CN104619836A

CN104619836A - 具有葡糖淀粉酶活性的变体

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Publication number: CN104619836A
Application number: CN201380042995.1A
Authority: CN
Inventors: J.F.克拉梅; P.E.德格恩; I.尼科拉伊; V.阿勒克塞耶夫; C.W.维罗伊曼; D.托雷斯帕兹米诺; N.M.菲什
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2015-05-13
Also published as: WO2014029808A1; IN2015DN00231A; EA201590425A1; US20170306309A1; JP2015526090A; US20150315558A1; MX2015002099A; EP2888357A1; AU2013305007A1

Abstract

本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性并且具有改善的特性的变体，并且涉及包含适用于例如生产食品、饮料(例如啤酒)、饲料、生物化学品或者生物燃料的这些变体的组合物。本发明还公开了编码所述变体的DNA构建体以及在宿主细胞中产生所述葡糖淀粉酶变体的方法。此外，公开了诸如在酿造工艺中与根据本发明的葡糖淀粉酶有关的不同方法和用途。

Description

具有葡糖淀粉酶活性的变体

序列表的引用

所附的是包括SEQ ID NO：1-31的序列表，其全文以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性且具有改善的特性的变体，并且涉及包含适用于例如生产食品、饮料(例如啤酒)、饲料、生物化学品或者生物燃料的这些变体的组合物。本发明还公开了编码所述变体的DNA构建体以及在宿主细胞中生成所述葡糖淀粉酶变体的方法。此外，公开了例如在酿造工艺中与根据本发明的葡糖淀粉酶有关的不同方法和用途。

背景技术

葡糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是淀粉水解外切作用糖酶，其催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原末端移除连续的葡萄糖单元。葡糖淀粉酶可水解淀粉(例如，直链淀粉和支链淀粉)的直链的和分支的糖苷键。

葡糖淀粉酶由多种细菌、真菌、酵母和植物的株系产生。受到特别关注并具有重要商业价值的是，葡糖淀粉酶是胞外产生的真菌酶，例如来自以下各属的菌株：曲霉属(Aspergillus)(Svensson et al.，Carlsberg Res.Commun.48：529-544(1983)(Svensson等人，《嘉士伯研究通讯》，第48卷，第529-544页，1983年)；Boel et al.，EMBO J.3：1097-1102(1984)(Boel等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第1097-1102页，1984年)；Hayashida et al.，Agric.Biol.Chem.53：923-929(1989)(Hayashida等人，《农业与生物化学》，第53卷，第923-929页，1989年)；美国专利No.5,024,941；美国专利No.4,794,175和WO88/09795)；篮状菌属(Talaromyces)(美国专利No.4,247,637；美国专利No.6,255,084；和美国专利No.6,620,924)；根霉属(Rhizopus)(Ashikari etal.，Agric.Biol.Chem.50：957-964(1986)(Ashikari等人，农业与生物化学》，第50卷，第957-964页，1986年)；Ashikari et al.，App.Microbio.Biotech.32：129-133(1989)(Ashikari等人，《应用微生物学和生物技术》，第32卷，第129-133页，1989年)和美国专利No.4,863,864)；腐质霉属(Humicola)(WO 05/052148和美国专利No.4,618,579)；以及毛霉属(Mucor)(Houghton-Larsen et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.62：210-217(2003)(Houghton-Larsen等人，《应用微生物学和生物技术》，第62卷，第210-217页，2003年))。已对编码这些酶的多个基因进行了克隆，并已使这些基因在酵母、真菌和/或细菌细胞中表达。在商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，且已被用于许多需要水解淀粉(例如用于从淀粉产生葡萄糖和其他单糖)的应用中。葡糖淀粉酶用于生产高果糖玉米甜味剂，高果糖玉米甜味剂占据超过美国50％的甜味剂市场。

通常，在淀粉水解工艺中葡糖淀粉酶可与且通常与α-淀粉酶一起使用，以将淀粉水解为糊精，然后水解为葡萄糖。然后可将葡萄糖由其他酶(例如葡萄糖异构酶)转化为果糖；结晶；或用于发酵以产生多种终产物(例如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸盐、抗坏血酸中间体、谷氨酸、甘油和1，3-丙二醇)。通过在含淀粉和/或纤维素的材料的发酵中使用葡糖淀粉酶而产生的乙醇可用作燃料来源或用于酒精消费。

在商业上用于高葡萄糖玉米糖浆(HGCS)和高果糖玉米糖浆(HFCS)生产的高固形物浓度下，葡糖淀粉酶通过缩合反应合成二糖、三糖和四糖。这是由于淀粉中α-(1-6)-D-葡萄糖苷键的水解缓慢以及由D-葡萄糖形成多种积聚的缩合产物(主要是异麦芽糖)而引起的。因此，许多常规工艺中葡萄糖的产率不超过理论产率的95％，全世界通过该工艺生产的糖浆量是非常大的，即使每吨淀粉的葡萄糖产率有十分小的增加在商业上都是重要的。

若干葡糖淀粉酶在例如WO/2008/045489、WO/2009/048488、WO/2009/048487、US8058033、WO/2011/022465、WO2011/020852和WO2012/001139中进行了描述。

在淀粉衍生的碳水化合物的水解中使用葡糖淀粉酶在酿造工业中越来越重要，特别是用于生产高发酵度(有时称为低卡路里)啤酒。葡萄糖很容易由酵母转化为醇，从而使得啤酒厂有可能由发酵获得十分高的醇产率并且同时获得啤酒，其在残留碳水化合物方面是十分低的。将发酵物用水稀释至所需的醇百分比，且最终的啤酒作为“低碳水化合物(low carb)”出售。出于与产品稳定性和法规相关的原因，使添加的酶活性在最终的啤酒中除去/失活很重要。遗憾的是，当葡糖淀粉酶源自通常来源，例如曲霉属(Aspergillus)物种，例如黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori)；腐质霉属(Humicola)物种；篮状菌属(Talaromyces)物种，诸如埃默森篮状菌(T.emersonii)；阿太菌属(Athelia)物种，诸如罗氏阿太菌(A.rolfsii)；青霉属(Penicillium)物种，诸如产黄青霉(P.chrysogenum)，并且所述酶在酿造过程中被添加到发酵容器(FV)中时，由于所述酶的热稳定性，该要求难以满足。

虽然将葡糖淀粉酶添加到淀粉糖化容器中，或在麦芽汁煮沸前的任何阶段添加，可以避免该问题，但是这引入了其他实际困难。美国专利No.4,666,718描述了采用包括酿造酶葡糖淀粉酶的反应器的酿造工艺，该酿造酶葡糖淀粉酶固定在固体载体上，由此可从产物回收酶。美国专利No.5,422,267A描述了采用表达重组葡糖淀粉酶的基因工程酵母的酿造工艺，但是其中该酶由酵母分泌。

因此，仍然需要例如具有葡糖淀粉酶活性的组合物形式的葡糖淀粉酶，其可添加到使用常规设备来制备发酵饮料(诸如啤酒)的常规工艺中的任何阶段，并且其活性可从最终产物安全地除去。

将例如组合物形式的具有水解活性的葡糖淀粉酶变体添加到在制备发酵饮料中使用的发酵容器(FV)中是特别有效的。益处为例如酶剂量降低、淀粉向可发酵碳水化合物的转化增加，以及酵母应激降低。这种方法并不常用的原因是，活性酶于是可存在于最终产物中，如上所述这是不期望的。市售葡糖淀粉酶一般是热稳定的，并且在发酵饮料的巴氏灭菌过程中施加的能量不足以使酶失活。因此，还需要不耐热的葡糖淀粉酶，其可在发酵之后通过巴氏灭菌来灭活。

发明内容

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO：2的残基29、43、48、116和502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。

本发明还涉及能够编码本发明的葡糖淀粉酶变体的核酸。

本发明还涉及能够表达本发明的葡糖淀粉酶变体的核酸。本发明还涉及质粒或表达载体，诸如包含核酸或能够表达本发明的葡糖淀粉酶变体的重组表达载体。本发明还涉及具有本发明的葡糖淀粉酶变体的异源表达的宿主细胞，以及包含如上定义的质粒或表达载体的宿主细胞。本发明还涉及分离、制备和/或表达本发明的葡糖淀粉酶变体的方法。

本发明还涉及包含本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的组合物。

本发明还涉及本发明的葡糖淀粉酶变体或组合物在发酵中的用途，其中在发酵步骤之前或期间添加所述葡糖淀粉酶变体或组合物。

本发明还涉及本发明的不耐热葡糖淀粉酶变体用于提高酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖的产量的用途。

本发明还涉及包括在发酵步骤之前或期间添加本发明的葡糖淀粉酶变体或组合物的方法。

本发明还涉及发酵饮料，其中该发酵饮料由本发明的方法制得。

本发明还涉及生产食品、饲料或饮料产品(诸如醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，例如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁)的方法，所述方法包括用本发明的葡糖淀粉酶变体或组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。

本发明还涉及生产第一代或第二代生物燃料(诸如生物乙醇)的方法，所述方法包括用如本文所述的葡糖淀粉酶变体来处理含有淀粉的材料的步骤，以及由这种方法获得的产物。本发明还涉及生产生物化学品(诸如生物基异戊二烯)的方法，所述方法包括用如本文所述的葡糖淀粉酶变体来处理含有淀粉的材料的步骤，以及由这种方法获得的产物。本发明还涉及如本文所公开的葡糖淀粉酶变体或组合物用于生产第一代或第二代生物燃料(诸如生物乙醇)或用于生产生物化学品(诸如生物基异戊二烯)的用途。

本发明还涉及试剂盒，其包含本发明的葡糖淀粉酶变体或组合物；以及所述葡糖淀粉酶变体或组合物的使用说明。

因此，本发明的目标是在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、生产所述产品的工艺或使用所述产品的方法，使得申请人保留该权利并特此公开放弃对任何先前已知的产品、工艺和方法的权利。还应该注意，本发明无意于在本发明的范围内涵盖任何不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83款)的书面说明和可实施性要求的产品、所述产品的制备工艺或使用所述产品的方法，使得申请人保留权利并特此公开放弃对任何先前描述的产品、制备所述产品的工艺或使用所述产品的方法的权利。

应该注意，在本公开中，特别是在权利要求书和/或实施例中，诸如“包含”等之类的术语可具有的含义是其在美国专利法中的含义；如，它们可意指“包括”等。并且诸如“基本上由...组成”之类的术语具有的含义是其在美国专利法中的含义，例如，它们允许没有被明确叙述的元素，但排除现有技术中存在的或影响本发明的基本特征或新特征的元素。

这些以及其他实施例在下面的具体实施方式中公开或根据下面的具体实施方式显而易见并且为下面的具体实施方式所涵盖。

附图说明

下面的以举例的方式给出但无意于将本发明只局限于所描述的具体实施例的具体实施方式可结合附图得到更好地理解，其中：

图1是入门载体：A)pEntry-GA CS4和B)pEntry-GA wt的示意图。

图2是表达载体：A)pTTT-pyrG13-GACS4和B)pTTTpyr2-GACS4的示意图。

图3描绘了TrGA变体的SDS-PAGE分析结果。上图为里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶变体：R_C_1、R_C_2、R_C_5、R_C_12、R_C_7、R_D_2、R_D_3和R_D_5；下图为变体R_C_13、R_C_22、R_A_1、R_A_2、R_A_6、R_A_7和TrGA(wt)。对于每个变体而言，在括号中示出的是葡糖淀粉酶活性(GAU/mL)。

图4描绘了TrGA变体的SDS-PAGE分析结果。在上图中，如图中所绘那样示出了里氏木霉葡糖淀粉酶变体CPS3-B01至CPS2-E08，以及空载体和TrGA-CS4的发酵产物。对于每个变体而言，在括号中示出的是葡糖淀粉酶活性(GAU/mL)。

图5描绘了纯化的TrGA变体的SDS-PAGE分析结果。如图中所示，从左起依次为：分子量标记和纯化的里氏木霉葡糖淀粉酶变体R_C_1和R_C_2。

图6A描绘了从侧面观察的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO：2)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(灰色)(SEQ ID NO：5)的三维结构比较。参照活性位点测量了所述侧面且活性位点入口位于分子的“顶部”。

图6B描绘了从侧面观察的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO：2)的三维结构。参照活性位点测量了所述侧面且活性位点入口位于分子的“顶部”。形成催化结构域和淀粉结合结构域之间的界面区域的残基以透明球体示出(来自催化结构域的残基为深灰色，来自淀粉结合结构域的残基为浅灰色)。

图7描绘了从顶部观察的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO：2)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)(SEQ ID NO：5)的三维结构比较。

图8描绘了从侧面观察的TrGA(SEQ ID NO：2)和AnGA(SEQ ID NO：6)的三维结构比对，其中示出了结合位点1和2。

图9描绘了阿卡波糖在TrGA结构中的结合模型。

图10A和10B描绘了来自下列物种的亲本葡糖淀粉酶的催化结构域的比对比较：泡盛曲霉(AaGA)(SEQ ID NO：5)；黑曲霉(Aspergillus niger)(AnGA)(SEQ ID NO：6)；米曲霉(Aspergillus oryzae)(AoGA)(SEQ ID NO：7)；里氏木霉(TrGA)(SEQ ID NO：3)；灰腐质霉(Humicola grisea)(HgGA)(SEQ ID NO：8)；和酒色肉座菌(Hypocrea vinosa)(HvGA)(SEQ ID NO：9)。相同的氨基酸以星号(*)指示。

图10C描绘了篮状菌属葡糖淀粉酶(TeGA)的成熟蛋白质序列(SEQ IDNO：23)。

图10D和10E描绘了比较来自下列物种的亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域(SBD)的比对：里氏木霉(SEQ ID NO：11)；灰腐质霉(HgGA)(SEQ IDNO：24)；疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanugmosus)(ThGA)(SEQ ID NO：25)；埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(TeGA)(SEQ ID NO：26)；黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：27)；泡盛曲霉(AaGA)(SEQ ID NO：28)；以及太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)(TtGA)(SEQ ID NO：29)。

序列

实例部分之后是序列，其全文以引用方式并入本文。

SEQ ID NO：1：里氏木霉葡糖淀粉酶，全长；带信号肽

SEQ ID NO：2：里氏木霉葡糖淀粉酶，成熟蛋白质；不带信号肽

SEQ ID NO：3：里氏木霉葡糖淀粉酶催化结构域，成熟TrGA的1-453，CD

SEQ ID NO：4：里氏木霉葡糖淀粉酶cDNA

SEQ ID NO：5：泡盛曲霉GA(AaGA)；CD

SEQ ID NO：6：黑曲霉(AnGA)，CD

SEQ ID NO：7：米曲霉(AoGA)，CD

SEQ ID NO：8：灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)；CD

SEQ ID NO：9：酒色肉座菌葡糖淀粉酶(HvGA)；CD

SEQ ID NO：10：TrGA，连接区

SEQ ID NO：11：TrGA，SBD

SEQ ID NO：12：SVDDFI：TrGA成熟蛋白质的起点

SEQ ID NO：13：里氏木霉葡糖淀粉酶CS4变体，成熟蛋白质；不带信号肽

SEQ ID NO：14：里氏木霉葡糖淀粉酶R_A_1变体，成熟蛋白质；不带信号肽

SEQ ID NO：15：里氏木霉葡糖淀粉酶R_C_1变体，成熟蛋白质；不带信号肽

SEQ ID NO：16：里氏木霉葡糖淀粉酶R_A_6变体，成熟蛋白质；不带信号肽

SEQ ID NO：17：里氏木霉葡糖淀粉酶R_C_13变体，成熟蛋白质；不带信号肽

SEQ ID NO：18：泡盛曲霉葡糖淀粉酶(AaGA)，全长，带信号肽

SEQ ID NO：19：黑曲霉葡糖淀粉酶(AnGA)，全长，带信号肽

SEQ ID NO：20：米曲霉葡糖淀粉酶(AoGA)，全长，带信号肽

SEQ ID NO：21：灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)，全长，带信号肽

SEQ ID NO：22：酒色肉座菌葡糖淀粉酶(HvGA)，全长，带信号肽

SEQ ID NO：23：篮状菌属GA，成熟蛋白质

SEQ ID NO：24：灰腐质霉GA，SBD

SEQ ID NO：25：疏棉状嗜热丝孢菌GA，SBD

SEQ ID NO：26：埃默森篮状菌GA，SBD

SEQ ID NO：27：黑曲霉GA，SBD

SEQ ID NO：28：泡盛曲霉GA，SBD

SEQ ID NO：29：太瑞斯梭孢壳霉GA，SBD

SEQ ID NO：30：经里氏木霉wt葡糖淀粉酶优化的cDNA(pEntry-GAWT)

