本文所设想的一种或多种多肽和/或一种或多种其他酶通过巴氏灭菌来灭活，例如通过在啤酒(例如比尔森啤酒)中使用小于50、45、40、35、30、25、24、23、22、21或20个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。
在一些实施例中，组合物将包含α-淀粉酶，如真菌α-淀粉酶(例如曲霉属物种(Aspergillus sp.))或细菌α-淀粉酶(例如芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)，如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))，及其变体和杂合体。在一些实施例中，α-淀粉酶是酸稳定性α-淀粉酶。在一些实施例中，α-淀粉酶是白曲霉(Aspergillus kawachi)α-淀粉酶(AkAA)，参见美国专利No.7,037,704。考虑用于本发明的组合物中的市售α-淀粉酶是已知的，包括G-997、 FRED、XTRA(丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US，Inc，Genencor Division))、TERMAMYL 120-L和SUPRA(诺维信生物技术公司(Novozymes，Biotech.))。
在一些实施例中，组合物将包含酸性真菌蛋白酶。在又一个实施例中，组合物将包含源自微生物黑曲霉的变体的内切蛋白酶(EC 3.4.21.26)，其在2007年9月13日公布的WO2007/101888中所公开的脯氨酸残基的羧基位点处水解肽。在又一个实施例中，酸性真菌蛋白酶源自木霉属物种(Trichoderma sp)并且可为2006年7月13日公布的US 2006/0154353中所公开的蛋白酶中的任一者，所述专利以引用的方式并入本文。在又一个实施 例中，组合物将包含来自布丘氏菌属物种(Buttiauxiella spp.)的植酸酶(例如BP-17，还可参见PCT专利公布WO 2006/043178中所公开的变体)。在又一个实施例中，组合物将包含例如来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或来自在1986年10月14日公布的US 4,617,273中所公开的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的修饰菌株中表达的短芽孢杆菌(Bacillus brevis)ALDC基因的乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)EC 4.1.1.5。
在其他实施例中，可将本文所设想的葡糖淀粉酶与其他此类葡糖淀粉酶组合。在一些实施例中，此类葡糖淀粉酶将与如下葡糖淀粉酶组合：源自高粱红曲霉的其他各种菌株或变体或者曲霉属(Aspergillus)或其变体，例如米曲霉、黑曲霉、白曲霉、和泡盛曲霉(A.awamori)的一种或多种葡糖淀粉酶；源自腐质霉属(Humicola)的菌株或其变体的葡糖淀粉酶；源自篮状菌属(Talaromyces)的菌株或其变体(例如埃默森篮状菌(T.emersonii))的葡糖淀粉酶；源自阿太菌属(Athelia)的菌株(例如罗氏阿太菌(A.rolfsii))的葡糖淀粉酶；或源自青霉属(Penicillium)的菌株(例如产黄青霉(P.chrysogenum))的葡糖淀粉酶。
具体地讲，本文所设想的葡糖淀粉酶可用于淀粉转化工艺，特别是可用于果糖糖浆、特种糖的葡萄糖的生产中，以及用于由含淀粉底物发酵而产生醇和其他终产物(例如有机酸、抗坏血酸和氨基酸)(G.M.A.van Beynum et al.，Eds.(1985)STARCH CONVERSIONTECHNOLOGY，Marcel Dekker Inc.NY(G.M.A.Van Beynum等人编辑，1985年，《淀粉转化技术》，纽约马塞尔·德克尔公司)。用本公开的变体葡糖淀粉酶组合物生产的糊精可导致至少80％、至少85％、至少90％和至少95％的葡萄糖产率。用本文所设想的葡糖淀粉酶由淀粉底物发酵产生醇可包括产生燃料醇或可饮用的醇。在一些实施例中，当在与野生型葡糖淀粉酶相同的条件下使用变体葡糖淀粉酶时，醇的产生将较多。在一些实施例中，与野生型葡糖淀粉酶相比，醇的产生将多出约0.5％和2.5％之间，包括但不限于多出0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％和2.4％的醇。
在一些实施例中，本文所设想的葡糖淀粉酶将可用于水解来自各种基于植物的底物的淀粉，所述底物通常为用于醇产生的含有淀粉和/或糖的植物材料。在一些实施例中，所述基于植物的底物将包括玉米、小麦、大 麦、黑麦、蜀黍、稻米、甘蔗、马铃薯、木薯以及它们的组合。在一些实施例中，所述基于植物的底物将为分级的植物材料，例如被分级为诸如纤维、胚、蛋白质和淀粉(胚乳)之类的组分的谷物谷粒(如玉米)(美国专利No.6,254,914和美国专利No.6,899,910)。醇发酵的方法描述于THE ALCOHOL TEXTBOOK，A REFERENCE FORTHE BEVERAGE，FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES，3rd Ed.，Eds K.A.Jacqueset al.，1999，Nottingham University Press，UK(《醇教科书：饮料、燃料和工业酒精行业参考》，第3版，K.A.Jacques等人编辑，1999年，英国诺丁汉大学出版社)中。在某些实施例中，所述醇将为乙醇。特别地，醇发酵生产工艺表征为湿磨或干磨工艺。在一些实施例中，葡糖淀粉酶将用于湿磨发酵工艺中，而在其他实施例中，葡糖淀粉酶将可用于干磨工艺中。
干谷粒研磨涉及多个基本步骤，其通常包括：碾磨、蒸煮、液化、糖化、发酵、和将液体与固体分离以产生醇和其他副产物。对植物材料，特别是全谷物谷粒(例如玉米、小麦或黑麦)进行碾磨。在一些情况下，可将谷粒首先分级为组成部分。可研磨经碾磨的植物材料以获得粗颗粒或细颗粒。可将经碾磨的植物材料与液体(例如水和/或酒糟水)在浆料槽中混合。使浆料在喷射式蒸煮锅中与液化酶(例如α-淀粉酶)一起经受高温(例如90℃至105℃或更高)以将谷粒中的淀粉溶解并水解为糊精。可使混合物冷却并用糖化酶(例如本发明所涵盖的葡糖淀粉酶)进一步处理，以产生葡萄糖。然后，可在发酵微生物(如产乙醇微生物，特别是酵母(酵母菌属物种(Saccharomyces spp)))的存在下，使含有葡萄糖的糖化醪发酵大约24至120小时。将糖化醪中的固体与液相分离，获得醇(如乙醇)和有用的副产物(如酒糟)。
在一些实施例中，将糖化步骤与发酵步骤相组合，该工艺称为同时糖化和发酵或同时糖化、酵母增殖和发酵。
在其他实施例中，这些葡糖淀粉酶可用于淀粉水解工艺中，其中该工艺的温度为30℃和75℃之间，在一些实施例中，为40℃和65℃之间。在一些实施例中，葡糖淀粉酶可在pH 3.0和pH 6.5之间的pH下用于淀粉水解工艺中。一些实施例中的发酵工艺包括研磨谷物谷粒或经分级的谷粒，以及将经碾磨的谷物谷粒与液体结合以形成浆料，然后可在单个容器中将该浆料与根据本发明的葡糖淀粉酶和任选其他的酶以及酵母混合以产生乙 醇和其他副产物(参见例如美国专利No.4,514,496、WO 04/081193和WO04/080923)，所述其他的酶为例如但不限于α-淀粉酶、其他葡糖淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶或具有颗粒淀粉水解活性的其他酶。
在一些实施例中，本发明涉及糖化液体淀粉溶液的方法，该方法包括使用本文所设想的一种或多种葡糖淀粉酶的酶促糖化步骤。
在一些实施例中，本发明涉及水解和糖化待用于酿造的经糊化和液化(通常是液化)的谷粉淀粉的方法，由此将包含一种或多种本文所设想的葡糖淀粉酶的组合物用于增加从淀粉获得的酿造啤酒用酵母可发酵糖的量。将酿造工艺用于生产可饮用的产品啤酒，其中通过用酿造啤酒用酵母发酵而使可发酵糖转化为乙醇和CO2。传统上可发酵糖源自谷物谷粒中的淀粉，该淀粉任选补充有诸如葡萄糖和麦芽糖糖浆以及蔗糖之类的可发酵糖源。简而言之，本领域所熟知的啤酒生产通常包括下列步骤：制麦芽、糖化醪制备和发酵。
历史上，啤酒生产的第一步是制麦芽-谷物谷粒(例如大麦)的浸渍、萌发和干燥。在制麦芽过程中，萌发的谷物(例如大麦)仁中产生酶并且其化学组成中有某些改变(称为修饰)，包括淀粉、蛋白质和β-葡聚糖有一定程度的降解。
研磨发芽的谷物以提供谷粉，可将谷粉与经研磨的辅料(例如非萌发的谷物谷粒)混合以提供混合的谷粉。谷粉还可主要由或单独由辅料组成。将该谷粉与水混合并使其经历糖化醪制备；可将之前蒸煮的(糊化和液化)辅料(“辅料蒸煮”的所得物)添加到糖化醪。在各种温度下在一段时间中进行糖化醪制备工艺，以水解谷物蛋白质、降解β-葡聚糖并溶解和水解淀粉。在传统的糖化醪制备中，麦芽和辅料中的谷粉淀粉的水解被认为是由发芽大麦内源性的两种主要的酶催化的。α-淀粉酶随机裂解淀粉分子内部的α-1，4键而将其片段化为更小的糊精。β-淀粉酶从这些糊精的非还原末端顺次裂解α-1，4键，从而主要产生麦芽糖。α-和β-淀粉酶二者都不能水解α-1，6键(其形成淀粉分子中淀粉链的分支点)，这导致极限糊精在糖化醪中积聚。麦芽确实含有酶，即极限糊精酶，其催化α-1，6键的水解，但由于其不耐热性，其在糖化醪制备温度下仅显示出弱的活性。在糖化醪制备后，将液体提取物(麦芽汁)与废糟固形物(即构成谷粉的一部分的 不可溶谷粒和壳材料)分离。麦芽汁分离的目的包括：·获得良好的提取物回收率，·获得良好的滤过率，以及·产生澄清的麦芽汁。麦芽汁的提取回收率和过滤性在酿造工艺的经济性方面是重要的。