SEQ ID NO：31：经里氏木霉CS4变体葡糖淀粉酶优化的cDNA(pEntry-GA CS4)

具体实施方式

葡糖淀粉酶在要求水解淀粉的广泛应用中是商业上重要的酶。本申请人已发现，通过将某些改变引入亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的特定区域内的位置，与亲本葡糖淀粉酶相比，葡糖淀粉酶变体表现出热稳定性下降，并且在一些实施例中不会损失任何糖化性能。

具体实施方式

葡糖淀粉酶在要求水解淀粉的广泛应用中是商业上重要的酶。本文公开了用于水解淀粉的热稳定性下降的葡糖淀粉酶变体。这些葡糖淀粉酶变体在催化结构域和/或淀粉结合结构域中含有氨基酸置换。所述变体显示出改变的特性，诸如改变的热稳定性和/或改变的比活性。

此外，本文描述了某些子集的葡糖淀粉酶变体在例如啤酒发酵期间添加到发酵容器中是非常有用的，因为该酶的合适的不耐热性使得通过巴氏灭菌来灭活成为可能。

巴氏灭菌实验已经以实验室规模、中试规模和全规模对啤酒进行，以评估在酿造过程中使本文所述的变体失活的能力。在全规模的隧道式巴氏灭菌器中对含葡糖淀粉酶的瓶装啤酒验证实验室规模的巴氏灭菌(数据未示出)。本发明人已提供了亲本葡糖淀粉酶的多个变体，在一些实施例中，所述变体不仅在发酵容器中显示出具有功能活性(高糖化性能)，还显示出比亲本葡糖淀粉酶和/或若干种另外的所测试葡糖淀粉酶明显更不耐热。这些葡糖淀粉酶变体可使用小于16.8个巴氏灭菌单位(PU)来完全灭活，这对于啤酒的巴氏灭菌是优选的。

在一些实施例中，在糖化工艺中使用如本文所述的葡糖淀粉酶变体可产生具有高葡萄糖百分比的糖浆。在一些实施例中，使用如本文所述的葡糖淀粉酶变体可导致在酿造步骤的淀粉糖化步骤和/或发酵步骤中可发酵糖的生成增加。在一些实施例中，使用如本文所述的葡糖淀粉酶变体导致实际发酵程度增加。这些改变的特性通过使亲本葡糖淀粉酶中选择位置处的氨基酸残基突变(例如，将其置换)而获得。这将在下文中更详细地描述。

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO：2的残基29、43、48、116和502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其包含

a)在与SEQ ID NO：2的位置502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换，以及任选地，选自由SEQ ID NO：2的残基29、43、48和116或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组的氨基酸置换；

b)在与SEQ ID NO：2的位置98或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换，以及任选地，选自由SEQ ID NO：2的残基97、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组的一个或两个氨基酸置换；

所述葡糖淀粉酶变体至少具有选自所述界面氨基酸组或所述催化核心氨基酸残基组的一个氨基酸置换；

其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少80％的序列同一性。

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其包含

a)在与SEQ ID NO：2的位置502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换；

b)在与SEQ ID NO：2的位置98或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换；以及

c)在与SEQ ID NO：2的位置48或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换，或者在与SEQ ID NO：2的位置147或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换；

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其包含

c)在与SEQ ID NO：2的位置147或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换；

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其包含

c)在与SEQ ID NO：2的位置48或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换；

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其包含SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换H502S；SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换L98E；SEQ IDNO：2或13的氨基酸置换Y48V，或者SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换Y147R；其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：2或13具有至少80％的序列同一性。

在一个方面，本文描述了具有淀粉结合结构域和催化结构域的葡糖淀粉酶变体，所述变体包含由SEQ ID NO：2的残基29、43、48、116和502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其还包含由SEQ ID NO：2的残基24、26、27、30、40、42、44、46、49、110、111、112、114、117、118、119、500、504、534、536、537、539、541、542、543、544、546、547、548、580、583、585、587、588、589、590、591、592、594和596或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换。

在另一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其还包含由SEQ ID NO：2的位置1至484中除位置24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、97、98、110、111、112、114、116、117、118、119、147、175、483和484之外的位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中的残基组成的催化核心氨基酸组中的一个、两个或三个氨基酸置换。

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO：2的残基24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118、119、500、502、504、534、536、537、539、541、542、543、544、546、547、548、580、583、585、587、588、589、590、591、592、594和596或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换。

在另一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO：2的位置1至484中除位置24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118和119之外的位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中的残基组成的催化核心氨基酸组中的一个、两个或三个氨基酸置换。

在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，当其剂量为0.058mgGA/ml麦芽汁时，如“测定法和方法”一节中的“酿造”分析中所述，其具有至少74.5％，诸如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％的RDF。

在一个方面，本发明描述了用于衍生一组TrGA变体的结构-功能性键，该组变体在啤酒中充分地不耐热，由此可被巴氏灭菌完全灭活，且同时在整个啤酒发酵过程中均保持着通过实际发酵程度进行评估的高性能。在另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含由SEQ ID NO：2的残基F29、I43、Y48、F116和H502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换，其中I43中的置换为I43Q，并且Y48中的置换为Y48V；以及由SEQ ID NO：2的残基S97、L98、Y147、F175、G483和T484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中S97中的置换为S97M，G483中的置换为G483S，并且T484中的置换为T484W。

在一个方面，如本文所述的亲本葡糖淀粉酶为SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22。在另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体与SEQID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少80％的序列同一性，诸如至少85％、90％、95％或99.5％的序列同一性。在一个方面，本文所述的亲本葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8、9和/或13具有至少80％、85％、90％、95％或99.5％的序列同一性的催化结构域，和/或与SEQ ID NO：11、24、25、26、27、28和/或29具有至少80％、85％、90％、95％或99.5％的序列同一性的淀粉结合结构域。

在另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体由氨基酸的SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22的亲本序列组成，氨基酸的该序列具有由SEQ ID NO：2的残基F29、I43、Y48、F116和H502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换，其中I43中的置换为I43Q，并且Y48中的置换为Y48V；以及由SEQ ID NO：2的残基S97、L98、Y147、F175、G483和T484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中S97中的置换为S97M，G483中的置换为G483S，并且T484中的置换为T484W。

在另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体由氨基酸的SEQ ID NO：2的序列组成，氨基酸的该序列具有由SEQ ID NO：2的残基F29、I43、Y48、F116和H502组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换，其中I43中的置换为I43Q，并且Y48中的置换为Y48V；以及由SEQ ID NO：2的残基S97、L98、Y147、F175、G483和T484组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中S97中的置换为S97M，G483中的置换为G483S，并且T484中的置换为T484W。

在另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体由氨基酸的SEQ ID NO：13的序列组成，氨基酸的该序列具有由SEQ ID NO：13的残基F29、I43、Y48、F116和H502组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换，其中I43中的置换为I43Q，并且Y48中的置换为Y48V；以及由SEQ ID NO：13的残基S97、L98、Y147、F175、G483和T484组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中SEQ ID NO：13中的S97中的置换为S97M，G483中的置换为G483S，并且T484中的置换为T484W。

在一个方面，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶相比，显示出改变的热稳定性。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶，诸如所述变体与其具有最高的序列同一性的亲本葡糖淀粉酶相比，显示出下降的热稳定性。在一个方面，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶，诸如所述变体与其具有最高的序列同一性的亲本葡糖淀粉酶相比，显示出改变的比活性。在一个方面，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶，诸如所述变体与其具有最高的序列同一性的亲本葡糖淀粉酶相比，显示出类似或增加的比活性。在一个方面，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶，诸如所述变体与其具有最高的序列同一性的亲本葡糖淀粉酶相比，不仅显示出下降的热稳定性，还显示出类似或增加的比活性。

在一个方面，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶相比，在FV中显示出通过实际发酵程度(RDF)度量的改变的糖化性能。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶，诸如所述变体与其具有最高的序列同一性的亲本葡糖淀粉酶相比，在酿造中产生类似或下降的RDF值。

在另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体通过巴氏灭菌来灭活，例如在啤酒中使用小于16.8、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。在又一个方面，葡糖淀粉酶变体的葡糖淀粉酶活性(GAU)为0.05-10GAU/mg，诸如0.1-5GAU/mg，诸如0.5-4GAU/mg，诸如0.7-4GAU/mg，或诸如2-4GAU/mg。

在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体在处于其晶体形式时，具有的晶体结构的主链原子的原子坐标与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218中的表20中所定义)在等价主链原子比对后具有小于0.13nm的均方根偏差，并且所述葡糖淀粉酶变体具有连接区、淀粉结合结构域和催化结构域。

在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置F29或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F29A/R/N/D/C/E/F/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F29V，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置I43或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的I43Q，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置Y48或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的Y48V，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置F116或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F116M，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置H502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的H502A/N/D/C/E/F/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V/W/Y，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的H502S/E，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置S97或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的S97M，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置L98或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的L98A/R/N/E/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V/Y，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的L98E，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置Y147或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的Y147R，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置F175或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F175V/I/L，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置G483或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的G483S，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含与SEQ ID NO：2的位置T484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的T484W，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

在一个方面，以下组(1)由SEQ ID NO：2的残基24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118、119、500、502、504、534、536、537、539、541、542、543、544、546、547、548、580、583、585、587、588、589、590、591、592、594和596或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸残基组；和(2)由在SEQID NO：2的位置1至484中除位置24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118和119之外的位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中的不与淀粉结合结构域直接接触的残基组成的催化核心氨基酸残基组；中的氨基酸置换的总数为二、三或四。

在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含以下氨基酸置换：SEQID NO：2或13的F29V-G483S、Y48V-L98E-H502S、F116M-F175V、F175V-H502E、I43Q-F175I、I43Q-F175V-H502S、F29V-S97M-G483S-T484W或L98E-Y147R-H502S，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体还包含以下氨基酸置换：L417V、T430A、Q511H、A539R和N563I。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体为SEQ ID NO：14、15或16。在一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体为SEQ ID NO：14、15或17。在另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含SEQ ID NO：14、15或16。在另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包含SEQ ID NO：14、15或17。

在一个方面，亲本葡糖淀粉酶选自从下述物种获得的葡糖淀粉酶：木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属物种、腐质霉属物种、青霉属物种、篮状菌属物种、或裂殖酵母属(Schizosaccharmyces)物种(图10C、D和E)。在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶是从木霉属物种或曲霉属物种获得的。

在一个方面，一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的同一性百分比通过使用具有如下默认设置的蛋白质-蛋白质Blast搜索(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)来确定：得分矩阵：blosum62，非冗余蛋白质序列数据库和blast算法

在一个方面，葡糖淀粉酶变体通过在宿主细胞中的重组表达而获得。

在一个方面，本发明涉及能够编码如本文所述的葡糖淀粉酶变体的核酸。在另一个方面，公开了包含这种核酸、或能够表达如本文所述的葡糖淀粉酶变体的表达载体或质粒。在一个方面，所述表达载体或质粒包含源自木霉属的启动子，诸如源自里氏木霉cbhI的启动子。在另一个方面，所述表达载体或质粒包含源自木霉属的终止子，诸如源自里氏木霉cbhI的终止子。在又一个方面，所述表达载体或质粒包含一个或多个选择性标记，诸如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS和pyrG。在另一个方面，所述表达载体或质粒包含允许在宿主细胞中维持非染色体质粒的一个或多个端粒区域。

在一个方面，本发明涉及具有如本文所述的葡糖淀粉酶变体的异源表达的宿主细胞。在另一个方面，相应的宿主细胞是真菌细胞。在又一个方面，真菌细胞是木霉属的细胞。在又一个方面，真菌细胞是里氏木霉物种或红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)物种的细胞。在另一个方面，所述宿主细胞包含如本文所述的质粒或表达载体，或优选地用如本文所述的质粒或表达载体进行转化。

在一个方面，本发明涉及分离如本文定义的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括如下步骤：诱导葡糖淀粉酶变体在如本文定义的具有所述葡糖淀粉酶变体的异源表达的宿主细胞中合成，随后回收由所述宿主细胞分泌的细胞外蛋白，以及任选地纯化所述葡糖淀粉酶变体。在另一个方面，本发明涉及生成如本文定义的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括如下步骤：诱导葡糖淀粉酶变体在如本文定义的具有所述葡糖淀粉酶变体的异源表达的宿主细胞中合成，以及任选地纯化所述葡糖淀粉酶变体。在另一个方面，本发明涉及表达如本文定义的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括：获得如本文定义的宿主细胞，随后由所述宿主细胞表达葡糖淀粉酶变体，以及任选地纯化所述葡糖淀粉酶变体。在另一个方面，如本文定义的葡糖淀粉酶变体是优势分泌蛋白。

在一个方面，本发明涉及包含一种或多种如本文所述的葡糖淀粉酶变体的组合物。在一个方面，所述组合物选自淀粉水解组合物、糖化组合物、洗涤剂组合物、醇发酵酶组合物，以及动物饲料、动物饲料组合物。在另一个方面，所述组合物包含一种或多种另外的酶。在又一个方面，所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。在另一个方面，此类葡糖淀粉酶变体和/或一种或多种另外的酶通过巴氏灭菌来灭活。在又一个方面，葡糖淀粉酶变体和/或一种或多种另外的酶通过巴氏灭菌来灭活，例如在啤酒中通过使用小于50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。

在一个方面，本发明涉及如本文公开的葡糖淀粉酶变体或如本文公开的组合物在发酵中的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体或组合物在发酵步骤之前或期间添加。在另一个方面，在所述发酵步骤，以及任选的啤酒过滤步骤之后是巴氏灭菌步骤。在一个方面，所述发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中。在一个方面，所述发酵饮料选自啤酒，诸如低醇啤酒或低卡路里啤酒。在一个方面，将本文公开的葡糖淀粉酶变体或组合物与一种或多种另外的酶结合而添加，所述一种或多种另外的酶诸如α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。在另一个方面，葡糖淀粉酶变体和/或一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中被灭活。在一个方面，葡糖淀粉酶变体以例如0.01-50mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.05-25mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.1-15mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.2-10mg/ml发酵麦芽汁，诸如1-5mg/ml发酵麦芽汁的量添加。在一个方面，本文描述了不耐热的葡糖淀粉酶变体用于提高酿造工艺的发酵步骤中的可发酵糖的产量的用途，其中葡糖淀粉酶变体如本文所公开。

在一个方面，本发明涉及一种方法，其包括在发酵步骤(诸如利用酵母的发酵步骤)之前或期间添加如本文公开的葡糖淀粉酶变体或如本文公开的组合物。在另一个方面，所述方法包括在发酵步骤或任选的啤酒过滤步骤之后进行巴氏灭菌步骤。在另一个方面，所述发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中。在又一个方面，所述发酵饮料选自啤酒，诸如低醇啤酒、低卡路里啤酒。在另一个方面，将所述葡糖淀粉酶变体或所述组合物与一种或多种另外的酶结合而添加，所述一种或多种另外的酶诸如选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。在另一个方面，葡糖淀粉酶变体和/或一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中被灭活。在一个方面，葡糖淀粉酶变体以例如0.01-50mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.05-25mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.1-15mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.2-10mg/ml发酵麦芽汁，诸如1-5mg/ml发酵麦芽汁的量添加。在又一个方面，用于生产发酵饮料的方法包括如下步骤：

a)制备醪液(mash)，

b)过滤醪液以获得麦芽汁，以及

c)对麦芽汁进行发酵以获得发酵饮料，

其中将如本文公开的葡糖淀粉酶变体或如本文公开的组合物添加到：步骤(a)的醪液和/或步骤(b)的麦芽汁和/或步骤(c)的麦芽汁。

在另一个方面，使发酵饮料经受巴氏灭菌步骤(d)。在又一个方面，步骤(a)中的醪液从谷粉获得，诸如其中所述谷粉包含发芽和/或未发芽的谷粒，或来自另一种作物的基于淀粉的材料中的一者或多者。在另一个方面，所述方法还包括使步骤(a)的醪液与一种或多种另外的酶接触，诸如其中所述酶选自淀粉脱支酶、R-酶、极限糊精酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。在另一个方面，所述方法还包括使步骤(b)或(c)的麦芽汁与一种或多种另外的酶接触，其中所述酶选自淀粉脱支酶、异淀粉酶和极限糊精酶，包括它们的任何组合。

在另一个方面，本发明涉及发酵饮料，其中所述发酵饮料通过如本文所述的方法制造。在另一个方面，所述发酵饮料是啤酒，诸如低醇啤酒或低卡路里啤酒。

在另一个方面，本发明涉及生产食品、饲料或饮料产品(诸如醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，例如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁)的方法，所述方法包括用如本文公开的葡糖淀粉酶变体或如本文公开的组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。

在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含如本文公开的葡糖淀粉酶变体，或如本文公开的组合物；以及所述葡糖淀粉酶变体或组合物的使用说明。

在另一个方面，本发明涉及如本文公开的葡糖淀粉酶变体或如本文公开的组合物在生产第一代或第二代生物燃料(诸如生物乙醇和/或生物丁醇)中的用途。

在另一个方面，本发明涉及如本文公开的葡糖淀粉酶变体或如本文公开的组合物在生产生物化学品(诸如生物基异戊二烯)中的用途。

在另一个方面，本发明涉及生产第一代或第二代生物燃料(诸如生物乙醇和/或生物丁醇)的方法，所述方法包括用如本文公开的葡糖淀粉酶变体或如本文公开的组合物来处理含有淀粉的材料的步骤。

在另一个方面，本发明涉及生产生物化学品(诸如生物基异戊二烯)的方法，所述方法包括用如本文公开的葡糖淀粉酶变体或如本文公开的组合物来处理含有淀粉的材料的步骤。

在另一个方面，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的产品。

在另一个方面，本发明涉及包含通过根据本发明的方法获得的产品的组合物，诸如其中所述产品在0.1％-99.9％的范围内。

1.定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton et al.，Dictionaryof Microbiology And Molecular Biology，2^nd ed.，John Wiley and Sons，NewYork(1994)(Singleton等人，《微生物学与分子生物学词典》，第2版，约翰威立父子出版公司，纽约，1994年)和Hale&Markham，The HarperCollins Dictionary Of Biology，Harper Perennial，N.Y.(1991)(Hale和Marham，《哈普柯林斯生物学词典》，哈珀永久出版社，纽约，1991年)为技术人员提供了本文所用许多术语的通用意义。为了清楚和引用方便起见，在下文中还是定义了某些术语。

如本文所用，术语“葡糖淀粉酶”(EC 3.2.1.3)是指催化从淀粉和相关寡糖及多糖的非还原末端释放D-葡萄糖的酶。

术语“亲本”或“亲本序列”是指宿主细胞中天然的或自然存在的序列。亲本葡糖淀粉酶包括但不限于SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21和22中任一者所示的葡糖淀粉酶序列，以及与SEQ ID NO：2具有至少80％的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。

如本文所用，术语“亲本”或“亲本序列”还可以指成熟TrGA变体CS4(SEQ ID NO：13)，包括与TrGA(SEQ ID NO.2)相比的L417V-T430A-Q511H-A539R-N563I。TrGA CS4的成熟形式包括催化结构域、连接区和淀粉结合结构域，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列。TrGA CS4中的葡糖淀粉酶氨基酸的编号方式类似于TrGA，并且基于葡糖淀粉酶与TrGA(SEQ ID NO：2和/或3)的序列比对。预期TrGA CS4的三维结构与里氏木霉葡糖淀粉酶的三维结构相同(参见WO2009/067218(美国丹尼斯科有限公司杰能科分公司(Danisco US Inc.，Genencor Division))中第94-216页的表20，在此以引用的方式并入本文；以及WO2009/067218(美国丹尼斯科有限公司杰能科分公司(Danisco US Inc.，Genencor Division))中第89-93页的实例11，在此以引用的方式并入本文)。

如本文所用，“等价位置”意指基于所考虑的亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列以及所考虑的亲本葡糖淀粉酶的三维结构与TrGA参考葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2或13)以及三维结构的比对而为两个亲本序列所共有的位置。因此，可使用序列比对或结构比对来确定等价性。

术语“TrGA”是指具有SEQ ID NO：2中示出的成熟蛋白质序列的亲本里氏木霉葡糖淀粉酶序列，所述成熟蛋白质序列包括具有SEQ ID NO：3中示出的序列的催化结构域。TrGA的分离、克隆和表达描述于WO2006/060062和美国专利No.7,413,887中，二者均以引用方式并入本文。在一些实施例中，亲本序列是指为蛋白质工程改造的起始点的葡糖淀粉酶序列。本文中的葡糖淀粉酶氨基酸的编号方式是基于葡糖淀粉酶与TrGA(SEQ ID NO：2和/或3)的序列比对。

术语“TrGA CS4”或“CS4”是指具有SEQ ID NO：13中示出的成熟蛋白质序列的亲本里氏木霉葡糖淀粉酶变体CS4序列，所述成熟蛋白质序列包括与TrGA(SEQ ID NO：2)相比的L417V-T430A-Q511H-A539R-N563I。

短语“变体、蛋白质或多肽的成熟形式”是指变体、蛋白质或多肽的最终的功能形式。葡糖淀粉酶的成熟形式可例如缺少信号肽。为了举例说明，TrGA/-CS4的成熟形式包括催化结构域、连接区和淀粉结合结构域，其具有SEQ ID NO：2/13的氨基酸序列。

如本文所用，术语“葡糖淀粉酶变体”和“变体”用于指与亲本葡糖淀粉酶序列具有一定程度的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。变体与亲本序列相似，但是在其氨基酸序列中具有至少一个使得它们在序列上不同于亲本葡糖淀粉酶的置换、缺失或插入。在某些情况中，对变体进行操纵和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一个使得它们在序列上不同于亲本的置换、缺失或插入。另外，葡糖淀粉酶变体可保留亲本葡糖淀粉酶的功能特性，例如，维持亲本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性的至少约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。如果是所选择的，其也可具有高于100％的活性。

当为了比较而进行最佳比对时，“变体”与亲本多肽序列可具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶的催化结构域可具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域可具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％的序列同一性。可在亲本或变体序列的全长上测量序列同一性。

如本文所用，涉及核酸或多肽序列的“同源序列”和“序列同一性”是指当为了比较而进行最佳比对时与核酸序列或多肽序列具有约至少100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少88％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％、或至少45％序列同一性，其中候选核酸序列或多肽序列的功能基本上跟与候选同源序列相比较的核酸序列或多肽序列相同。在一些实施例中，同源序列具有至少约85％和100％之间的序列同一性，而在其他实施例中，存在约90％和100％之间的序列同一性，并且在其他实施例中，存在至少约95％和100％的序列同一性。

同一性程度

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性”进行描述。

在一个实施例中，查询序列和参考序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认计分矩阵和默认空位罚分，将所述两个序列进行对比，2)识别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上识别出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数量除以参考序列的长度。

在一个实施例中，查询序列和参考序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认计分矩阵和默认空位罚分，将所述两个序列进行对比，2)识别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上识别出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数量除以所述两个序列中最长者的长度。

在一个实施例中，查询序列和参考序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认计分矩阵和默认空位罚分，将所述两个序列进行对比，2)识别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上识别出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数量除以“比对长度”，其中比对长度是整个比对的长度，包括所述序列的空位和突出部分。

序列同一性比较可通过眼来进行，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购获得的计算机程序使用复杂的比较计算法来比对最反映可能会导致两个或更多个序列之间的差异的演化事件的两个或更多个序列。因此，这些计算法用对相同或类似氨基酸对齐加分并对空位插入、空位延伸和非相似氨基酸对齐罚分的评分系统进行工作。比较计算法的评分系统包括：

i)每次插入空位时分配罚分(空位罚分)，

ii)每次现有的空位延伸额外的位置时分配罚分(延伸罚分)，

iii)相同氨基酸对齐时分配高分，以及

iv)非相同氨基酸对齐时分配可变分数。

大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。

根据计分矩阵(也称为置换矩阵)分配非相同氨基酸对齐时的分数。此类置换矩阵中提供的分数反映这样的事实：演化过程中一个氨基酸被另一个取代的可能性不同，并且取代的可能性取决于待取代的氨基酸的物理/化学性质。例如，极性氨基酸被另一个极性氨基酸取代的可能性比被疏水氨基酸取代的可能性要高。因此，计分矩阵将为相同氨基酸分配最高的分数，为非相同但相似的氨基酸分配较低的分数，并为非相同、非相似的氨基酸分配甚至更低的得分。最常用的计分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff等人(1978年)，Jones等人(1992年))、BLOSUM矩阵(Henikoff和Henikoff(1992年))和Gonnet矩阵(Gonnet等人(1992年))。

进行这种比对的合适的计算机程序包括(但不限于)Vector NTI(英杰公司(Invitrogen Corp.))以及ClustalV、ClustalW和ClustalW2程序(Higgins DG和Sharp PM(1988年)，Higgins等人(1992年)，Thompson等人(1994年)，Larkin等人(2007年))。在网址为www.expasy.org的蛋白分析专家系统服务器(ExPASy Proteomics server)上提供了精选的不同比对工具。可以进行序列比对的软件的另一个例子是BLAST(基本局部比对搜索工具)，它由当前网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)网页提供，并且首先描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215；403-410(Altschul等人，《分子生物学杂志》，1990年，第215卷，第403-410页)中。

在本发明的一个实施例中，所述比对程序执行全局比对程序，该全局比对程序优化了在序列的全长上的比对。在另一个实施例中，所述全局比对程序基于Needleman-Wunsch算法(Needleman，Saul B.；and Wunsch，Christian D.(1970)。“A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins”。Journal of Molecular Biology 48(3)：443-53(Needleman，Saul B.和Wunsch，Christian D.，1970年，“适用于搜索两种蛋白质的氨基酸序列的相似性的通用方法”，《分子生物学杂志》，第48卷，第3期，第443-453页))。当前使用Needleman-Wunsch算法执行全局比对的程序的例子为EMBOSS Needle和EMBOSS Stretcher程序，它们均可从网址http：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/获得。

EMBOSS Needle程序使用Needleman-Wunsch比对算法查找两个序列沿着它们的整个长度的最佳比对(包括空位)，从而执行最佳全局序列比对。

EMBOSS Stretcher程序使用改进的Needleman-Wunsch算法，其能够对较大的序列进行全局比对。

在一个实施例中，通过全局比对程序将所述序列进行比对，并且序列同一性通过由程序识别出精确匹配的数量，再将该数量除以“比对长度”而计算得到，其中比对长度是整个比对的长度，包括所述序列的空位和突出部分。在另一个实施例中，全局比对程序使用Needleman-Wunsch算法，并且序列同一性通过由程序识别出精确匹配的数量，再将该数量除以“比对长度”而计算得到，其中比对长度是整个比对的长度，包括所述序列的空位和突出部分。

在又一个实施例中，全局比对程序选自EMBOSS Needle和EMBOSSStretcher，并且序列同一性通过由程序识别出精确匹配的数量，再将该数量除以“比对长度”而计算得到，其中比对长度是整个比对的长度，包括所述序列的空位和突出部分。

软件进行比对后，可以计算相似性％和序列同一性％。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。

在一个实施例中，优选的是使用ClustalW软件进行序列比对。优选地，用ClustalW和以下参数进行双序列比对：

置换矩阵：	Gonnet 250
		空位开放罚分：	20

空位延伸罚分：	0.2
		空位终止罚分：	无

例如，ClustalW2由欧洲生物信息学研究所(European BioinformaticsInstitute)列于EMBL-EBI网页www.ebi.ac.uk选项卡“工具”-“序列分析”-“ClustalW2”下，供互联网使用。目前，ClustalW2工具的准确地址为www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。

在另一个实施例中，优选使用Vector NTI(英杰公司(Invitrogen))中的程序Align X来执行序列比对。在一个实施例中，可以采用下列默认设置使用Exp10：

空位开放罚分：10

空位延伸罚分：0.05

空位分离罚分范围：8

在另一个实施例中，一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的比对通过使用得分矩阵blosum62mt2和VectorNTI，采用以下成对比对设置确定

在一个优选的实施例中，一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的同一性百分比通过使用具有如下默认设置的蛋白质-蛋白质Blast搜索(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)来确定：得分矩阵：字长为3，blosum62置换矩阵，非冗余蛋白质序列数据库以及blast算法

术语“最佳比对”是指给出最高同一性百分比评分的比对。

使用本领域中已知的标准技术来确定同源性(参见例如Smith andWaterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)(Smith和Waterman，《应用数学进展》，第2卷，第482页，1981年)；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页，1970年)；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)(Pearson和Lipman，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页，1988年)；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)(威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机集团(GeneticsComputer Group，Madison，WI))中的程序，诸如GAP、BESTHT、FASTA和TFASTA；以及Devereux el al.，Nucleic Acid Res.，12：387-395(1984)(Devereux等人，《核酸研究》，第12卷，第387-395页，1984年))。

通过已知的序列比对方法来测定同源序列。在本申请中通过序列比对的方法确定“序列同一性”。通常使用的比对方法为Altschul等人所描述的BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)(Altschul等人，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页，1990年)；和Karlin et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993)(Karlin等人，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5787页，1993年))。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul et al，Meth.Enzymol.266：460-480(1996)(Altschul等人，《酶学方法》，第266卷，第460-480页，1996年))。WU-BLAST-2使用数个搜索参数，其中大多数被设置为默认值。可调节的参数设定为以下值：重叠跨越(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字长阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSPS2参数是动态的值，并且取决于具体序列的组成和针对其对所关注序列进行检索的具体数据库的组成而由程序本身确立。然而，可调节所述值以增加灵敏度。

其他方法可用于比对序列。可用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化形式(Feng and Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360(1987)(Feng和Doolittle，《分子进化杂志》，第35卷，第351-360页，1987年))。该方法类似于Higgins和Sharp所描述的方法(Higgins and Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)(Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页，1989年))。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重＝3.00，默认空位长度权重＝0.10，以及加权的末端空位。

如本文所用，术语“葡糖淀粉酶变体”或“变体”是用来指这样的葡糖淀粉酶，其类似于亲本葡糖淀粉酶序列，但在其氨基酸序列中具有至少一个使其在序列上不同于亲本序列的置换、缺失或插入。在一些情况下，对其进行操纵和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一个使其在序列上不同于亲本葡糖淀粉酶的置换、缺失或插入。