麦芽汁的组成取决于原材料、糖化醪制备工艺和特征以及其它变量。典型的麦芽汁包含65-80％的可发酵糖(葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖)，以及20-35％的非可发酵极限糊精(具有比麦芽三糖更高的聚合度的糖)。当以高水平的辅助的未出芽谷物谷粉酿造时，可引起糖化醪制备工艺中淀粉水解酶的不足。因此需要外源性酶来源，所述外源性酶能够在糖化醪制备的过程中产生可发酵的糖。此外，也需要此类外源性酶以降低麦芽汁中非可发酵糖的水平，伴有可发酵糖的相应增加，以酿造具有低碳水化合物含量的高发酵度啤酒。本文中公开的是用于淀粉水解的酶组合物，其包含至少一种本文中所设想的葡糖淀粉酶，可将其加入糖化醪中或用于酿造工艺的糖化醪制备步骤中，以便裂解淀粉谷粉中的α-1，4键和/或α-1，6键并从而增加麦芽汁中的可发酵糖含量和减少成品啤酒中的非可发酵糖残余物。此外，可干燥(通过例如喷雾干燥)或浓缩(例如煮沸和蒸发)如此制备的麦芽汁以提供糖浆或粉末。
本文所设想的谷粉可包含任何含有淀粉和/或糖的植物材料，所述植物材料可源自任何植物和植物部分，包括例如之前所述的块茎、根、茎、叶和种子。优选地，谷粉包含谷粒，例如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻米、蜀黍、粟和高粱的谷粒，并且更优选至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％，例如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量)的麦芽汁的谷粉源自谷粒。最优选地，所述谷粉包含发芽的谷粒，如大麦麦芽。优选地，至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％(如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量))的麦芽汁的谷粉源自发芽的谷粒。优选地，所述谷粉包含辅料，如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、蜀黍、粟和高粱的未发芽谷粒，更优选地，至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％，如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量)的所述麦芽汁的谷粉源自未发芽谷粒或其它辅料。可在本发明的糖化醪制备工艺之前、期间或之后将包含可容易发酵的碳水化合物(如糖或糖浆)的辅料加入麦芽糖 化醪，但优选在糖化醪制备工艺之后加入。在加入到糖化醪中之前，可用α-淀粉酶，和/或内切肽酶(蛋白酶)和/或内切葡聚糖酶处理辅料的一部分，和/或对其进行热处理。如本文所设想的用于水解淀粉的酶组合物可包含另外的酶，优选选自如下的酶：α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。在糖化醪制备的过程中，将从谷粉中提取的淀粉逐渐水解为可发酵糖和更小的糊精。优选地，在麦芽汁分离之前，糖化醪对于碘测试是淀粉阴性的。
糖化醪制备之后，麦芽汁(液体提取物麦芽汁)通过滤清或糖化醪过滤的过程从废糟固形物分离。麦芽汁分离的目的包括：良好的提取物回收率；良好的滤过率，以及澄清的麦芽汁(更多信息可见于“Technology Brewing and Malting”by Wolfgang Kunze of theResearch and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB)，3rd completely updatededition，2004，ISBN3-921690-49-8(柏林酿造研究学院的Wolfgang Kunze所著的《酿造和制麦技术》，第三完全更新版，2004年，ISBN 3-921690-49-8))。
在酿造工艺的第三步(发酵)之前，通常将麦芽汁转移到酿造罐中并剧烈煮沸50-60分钟。在麦芽汁沸腾期间中发生多个重要的过程(更多信息可见于“Technology Brewingand Malting”by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute ofBrewing，Berlin(VLB)，3rd completely updated edition，2004，ISBN 3-921690-49-8(柏林酿造研究学院的Wolfgang Kunze所著的《酿造和制麦技术》，第三完全更新版，2004年，ISBN 3-921690-49-8))，包括内源性麦芽酶和加入到糖化醪或辅料中的任何外源性酶的失活。然后冷却煮沸的麦芽汁，用酿造啤酒用酵母接种，并且在8-16℃范围内的温度下发酵以将可发酵糖转化为乙醇。可通过用于选择性除去醇的真空蒸发工艺从最终的啤酒产生低醇啤酒。此外，可将啤酒花添加到麦芽汁中。
在一个方面，本发明涉及本文所设想的多肽或组合物在发酵中的用途，其中在发酵步骤之前或期间添加所述多肽或组合物。在又一个方面，所述发酵步骤之后是巴氏灭菌步骤。在一个方面，所述发酵饮料选自啤 酒，例如低醇啤酒或低卡路里啤酒。在另一个方面，所述多肽或所述组合物与一种或多种另外的酶组合在一起添加，所述酶选自α-淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。在还又一个方面，所述多肽和/或所述一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中失活。
在一个方面，以例如1-1000mg/kg谷粉、如20-500mg/kg谷粉、如30-400mg/kg谷粉、如40-300mg/kg谷粉、如50-200mg/kg谷粉的量来添加本文所设想的一种或多种多肽。
在一个方面，以例如至少1、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mg/kg谷粉的量来添加本文所设想的一种或多种多肽。
在一个替代实施例中，本发明涉及一种方法，例如在其中发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中的方法中，该方法包括在发酵步骤之前或期间添加本文所述的多肽或组合物，例如在包括发酵步骤或任选的啤酒过滤步骤之后的巴氏灭菌步骤的方法中。
在一个方面，本发明涉及生产发酵饮料的方法，该方法包括以下步骤：
a)制备糖化醪(例如得自谷粉)，其中所述谷粉例如包含发芽和/或未发芽的谷粒或来自另一种作物的淀粉基材料中的一种或多种，并且其中该步骤任选地还包括将所述糖化醪与一种或多种另外的酶接触，
b)过滤糖化醪以获得麦芽汁，以及
c)对麦芽汁进行发酵以获得发酵饮料，
以及任选地进行巴氏灭菌步骤(d)，
其中将本文所述的多肽或组合物添加到：
i.步骤(a)的糖化醪和/或
ii.步骤(b)的麦芽汁和/或
iii.步骤(c)的麦芽汁。
在一个方面，可任选地添加到步骤a中的一种或多种酶可选自淀粉脱支酶、R-酶、极限糊精酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内 肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。在另一个方面，还可通过将步骤(b)或(c)的麦芽汁与一种或多种另外的酶接触来添加一种或多种酶，其中所述酶选自淀粉脱支酶、异淀粉酶和极限糊精酶，包括它们的任何一种或多种组合。
在一个替代实施例中，本发明涉及使用包含一种或多种本文所设想的葡糖淀粉酶(例如不耐热的葡糖淀粉酶)的组合物来提高麦芽汁中可发酵糖的量的方法，由此在麦芽汁煮沸后将所述组合物加入麦芽汁中，使得一种或多种葡糖淀粉酶在发酵步骤中是有活性的。可在用酿造啤酒用酵母接种麦芽汁之前、与之同时或在之后将组合物加入到煮沸的麦芽汁中。在发酵和成熟步骤结束时，接着对啤酒(其可任选经受真空蒸发以产生低醇啤酒)进行任选地过滤和/或巴氏灭菌。该方法的内在优势在于发酵过程的持续时间为约6-15天(取决于接种率、发酵、温度等)，与短的糖化醪制备步骤(2-4小时的持续时间)相比，这使得有更多的时间来对非可发酵糖进行酶促裂解。该方法的另外的优点在于实现所期望的非可发酵糖减少(和可发酵糖增加)所需的组合物的量，与实现非可发酵糖的类似减少而将需要向糖化醪中加入的量相比，其对应于显著更低数目的酶活性单位(例如葡糖淀粉酶活性单位)。此外，其消除了当在糖化醪中加入高剂量率的葡糖淀粉酶时，在麦芽汁分离(特别是通过滤清(lautering)进行分离)过程中通常所见的困难。已经出乎意料地发现，与葡糖淀粉酶的替代来源相比，本文所设想的葡糖淀粉酶是足够温度敏感的，使得成品啤酒的最终热处理步骤(标准巴氏灭菌条件)足以使其催化活性失活。因此包含本文所设想的一种或多种葡糖淀粉酶的组合物的一个重要优点在于，其可用于在酿造的发酵步骤期间减少麦芽汁中的非可发酵糖的量以便酿造具有低碳水化合物含量的高发酵度啤酒，并且其中该组合物的催化活性易通过啤酒巴氏灭菌过程中的热处理而失活，从而避免固定化酶反应器的费用或基因工程酿造啤酒用酵母的使用。
本发明还提供生产食品、饲料或饮料产品(例如醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，例如葡萄酒、苹果酒、 醋、米酒、酱油或果汁)的方法，所述方法包括用本文所述的多肽或组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。在另一个方面，本发明还涉及试剂盒，其包含本文所设想的多肽或组合物；以及所述多肽或组合物的使用说明书。本发明还涉及通过本文所述的方法生产的发酵饮料。
本发明还提供包含至少一种本文所设想的葡糖淀粉酶的动物饲料组合物或配方。例如WO 03/049550(以引用的方式全文并入本文)中提供了在制备包含淀粉的饲料中使用葡糖淀粉酶的方法。简而言之，将葡糖淀粉酶与包含淀粉的饲料混合。所述葡糖淀粉酶能够降解抗性淀粉以便动物使用。
根据本说明书，本公开的其他目标和优势将显而易见。
5.根据本发明的另外的实施例：
实施例 1.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽选自：