如本文所用，术语“催化结构域”是指多肽的结构区域，其含有催化底物水解的活性位点，参见例如下文的TrGA的特定区域。

位于来自里氏木霉的葡糖淀粉酶中的催化核心结构域和淀粉结合结构域之间的界面区域通过使用用于探索大分子蛋白质界面的PDBePISA交互式工具(http：//www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html)，采用数据库搜索和PDB入门参数：2VN4来确定(R.Bott et al.，(2008)Biochemistry 47：5746-5754(R.Bott等人，2008年，《生物化学》，第47卷，第5746-5754页))，其中为了进行分子内界面分析对链同一性进行改进，方式为：链A，残基1-453；催化核心结构域，以及链B，残基491-599。界面搜索采用针对界面分析的默认设置执行：

设置：处理模式，自动

是否处理配体，是

搜索得到了位于两个结构域之间的连接表面区域处的以下氨基酸残基，其与SEQ ID NO：2的位置24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118、119、500、502、504、534、536、537、539、541、542、543、544、546、547、548、580、583、585、587、588、589、590、591、592、594和596对应，使用Pymol(PyMOL分子图形系统(PyMOL Molecular Graphics System)，1.2r3pre版，薛定谔有限责任公司(LLC.))以手动检测方式对所述残基进行验证。

在本发明的上下文中，术语“位置1至484中的不与淀粉结合结构域直接接触的残基”意指SEQ ID NO：2的位置1至484中的不与淀粉结合结构域中的氨基酸残基产生直接的静电、极性或疏水相互作用的氨基酸残基。位置1至484位中的大部分残基不直接接触，如从TrGA的结构中所看到(PDB ID：2VN4)。相互作用和所涉及残基的鉴定可由PISA ePDB服务器定义，并且包括：疏水相互作用(范德华力)、氢键、偶极、或侧链与主链原子之间的其他直接静电相互作用。因此，在一个方面，来自SEQ IDNO：2的残基1至484中的全部，除SEQ ID NO：2的残基24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118和119之外，均不与淀粉结合结构域直接接触。

术语“连接区”是指通常具有3至40个氨基酸残基的短氨基酸序列，其将包含淀粉结合结构域的氨基酸序列与包含催化结构域的氨基酸序列共价结合。

术语“淀粉结合结构域”(SBD)是指优先结合淀粉底物的氨基酸序列。本领域的技术人员熟知如何鉴定SBD-该SBD为碳水化合物结合模块(CBM)的例子，并且CBM已通过使用基于序列的分类系统被分类为CBM家族(http：//www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html)。此外，本领域的技术人员熟知使用生淀粉或β-环糊精亲合色谱法来分离包含例如SBD的材料(Hamilton et al.(2000)Enzyme and Microbial Technology 26 p561-567(Hamilton等人，2000年，《酶与微生物技术》，第26卷，第561-567页))。在一个方面，SBD的结构域定义取自Pfam数据库(http：//pfam.sanger.ac.uk/orwww.sanger.ac.uk/resources/databases/pfam.html)，该蛋白质结构域家族数据库根据序列相似性产生。因此，在一个方面，SBD由Pfam数据库中的碳水化合物结合模块20家族定义。

如本文所用，术语“片段”被定义为这样的变体，其从例如SEQ IDNO：2的多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(若干)氨基酸；其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一个方面，所述片段从SEQ ID NO：2或13的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(若干)氨基酸。

如本文所用，术语“截短的”是指这样的多肽，其与亲本葡糖淀粉酶(或另一种变体)相比未达到其完全翻译长度，并且因此丢失了存在于亲本葡糖淀粉酶中的一些氨基酸。截短通常由提前终止突变导致，但是也可能由另一种机制引起：诸如翻译后修饰或蛋白酶切割。

如本文所用，术语“突变序列”和“突变基因”可互换使用并且是指在存在于宿主细胞的亲本序列中的至少一个密码子中具有改变的多核苷酸序列。突变序列的表达产物是相对于亲本葡糖淀粉酶具有改变的氨基酸序列的变体蛋白质。表达产物可具有改变的功能能力(例如，增强的酶活性或下降的热稳定性)。

如本文所用，在多肽的语境中，术语“特性”或其语法上的等价物是指多肽可被选择或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、K_M、K_CAT、K_CAT/K_M比、蛋白质折叠、结合底物的能力和被分泌的能力。

如本文所用，在核酸的语境中，术语“特性”或其语法上的等价物是指核酸的任何可被选择或检测的特征或属性。这些特性包括但不限于影响基因转录(例如，启动子强度或启动子识别)的特性、影响RNA加工(例如，RNA剪接和RNA稳定性)的特性、影响翻译(例如，调节mRNA与核糖体蛋白的结合)的特性。

术语“热稳定的”和“耐热的”是指在淀粉底物水解过程中的普遍条件下(例如在暴露于改变的温度时)，在暴露于温度持续给定的时间段后可保留特定量的酶活性的本公开的葡糖淀粉酶变体。

在诸如热稳定性的特性的语境中，术语“增强的稳定性”是指与亲本葡糖淀粉酶相比，随时间推移经测量仍然保持较高的催化活性或淀粉水解活性。

术语“不耐热葡糖淀粉酶”是指本公开的葡糖淀粉酶，在暴露于一定温度持续给定的时间段后失去可检测的水解酶活性。在一个方面，术语“不耐热葡糖淀粉酶”是指本公开的葡糖淀粉酶，其在酿造过程产物的巴氏灭菌期间的常见的条件下，在暴露于一定温度持续给定的时间段后失去可检测的水解酶活性。巴氏灭菌的精确条件(例如巴氏灭菌单位)将取决于通过酿造过程生产的啤酒的类型。巴氏灭菌的啤酒中不耐热葡糖淀粉酶的可检测水解活性的损失可使用本文所述的葡糖淀粉酶测定法来检测，并且可由通过该测定法测得的活性的损失来定义。在一个方面，当与亲本葡糖淀粉酶比较时，“热稳定性下降”可与“更不耐热”互换使用。

术语“比活性”定义为每毫克葡糖淀粉酶蛋白的活性。在一些实施例中，葡糖淀粉酶的活性通过特定的葡糖淀粉酶显色测定法，利用pNP-β-麦芽糖苷底物测定，并将其表示为由底物在限定的测定条件下每分钟所生成的对硝基酚的量。在一些实施例中，可使用Bradford测定法来测定蛋白质浓度。

术语“活性的”和“生物学活性的”是指与特定蛋白质相关的生物学活性。因此，给定蛋白质的生物学活性是指本领域技术人员通常归于该蛋白质的任何生物学活性。例如，与葡糖淀粉酶相关的酶活性是水解性的，因此有活性的葡糖淀粉酶具有水解活性。

如本文所用，术语“葡糖淀粉酶活性”是指催化从淀粉和相关寡糖及多糖的非还原末端释放D-葡萄糖的酶的活性。具体地讲，可通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法来测定葡糖淀粉酶活性(参见Goto et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.58：49-54(1994)(Goto等人，《生物科学生物技术和生物化学》，第58卷，第49-54页，1994年))。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的多聚形式的核苷酸，其为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

如本文所用，术语“DNA构建体”、“转化DNA”和“表达载体”可互换使用，指用于将序列引入宿主细胞或生物体中的DNA。可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其他合适的技术在体外产生所述DNA。DNA构建体、转化DNA或重组表达盒可被掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列外，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达盒部分还包括待转录的核酸序列和启动子。在一些实施例中，表达载体具有将异源DNA片段掺入宿主细胞中并使其表达的能力。

如本文所用，术语“载体”是指多核苷酸构建体，其被设计用于将核酸引入一个或多个细胞类型中。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。

如本文所用，在将核酸序列引入细胞中的语境中，术语“引入”是指任何适于将核酸序列转移进细胞中的方法。此类用于引入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导。

如本文所用，术语“转化的”和“稳定转化的”是指具有非天然(异源)多核苷酸序列的细胞，所述多核苷酸序列被整合进其基因组中或作为被保持至少两代的附加型质粒。

如本文所用，术语“可选标记”和“选择性标记”是指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如基因)，其使得能容易地选择含有该载体的那些宿主。通常，可选标记是赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势的基因以允许将含有外源DNA的细胞与在转化过程中未接受任何外源序列的细胞区分开。

如本文所用，术语“启动子”是指起作用以引导下游基因的转录的核酸序列。启动子以及其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)是表达给定基因所必需的。通常，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。

当将核酸置于与另一核酸序列的功能性关系中时，其为“有效连接”(operably linked)的。例如，如果编码分泌前导序列(即信号肽)的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白(preprotein)的话，则其可与该多肽的DNA有效连接。通常，“有效连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情形中，其为连续的且在阅读相中。

如本文所用，术语“基因”是指多核苷酸(例如DNA区段)，其编码多肽且包括编码区之前和之后的区域，以及单个编码区段(外显子)之间的居间序列(内含子)。

如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。

如果一条核酸序列与参考核酸序列在中等至高严格性杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则该核酸序列被认为是与该参考核酸序列“可选择性杂交”。杂交条件是基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格性”通常发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm 5℃)下；“高严格性”在低于该Tm约5-10℃下；“中度严格性”在低于探针的Tm约10-20℃下；而“低严格性”在低于该Tm约20-25℃下。功能上，最大严格性条件可用于鉴别与杂交探针有严格同一性或接近严格同一性的序列；而中度或低严格性杂交可用于鉴别或检测多核苷酸序列同源物。

中等和高严格性杂交条件是本领域所熟知的。高严格性条件的例子包括在约42℃下，在50％甲酰胺、5×SSC、5×邓哈特溶液(Denhardt′ssolution)、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，然后在室温下，在2×SSC和0.5％SDS中洗涤两次，并且在42℃下，在0.1×SSC和0.5％SDS中再洗涤两次。中度严格性条件的例子包括在37℃下，在包含20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑鱼精子DNA的溶液中过夜温育，然后在约37-50℃下，在1×SSC中洗涤过滤器。本领域的技术人员了解如何根据需要来调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等的因素。

如本文所用，“重组的”包括指通过引入异源或同源核酸序列而被修饰的细胞或载体，或是指所述细胞源自经如此修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞可表达未在细胞的天然(非重组)形式中以相同形式存在的基因或者因人为故意干预而可表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。

在一个实施例中，在至少一个密码子和/或核苷酸中用位点饱和诱变产生突变的DNA序列。在另一个实施例中，对于两个或更多个密码子进行位点饱和诱变。在又一个实施例中，突变DNA序列与葡糖淀粉酶DNA序列具有大于约50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、或大于98％的同一性。在替代实施例中，可使用任何已知的诱变程序(例如辐射、亚硝基胍等)在体内产生突变DNA。然后可分离所需的DNA序列并将其用于本文所提供的方法中。

如本文所用，“异源蛋白”是指不在宿主细胞中天然存在的蛋白质或多肽。

如果酶以比其在相应野生型细胞中的表达水平更高的水平在宿主细胞中表达，则该酶在所述细胞中“过表达”。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的三字母代码遵照生物化学命名联合委员会(IUPAC-IUB Joint Commission onBiochemical Nomenclature(JCBN))的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。

本公开的变体通过如下命名法描述：[初始氨基酸残基/位置/置换的氨基酸残基]。当在本文中确定适合置换的位置而又没有提出具体的氨基酸时，应理解任何氨基酸残基都可置换在该位置中存在的氨基酸残基。

“原序列(prosequence)”是信号序列与成熟蛋白质之间的蛋白质分泌所必需的氨基酸序列。剪切原序列将产生成熟的活性蛋白质。

术语“信号序列”或“信号肽”是指可参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信号序列的这个定义是功能性定义，意在包括所有那些由该蛋白质基因的N末端部分所编码的、参与蛋白质分泌的实现的氨基酸序列。它们往往但并不普遍地结合到蛋白质的N末端部分或者结合到前体蛋白质的N末端部分。信号序列可以是内源性的或外源性的。信号序列可以是通常与蛋白质(例如葡糖淀粉酶)相关联的序列，或者可以是来自编码另一被分泌的蛋白质的基因的序列。

术语蛋白质或肽的“前体”形式是指具有与该蛋白质的氨基或羰基末端有效连接的原序列的蛋白质的成熟形式。前体也可具有与原序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。前体还可具有涉及翻译后活性的额外的多核苷酸(例如，从其上被剪切而留下蛋白质或肽的成熟形式的多核苷酸)。

“宿主株系”或“宿主细胞”是指用于包含根据本公开的DNA的表达载体的适合宿主。

术语“源自”和“获自”不仅是指由所考虑的生物体的株系产生的或可由其产生的葡糖淀粉酶，还指由分离自此类株系的DNA序列编码并在含有这种DNA序列的宿主生物体中产生的葡糖淀粉酶。此外，该术语指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码且具有所考虑的葡糖淀粉酶的鉴别特征的葡糖淀粉酶。

在此定义范围内的“衍生物”通常以一定程度保留了在葡糖淀粉酶中所观察到的特征性水解活性，所述程度使得所述衍生物可用于与所述野生型、天然或亲本形式相似的目的。葡糖淀粉酶的功能性衍生物涵盖天然存在的、合成或重组产生的肽或肽片段，其具有本公开的葡糖淀粉酶的一般特征。

术语“分离的”是指从天然环境中移出的物质(如果其天然存在的话)。“纯化的”蛋白质是指被至少部分纯化至同质的蛋白质。在一些实施例中，如通过SDS-PAGE所测定的，纯化的蛋白质可以是超过约10％纯，任选地超过约20％纯，以及任选地超过约30％纯。如通过SDS-PAGE所测定的，本公开的另外的方面涵盖高度纯化形式的蛋白质(即超过约40％纯、超过约60％纯、超过约80％纯、超过约90％纯、超过约95％纯、超过约97％纯、以及甚至超过约99％纯)。

如本文所用，术语“组合诱变”是指其中产生了起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体含有一个或数个选自预定突变组的突变。此外，该方法提供了手段来引入不是预定突变组的成员的随机突变。在一些实施例中，该方法包括美国专利No.6,582,914中所示的那些，藉此将其以引用的方式并入本文。在替代实施例中，组合诱变方法涵盖可商购获得的试剂盒(例如，加利福尼亚州圣地亚哥Stratagene公司(Stratagene，SanDiego，CA)的Multisite)。

如本文所用，术语“突变体的文库”是指其基因组的大部分是相同的但包括一个或多个基因的不同同源物的一组细胞。可将此类文库用于例如鉴别具有改善性状的基因或操纵子。

如本文所用，术语“干固形物含量(DS或ds)”是指以干重计，以％表示的浆料的总固形物。

如本文所用，术语“初始命中物”是指通过筛选组合共有诱变文库而鉴别出的变体。在一些实施例中，与起始基因相比初始命中物具有改善的性能特征。

如本文所用，术语“改善的命中物”是指通过筛选增强的组合共有诱变文库而鉴别出的变体。

如本文所用，术语“靶特性”是指待改变的起始基因的特性。无意于将本公开限制为任何特定的靶特性。然而，在一些实施例中，靶特性是基因产物的稳定性(例如对变性、蛋白质水解或其他降解性因素的抗性)，而在其他实施例中，生产宿主中的生产水平得以改变。的确，设想的是起始基因的任何特性都将可用于本公开中。术语的其他定义可在整个本说明书中出现。

如本文所用，术语“组合物”涉及根据本发明制备的例如饮料、食品或饲料成分形式的制品，并且可为溶液形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施予模式。固体形式可作为干燥酶粉末或者作为颗粒化酶。组合物可包含根据本发明的变体、酶载体，以及任选的稳定剂和/或防腐剂。酶载体可选自甘油或水。该制品可包含稳定剂。稳定剂可选自无机盐类、多元醇类、糖类和它们的组合。此外，稳定剂可为无机盐，例如氯化钾。在另一个方面，多元醇是甘油、丙二醇或者山梨糖醇。糖是小分子碳水化合物，具体地讲是若干有甜味的小分子碳水化合物如葡萄糖、果糖和蔗糖中的任何一种。在又一个方面，该制品可包含防腐剂。在一个方面，防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸盐、山梨酸盐或者其他食品批准的防腐剂或者它们的混合物。