a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；
b)由以下编码的多肽：i)在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中包含的核酸序列、或ii)i)的cDNA序列、或iii)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的序列、或iv)在至少低严格性条件下与i)、ii)、或iii)的互补链杂交的多核苷酸；
c)包含氨基酸序列中的一种或多种氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽；
d)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3或6的成熟多肽编码序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；和
e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的片段。
实施例 2.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：3和6的成熟多肽的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
实施例 3.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽由以下编码：i)在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中包含的核酸序列、或ii)i)的cDNA序列、或iii)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的序列、或iv)在至少低严格性条件下与i)、ii)、或iii)的互补链杂交的多核苷酸。
实施例 4.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽包含选自SEQ IDNO：3和6的成熟多肽的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。
实施例 5.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3或6的成熟多肽编码序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
实施例 6.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽为根据实施例1-5中任一项所述的多肽的片段。
实施例 7.根据实施例1-6中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含至少选自以下组的一个或多个氨基酸残基：
a.选自与SEQ ID NO：3或6中的第459位对应的位置处的A和P的氨基酸残基，
b.选自与SEQ ID NO：3或6中的第473位对应的位置处的C和S的氨基酸残基，
c.选自与SEQ ID NO：3或6中的第474位对应的位置处的A和R的氨基酸残基，
d.选自与SEQ ID NO：3或6中的第475位对应的位置处的A和P的氨基酸残基，
e.选自与SEQ ID NO：3或6中的第476位对应的位置处的T和Y的氨基酸残基，
f.选自与SEQ ID NO：3或6中的第477位对应的位置处的P和G的氨基酸残基，
g.选自与SEQ ID NO：3或6中的第479位对应的位置处的A和G的氨基酸残基和/或
h.选自与SEQ ID NO：3或6中的第480位对应的位置处的V和R的氨基酸残基。
实施例 8.根据实施例1-7中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ IDNO：3或6的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
实施例 9.根据实施例1-8中任一项所述的多肽，其包含SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列或其具有葡糖淀粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO：3或6的氨基酸序列或其具有葡糖淀粉酶活性的片段组成。
实施例 10.根据实施例1-9中任一项所述的多肽，其包含SEQ ID NO：3或6的成熟多肽，或者由SEQ ID NO：3或6的成熟多肽组成。
实施例 11.根据实施例1-10中任一项所述的多肽，其中一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的同一性百分数通过使用具有如下默认设置的蛋白质-蛋白质Blast搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)来测定：得分矩阵：blosum62，非冗余蛋白质序列数据库和blast算法
实施例 12.根据实施例1-11中任一项所述的多肽，该多肽通过巴氏灭菌来灭活，例如在啤酒中使用小于50、45、40、35、30、25、24、23、22、21或20个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。
实施例 13.根据实施例1-12中任一项所述的多肽，该多肽的葡糖淀粉酶活性(GAU)为0.05-10GAU/mg，例如0.1-5GAU/mg，例如0.5-4GAU/mg，例如0.7-3GAU/mg，或例如1-3GAU/mg。
实施例 14.根据实施例1-13中任一项所述的多肽，其中该多肽不具有SBD。
实施例 15.根据实施例1-14中任一项所述的多肽，其具有至多480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、495、500、505、507、515、525、535、545、555、565或573个氨基酸残基。
实施例 16.根据实施例1-15中任一项所述的多肽，其中该多肽与SEQ ID NO：3相比是截短的。
实施例 17.根据实施例1-16中任一项所述的多肽，其通过在宿主细胞中的重组表达获得。
实施例 18.一种核酸，其能够编码根据实施例1-17中任一项所述的多肽。
实施例 19.一种表达载体，其包含根据实施例18所述的核酸，或者能够表达根据实施例1-17中任一项所述的多肽。
实施例 20.如实施例19中所定义的表达载体或质粒，其包含源自木霉属的启动子，例如里氏木霉cbhI来源的启动子。
实施例 21.如实施例19中所定义的表达载体或质粒，其包含源自木霉属的终止子，例如里氏木霉cbhI来源的终止子。
实施例 22.根据实施例19所述的表达载体或质粒，其包含一种或多种选择性标记，例如构巢曲霉amdS和pyrG。
实施例 23.根据实施例19所述的表达载体或质粒，其包含一个或多个端粒区域，所述端粒区域使得可以在宿主细胞中维持非染色体质粒。
实施例 24.一种宿主细胞，其具有如实施例1-17中任一项所定义的多肽的异源表达。
实施例 25.如实施例17和24中任一项所定义的宿主细胞，其中该宿主细胞为真菌细胞。
实施例 26.根据实施例25所述的宿主细胞，其中该真菌细胞属于木霉属。
实施例 27.根据实施例26所述的宿主细胞，其中该真菌细胞属于里氏木霉物种。
实施例 28.根据实施例26所述的宿主细胞，其中该真菌细胞属于红褐肉座菌物种。
实施例 29.一种宿主细胞，其包含如实施例19-23中任一项所定义的质粒或表达载体，或者优选地用该质粒或表达载体转化。
实施例 30.一种分离如实施例1-17中任一项所定义的多肽的方法，该方法包括以下步骤：在如实施例25-29中任一项所定义的具有所述多肽的异源表达的宿主细胞中诱导所述多肽的合成；以及回收由所述宿主细胞分泌的细胞外蛋白质；以及任选地纯化所述多肽。
实施例 31.一种制备如实施例1-17中任一项所定义的多肽的方法，该方法包括以下步骤：在如实施例25-29中任一项所定义的具有所述多肽的异源表达的宿主细胞中诱导所述多肽的合成；以及任选地纯化所述多肽。
实施例 32.一种表达如实施例1-17中任一项所定义的多肽的方法，该方法包括获得如实施例25-29中任一项所定义的宿主细胞，以及从所述宿主细胞表达所述多肽，以及任选地纯化所述多肽。
实施例 33.根据实施例30-32中任一项所述的方法，其中如实施例1-17中任一项所定义的多肽为优势分泌蛋白。
实施例 34.一种组合物，其包含一种或多种如实施例1-17中任一项所定义的多肽。
实施例 35.根据实施例34所述的组合物，其中所述组合物选自淀粉水解组合物、糖化组合物、洗涤剂组合物、醇发酵酶组合物，以及动物饲料动物饲料组合物。
实施例 36.根据实施例34-35中任一项所述的组合物，其包含一种或多种另外的酶。
实施例 37.根据实施例36所述的组合物，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
实施例 38.根据实施例34-37中任一项所述的组合物，该多一种或多种肽和/或一种或多种另外的酶通过巴氏灭菌来灭活。
实施例 39.根据实施例38所述的组合物，其中所述多肽和/或所述一种或多种另外的酶通过巴氏灭菌来灭活，例如在啤酒中通过使用小于50、45、40、35、30、25、24、23、22、21或20个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。
实施例 40.如实施例1-17中任一项所定义的多肽或如实施例34-39中任一项所定义的组合物在发酵中的用途，其中在发酵步骤之前或期间添加所述多肽或组合物。
实施例 41.根据实施例40所述的用途，其中所述发酵步骤和任选的啤酒过滤步骤之后是巴氏灭菌步骤。