在本发明的上下文中，术语“发酵”是指通过使微生物在培养物中生长来提供组合物，例如发酵饮料和/或物质。在酶(如，葡糖淀粉酶)制备的上下文中，术语“发酵”是指涉及在微生物培养过程中制备酶的方法。在酿造的语境中，术语“发酵”是指麦芽汁中的糖被酿造啤酒用酵母中的酶转化为乙醇和二氧化碳，伴随其他发酵副产物的形成。

如本文所用，“制备发酵饮料(例如啤酒)的方法”一般包括以下步骤：制备醪液(例如基于谷粉)，过滤醪液以得到麦芽汁和废糟，以及发酵麦芽汁以得到发酵饮料。

如本文所用，术语“含有淀粉和/或糖的植物材料”是指可源自任何植物和植物部分的含有淀粉和/或糖的植物材料，所述植物和植物部分包括块茎、根、茎、叶和种子。例如，“包含淀粉和/或糖的植物材料”可为例如一种或多种谷类，如大麦、小麦、玉蜀黍、黑麦、高粱、粟或稻米以及它们的任何组合。包含淀粉和/或糖的植物材料可被处理，例如碾磨、发芽、部分发芽或未发芽。未发芽的谷类也称“原粮”。非谷类含淀粉植物材料的例子包括例如块茎。

如本文所用，术语“谷粉”是指适于淀粉糖化的任何经处理的含有淀粉和/或糖的植物材料。如本文所设想的，谷粉可包含可源自任何植物和植物部分的任何含有淀粉和/或糖的植物材料，所述植物和植物部分包括块茎、根、茎、叶和种子。处理的例子包括研磨和/或碾磨，这通常提供比面粉更粗的材料。在本发明的语境中，谷粉可包含来自谷粒的经处理的材料，诸如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(玉蜀黍)、稻米、蜀黍、粟和高粱的谷粒，并且更优选地，至少10％、或更优选至少15％、甚至更优选至少25％、或最优选至少35％，诸如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量)的麦芽汁的谷粉源自谷粒。在一些实施例中，谷粉可包含从木薯[Manihot esculenta]根获得的含有淀粉和/或糖的植物材料。谷粉可包含发芽的谷粒，如大麦麦芽。优选地，至少10％、或更优选至少15％、甚至更优选至少25％、或最优选至少35％，诸如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量)的麦芽汁的谷粉源自发芽的谷粒。

如本文所用，术语“麦芽”被理解为任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。

在一个方面，当使用主要从与生产啤酒有关的选定大麦品种产生的麦芽时，麦芽对啤酒的整体特征和质量影响最大。第一，麦芽是啤酒中主要的风味剂。第二，麦芽提供可发酵糖的主要部分。第三，麦芽提供蛋白质，其将促成啤酒的主体(body)和泡沫特征。第四，麦芽在淀粉糖化过程中提供酶活性，任选地通过添加外源酶来补充。第五，麦芽废糟提供过滤介质以在淀粉糖化之后分离麦芽汁-通常通过滤清(lautering)或醪液过滤(mashfiltration)来分离。

如本文所用，术语“辅料”是指不是大麦麦芽的任何含有淀粉和/或糖的植物材料。作为辅料的例子，可以提及可用作淀粉来源的材料，诸如普通玉米(玉蜀黍)糁、精制玉米(玉蜀黍)糁、制啤酒用研磨酵母、稻米、高粱、精制玉米(玉蜀黍)淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘培谷类、谷类片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯和糖浆诸如玉米(玉蜀黍)糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等等。淀粉将最终被转化为糊精和可发酵糖。在一个方面，“辅料”包括从木薯[Manihot esculenta]根获得的含有淀粉和/或糖的植物材料。

如本文所用，术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或它们的组合的含水浆料，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。

如本文所用，术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化过程中对谷粉进行提取后未发酵的液体流出物(run-off)。

如本文所用，术语“废糟”是指当对谷粉进行了提取且将麦芽汁从醪液中分离时剩余的沥干的固体。“废糟”可用作例如饲料。

如本文所用，术语麦芽汁中的“提取回收率”是指从谷粉(麦芽和/或辅料)提取的可溶性物质的总和，以基于干物质的百分比表示。

如本文所用，术语“啤酒花”是指其在对啤酒质量(包括风味)作出显著贡献中的用途。具体地讲，啤酒花(或啤酒花组成物)给啤酒中加入想要的苦味化物质。此外，啤酒花可充当蛋白质沉淀剂，建立防腐剂并且有助于泡沫形成和稳定化。

如本文所用，术语“饮料”和“饮料产品”包括啤酒，例如全麦芽啤酒、以“《德国啤酒纯净法》”(“Reinheitsgebot”)酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、贮藏啤酒、苦啤酒、发泡酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等。术语“饮料”或“饮料产品”还包括替代形式的谷类和麦芽饮料，例如水果味麦芽饮料，例如柑橘味(诸如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味)麦芽饮料，酒味麦芽饮料(例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒)，或咖啡味麦芽饮料(例如咖啡因味麦芽酒)等。在又一个方面，饮料或饮料产品为醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，诸如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁。

如本文所用，术语“麦芽饮料”包括诸如全麦啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、贮藏啤酒、苦啤酒、发泡酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、淡啤酒、轻啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无醇麦芽酒等的麦芽饮料。术语“麦芽饮料”还包括替代形式的麦芽饮料，例如水果味麦芽饮料，例如柑橘味(诸如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味)麦芽饮料，酒味麦芽饮料(例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒)，或咖啡味麦芽饮料(例如咖啡因味麦芽酒)等。

在本发明的语境中，术语“啤酒”意在包括任何通过含淀粉植物材料的发酵/酿造生产的发酵麦芽汁，因此具体地讲还包括专门从麦芽或辅料生产或者从麦芽和辅料的任何组合生产的啤酒。

啤酒可通过基本上相同的方法由各种含有淀粉和/或糖的植物材料(通常为谷物谷粒和/或麦芽)制成。谷粒淀粉被认为是葡萄糖均聚物，其中葡萄糖残基通过α-1，4键或α-1，6键连接，以前者为主。

如本文所用，术语“比尔森啤酒”是指浅色底部发酵贮藏啤酒(lager)(由比尔森麦芽制成)，其通常比普通(例如淡啤酒(helles))浅色贮藏啤酒具有更明显的啤酒花特征。

如本文所用，术语“轻啤酒、卡路里减少的啤酒或低卡路里啤酒”是指最近广泛普及的酿造饮料，特别是在美国市场中。如在美国所定义的，这些高发酵度的啤酒与制造商的“普通”啤酒相比，卡路里少大约30％。

如本文所用，术语“无醇啤酒”或“低醇啤酒”是指以体积计含有最多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％醇的啤酒。无醇啤酒可通过特殊方法(停止发酵)用特殊的非产醇的“酵母”来酿造，或通过传统方法来酿造，但是在酿造过程的终了阶段期间，醇(例如)通过真空蒸发、通过利用水和醇的不同沸点而被除去。

如本文所用，术语“低卡路里啤酒”或“具有低碳水化合物含量(low-carb)的啤酒”被定义为碳水化合物含量为0.75g/100g或更低且发酵度为约90％-92％的啤酒。

如本文所用，术语“巴氏灭菌”意指通过加热来杀灭水溶液中的微生物。在酿造工艺中实施巴氏灭菌通常是通过使用闪蒸巴氏灭菌器或隧道式巴氏灭菌器。如本文所用，术语“巴氏灭菌单位或PU”是指对巴氏灭菌的定量度量。对于啤酒而言一个巴氏灭菌单位(1PU)被定义为在60摄氏度下保热一分钟。可计算如下：

PU＝t×1.393^(T-60)，其中：

t＝在巴氏灭菌器中在巴氏灭菌温度下的时间(分钟)，

T＝巴氏灭菌器中的温度(摄氏度)，

[^(T-60)表示指数(T-60)]

取决于啤酒类型、原材料和微生物污染、酿造者和对啤酒风味的感知效果，可使用不同的最小PU。通常，对于啤酒巴氏灭菌，需要14-15PU。取决于巴氏灭菌的设备，巴氏灭菌温度通常在64-72摄氏度的范围内，相应地计算巴氏灭菌时间。其他信息可在如下文献中找到：“Technology Brewing and Malting”by Wolfgang Kunze of the Research andTeaching Institute of Brewing，Berlin(VLB)，3rd completely updated edition，2004，ISBN 3-921690-49-8(柏林酿造研究学院的Wolfgang Kunze所著的《酿造和制麦技术》，第三完全更新版，2004年，ISBN 3-921690-49-8)。

在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定范围中的任何规定值或中间值与该规定范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围被涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中界限中任一者、界限均不或界限二者被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开文本中，但依据该规定范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开文本中。

在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然是可变的。尽管与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料可用于本公开的实施或测试，但现在将描述示例性的方法和材料。

如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物，除非文中另外明确指出。因此，例如，提到“基因”则包括多个这种候选物质，而提到“细胞”则包括提到“一个或多个细胞”以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。

本文述及的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文中没有任何部分应被理解为承认本公开因为在先发明而无权先于此类出版物。

2.缩写

3.葡糖淀粉酶多肽

亲本葡糖淀粉酶

在一些实施例中，本公开提供了葡糖淀粉酶变体。所述葡糖淀粉酶变体是亲本葡糖淀粉酶的变体，其可包含催化结构域和淀粉结合结构域二者。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶包含催化结构域，其具有如SEQ IDNO：1、2、3、5、6、7、8、9或13中示出的氨基酸序列或具有显示出与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8、9或13中示出的一个或多个氨基酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或约99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在另外的其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶包含如下DNA序列编码的催化结构域，所述DNA序列在中、高或严格条件下与编码葡糖淀粉酶的催化结构域的DNA杂交，所述葡萄糖淀粉酶具有SEQID NO：1、2或3的氨基酸序列之一。

在一个方面，如本文所述的变体具有至多480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、495、500、505、507、515、525、535、545、555、565或573个氨基酸残基。

在一个方面，如本文所述的变体具有至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基置换。

在一个方面，如本文所述的变体具有至多长度为20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的缺失。

在一个方面，如本文所述的变体具有至多长度为20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的插入。

在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶包含的淀粉结合结构域具有如SEQID NO：1、2、11、24、25、26、27、28或29中所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：1、2、11、24、25、26、27、28或29中所示的氨基酸序列的一者或多者显示出至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％或约99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在另外的其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶包含由如下DNA序列编码的淀粉结合结构域，所述DNA序列在中、高或严格条件下与编码葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域的DNA杂交，所述葡萄糖淀粉酶具有SEQ ID NO：1、2或11的氨基酸序列之一。

葡糖淀粉酶的预测结构和已知序列在真菌物种中是保守的(Coutinhoet al.，1994，Protein Eng.，7：393-400(Coutinho等人，1994年，《蛋白质工程》，第7卷，第393-400页)和Coutinho et al.，1994，Protein Eng.，7：749-760(Coutinho等人，1994年，《蛋白质工程》，第7卷，第749-760页))。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶为丝状真菌葡糖淀粉酶。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶从下述物种获得：木霉属菌株(如里氏木酶、长梗木霉(T.longibrachiatum)、严紧木霉(T.strictipilis)、棘孢木霉(T.asperellum)、康长木霉(T.konilangbra)和哈茨木霉(T.hazianum))，曲霉属菌株(如黑曲霉、构巢曲霉、白曲霉(A.kawachi)、泡盛曲霉和米曲霉)，篮状菌属菌株(如埃默森篮状菌、嗜热篮状菌(T.thermophilus)和杜邦篮状菌(T.duponti))，肉座菌属(Hypocrea)菌株(如胶质肉座菌(H.gelatinosa)、东方肉座菌(H.orientalis)、酒色肉座菌和柠檬肉座菌(H.citrina))，镰刀菌属(Fusarium)菌株(如尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、粉红镰刀菌(F.roseum)和产毒镰刀菌(F.venenatum))，脉孢菌属(Neurospora)菌株(如粗糙脉孢菌(N.crassa))和腐质霉属菌株(如灰腐质霉(H.grisea)、特异腐质霉(H.insolens)和柔毛腐质霉(H.lanuginose))，青霉属菌株(如特异青霉菌(P.notatum)或产黄青霉菌(P.chrysogenum))，或复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)菌株(如扣囊复膜孢酵母(S.fibuligera))。

在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶可以是细菌葡糖淀粉酶。例如，多肽可从革兰氏阳性细菌菌株中获得，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)(如嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis))或链霉菌属(Streptomyces)菌株(如变铅青链霉菌(S.lividans))。

在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：3的TrGA氨基酸序列的催化结构域具有至少约80％、约85％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的催化结构域。

在其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6的曲霉属亲本葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的催化结构域。

在另外的其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：8的灰腐质霉(HgGA)亲本葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％的序列同一性的催化结构域。

在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：1、2或11的TrGA氨基酸序列的淀粉结合结构域具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约98％的序列同一性的淀粉结合结构域。

在其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：24的灰腐质霉(HgGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％的序列同一性的淀粉结合结构域。

在其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：29的太瑞斯梭孢壳霉(TtGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％的序列同一性的淀粉结合结构域。还可参见图10D和图10E中的比对。

在其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：25的疏棉状嗜热丝孢菌(ThGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％的序列同一性的淀粉结合结构域(图10D和图10E)。

在其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：26的埃默森篮状菌(TeGA)葡糖淀粉酶的催化结构域具有至少约90％、约95％、约97％或约99％的序列同一性的淀粉结合结构域。

在另外的其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶将包含与SEQ ID NO：27或28的曲霉属亲本葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域具有至少约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的淀粉结合结构域。

在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：1或2的TrGA氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。

在其他实施例中，将从木霉属或肉座菌属菌株获得木霉属葡糖淀粉酶同源物。一些典型的木霉属葡糖淀粉酶同源物在美国专利No.7,413,887中描述，特别参考所述参考文献中SEQ ID NO：17-22和43-47中所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的TrGA，或与TrGA序列(SEQ ID NO：2)具有至少约80％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的木霉属葡糖淀粉酶同源物。

可使用标准重组DNA技术分离和/或鉴别亲本葡糖淀粉酶。可使用本领域技术人员已知的任何标准技术。例如，可使用葡糖淀粉酶的保守区域特异性的探针和/或引物来鉴别细菌或真菌细胞中的同源物(催化结构域、活性位点等)。作为另外一种选择，可使用简并PCR来鉴别细菌或真菌细胞中的同源物。在一些情形中，可分析已知序列(例如数据库中的序列)对已知葡糖淀粉酶(包括SEQ ID NO：2)或已知淀粉结合结构域(包括SEQ ID NO：11)中之一的序列和/或结构同一性。也可使用功能性测定法来鉴别细菌或真菌细胞中的葡糖淀粉酶活性。可分离具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质并逆向测序以分离相应的DNA序列。此类方法是本领域技术人员已知的。

葡糖淀粉酶结构同源性

分子生物学的中心法则是编码特定酶的基因的DNA序列决定该蛋白质的氨基酸序列，此序列继而决定酶的三维折叠。这种折叠使不同的残基聚到一起而产生催化中心和底物结合表面，并且这产生了所考虑的酶的高特异性和活性。