实施例 42.根据实施例40-41中任一项所述的用途，其中所述发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中。
实施例 43.根据实施例40-42中任一项所述的用途，其中所述发酵饮料选自啤酒，例如低醇啤酒或低卡路里啤酒。
实施例 44.根据实施例40-43中任一项所述的用途，其中所述多肽或所述组合物与一种或多种另外的酶进行组合来添加。
实施例 45.根据实施例44所述的用途，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
实施例 46.根据实施例40-45中任一项所述的用途，其中所述多肽和/或所述一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中失活。
实施例 47.根据实施例40-46中任一项所述的用途，其中以1-1000mg/kg谷粉，例如20-500mg/kg谷粉、例如30-400mg/kg谷粉、例如40-300mg/kg谷粉、例如50-200mg/kg谷粉的量来添加所述多肽。
实施例 48.不耐热多肽用以提高酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖的产量的用途，其中所述多肽为如实施例1-17中任一项所定义的。
实施例 49.一种方法，其包括在发酵步骤(例如利用酵母的发酵步骤)之前或期间添加如实施例1-17中任一项所定义的多肽或如实施例34-39中任一项所定义的组合物。
实施例 50.根据实施例49所述的方法，其包括发酵步骤或任选的啤酒过滤步骤之后的巴氏灭菌步骤。
实施例 51.根据实施例49-50中任一项所述的方法，其中所述发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中。
实施例 52.根据实施例49-51中任一项所述的方法，其中所述发酵饮料选自啤酒，例如低醇啤酒、低卡路里啤酒。
实施例 53.根据实施例49-51中任一项所述的方法，其中所述多肽或所述组合物与一种或多种另外的酶进行组合来添加。
实施例 54.根据实施例53所述的方法，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
实施例 55.根据实施例49-54中任一项所述的方法，其中所述多肽和/或所述一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中失活。
实施例 56.根据实施例49-55中任一项所述的方法，其中以1-1000mg/kg谷粉，例如20-500mg/kg谷粉、例如30-400mg/kg谷粉、例如40-300mg/kg谷粉、例如50-200mg/kg谷粉的量来添加所述多肽。
实施例 57.根据实施例49-56中任一项所述的用于生产发酵饮料的方法，其包括以下步骤：
a)制备糖化醪，
b)过滤糖化醪以获得麦芽汁，以及
c)对麦芽汁进行发酵以获得发酵饮料，
其中将如实施例1-17中任一项所定义的多肽或如实施例34-39中任一项所定义的组合物添加到：
i.步骤(a)的糖化醪和/或
ii.步骤(b)的麦芽汁和/或
iii.步骤(c)的麦芽汁。
实施例 58.根据实施例57所述的方法，其中对所述发酵饮料执行巴氏灭菌步骤(d)。
实施例 59.根据实施例57-58中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的糖化醪得自谷粉。
实施例 60.根据实施例57所述的方法，其中所述谷粉包含发芽和/或未发芽的谷物或来自另一种作物的淀粉基材料中的一种或多种。
实施例 61.根据实施例57-60中任一项所述的方法，该方法进一步包括使步骤(a)的糖化醪与一种或多种另外的酶接触。
实施例 62.根据实施例61所述的方法，其中所述酶选自淀粉脱支酶、R-酶、极限糊精酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
实施例 63.根据实施例57-62中任一项所述的方法，该方法进一步包括使步骤(b)或(c)的麦芽汁与一种或多种另外的酶接触，其中所述酶选自淀粉脱支酶、异淀粉酶和极限糊精酶，包括它们的任何一种或多种组合。
实施例 64.一种发酵饮料，其中该发酵饮料通过如实施例49-63中任一项所定义的方法来生产。
实施例 65.根据实施例64所述的发酵饮料，其为啤酒，例如低醇啤酒或低卡路里啤酒。
实施例 66.一种用于生产食品、饲料或饮料产品(例如醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，例如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁)的方法，所述方法包括用根据实施例1-17所述的多肽或如实施例34-39中任一项所定义的组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。
实施例 67.一种试剂盒，其包含根据实施例1-17所述的多肽或如实施例34-39中任一项所定义的组合物；以及所述多肽或组合物的使用说明书。
提供了以下实例，并且应当理解，在不脱离所讨论的实施例的精神的情况下可进行各种修改。
5.实验
实例1
高粱红曲霉的发酵液中的酶活性分析以及与其他微生物的比较
将CBS302.78在28℃下在50ml MD培养基[酪蛋白氨基酸(9g/L)、MgSO4.7H2O(1g/L)、(NH4)2SO4(5g/L)、KH2PO4(4.5g/L)、CaCl2.2H2O(1g/L)、PIPSS(33g/L)、2.5ml/L里氏木霉微量元素[柠檬酸(175g/L)、FeSO4.7H2O(200g/L)、ZnSO4.7H2O(16g/L)、CuSO4.5H2O(3.2g/L)、 MnSO4.H2O(1.4g/L)、H3BO3(0.8g/L)]、500ml 30％麦芽糖，pH 5.5]中发酵7天。如图1所示，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析高粱红曲霉的发酵液以及表1中列出的其他野生型真菌菌株。根据制造商的方案，用12孔的1.0mm InvitrogenNovex 10％ Bis-Tris凝胶(目录号NP0302box)、See-预染标准品(目录号LC5625)和 MES SDS运行缓冲液(目录号NP0002)，运行所有SDS_PAGE凝胶。
使用Bradford测定法进行总蛋白定量。试剂溶液为Bradford Quikstart工作溶液(伯乐公司(BioRad)目录号500-0205)。将100μl的上清液置于新的96孔平底板中。向每个孔中添加200UI试剂，并且在室温下温育5分钟。在MTP读板仪(分子仪器公司(MolecularDevices)Spectramax 384plus)中在595nm处测量吸光度。根据牛血清白蛋白(BSA)(0-50Ug/ml)标准曲线来计算蛋白质浓度。
表1
出乎意料的是，高粱红曲霉的发酵液在与其他丝状真菌的葡糖淀粉酶相同范围内的尺寸(62kDa)处显示出明亮蛋白条带。重复高粱红曲霉的50mL发酵，并且如图2所示，PAGE凝胶显示出62和49kDa的丰富蛋白条带。
将这两个条带从凝胶分离，并且通过液相色谱-质谱(LC/MS)来分析。从该结果可得出的结论是，62kDa条带代表葡糖淀粉酶，而49kDA条带代表葡糖淀粉酶前体蛋白质。
生成足够的酶样品以用于小规模应用测试。在2L摇瓶中在28℃下进行五个400mLMD培养基发酵4天。发酵液的SDS-PAGE分析示于图3中。在Sorvall GS-3 Rotor中以8.500rpm将培养物离心30分钟，并且通过用0.22μm过滤器(密理博公司(Millipore))过滤对离心液进行除菌。使用具有10kDa截留分子量的VivaSpin 200超滤装置来浓缩滤液。
pNPG葡糖淀粉酶活性测定法：
试剂溶液：NaAc缓冲液(pH 4.5的200mM乙酸钠缓冲液)；底物(50mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma N-1377)于NaAc缓冲液中的溶液(0.3g/20ml))，以及终止溶液(800mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH10)。将30μl经过滤的上清液置于新的96孔平底MTP中。向每个孔中添加50μl NaAc缓冲液和120μl底物并在50℃下温育(热电雷勃公司(Thermolabsystems)iEMS培养箱/摇荡器HT)30分钟。通过加入100μl终止溶液而使反应终止。在MTP读板仪(分子仪器公司(Molecular Devices)Spectramax 384 plus)中在405nm处测量吸光度并用0.011μM/cm的摩尔消光系数来计算活性。
如下表2所示来测定GA活性。
表2
菌株 基因来源： 总蛋白(mg/ml) 单位GA/L 比活性
GAV213 高粱红曲霉 1.66 145 87
通过SDS-PAGE分析将高粱红曲霉的发酵液与黑曲霉的发酵液进行比较。在图4中可以看出，野生型高粱红曲霉的葡糖淀粉酶的产量非常高，并且发酵的产率与黑曲霉菌株dgr246处于相同数量级。
出乎意料的是，如图4所示，黑曲霉的发酵液包含分泌的α-淀粉酶，而高粱红曲霉的发酵液仅示出了葡糖淀粉酶。因此，可以看出，葡糖淀粉酶是由高粱红曲霉分泌的仅有优势酶。
实例2
高粱红曲霉葡糖淀粉酶基因的阐释
为了进一步表征来自高粱红曲霉的葡糖淀粉酶，将具有2％麦芽糖的MD-培养基中预生长过夜的高粱红曲霉菌株(CBS302.78)培养物在具有15％麦芽糖的新鲜MD-培养基中诱导8小时以引发葡糖淀粉酶合成。使用Qiagen植物小量提取试剂盒(目录号74904)从高粱红曲霉分离总RNA。使用Invitrogen RNase AWAY(目录号10328-011)来清除所有材料和工作表面的RNA酶。