葡糖淀粉酶由多至三个不同结构域组成，即大约450个残基的催化结构域(其在所有的葡糖淀粉酶中在结构上是保守的)，其后一般接有由30至80个残基组成的连接区，其与大约100个残基的淀粉结合结构域相连。本文中以1.8埃的分辨率确定了所有三个区域均完整的里氏木霉葡糖淀粉酶的结构(参见WO2009/067218(美国丹尼斯科有限公司杰能科分公司(Danisco US Inc.，Genencor Division))中第94-216页的表20，在此以引用的方式并入本文；以及WO2009/067218(美国丹尼斯科有限公司杰能科分公司(Danisco US Inc.，Genencor Division))中第89-93页的实例11，在此以引用的方式并入本文)。使用坐标(参见WO2009/067218(美国丹尼斯科有限公司杰能科分公司(Danisco US Inc.，Genencor Division))中第94-216页的表20，在此以引用的方式并入本文)，将此结构与之前测定的来自泡盛曲霉菌株X100的葡糖淀粉酶的催化结构域的坐标进行比对(Aleshin，A.E.，Hoffman，C.，Firsov，L.M.，and Honzatko，R.B.Refined crystal structures ofglucoamylase from Aspergillus awamori var.X100.J.Mol.Biol.238：575-591(1994)(Aleshin，A.E.、Hoffman，C.、Firsov，L.M.和Honzatko，R.B.，“来自泡盛曲霉变种X100的葡糖淀粉酶的精修晶体结构”，《分子生物学杂志》，第238卷，第575-591页，1994年))。泡盛曲霉晶体结构仅包括催化结构域。如在图6A和7中所见的，催化结构域的结构非常紧密地重合，并且有可能基于此结构叠合而鉴别出等价的残基。据信所有的葡糖淀粉酶均具有图6A和图7中所描绘的基本结构。

TrGA的催化结构域因此具有大约450个残基(诸如TrGA SEQ ID NO：2的残基1-453)并且是12个螺旋的双桶型结构域。可依据具有SEQ IDNO：2的TrGA的形成螺旋和环的残基来定义催化结构域的所述螺旋和环：

连接结构域具有30至80个残基(诸如具有SEQ ID NO：2的TrGA的残基454-490)。

TrGA的淀粉结合结构域具有大约100个残基(诸如具有SEQ ID NO：2的TrGA的残基496-596)，其由β夹心(由两个扭转的三链片层构成)组成。可依据具有SEQ ID NO：2的TrGA的形成片层、螺旋和环的残基来定义淀粉结合结构域的所述片层、螺旋和环：

TrGA中的催化结构域相对于淀粉结合结构域表面的定位在所述两个结构域之间留出了界面区域。该连接表面区域对应于TrGA(SEQ ID NO：2)中的以下位置：24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118、119、500、502、504、534、536、537、539、541、542、543、544、546、547、548、580、583、585、587、588、589、590、591、592、594和596。这些残基在TrGA的三维结构中的位置在图6B中示出。

有可能基于结构叠合而鉴别出其他葡糖淀粉酶中的等价残基，如下文中所进一步详细描述的。

图6A是从侧面观察的SEQ ID NO：2的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)的三维结构比较。在此视图中，可看到催化结构域和连接区以及淀粉结合结构域之间的关系。

图6B描绘了从侧面观察的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO：2)的三维结构，其中形成催化结构域和淀粉结合结构域之间的界面区域的残基被突出显示(来自催化结构域的残基为深灰色，来自淀粉结合结构域的残基为浅灰色)。

图7是从顶部观察的SEQ ID NO：2的里氏木霉葡糖淀粉酶(黑色)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)的三维结构比较。本文所示的葡糖淀粉酶以及实际上迄今所有已知的葡糖淀粉酶具有这种结构同源性。对于所有的葡糖淀粉酶而言，结构的保守性与活性的保守性以及保守的作用机制相关。鉴于此高同源性，由木霉属葡糖淀粉酶的位点特异性变体(其引起改变的功能)产生的改变在其他葡糖淀粉酶中也将具有相似的结构性、因而功能性的影响。因此，关于什么变体产生所需的益处的教导可被应用于其他葡糖淀粉酶。

对于淀粉结合结构域(SBD)，使用WO2009/067218(美国丹尼斯科有限公司杰能科分公司(Danisco US Inc.，Genencor Division))中第94-216页的表20(在此以引用的方式并入本文)的坐标来产生进一步的晶体结构。将TrGA的SBD与黑曲霉的SBD进行比对。如图8中所示的，黑曲霉和TrGA的SBD的结构非常紧密地重合。据信虽然所有的淀粉结合结构域至少具有图8中所示的某些基本结构，但一些SBD在结构上比其他的更相似。例如，TrGA SBD可被归类为在CAZY数据库(cazy.org)内的碳水化合物结合模块20家族中。CAZY数据库描述了酶降解、修饰或产生糖苷键的结构上相关的催化模块和碳水化合物结合模块(或功能性结构域)的家族。鉴于高的结构同源性，引起功能改变的TrGA SBD的位点特异性变体对于具有与所述TrGA SBD的结构有相似结构的SBD的其他葡糖淀粉酶(特别是被归类在碳水化合物结合模块20家族中的那些)也将有相似的结构以及功能性影响。因此，关于什么变体产生所需的益处的教导可被应用于具有结构相似性的其他SBD。

因此，本文中所讨论的氨基酸位置编号是指分配给具有SEQ ID NO：2的成熟里氏木霉葡糖淀粉酶序列的那些。然而，本公开不限于木霉属葡糖淀粉酶的变体，而是延伸至在“等价”于里氏木霉葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：2)中具体确定的残基的位置处含有氨基酸残基的葡糖淀粉酶。在本公开的一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶是篮状菌属GA并且在篮状菌属葡糖淀粉酶(参见例如SEQ ID NO：23)中等价的氨基酸残基位置处进行置换，如本文中所描述的那些。在其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶包括SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21和22。

“结构同一性”决定氨基酸残基是否是等价的。结构同一性是当将两个结构(三维和氨基酸结构)进行比对时一对一的拓扑等价。如果葡糖淀粉酶的残基(氨基酸)位置与里氏木霉葡糖淀粉酶中的特定残基或该残基的部分同源(即，在一级或三级结构中在位置上相对应)或类似(具有相同或相似的功能能力以结合、反应或在化学上相互作用)，则其“等价”于里氏木霉葡糖淀粉酶的残基。

为了确立与一级结构的同一性，可将葡糖淀粉酶的氨基酸序列与里氏木霉葡糖淀粉酶的一级序列直接进行比较，特别是与在序列已知的葡糖淀粉酶中已知不变的残基组进行比较。例如，本文中的图10A和图10B示出了葡糖淀粉酶之间的保守残基。图10D和图10E示出了来自各种葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域的比对。在将保守残基进行比对、允许必要的插入和缺失以维持比对(即避免通过随意的缺失和插入而消除保守残基)后，可确定与里氏木霉葡糖淀粉酶一级序列中的特定氨基酸等价的残基。保守残基的比对通常应当是此类残基100％保守。然而，超过约75％或少至约50％的保守残基的比对也足以确定等价的残基。此外，可将结构同一性与序列同一性相结合而用于鉴别出等价的残基。

例如，在图10A和图10B中，将来自六种生物体的葡糖淀粉酶的催化结构域进行比对以提供氨基酸序列间最大量的同源性。这些序列的比较显示，每个序列中都含有许多保守残基，如用星号所指示的。因此，这些保守残基可用于在其他葡糖淀粉酶(诸如来自黑曲霉的葡糖淀粉酶)中确定里氏木霉葡糖淀粉酶的相应等价氨基酸残基。类似地，图10D和图10E示出了来自七种生物体的葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域，将其进行比对以鉴别出等价的残基。

结构同一性涉及鉴别两个结构之间的等价残基。对于已通过X射线晶体学确定了其三级结构的酶，可通过确定三级结构水平上的同源性(结构同一性)来定义“等价残基”。等价残基被定义为这样的残基：比对后，对其而言，里氏木霉葡糖淀粉酶的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子(N对N、CA对CA、C对C以及O对O)的原子坐标在0.13nm以及任选在0.1nm之内。在一个方面中，比对之后，四个可能的主链原子中的至少2个或3个在0.1nm之内。比对是在已将最佳模型进行取向和定位以使所考虑的葡糖淀粉酶的非氢蛋白质原子与里氏木霉葡糖淀粉酶的原子坐标达到最大重叠后实现的。最佳模型是对于可用的最高分辨率下的实验衍射数据给出最低R因子的晶体模型。

功能上类似于里氏木霉葡糖淀粉酶特定残基的等价残基被定义为该酶的这样的氨基酸：其可采取某种构象，使得它们以确定的且归因于里氏木霉葡糖淀粉酶特定残基的方式改变、修饰或促成蛋白质结构、底物结合或催化作用。此外，它们是酶(已通过X射线晶体学获得了其三级结构)的这样的残基：其以如下程度占据类似的位置，即尽管给定残基的主链原子可能不满足基于占据同源位置的等价标准，但该残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于里氏木霉葡糖淀粉酶相应侧链原子的0.13nm内。里氏木霉葡糖淀粉酶三维结构的坐标如WO2009/067218(美国丹尼斯科有限公司杰能科分公司(Danisco US Inc.，Genencor Division))中第94-216页的表20所示(在此以引用的方式并入本文)，并可如上文所述用于在三级结构水平上确定等价残基。

被鉴别用于置换的残基中的一些是保守残基，而其他则不是。在残基不保守的情形中，一个或多个氨基酸的置换局限于产生如下变体的置换：所述变体具有的氨基酸序列不对应于自然中存在的氨基酸序列。在保守残基的情形中，此类置换不应产生天然存在的序列。

葡糖淀粉酶变体

根据本公开的变体在亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列中包括至少一个置换、缺失或插入而使得所述变体在序列上不同于所述亲本葡糖淀粉酶。在一些实施例中，本公开的变体将具有至少约20％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约100％的如TrGA(SEQ ID NO：2)、与TrGA(SEQ ID NO：2)具有至少80％序列同一性的亲本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性。在一些实施例中，根据本公开的变体将在亲本TrGA(SEQ ID NO：2)的至少一个氨基酸位置，或与TrGA序列(SEQ ID NO：2)具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％序列同一性的另一个亲本葡糖淀粉酶的序列中的等价位置包含置换、缺失或插入。

在其他实施例中，根据本公开的变体将在亲本TrGA的片段(其中所述片段包括TrGA序列的催化结构域(SEQ ID NO：3))的至少一个氨基酸位置，或包含与SEQ ID NO：3、5、6、7、8或9的含催化结构域的片段具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％序列同一性的亲本葡糖淀粉酶催化结构域的片段中的等价位置包含置换、缺失或插入。在一些实施例中，所述片段将包含TrGA催化结构域(SEQ ID NO：3)的至少约400、约425、约450或约500个氨基酸残基。

在其他实施例中，根据本公开的变体将在亲本TrGA的片段(其中所述片段包括TrGA序列的淀粉结合结构域(SEQ ID NO：11))的至少一个氨基酸位置，或包括与SEQ ID NO：11、24、25、26、27、28和/或29的含淀粉结合结构域的片段具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％序列同一性的亲本葡糖淀粉酶淀粉结合结构域的片段中的等价位置包含置换、缺失或插入。在一些实施例中，所述片段将包含TrGA淀粉结合结构域(SEQ ID NO：11)的至少约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100或约109个氨基酸残基。

在一些实施例中，当亲本葡糖淀粉酶包括催化结构域、连接区和淀粉结合结构域时，变体将在包含部分连接区的片段的至少一个氨基酸位置包含置换、缺失或插入。在一些实施例中，变体将在TrGA序列(SEQ ID NO：2)的片段的氨基酸序列中包含置换、缺失或插入。

关于氨基酸置换的结构同一性意指置换发生在同源葡糖淀粉酶或亲本葡糖淀粉酶的等价氨基酸位置。术语等价位置意指基于所考虑的亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列及所考虑的亲本葡糖淀粉酶的三维结构与TrGA参考葡糖淀粉酶氨基酸序列及三维序列的比对而为两个亲本序列所共有的位置。例如，参考图10A，TrGA(SEQ ID NO：2或3)中的位置24是D24，黑曲霉(SEQ ID NO：6)的等价位置是位置D25，且米曲霉(SEQ ID NO：7)的等价位置是位置D26。对于三维序列的示例性比对，参见图6A和图7。

因此，在一个方面，本文描述了葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体在处于其晶体形式时，具有的晶体结构的主链原子的原子坐标与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218中的表20中所定义的)在等价主链原子比对后具有小于0.13nm的均方根偏差，并且所述葡糖淀粉酶变体具有连接区、淀粉结合结构域和催化结构域，相对于亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列所述变体在淀粉结合结构域的互联环2′中，和/或在催化结构域的环1中和/或螺旋2中和/或环11中和/或螺旋12中包含两个或更多个氨基酸置换。在另一个方面中，与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218的表20中所定义的)的均方根偏差小于0.12nm，诸如小于0.11或如小于0.10。

在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、11、13、24、25、26、27、28或29的淀粉结合结构域具有至少96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的淀粉结合结构域。在另一个方面中，葡糖淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7、8、9或13的催化结构域具有至少80％、85％、90％、95％或99.5％序列同一性的催化结构域。

在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶为真菌葡糖淀粉酶。

在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶选自从下述物种获得的葡糖淀粉酶：木霉属物种、曲霉属物种、腐质霉属物种、青霉属物种、篮状菌属物种或裂殖酵母属物种。

在另一个方面中，亲本葡糖淀粉酶是从木霉属物种或曲霉属物种获得的。

在另一个方面中，已对葡糖淀粉酶进行纯化。可通过本领域中已知的多种程序(包括离心、过滤、提取、沉淀等)从培养基回收或纯化本公开的葡糖淀粉酶。

在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体将在亲本的氨基酸序列中包括至少两个置换。在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体将在亲本诸如SEQ ID NO：2或13的氨基酸序列中包括至少两个、三个或四个置换。在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体将在亲本诸如SEQ ID NO：2或13的氨基酸序列中包括至多两个、三个或四个置换。在其他实施例中，所述变体可具有多于两个置换。例如，与相应的亲本葡糖淀粉酶相比，变体可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个氨基酸置换、缺失或插入。

在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体在对应于图10A、图10B、图10D和图10E中所示的非保守氨基酸区域的位置(例如，对应于图10A、图10B、图10D和图10E中未标记为“*”的那些位置的氨基酸位置)的至少一个氨基酸位置包含置换、缺失或插入(通常为置换)。

在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。在其他实施例中，亲本葡糖淀粉酶将是木霉属葡糖淀粉酶同源物。在一些实施例中，变体将具有改变的特性。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：13的葡糖淀粉酶具有结构同一性。

在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体可仅在特定的位置有别于亲本葡糖淀粉酶。

亲本葡糖淀粉酶可包含与SEQ ID NO：1、2、11、13、24、25、26、27、28或29具有至少95％序列同一性的淀粉结合结构域。亲本葡糖淀粉酶可与SEQ ID NO：1或2具有至少80％的序列同一性；例如，其可能包括SEQ ID NO：1或2。任选地，亲本葡糖淀粉酶可由SEQ ID NO：1、2或13组成。

本公开的葡糖淀粉酶变体还可以包括嵌合或杂合的葡糖淀粉酶，其具有例如来自一种葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域(SBD)和来自另一种葡糖淀粉酶的催化结构域和连接区。例如，杂合的葡糖淀粉酶可通过将来自AnGA(SEQ ID NO：6)的SBD交换为来自TrGA(SEQ ID NO：2)的SBD，使得AnGA SBD与TrGA催化结构域以及连接区杂合而制备。作为另外一种选择，可将来自AnGA的SBD和连接区交换为来自TrGA的SBD和连接区。

在某些方面，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体葡糖淀粉酶显示出改变的热稳定性。在一些方面，所述改变的热稳定性可以是与亲本葡糖淀粉酶相比下降的热稳定性。在一些实施例中，所述改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比改变的比活性。在一些实施例中，与亲本葡糖淀粉酶相比，所述比活性可能类似或增加。在一些实施例中，所述改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比，在更低的温度下下降的热稳定性。在一些实施例中，所述改变的特性是与亲本葡糖淀粉酶相比类似或增加的比活性和下降的热稳定性。