使用CloneminerTM文库构建试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，目录号18249-029)利用总RNA来构建cDNA文库。将来自该文库的大约2920个菌落涂布于补充有卡那霉素(50μg/ml)的2TY-培养基[细菌用胰蛋白胨(16g/L)、细菌用酵母提取物(10g/L)、NaCL(5g/L)、琼脂(15g/L)]上。将菌落转移到Hybond-N膜(目录号RPN2222N)上。使用美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏应用科学部(Roche Applied Science，Indianapolis，IN 46250-0414USA)的标记和检测系统，通过Southern杂交对膜筛选葡糖淀粉酶cDNA插入片段。所使用的同源探针在两个步骤的过程中分离。首先，使用由得自MS/LC的氨基酸片段设计的如下简并引物，通过PCR从cDNA文库模板分离高粱红曲霉GA基因的内部片段：正向简并引物：5’-GAYTAYTTYTAYACNTGG-3’(SEQ ID NO：7)和反向简并引物：5’-YTGRTANACRTCDTCNGG-3’(SEQID NO：8)。在下一个步骤中，使用源自上述片段的如下同源引物，通过PCR分离同源探针：MkGA探针正向：5’-CTGGTCAATGGTGACGTGAATC-3’(SEQ ID NO：9)和MkGA探针反向：5’-GCAATACCCGAGTTGAGAGAGTAG-3’(SEQ ID NO：10)。2920个这些菌落中有二十三(23)个产生阳性杂交信号，并且通过序列分析而证实其包含葡糖淀粉酶cDNA片段。这些葡糖淀粉酶cDNA片段的序列分析结果表明，存在葡糖淀粉酶的两种不同变体。在本文称为葡糖淀粉酶II的第一较长变体编码具有淀粉结合域(SBD)的葡糖淀粉酶，而在本文称为葡糖淀粉酶I的第二较短变体编码无SBD的葡糖淀粉酶(分别为SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 5)。两个变体之间的差别是在连接区末端处将催化核心与SBD分离的162个碱基对的空位(SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 6)。序列中的该空位导致阅读框位移+1至+3，因此，翻译的初步终止似乎是造成这 两种葡糖淀粉酶形式的原因。此外，据发现，葡糖淀粉酶II cDNA中的额外突变导致在第507位处丙氨酸取代脯氨酸(A507P)的氨基酸取代。
为了获得关于2种cDNA物质的内含子位置和起点的更多信息，使用如下特异性引物对基因组DNA进行PCR，从SBD的第一起始密码子开始至终止密码子：MkGA正向引物：5’-ATGATTGACACAAAACCGACTGATATCGTCTC-3’(SEQ ID NO：11)和MkGA反向引物：5’-CTACTTCCAGCTGTCGTTGACGGTCAC-3’(SEQ ID NO：12)。根据供应商的方案，使用得自英杰公司(Invitrogen)的Taq高保真DNA聚合酶(目录号11304-011)在MJ ResearchPTC-200Peltier热循环仪上进行该反应。根据制造商的方案，使用QiagenPCR纯化试剂盒(目录号28106)对所有PCR产物进行纯化。PCR显示了凝胶上的两个条带，所述条带长度为大约2.1kb和2.3kb(未示出)。序列分析表明，两种基因组片段编码葡糖淀粉酶I和II形式(分别为SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 1)。在外显子序列内，这些片段显示出与上述相应cDNA克隆的100％同一性。序列比对使得可以鉴定较长葡糖淀粉酶II基因内的4个内含子。较短葡糖淀粉酶I基因在连接区末端处缺少完全相同的162个碱基对片段，并且在第507位处带有作为较短cDNA克隆的突变。基于这些结果可得出的结论是，高粱红曲霉基因组包含两个密切相关的编码具有和不具有SBD的蛋白质的葡糖淀粉酶基因。还发现，除了单核苷酸变化之外，重叠区域内的两个基因几乎相同。
实例3
来自发酵液的高粱红曲霉葡糖淀粉酶在常规乙醇发酵中的用途
将高粱红曲霉葡糖淀粉酶用以糖化经液化的淀粉和支持乙醇发酵的用途与来自黑曲霉的葡糖淀粉酶进行比较。
按照以下所述来进行乙醇发酵测定法：在75℃下解冻冷冻的液化物(具有32％干固形物(DS)含量的液化淀粉)，然后使其达到室温，所测得的pH为5.6。乙醇酵母由红星酵母公司(Red Star Yeast Company)提供。然后将液化物以150克的量分配到250ml锥形瓶中。将500μl的20％酵母/水溶液和600μl的10％尿素/水溶液(400ppm)加入到每个烧瓶。酶的剂量依照表3中的实验设计。因为MkGA的活性相对较低，所以需要较大的体积来 实现所需剂量。将水加入到烧瓶中以保持体积恒定。将烧瓶在强制通风摇荡器中以150rpm在32℃下温育。
表3
烧瓶 说明 μLGA μL水 总μL 葡糖淀粉酶单位(GAU)
1和2 AnGA 32.0 2101.0 2133.0 15.6
3和4 MkGA@0.325 1733.0 400.0 2133.0 15.6
5和6 MkGA@0.40 2133.0 0 2133.0 19.2
AnGA：黑曲霉葡糖淀粉酶(487个葡糖淀粉酶单位/g)
MkGA：高粱红曲霉葡糖淀粉酶I和II制剂(9个葡糖淀粉酶单位/g)
在预定时间间隔从每个烧瓶取出样品进行HPLC分析，并在发酵结束时从每个烧瓶取出样品进行淀粉分析。
对于HPLC分析，首先将样品离心，在0.1N H2SO4中1∶10稀释，加热至75℃15分钟，并且通过0.45微米过滤器过滤。将10微升样品注射到耦合至折射率检测器的HPLCPhenomenex Rezex有机酸柱中，其中23分钟HPLC运行条件是：在65℃下，用0.01N H2SO4作为流动相。
对于不溶性残余淀粉(IRS)分析，将发酵液的100g等分试样置于250ml锥形瓶中，并且在用搅拌棒搅拌的同时，将样品加热到沸点，并且煮沸10分钟，然后离心(HOT)。滗析上清液，使之在冰上冷却10分钟，然后升温至室温。然后将1.0ml上清液样品加入到15ml测容积试管中的14ml的蒸馏H2O中，并且使不溶性淀粉残余物沉降过夜。视觉评估沉淀淀粉的体积。
表4
在表1和图5中可以看出，当在相等数量的葡糖淀粉酶单位(GAU)/g干固形物(DS)的液化淀粉剂量基础上比较时，使用高粱红曲霉葡糖淀粉酶(MkGA)获得比黑曲霉葡糖淀粉酶更快的乙醇发酵速率，指示更好的碳转化效率。使用两种葡糖淀粉酶产生的醇的最终产率是相当的，为大约14.3％。
当在0.325GAU/g DS的基础上比较时，在葡糖淀粉酶存在下进行液化淀粉的乙醇发酵之后剩余的不溶性残余淀粉(IRS)的量对于高粱红曲霉葡糖淀粉酶(MkGA)而言大于黑曲霉葡糖淀粉酶。然而，MkGA剂量增加25％(0.4GAU/g DS)得到与0.325GAU/g DS的AnGA(图6)相似的IRS水平。
实例4
来自发酵液的高粱红曲霉葡糖淀粉酶在酿造的发酵步骤中的用途
将高粱红曲霉葡糖淀粉酶用以糖化麦芽汁碳水化合物和支持乙醇发酵的用途与X4进行比较，所述X4包含来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(AnGA)。使用初始比重为1056.7(即13.92°Plato)的由Munton苦味酒家酿成套材料(Munton′sBitter Home Brew Kit)制备的加入啤酒花的麦芽汁来进行发酵试验。将200ml的麦芽汁加入到每个500ml烧瓶(发酵容器，FV)中，然后将其在99℃下高压灭菌10分钟，然后冷却。对烧瓶进行以下添加：
-阴性对照烧瓶容纳1ml无菌水；
-阳性对照烧瓶容纳1ml由杰能科国际公司(Genencor International)提供的X4(源自黑曲霉菌株的浓缩葡糖淀粉酶)100倍稀释液，相当于每hl接种的麦芽汁为5gX4的添加率；
-测试烧瓶容纳1ml的2.9g→5ml高粱红曲霉葡糖淀粉酶的稀释液，就每hl接种的麦芽汁添加的葡糖淀粉酶活性单位而言，相当于用于阳性对照中的X4的相同添加率。
向每个烧瓶以每ml每°Plato 10.106的剂量率加入W34/70(唯森公司(Weihenstephan))酵母，使发酵在标准化实验室测试条件(22.5℃的高温，100rpm的轻柔搅拌，在轨道培养箱中长达165小时)下进行。在预定时间间隔对每个烧瓶分析重量损失和比重，同时计算最终发酵麦芽汁(啤酒)的实际发酵程度(RDF，其为以百分数形式表示的实际发酵度)，并且采用实例3中所述的方法对样品进行碳水化合物组成和发酵产物的HPLC分析。使用液体比重计或安东帕密度计(例如DMA 4100 M)来测量发酵之前、期间和之后的麦芽汁比重，并且根据Ensminger列出的公式(参见http://hbd.org/ensmingr/，“Beer data：Alcohol，Calorie，and Attenuation Levels of Beer”(“啤酒数据：啤酒的醇、卡路里和发酵水平”))来计算实际发酵度，并且以百分数的形式表示为RDF。在发酵过程中监测重量损失提供CO2生成的间接量度，因此也提供了乙醇形成的间接量度。
表5
对在与X4相比相等单位数的来自MkGA的葡糖淀粉酶的存在下发酵产生的最终啤酒的分析显示，对于乙醇产生、重量损失(CO2产生)和RDF，MkGA葡糖淀粉酶得到略低的产率(参见表5-7和图7)。相应地，聚合度为DP4及DP4以上的寡糖的含量在用MkGA葡糖淀粉酶生产的最终啤酒中升高。这些结果清楚地表明X4可用MkGA葡糖淀粉酶替换以产生麦芽汁中可发酵的碳水化合物，从而支持乙醇发酵。基于用实例3中所示的较高MkGA剂量率观察到的增加的乙醇产量，发酵容器中MkGA葡糖淀粉酶的增加的剂量可能支持乙醇产生率类似于或大于 X4的乙醇产生率。
表6
表7A
表7B
实例5
MkGA I和MkGA II的纯化以及其在酿造的发酵步骤中的用途
纯化：
使高粱红曲霉CBS302.78在PDA琼脂板上生长。为了开始预培养物发酵，使用一块(约1cm2)含高粱红曲霉CBS302.78的新鲜PDA板接种250ml无菌挡板式摇瓶中的50ml LD-麦芽糖培养基。使培养物在28℃下生长2天并收获。将50mL这个培养物转移到2.8L挡板式冯巴赫瓶(Fernbac)中的1000ml LD-麦芽糖培养基中，并且在pH固定于5.0或5.5的情况下在28℃下温育4天。收获细胞培养物并且通过离心(在4000rpm下15分钟)和过滤(VacuCap 90，0.2μm)使培养基澄清。随后，浓缩发酵物并保存在-20℃下。
按如下所述来纯化MkGA I和MkGA II：用活性炭处理澄清的发酵液以除去高粱红曲霉分泌的过量色素，例如：红曲红素、红曲黄素和红曲玉红素。因此，将2％(w/v)Norit SAPlus加入发酵液，并接着在室温下搅拌20分钟。以4000rpm将该浆料离心20分钟，并过滤(0.2μm)，之后利用用于第一柱的缓冲液A(25mM乙酸钠，pH 4.3)将其1∶4稀释。在BioRADFPLC系统上手动进行色谱法。15mlβ-环糊精柱通过在环氧树脂活化的SepharoseTM6B(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，批号：10021987)上固定β-环糊精(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；CAS号：68168-23-0)而制成。该β-CD-柱用流速为2ml/min的缓冲液A平衡。在整个纯化过程中保持该流速。将包含500M-GAU的样品通过入口管上样到柱上，并且在整个纯化过程中收集10ml的级分。可在流出液中收集MkGA I，并且在通过用缓冲液A充分洗涤而稳定基线之后将缓冲液转换为100％缓冲液B(pH为4.3的25mM乙酸钠中的10mMα-环糊精)。将结合的MkGA II从柱洗脱，并且在所有蛋白质洗脱之后将缓冲液最终转换回A。通过SDS-page来分析流出液和洗脱液中的蛋白质的葡糖淀粉酶活性。
根据制造商的方案，用10孔的1.0mm InvitrogenNovex 10％Bis-Tris凝胶(目录号NP0321box)、Plus2预染标准品(目录号LC5925)和MESSDS运行缓冲液(目录号NP0002)，运行所有SDS-page凝胶。用考马斯亮蓝染色。
分别合并包含MkGA I和MkGA II的级分，并且通过使样品穿过PD10柱来除去α-环糊精。将含GA的级分在VivaspinTM超滤离心管中浓缩至大约20mg/ml(25ml，MWCO，赛多利斯公司(Sartorius))。
来自β-环糊精柱的含MkGA I的流出液包含少量的MkGA II(＜10％)，并且进一步被纯化。通过充分透析将MkGA I的样品变为缓冲液C(20mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.5)。将4ml样品(对应于100 GAU)上样到装配在Pharmacia FPLC系统(通用电气医疗集团(GEHealthcare))上的已用缓冲液C预平衡的1ml SPFF HiTrap柱上，并在1ml/min的流速下运行。用20CV梯度将结合的蛋白质分离到50％缓冲液D(pH为3.5的20mM柠檬酸盐缓冲液，1MNaCl)中。收集峰级分，并且通过SDS-page分析葡糖淀粉酶活性。以这种方式获得完全纯的MkGA I和MkGA II。
通过MS分析来获得纯化的MkGA I和MkGA II的氨基酸序列(SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.3)，其与翻译的cDNA序列一致。
根据制造商的说明书，通过Megazyme R-AMGR3测定法(M-GAU)来测定葡糖淀粉酶活性(参见实例6)。在Biomek 3000(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))上于96孔ELISA板中进行稀释和混合。
酿造分析：
将MkGA I、MkGA II、AnGA(X4)和TrGA全部在酿造实验中进行测试。在该设置中，使用Munton麦芽浸膏制得麦芽汁。将340g Munton麦芽浸膏溶解于1500ml热水中。将5粒啤酒花加入该浆料，通过H2SO4将pH调整为5.2，并煮沸1小时，之后在121℃下高压灭菌15分钟。然后，将0.6g新鲜制备的W34/70(唯森公司(Weihenstephan))酵母与不同的酶一起加入100g冷却的麦芽汁。按相似的蛋白质量(0.066mg GA/mL麦芽汁)或相似的β-D-麦芽糖苷活性(0.16M-GAU/mL麦芽汁)加入酶。
将麦芽汁在500ml锥形瓶中在18℃和150rpm的轻柔搅拌下发酵。在发酵之前或之后测量残余活性。通过发酵物的重量损失来间接测量乙醇的产量。在安东帕密度计(例如DMA 4100 M)上测量醇，并且根据Ensminger列出的公式(参见http://hbd.org/ensmingr/，“Beer data：Alcohol，Calorie，and Attenuation Levels of Beer”(“啤酒数据：啤酒的醇、卡路里和发酵水平”))来计算实际发酵度，并且以百分数的形式表示为RDF。
发酵麦芽汁的碳水化合物分析：
在具有Gilson 234自动进样器的Gilson HPLC系统上分析从发酵获取的样品。HPLC参数如下：流动相：Milli-Q水，流速：等度，1ml/min，柱：Phenomenex RSO-寡糖，柱温：75℃，进样体积：20μL，检测器：折射率(Laserchrom Schambeck RI检测器)，积分：手动，样品制备：Milli-Q水中2倍稀释(2.5ml样品+2.5ml水)，以及通过0.45μm注射式过滤器的过滤，定量：占标准品峰面积的峰面积百分数。定量了以下样本：乙醇、甘油、葡萄糖、DP2、DP3、DP4、DP4+(所有以上并且包括DP4)以及DP1-4+。
在表8中可以看出，在两个剂量实验中MkGA I的效果优于MkGA II，并且表明在实验误差内与使用AnGA或TrGAA获得的效果相当。
表8
表8.使用麦芽浸膏麦芽汁所测定的以指示剂量施加到FV的所列GA的RDF值。结果为3次测定的平均值。
根据获得的RDF值，MkGA I、MkGA II和显示出在发酵期间(96h)麦芽汁中的寡糖周转非常相似(图8)。仅有的显著区别是，与MkGA I和MkGA II相比，X4显示出略快的DP3和DP4+寡糖的初始消耗。然而，这并不影响残余寡糖组成和所得的RDF值的最终结果。
实例6
MkGA I和MkGA II在缓冲液和啤酒中的热稳定性。
使用实验室规模的巴氏灭菌测定法(范围从0至42PU)在啤酒pH(4.3-4.6)中和在乙酸钠pH(4.7)缓冲液中测定MkGA I、MkGA II、X4(AnGA)和TrGA的葡糖淀粉酶活性。
M-GAU活性的测定：
该测定法为Megazyme R-AMGR3测定法的ELISA缩放版本。
底物：对硝基苯基-β-麦芽糖苷(4mM)，加上热稳定性的β-葡糖苷酶(5U/ml)：将一小瓶的该内容物溶解于10mL的milli-q水中，将其分成1ml的等分试样并冻存。
缓冲液：200mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)。将5.9mL的冰乙酸(1.05g/mL)加入到900mL的milli-q水中。通过加入1M(4g/100mL)NaOH溶液(大约需要30mL)将pH调整为pH 4.4。将体积调整为1L，并且在4℃下保存于密封良好的瓶中。
将酶样品在乙酸钠缓冲液中稀释10倍(如果必要的话用相同的缓冲液进一步稀释，但是应记住，为了使pH达到4.5，始终需要第一稀释度)。在96孔板中：将20μL底物与20μL酶溶液相混合并在40℃下搅拌温育10分钟。加入300μL 2％Trizma碱以终止反应并显色。
针对试剂空白在400nm处测量吸光度。空白是通过在剧烈搅拌下向20μL底物中加入300μL Trizma碱溶液(2％)，随后加入酶溶液(20μL)而制备。活性如下计算：
其中：GAU＝葡糖淀粉酶活性单位。一个单位是在限定的pH和温度下每分钟从底物释放1微摩尔对硝基酚的GA的量。ΔA400＝吸光度(反应)-吸光度(空白)。10＝温育时间(min)。340＝最终反应体积(μL)。20＝被测定的酶的体积(μL)18.1＝2％Trizma碱(pH约8.5)中的对硝基酚在400nm处的E mM(单位：μM-1*cm-1)。0.88＝光程(cm)
巴氏灭菌测定法：
以实验室规模的巴氏灭菌测定法在脱气啤酒或乙酸盐缓冲液中测定葡糖淀粉酶活性的相对损失。将样品在啤酒或缓冲液中1∶10稀释，转移到薄玻璃管中，置于72℃下的水浴中，在此处测量时间和温度。随时间推移(0至100秒)取出样品，并且在测定残余活性之前保持在冰上。在Biomek3000(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))上于96孔ELISA板中进行稀释和混合。为了在用于本实验的条件下测量酶的热稳定性，在酶的温育之前或之后测定GAU活性。将不含葡糖淀粉酶的啤酒或缓冲液用作空白。通过上述公式将累积的能量输入转化成巴氏杀菌单位PU(能量当量指数)。数据呈现为相对活性损失。
在pH为4.5的普通脱气比尔森啤酒(皇家出口比尔森啤酒)中测定MkGA I、MkGAII、MkGA I+MkGA II、X4(AnGA)和TrGA的热稳定性。从表9的结果看出，在比尔森啤酒中，与其他受试的葡糖淀粉酶相比，MkGA I显著更不耐热。使用72℃的巴氏灭菌温度，用小于26个巴氏灭菌单位(PU)就使MkGA I完全失活。相比之下，MkGA II需要 100PU，而AnGA和TrGA需要大于200PU来灭活。明显地，与全部具有带有催化域和SBD的相同结构域结构的MkGA II、AnGA和TrGA相比，MkGA I是截短的，并且缺少SBD。
表9
表9.在72℃下加强巴氏灭菌之后，MkGA I、MkGA II、MkGA I+MkGA II(MkGA)、AnGA((X4)和TrGA的啤酒中的残余葡糖淀粉酶活性。残余活性计算为实际活性除以初始活性(OPU)，并且结果为3次测定的平均值。