已将多种亲本葡糖淀粉酶与TrGA的氨基酸序列进行了比对。图10A和图10B包括下列亲本葡糖淀粉酶的催化结构域：泡盛曲霉(AaGA)(SEQID NO：5)；黑曲霉(AnGA)(SEQ ID NO：6)；米曲霉(AOGA)(SEQ ID NO：7)；灰腐质霉(HgGA)(SEQ ID NO：8)；和酒色肉座菌(HvGA)(SEQ ID NO：9)。下面的表A中给出了催化结构域的同一性百分比。

表A：各种真菌葡糖淀粉酶之间的序列同源性

	AaGA	AnGA	AoGA	HgGA	HvGA	TrGA
							AaGA	100	95	58	53	57	56
AnGA		100	59	53	57	56
							AoGA			100	55	56	56
HgGA				100	61	63
							HvGA					100	91
TrGA						100

在一些实施例中，例如，变体葡糖淀粉酶将源自为曲霉属葡糖淀粉酶、腐质霉属葡糖淀粉酶或肉座菌属葡糖淀粉酶的亲本葡糖淀粉酶。

在一个方面，如本文所设想的变体通过宿主细胞中的重组表达而获得。

在一个方面，本文所述的变体的葡糖淀粉酶活性(GAU)为至少0.05GAU/mg、0.1GAU/mg、0.2GAU/mg、0.3GAU/mg、0.4GAU/mg、0.5GAU/mg、0.6GAU/mg、0.7GAU/mg、0.8GAU/mg、0.9GAU/mg、1GAU/mg、2GAU/mg、3GAU/mg、5GAU/mg或10GAU/mg。

在另一个方面，本文所述的变体的葡糖淀粉酶活性(GAU)为0.05-10GAU/mg，诸如0.1-5GAU/mg，诸如0.5-4GAU/mg，诸如0.7-4GAU/mg，诸如2-4GAU/mg。

在又一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶变体包括SEQ ID NO：14、15或16的变体，或者由SEQ ID NO：14、15或16的变体组成。

对变体葡糖淀粉酶的表征

本公开还提供与亲本葡糖淀粉酶(特别是TrGA)相比具有至少一个改变的特性(例如，改善的特性)的葡糖淀粉酶变体。在一些实施例中，至少一个改变的特性(例如，改善的特性)选自：GAU活性、实际发酵程度、表达水平、热稳定性以及比活性。通常，改变的特性是下降的热稳定性、增加的实际发酵程度和/或增加的比活性。下降的热稳定性通常是在更高的温度下。

与亲本葡糖淀粉酶相比，本公开的葡糖淀粉酶变体也可提供在低底物浓度下更高的淀粉水解速率。当在相同的条件下测试时，变体可具有比亲本葡糖淀粉酶更高的V_max或更低的K_m。例如，变体葡糖淀粉酶在约25℃至约40℃(例如，约25℃至约35℃；约30℃至约35℃)的温度范围内可具有更高的V_max。使用标准的已知程序可以容易地测定米氏常数、K_m和V_max值。在另一方面，葡糖淀粉酶也可显示出降低的淀粉水解活性，其与亲本葡糖淀粉酶(诸如TrGA或TrGA CS4)相比降低不超过5％、不超过10％或不超过15％。

具有改变的热稳定性的变体葡糖淀粉酶

在某些方面，本公开涉及与亲本(野生型)相比具有改变的热稳定性的变体葡糖淀粉酶。改变的热稳定性可以是在增加的温度下或在降低的温度下。热稳定性以在NaAc缓冲液(pH 4.5)或常规比尔森啤酒中于72℃下温育最多100秒后的残余活性百分比度量，与在这些条件下进行温育之前的初始活性相比，TrGA的残余活性为24％。TrGA在这些条件下的残余活性与将酶在NaAc缓冲液(pH 4.5)中于64℃下温育1小时之后留下的残余活性(其与进行温育之前的初始活性相比为约15％)相当。因此，在一些实施例中，与温育前的初始活性相比，具有下降的热稳定性(即，更不耐热)的变体具有的残余活性相较于亲本少至少约50％到至少约100％(在常规比尔森啤酒(pH 4.5)中于72℃下温育100秒之后)，包括约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％和约100％。例如，当亲本的残余活性为24％时，热稳定性下降的变体可具有介于约2％和约3％之间的残余活性。在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体在暴露于改变的温度持续给定的时间段(例如，在72℃下持续至少约50秒、约60秒、约70秒、约100秒、或约150秒)后，将具有下降的热稳定性，诸如保留至少约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％或约20％的酶活性。在一些实施例中，在约40℃至约80℃范围中、约50℃至约75℃范围中和约60℃至约70℃范围中的选定温度下且在约4.0至约6.0的pH范围内，变体具有相较于亲本葡糖淀粉酶下降的热稳定性。在一些实施例中，如在“测定法和方法”中所描述的那样对热稳定性进行测定。可酌情调整所述方法来测量其他温度下的热稳定性。作为另外一种选择，可如所述方法中所描述的，在64℃下测定热稳定性。在一些实施例中，在约20℃至约50。C(包括约35℃至约45。C和约30℃至约40。C)的范围中的选定温度下，变体在更低的温度下具有相较于亲本葡糖淀粉酶下降的热稳定性。

在一些实施例中，热稳定性下降的变体包括一个或多个缺失、置换或插入，特别是SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列中的以下位置中的置换：由SEQ ID NO：2的残基29、43、48、116和502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。在一些实施例中，热稳定性下降的变体包括一个或多个缺失、置换或插入，特别是SEQ ID NO：2或13示出的氨基酸序列中的以下位置中的置换：由SEQ IDNO：2或13的残基29、43、48、116和502组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2或13的残基97、98、147、175、483和484组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将是木霉属葡糖淀粉酶同源物，而在另外的实施例中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：2或13具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％的序列同一性。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶还将与SEQ ID NO：2具有结构同一性。在一些实施例中，热稳定性下降的变体具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个或两个：F29V、F29Q、I43Q、Y48V、F116M、H502S、H502E或H502W，并具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个、两个或三个：S97M、L98E、Y147R、F175V、F175L、F175I、G483S或T484W。在一些实施例中，热稳定性下降的变体具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个或两个：F29V、I43Q、Y48V、F116M、H502S或H502E，并具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个、两个或三个：S97M、L98E、Y147R、F175V、F175L、F175I、G483S或T484W。

具有改变的比活性的变体葡糖淀粉酶

如本文所用，比活性是每毫克蛋白质的葡糖淀粉酶活性。活性采用葡糖淀粉酶测定法使用显色pNP-β-麦芽糖苷底物进行测定。筛选鉴别出与亲本TrGA的性能指数(PI)相比具有＞1.0或＝1.0的PI的变体。PI是由野生型(WT)和变体酶的比活性(活性/mg酶)计算的。其为“变体-比活性/WT-比活性”之商且可以是变体比活性增加的量度。为约2的PI应当优于WT，为WT的约2倍。在一些方面，本公开涉及与亲本或野生型葡糖淀粉酶相比具有改变的比活性的变体葡糖淀粉酶。在一些实施例中，所述改变的比活性为增加的比活性。增加的比活性可定义为大于1的增加的性能指数，包括大于或等于约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9和约2。在一些实施例中，增加的比活性为约1.0至约5.0，包括约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2.、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8和约4.9。在一些实施例中，变体具有高于亲本葡糖淀粉酶至少约1.0倍的比活性，包括至少约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2.0倍、约2.2倍、约2.5倍、约2.7倍、约2.9倍、约3.0倍、约4.0倍和约5.0倍。在一些实施例中，所述比活性与亲本类似或相等。因此，类似的比活性可定义这样的性能指数，其与亲本的1.0相比大0.1、相等或小0.1，包括比1.0大或小约0.02，包括比1.0大或小约0.04，包括比1.0大或小约0.06，包括比1.0大或小约0.08，且包括比1.0大或小约0.1。

在一些实施例中，具有比活性的改善的变体包括一个或多个缺失、置换或插入，特别是SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列中的以下位置中的置换：由SEQ ID NO：2的残基29、43、48、116和502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQID NO：2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。在一些实施例中，具有比活性的改善的变体包括一个或多个缺失、置换或插入，特别是SEQ ID NO：2或13示出的氨基酸序列中的以下位置中的置换：由SEQ ID NO：2或13的残基29、43、48、116和502组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2或13的残基97、98、147、175、483和484组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将是木霉属葡糖淀粉酶同源物，而在另外的实施例中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：2或13具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％的序列同一性。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶还将与SEQ ID NO：2具有结构同一性。在一些实施例中，具有比活性的改善的变体具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个或两个：F29V、F29Q、I43Q、Y48V、F116M、H502S、H502E或H502W，并具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个、两个或三个：S97M、L98E、Y147R、F175V、F175L、F175I、G483S或T484W。

在一些实施例中，如在“测定法和方法”中所描述的那样对与变体相比的亲本的比活性进行测定。

具有改变的糖化性能的变体葡糖淀粉酶

如本文所用，葡糖淀粉酶在发酵容器(FV)中促进淀粉糖化的性能通过实际发酵程度间接测定。实际发酵程度在采用葡糖淀粉酶变体的麦芽-辅料酿造实验中测定，其中葡糖淀粉酶变体在定义的一组条件下要么基于GAU活性要么基于蛋白质进行剂量施用。计算最终发酵麦芽汁(啤酒)的实际发酵程度(RDF，其为以百分比形式表示的实际发酵度)，并且使用液体比重计或安东帕(Anton-Paar)密度计(例如DMA 4100M)来测量发酵之前、期间和之后的麦芽汁比重。根据Ensminger列出的公式(参见http：//hbd.org/ensmingr/“Beer data：Alcohol，Calorie，and Attenuation Levels ofBeer”(“啤酒数据：啤酒的醇、卡路里和发酵水平”))来计算实际发酵度，并且以百分比的形式表示为RDF。

在一些方面，本公开涉及与亲本或野生型葡糖淀粉酶相比具有改变的RDF性能的变体葡糖淀粉酶。在一些实施例中，所述改变的RDF性能与亲本类似或相等。当以0.058mg GA/ml麦芽汁的剂量施用时，TrGA具有为75.04％的RDF性能。因此，类似的RDF性能可定义为在所述的一组条件下且以0.058mg GA/ml麦芽汁剂量施用时获得的RDF值，其与75.04％相比大0.5％、相等或小0.5％，包括比75.04％大或小约0.1％，比75.04％大或小约0.2％，比75.04％大或小约0.3％，比75.04％大或小约0.4％、或比75.04％大或小约0.5％。

在一些实施例中，与亲本葡糖淀粉酶(诸如TrGA)相比具有类似的实际发酵程度的变体包括一个或多个缺失、置换或插入，特别是SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列中的以下位置中的置换：由SEQ ID NO：2的残基29、43、48、116和502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。在一些实施例中，具有改善的RDF性能的本公开变体包括一个或多个缺失、置换或插入，特别是SEQ IDNO：2或13示出的氨基酸序列中的以下位置中的置换：由SEQ ID NO：2或13的残基29、43、48、116和502组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2或13的残基97、98、147、175、483和484组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将是木霉属葡糖淀粉酶同源物，而在另外的实施例中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：2或13具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％的序列同一性。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶还将与SEQ ID NO：2具有结构同一性。在一些实施例中，具有改善的RDF性能的本公开变体具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个或两个：F29V、F29Q、I43Q、Y48V、F116M、H502S、H502E或H502W，并具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个、两个或三个：S97M、L98E、Y147R、F175V、F175L、F175I、G483S或T484W。

在一些实施例中，如在“测定法和方法”中所描述的那样对与变体相比的亲本的RDF性能进行测定。

与亲本葡糖淀粉酶相比具有下降的热稳定性和类似的糖化性能的变体葡糖淀粉酶

在一些方面，本公开涉及与亲本(例如野生型)相比具有改变的热稳定性和类似的糖化(RDF)性能的变体葡糖淀粉酶。在一些实施例中，所述改变的热稳定性是下降的热稳定性，例如，更不耐热的变体。在一些实施例中，所述RDF性能是与亲本葡糖淀粉酶相比类似的RDF性能。

在一些实施例中，具有下降的热稳定性和类似的RDF性能的变体包括一个或多个缺失、置换或插入，特别是SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列中的以下位置中的置换：由SEQ ID NO：2的残基29、43、48、116和502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。在一些实施例中，具有下降的热稳定性和类似的RDF性能的变体包括一个或多个缺失、置换或插入，特别是SEQ ID NO：2或13示出的氨基酸序列中的以下位置中的置换：由SEQ ID NO：2或13的残基29、43、48、116和502组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2或13的残基97、98、147、175、483和484组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶将是木霉属葡糖淀粉酶同源物，而在另外的实施例中，亲本葡糖淀粉酶将与SEQ ID NO：2或13具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％的序列同一性。在一些实施例中，亲本葡糖淀粉酶还将与SEQ ID NO：2具有结构同一性。在一些实施例中，具有下降的热稳定性和类似的RDF性能的变体具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个或两个：F29V、F29Q、I43Q、Y48V、F116M、H502S、H502E或H502W，并具有SEQ ID NO：2或13的以下置换中的一个、两个或三个：S97M、L98E、Y147R、F175V、F175L、F175I、G483S或T484W。

产生可发酵糖的变体葡糖淀粉酶

在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(诸如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出可发酵糖生成提高。在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(诸如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出在酿造工艺的淀粉糖化步骤中可发酵糖生成提高。在另一个方面中，与亲本葡糖淀粉酶(诸如TrGA)相比，葡糖淀粉酶显示出在酿造工艺的发酵步骤中可发酵糖生成提高。在另一个方面中，所述可发酵糖为葡萄糖。本领域技术人员可通过例如HPLC技术来测定可发酵糖的生成。

4.编码葡糖淀粉酶的多核苷酸

本公开还涉及编码变体葡糖淀粉酶的分离的多核苷酸。所述多核苷酸可通过本领域中已知的确立的技术制备。可以合成方式制备所述多核苷酸，例如通过自动化DNA合成仪。DNA序列可以是通过将片段连接在一起而制备的混合的基因组(或cDNA)和合成来源的。还可利用特异性引物，通过聚合酶链反应(PCR)来制备多核苷酸。一般而言，可参考MinshullJ.et al.，Methods 32(4)：416-427(2004)(Minshull J.等人，《方法》，第32卷，第4期，第416-427页，2004年)。还可由许多商业公司(诸如德国雷根斯堡的Geneart AG公司(Geneart AG，Regensburg，Germany))来合成DNA。

本公开还提供分离的多核苷酸，其包括这样的核苷酸序列：(i)与SEQID NO：4具有至少约50％的同一性，包括至少约60％、约70％、约80％、约90％、约95％和约99％的同一性，或(ii)能够在中度至高严格性条件下与源自SEQ ID NO：4中所示的核苷酸序列的探针杂交，或者(iii)同与SEQ IDNO：4中所示的序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列互补。根据本公开可使用的探针可包括SEQ ID NO：4的至少约50、约100、约150、约200、约250、约300或更多个连续的核苷酸。在一些实施例中，所编码的变体还与SEQ ID NO：2具有结构同一性。