此外，在如下的比重(即°Plato)相差甚大的啤酒中于72℃下进行巴氏灭菌：在之前的MkGA I和MkGA II热稳定性(1)研究中使用的百威比尔森啤酒pH(4.5)、纽卡斯尔棕啤pH(4.3)、Thisted bryghus波特酒pH(4.6)和0.1M乙酸钠pH(4.7)。从图9所示的结果可明显看出，与乙酸钠缓冲液相比，MkGA I和MkGA II在啤酒中更不耐热，而X4(AnGA)的热稳定性在缓冲液与啤酒之间未显著改变。出乎意料的是，具有最低热稳定性的MkGA I的残余活性在啤酒中降低较快，并且与缓冲液相比，用小于25PU就可将所有啤酒中的葡糖淀粉酶完全灭活，所述缓冲液在用42PU进行巴氏灭菌之后保持较小但显著(2％)的残余活性。Thisted bryghus波特酒是其中MkGA I和MkGA II显示出最低热稳定性的啤酒。
实例7
为了在异源宿主红褐肉座菌(无性型里氏木霉)中表达两种形式的高粱红曲霉葡糖淀粉酶MkGA I和MkGA II，用下面所示的上游和下游引物(SEQ ID NO：13-15)通过PCR从按之前例子中所述制备的高粱红曲霉基因组DNA或混合cDNA文库扩增两个相应基因的基因组序列和cDNA序列：
正向-5’GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCACCATGGTGAAGATCAGCATAAATCCCATC3’(SEQ ID NO：13)，
反向I(用于MkGA II)-5’
ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACTTCCAGCTGTCGTTGACGGTC 3’(SEQ ID NO：14)和反向II(用于MkGA I)-5’ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACCGTCCCGTGCCATAGGGGCGTG3’(SEQ ID NO：15)。
此外，使用如下的上游引物扩增一个额外片段，该片段编码MkGA I葡糖淀粉酶，但是起始自在翻译的推定起点上游符合读框地存在的另一个ATG密码子(SEQ ID NO：17)：
5’
GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGATTGACACAAAACCGACTGATATCGTCTC3’(SEQ IDNO：16)。
所有引物包括与Gateway克隆技术(美国加州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))相容的特异性重组attB1和attB2位点，以有助于扩增片段在pDONRTM221或pDONRTM/Zeo载体中的克隆，然后是与pTTTpyrG13目的载体(图10)的第二重组反应。该载体使得可以在红褐肉座菌细胞中表达MkGA I和MkGA II基因，并且在WO2010141779A1中进行了描述。其含有里氏木霉cbhI来源的启动子和终止子区(驱动所关注基因进行强的诱导型表达)、构巢曲霉amdS和pyrG选择性标记(使得转化株能以乙酰胺作为唯一的氮源在不存在尿苷的情况下生长)，以及里氏木霉端粒区(使得可以在真菌细胞中维持非染色体质粒)。cbhI启动子与终止子区被氯霉素抗性基因CmR和对大肠杆菌致死的ccdB基因分隔开，其旁侧为噬菌体λ的特异性重组位点attR1、attR2。这种构型使得可以直接选择含有通过LR重组反应而处于正确取向的cbhI调控元件控制下 的高粱红曲霉GA序列的重组体。最终表达质粒示于图11中，并且通过序列分析来确认克隆的具体基因组序列和cDNA序列的同一性。根据供应商(美国加州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))的建议来进行所有克隆步骤。
使用其他地方(US20110020899)所述的PEG-原生质体方法，将分离的质粒转化进缺失四个主要纤维素酶pyr4-)的红褐肉座菌Quad菌株中。收获了选择用于在乙酰胺作为氮源的基本培养基上生长的转化株，并且将孢子混合物用于接种甘氨酸生产培养基(4.7g/L(NH4)2SO4、pH为5.5的33g/L 1，4-哌嗪二(丙磺酸)、6.0g/L甘氨酸、5.0g/L KH2PO4、1.0g/L CaCl2x2H2O、1.0g/L MgSO4x7H2O、2.5ml/L的400X里氏木霉微量元素{5g/L FeSO4x7H2O、1.4g/L ZnSO4x7H2O、1.6g/L MnSO4xH2O、3.7g/LCoCl2x6H2O}、20g/L葡萄糖、0.6g/L槐糖)。在28℃下于摇瓶中在200rpm旋转摇动下生长5天后，收获培养物样品，并且通过SDS-PAGE和将对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷用作底物的活性测定法两者来分析高粱红曲霉葡糖淀粉酶的产量。如实例1中所述来进行SDS-PAGE分析和葡糖淀粉酶活性测定法。
从图12和下表10可以看出，两种形式的MkGA I和MkGA II均以它们的活性形式在异源宿主红褐肉座菌中成功地表达。对于两个基因来说，只有基因组序列导致了相应葡糖淀粉酶分子的可检测的表达。当下游ATG密码子用作翻译的起点时，观察到更明显的表达，这表明其可能为信号肽的真正起点。
表10：异源表达的高粱红曲霉葡糖淀粉酶的活性。同样地稀释发酵样品，并且针对对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷测量活性
通过MS来分析里氏木霉表达的MkGA-I/MkGA-II。对来自高粱红曲霉和里氏木霉的成熟蛋白质(从SDS-page纯化，参见图13)进行部分序列分析(覆盖全序列的70％)，表明各自的变体是100％相同的(未示出)。对来自里氏木霉的MkGA-I/MkGA-II(粗发酵物)的热稳定性进行检测，其与来自高粱红曲霉的纯化的野生型酶非常相似(表11)。明显地，用小于42PU使里氏木霉中产生的gMkGA I失活是可能的。
表11.来自高粱红曲霉和里氏木霉的MkGA I和MkGA II在啤酒中的残余葡糖淀粉酶活性与在72℃下施加的巴氏灭菌单位的关系。残余活性在β-D-麦芽糖苷底物上测量，并且计算为实际活性除以初始活性(OPU)，结果为3次测定的平均值。
在酿造实验中对在红褐肉座菌和高粱红曲霉中表达的MkGA I和MkGA II进行测试。使用Munton麦芽浸膏制得麦芽汁。将340g Munton麦芽浸膏溶解于1500ml热水中。将5粒啤酒花加入该浆料，通过H2SO4将pH调整为5.2，并煮沸1小时，之后在121℃下高压灭菌15分钟。然后，将0.6g新鲜制备的唯森(Weihenstephan)酵母与不同的酶(如实例5中所述)一起加入100g冷却的麦芽汁。
将麦芽汁(通常为100ml)在500ml锥形瓶中在18℃和150rpm下发酵。在发酵之前或之后测量残余活性。通过发酵物的重量损失来间接测量乙醇的产量。在安东帕Alcoanalyzer上测量醇，并且以啤酒的比重和来自Alcoanalyzer的醇浓度为基础来进行RDF的计算。
来自里氏木霉的gMkGA I和gMkGA II在啤酒FV应用中的性能证实是高的，但是与来自高粱红曲霉的纯化的蛋白质相比有所降低(就RDF值而言)(参见图14)。酶按活性加入(GAU/mL)，并且降低的性能可能由于来自里氏木霉的粗发酵物中的副活性，而非FV中的实际性能差异，因为它们具有相似的氨基酸序列。
(SEQ ID NO：1)
gDNA MkGA II
(SEQ ID NO：2)
MkGA II的cDNA序列
(SEQ ID NO：3)
MkGA II(成熟蛋白质)的氨基酸序列
(SEQ ID NO：4)
gDNA MkGA I
(SEQ ID NO：5)
MkGA I的cDNA序列
(SEQ ID NO：6)
MkGA I(成熟蛋白质)的氨基酸序列
(SEQ ID NO：7)
正向简并引物
GAYTAYTTYTAYACNTGG
(SEQ ID NO：8)
反向简并引物
YTGRTANACRTCDTCNGG
(SEQ ID NO：9)
MkGA探针正向
CTGGTCAATGGTGACGTGAATC
(SEQ ID NO：10)
MkGA探针反向
GCAATACCCGAGTTGAGAGAGTAG
(SEQ ID NO：11)
MkGA正向引物
ATGATTGACACAAAACCGACTGATATCGTCTC
(SEQ ID NO：12)
MkGA反向引物
CTACTTCCAGCTGTCGTTGACGGTCAC
(SEQ ID NO：13)
MkGA正向引物-里氏木霉表达
5’
GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCACCATGGTGAAGATCAGCATAAATCCCATC3’，
(SEQ ID NO：14)
MkGA II反向引物-里氏木霉表达
5’
ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACTTCCAGCTGTCGTTGACGGTC3’
(SEQ ID NO：15)
MkGA I反向引物-里氏木霉表达
5’
ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACCGTCCCGTGCCATAGGGGCGTG3’
(SEQ ID NO：16)
MkGA I+ATG正向引物-里氏木霉表达
5’
GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGATTGACACAAAACCGACTGATATCGTCTC3’
(SEQ ID NO：17)
gDNA MkGA I+ATG
对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离本文所述的实施例的范围和精神的情况下对这些实施例作出多种修改和变型。应当理解，如要求权利要求保护的主题不应不当地限于此类具体的实施例。实际上，对 于本领域技术人员而言显而易见的对所描述的执行实施例的模式的各种修改，也旨在处于以下权利要求书的范围内。
出于所有目的，将本文所讨论的全部参考文献以引用的方式并入本文。

Claims (57)

1.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽由SEQ ID NO:3或6所示的氨基酸序列组成。
2.一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽由以下编码：i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii) SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽，所述多肽通过巴氏灭菌在啤酒中使用小于50个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽，所述多肽的葡糖淀粉酶活性(GAU)为0.05-10GAU/mg。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽，其中所述多肽不具有淀粉结合域。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽，所述多肽通过在宿主细胞中的重组表达来获得。
7.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-2中任一项所述的多肽。
8.一种表达载体或质粒，所述表达载体或质粒包含根据权利要求7所述的核酸，或者表达根据权利要求1-6中任一项所述的多肽。
9.如权利要求8所定义的表达载体或质粒，所述表达载体或质粒包含源自里氏木霉（T.reesei）cbhI的启动子。
10.如权利要求8所定义的表达载体或质粒，所述表达载体或质粒包含源自里氏木霉cbhI的终止子。
11.根据权利要求8所述的表达载体或质粒，所述表达载体或质粒包含选自构巢曲霉（Aspergillus nidulans）amdS和pyrG的一种或多种选择性标记。
12.根据权利要求8所述的表达载体或质粒，所述表达载体或质粒包含允许在宿主细胞中维持非染色体质粒的一个或多个端粒区域。
13.一种宿主细胞，所述宿主细胞具有如权利要求1-6中任一项所定义的多肽的异源表达。
14.如权利要求13所定义的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真菌细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于木霉属。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于里氏木霉物种。
17.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于红褐肉座菌（Hypocreajecorina）物种。
18.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求8-12中任一项所定义的质粒或表达载体。
19.一种分离如权利要求1-6中任一项所定义的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：在如权利要求14-18中任一项所定义的具有所述多肽的异源表达的宿主细胞中诱导所述多肽的合成；以及回收由所述宿主细胞分泌的细胞外蛋白质；以及任选地纯化所述多肽。
20.一种制备如权利要求1-6中任一项所定义的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：在如权利要求14-18中任一项所定义的具有所述多肽的异源表达的宿主细胞中诱导所述多肽的合成；以及任选地纯化所述多肽。
21.一种表达如权利要求1-6中任一项所定义的多肽的方法，所述方法包括获得如权利要求14-18中任一项所定义的宿主细胞，以及从所述宿主细胞表达所述多肽，以及任选地纯化所述多肽。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中如权利要求1-6中任一项所定义的多肽为优势分泌蛋白。
23.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-6中任一项所定义的一种或多种多肽。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物选自淀粉水解组合物、糖化组合物、洗涤剂组合物、醇发酵酶组合物，以及动物饲料组合物。
25.根据权利要求23所述的组合物，所述组合物包含一种或多种另外的酶。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的组合物，所述一种或多种多肽和/或一种或多种另外的酶通过巴氏灭菌来灭活。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述多肽和/或所述一种或多种另外的酶通过巴氏灭菌在啤酒中通过使用小于50个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。
29.如权利要求1-6中任一项所定义的多肽或如权利要求23-28中任一项所定义的组合物在发酵中的用途，其中在发酵步骤之前或期间添加所述多肽或组合物。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述发酵步骤和任选的啤酒过滤步骤之后是巴氏灭菌步骤。
31.根据权利要求29-30中任一项所述的用途，其中所述发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述发酵饮料是啤酒。
33.根据权利要求29-30中任一项所述的用途，其中所述多肽或所述组合物与一种或多种另外的酶组合进行添加。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述多肽和/或所述一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中失活。
36.根据权利要求29-30中任一项所述的用途，其中以1-1000mg/kg谷粉的量来添加所述多肽。
37.不耐热多肽用以提高酿造工艺中的发酵步骤中可发酵糖的产量的用途，其中所述多肽如权利要求1-6中任一项所定义。
38.一种发酵方法，所述方法包括在使用酵母的发酵步骤之前或发酵步骤期间添加如权利要求1-6中任一项所定义的多肽或如权利要求23-28中任一项所定义的组合物。
39.根据权利要求38所述的方法，所述方法包括所述发酵步骤或任选的啤酒过滤步骤之后的巴氏灭菌步骤。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述发酵饮料是啤酒。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述多肽或所述组合物与一种或多种另外的酶组合进行添加。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述多肽和/或所述一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中失活。
45.根据权利要求38所述的方法，其中以1-1000mg/kg谷粉的量来添加所述多肽。
46.根据权利要求38-45中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备糖化醪，
b)过滤所述糖化醪以获得麦芽汁，以及
c)对所述麦芽汁进行发酵以获得发酵饮料，
其中将权利要求1-6中任一项所定义的多肽或权利要求23-28中任一项所定义的组合物添加到：
i.步骤(a)的所述糖化醪和/或
ii.步骤(b)的所述麦芽汁和/或
iii.步骤(c)的所述麦芽汁。
47.根据权利要求46所述的方法，其中对所述发酵饮料执行巴氏灭菌步骤(d)。
48.根据权利要求46-47中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述糖化醪得自谷粉。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述谷粉包含发芽和/或未发芽的谷粒或来自另一种作物的淀粉基材料中的一种或多种。
50.根据权利要求46所述的方法，所述方法进一步包括使步骤(a)的所述糖化醪接触一种或多种另外的酶。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述酶选自淀粉脱支酶、R-酶、极限糊精酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何一种或多种组合。
52.根据权利要求46所述的方法，所述方法进一步包括使步骤(b)或(c)的所述麦芽汁接触一种或多种另外的酶，其中所述酶选自淀粉脱支酶、异淀粉酶和极限糊精酶，包括它们的任何一种或多种组合。
53.一种用于生产食品、饲料或饮料产品的方法，所述方法包括使用根据权利要求1-6所述的多肽或如权利要求23-28中任一项所定义的组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。
54.根据权利要求53的方法，其中所述饮料产品是醇饮料或无醇饮料。
55.根据权利要求53的方法，其中所述饮料产品是基于谷类或麦芽的饮料。
56.根据权利要求53的方法，其中所述饮料产品是啤酒，威士忌，葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁。
57.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-6所述的多肽或如权利要求23-28中任一项所定义的组合物；以及所述多肽或组合物的使用说明书。
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