本公开还提供了编码变体葡糖淀粉酶的分离的多核苷酸，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：13具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。此外，本公开提供了包含任何上文所提供的多核苷酸的表达载体。本公开还提供了编码本文所提供的变体葡糖淀粉酶的DNA的片段(即，部分)。这些片段可用于获得部分长度的DNA片段，其能够被用于从丝状真菌细胞(例如，木霉属、曲霉属、镰刀菌属、青霉属和腐质霉属)中分离或鉴别编码本文所述的成熟葡糖淀粉酶的多核苷酸，或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。在一些实施例中，DNA片段可包含至少约50、约100、约150、约200、约250、约300或更多个连续的核苷酸。在一些实施例中，SEQ ID NO：4中所提供的DNA的部分可用于从其他物种(诸如编码葡糖淀粉酶的丝状真菌)中获得亲本葡糖淀粉酶，特别是木霉属葡糖淀粉酶同源物。

5.葡糖淀粉酶的产生

DNA构建体和载体

根据本公开的一个实施例，组装包含上文所述的编码本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶且与启动子序列有效连接的多核苷酸的DNA构建体以转移到宿主细胞中。在一个方面中，提供了编码本文所公开的葡糖淀粉酶变体的多核苷酸。

可使用载体将DNA构建体引入宿主细胞中。在一个方面，提供了包含所述多核苷酸或能够表达如本文所公开的葡糖淀粉酶变体的载体。所述载体可以是在引入宿主细胞时被稳定引入的任何载体。在一些实施例中，载体整合到宿主细胞基因组中并被复制。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。在一些实施例中，载体为包含与葡糖淀粉酶编码序列有效连接的调控序列的表达载体。

合适的表达和/或整合载体的例子在下列文献中提供：Sambrook et al.(1989)supra(Sambrook等人，1989年，出处同上)，以及Ausubel(1987)supra(Ausubel，1987年，出处同上)，以及van den Hondel et al.(1991)inBennett and Lasure(Eds.)More Gene Manipulations In Fungi，Academic Presspp.396-428(van den Hondel等人，1991年，载于Bennett和Lasure(编辑)，《真菌中的更多基因操纵》，学术出版社，第396-428页)，以及美国专利No.5,874,276。还可参考美国真菌遗传资源中心菌株目录FungalGenetics Stock Center Catalogue of Strains)(FGSC，http：//www.fgsc.net)的载体列表。特别有用的载体包括从例如英杰公司(Invitrogen)和普洛麦格公司(Promega)获得的载体。

适用于细菌细胞的质粒包括允许在大肠杆菌(E.coli)中复制的pBR322和pUC19，以及例如允许在芽孢杆菌属中复制的pE194。其他适用于大肠杆菌宿主细胞的具体载体包括诸如下列载体：pFB6、pBR322、pUC18、pUC100、pDONR^TM201、10 pDONR^TM221、pENTR^TM、3Z知4Z。

适用于真菌细胞的具体载体包括pRAX(可用于曲霉属的通用表达载体)、含有glaA启动子的pRAX，以及在肉座菌属/木霉属中包括含有cbh1启动子的pTrex3g。

在一些实施例中，在细菌或真菌宿主细胞中显示出转录活性的启动子可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。启动子可以是突变启动子、截短启动子和/或杂合启动子。上文提及的启动子是本领域中已知的。可用于真菌细胞(特别是丝状真菌细胞，诸如木霉属或曲霉属细胞)中的合适启动子的例子包括诸如里氏木霉启动子cbh1、cbh2、egl1、egl2、eg5、xln1和xln2之类的示例性启动子。可用启动子的其他例子包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因(glaA)的启动子(参见Nunberg et al.，Mol.Cell Biol.4：2306-2315(1984)(Nunberg等人，《分子和细胞生物学》，第4卷，第2306-2315页，1984年)和Boel et al.，EMBOJ.3：1581-1585(1984)(Boel等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第1581-1585页，1984年))，米曲霉TAKA淀粉酶启动子，来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的TPI(磷酸丙糖异构酶)启动子，来自构巢曲霉乙酰胺酶基因和米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶基因的启动子。可用于细菌细胞的合适启动子的例子包括从下列获得的那些：大肠杆菌lac操纵子；地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因(amyS)；枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、β-内酰胺酶基因、以及tac启动子。在一些实施例中，启动子是宿主细胞的天然启动子。例如，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子。在其他实施例中，启动子是对于真菌宿主细胞为异源性的启动子。在一些实施例中，启动子将是亲本葡糖淀粉酶的启动子(例如，TrGA启动子)。

在一些实施例中，DNA构建体包括编码信号序列的核酸，即与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，其引导所编码的多肽进入细胞的分泌途径。核酸序列编码序列的5′末端可天然地包括信号肽编码区域，其天然地在翻译阅读框中与编码分泌性葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶编码序列的区段相连，或者核酸序列编码序列的5′末端可包括对该编码序列是外来的信号肽。在一些实施例中，DNA构建体包括与已从中获得了变体葡糖淀粉酶的亲本葡糖淀粉酶基因天然地相关联的信号序列。在一些实施例中，信号序列将是SEQ ID NO：1中所示的序列或者与其具有至少约90％、约94或约98％的序列同一性的序列。有效的信号序列可包括从其他丝状真菌酶获得的信号序列，诸如来自木霉属(里氏木霉葡糖淀粉酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶II，或分泌的蛋白酶，如天冬氨酸蛋白酶)、腐质霉属(特异腐质霉纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶，或灰腐质霉葡糖淀粉酶)或曲霉属(黑曲霉葡糖淀粉酶和米曲霉TAKA淀粉酶)。

在另外的实施例中，包含信号序列的DNA构建体或载体和待引入宿主细胞中的启动子序列源自相同的来源。在一些实施例中，可使用木霉属葡糖淀粉酶同源物的天然葡糖淀粉酶信号序列，诸如来自肉座菌属菌株的信号序列。

在一些实施例中，表达载体还包括终止序列。在本公开中可使用在宿主细胞中有功能的任何终止序列。在一些实施例中，终止序列和启动子序列源自相同的来源。在另一个实施例中，终止序列是与宿主细胞同源的。有用的终止序列包括从下列获得的终止序列：里氏木霉cbl1基因；黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(Nunberg et al.(1984)supra(Nunberg等人，1984年，出处同上)以及Boel et al.，(1984)supra(Boel等人，1984年，出处同上))、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、米曲霉TAKA淀粉酶、或构巢曲霉trpC(Punt et al.，Gene 56：117-124(1987)(Punt等人，《基因》，第56卷，第117-124页，1987年))。

在一些实施例中，表达载体包括可选标记。可选标记的例子包括赋予抗微生物抗性的那些(例如，潮霉素和腐草霉素)。营养性选择性标记也可用于本公开，包括本领域称为amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)和pyrG(乳清酸核苷-5′磷酸脱羧酶)的那些标记。可用于针对木霉属转化的载体系统中的标记是本领域已知的(参见例如Finkelstein，Chapter 6 in Biotechnology Of Filamentous Fungi，Finkelstein et al.(1992)Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(Finkelstein，《丝状真菌的生物技术》，第6章，Finkelstein等人1992年编辑，巴特沃斯海涅曼出版社，马萨诸塞州波士顿)；Kinghorn et al.(1992)Applied Molecular Genetics OfFilamentous Fungi，Blackie Academic and Professional，Chapman and Hall，London(Kinghorn等人，1992年，《丝状真菌的应用分子遗传学》，布莱卡学院和专业出版社，查普曼霍尔公司，伦敦)；Berges and Barreau，Curr.Genet.19：359-365(1991)(Berges和Barreau，《当代遗传学》，第19卷，第359-365页，1991年)；以及van Hartingsveldt et al.，Mol.Gen.Genet.206：71-75(1987)(van Hartingsveldt等人，《分子遗传学和基因组学》，第206卷，第71-75页，1987年))。在一些实施例中，选择性标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，从而允许转化的细胞以乙酰胺作为氮源生长。使用构巢曲霉amdS基因作为选择性标记描述于：Kelley et al.，EMBO J.4：475-479(1985)(Kelley等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第4卷，第475-479页，1985年)和Penttila et al.，Gene 61：155-164(1987)(Penttila等人，《基因》，第61卷，第155-164页，1987年)。

用于连接包含编码变体葡糖淀粉酶的核酸序列、启动子、终止序列和其他序列的DNA构建体的方法，以及将它们插入合适载体中的方法是本领域所熟知的。连接通常是通过在方便的限制性位点进行连接来实现的。如果不存在此类位点，则根据常规做法使用合成的寡核苷酸接头(参见Sambrook et al.(1989)supra(Sambrook等人，1989年，出处同上)以及Bennett and Lasure，More Gene Manipulations In Fungi，Academic Press，SanDiego(1991)pp 70-76(Bennett和Lasure，《真菌中的更多基因操纵》，学术出版社，圣地亚哥，1991年，第70-76页))。此外，可使用已知的重组技术(例如英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies)，Gateway技术)来构建载体。

宿主细胞和宿主细胞的转化

本公开还涉及包含编码本公开的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞选自细菌、真菌、植物和酵母细胞。术语宿主细胞包括用于产生根据本公开的变体葡糖淀粉酶的细胞、细胞的子代和由细胞产生的原生质体。在一个方面中，公开了包含(优选转化有)载体的宿主细胞。在另一个方面中，提供了能够表达葡糖淀粉酶变体的细胞。在另一个方面中，所述宿主细胞为蛋白酶缺陷的和/或木聚糖酶缺陷的和/或葡聚糖酶缺陷的宿主细胞。蛋白酶缺陷的和/或木聚糖酶缺陷的和/或天然葡聚糖酶缺陷的宿主细胞可通过使编码所提及的酶的基因缺失或沉默来获得。因此，含有所述GA变体的宿主细胞不表达所提及的酶。

在一些实施例中，宿主细胞是真菌细胞以及任选丝状真菌宿主细胞。术语“丝状真菌”是指真菌亚门的所有丝状形式(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York(Alexopoulos，C.J.，1962年，《菌物学概论》，威利出版社，纽约))。这些真菌的特征在于具有由几丁质、纤维素和其他复杂多糖构成的细胞壁的营养菌丝体。本公开的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上与酵母相区别。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长，且碳分解代谢是专性好氧的。在本公开中，丝状真菌亲本细胞可以是以下物种但不限于这些物种的细胞：木霉属(例如，里氏木霉、红褐肉座菌的无性形态(之前被归类为长梗木霉)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum))(Sheir-Neirs et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53(1984)(Sheir-Neirs等人，《应用微生物学和生物技术》，第20卷，第46-53页，1984年)；ATCC No.56765和ATCC No.26921)、青霉属物种、腐质霉属物种(例如特异腐质霉、柔毛腐质霉和灰腐质霉)、金孢子菌属物种(Chrysosporium sp.)(例如C.lucknowense)、粘帚霉属物种(Gliocladium sp.)、曲霉属物种(例如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)和泡盛曲霉)(Ward et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743(1993)(Ward等人，《应用微生物学和生物技术》，第39卷，第738-743页，1993年)和Goedegebuur et al.，Curr.Genet.41：89-98(2002)(Goedegebuur等人，《当代遗传学》，第41卷，第89-98页，2002年))、镰刀菌属物种(例如粉红镰刀菌、禾镰刀菌(F.graminum)、禾谷镰刀菌(F.cerealis)、尖孢镰刀菌和产毒镰刀菌)、脉孢菌属物种(粗糙脉孢菌)、肉座菌属物种、毛霉属物种(米赫毛霉(M.miehei))、根霉属物种、和裸胞壳属物种(Emericella sp.)(还可参见Innis etal.，Science 228：21-26(1985)(Innis等人，《科学》，第228卷，第21-26页，1985年))。术语“木霉属”或“木霉属的物种”或“木霉属物种”是指之前或目前被归类为木霉属的任何真菌属。

在一些实施例中，宿主细胞将是革兰氏阳性细菌细胞。非限制性例子包括链霉菌属(例如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌属的菌株。如本文所用，“芽孢杆菌属”包括“芽孢杆菌”属中的所有种，如本领域技术人员所知的，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌。已经认识到，芽孢杆菌属继续经历着分类学上的重构。因此，预期的是该属包括已被重新归类的种，包括但不限于诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(其现在被命名为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillustearothermophilus))之类的生物体。

在一些实施例中，所述宿主细胞为革兰氏阴性细菌菌株，诸如大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在其他实施例中，宿主细胞可以是酵母细胞，诸如酵母属(Saccharomyces)物种、裂殖酵母属物种、毕赤酵母属(Pichia)物种或假丝酵母属(Candida)物种。在其他实施例中，宿主细胞将是经遗传学工程改造的宿主细胞，其中已使天然基因失活(例如通过在细菌或真菌细胞中缺失来失活)。当希望获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞时，可使用已知的方法(例如，美国专利No.5,246,853、美国专利No.5,475,101和WO 92/06209中所公开的方法)。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过使基因对于其所欲的目的而言无功能(从而防止该基因表达有功能的蛋白)的任何其他方式而实现基因失活。在一些实施例中，当宿主细胞为木霉属细胞(特别是里氏木霉宿主细胞)时，将使cbh1、cbh2、egl1和egl2基因失活和/或缺失。美国专利No.5,847,276和WO 05/001036中示出和描述了具有四重缺失的蛋白质的示例性里氏木霉宿主细胞。在其他实施例中，宿主细胞为蛋白酶缺陷的或无蛋白酶的株系。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括诸如以下的技术：转化；电穿孔；细胞核显微注射；转导；转染(例如脂质转染介导或DEAE-葡聚糖介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀一起温育；用DNA包被的微粒子弹进行高速轰击；以及原生质体融合。一般的转化技术是本领域中已知的(参见例如Ausubel et al.(1987)supra，chapter 9(Ausubel等人，1987年，出处同上，第9章)；Sambrook et al.(1989)supra(Sambrook等人，1989年，出处同上)以及Campbell et al.，Curr.Genet.16：53-56(1989)(Campbell等人，《当代遗传学》，第16卷，第53-56页，1989年))。

用于芽孢杆菌的转化方法在许多参考文献中公开，包括Anagnostopoulos C.and J.Spizizen，J.Bacteriol.81：741-746(1961)(Anagnostopoulos C.和J.Spizizen，《细菌学杂志》，第81卷，第741-746页，1961年)和WO 02/14490。

用于曲霉属的转化方法在Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：1470-1474(1984)(Yelton等人，《美国国家科学院院刊》，第81卷，第1470-1474页，1984年)；Berka et al.，(1991)in Applications of EnzymeBiotechnology，Eds.Kelly and Baldwin，Plenum Press(NY)(Berka等人，1991年，载于《酶生物技术的应用》，Kelly和Baldwin编辑，普莱南出版社，纽约)；Cao et al.，Protein Sci.9：991-1001(2000)(Cao等人，《蛋白质科学》，第9卷，第991-1001页，2000年)；Campbell et al.，Curr.Genet.16：53-56(1989)(Campbell等人，《当代遗传学》，第16卷，第53-56页，1989年)和EP 238 023中有所描述。在木霉属中表达异源蛋白质描述于如下专利和文献：美国专利No.6,022,725；美国专利No.6,268,328；Harkki et al.Enzyme Microb.Technol.13：227-233(1991)(Harkki等人，《酶和微生物技术》，第13卷，第227-233页，1991年)；Harkki et al.，BioTechnol.7：596-603(1989)(Harkki等人，《生物技术》，第7卷，第596-603页，1989年)；EP 244,234；EP 215,594；以及Nevalainen et al.，“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expressionof Both Homologous and Heterologous Genes”，in Molecular IndustrialMycology，Eds.Leong and Berka，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)pp.129-148(Nevalainen等人，“木霉属的分子生物学及其表达同源和异源基因的应用”，载于《分子工业真菌学》，Leong和Berka编辑，马塞尔·德克尔公司，纽约，1992年，第129-148页)。对于镰刀菌属菌株的转化，还可参见W096/00787以及Bajar et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8202-8212(1991)(Bajar等人，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第8202-8212页，1991年)。

在一个具体的实施例中，为了转化而制备木霉属物种涉及由真菌菌丝体制备原生质体(参见Campbell et al.，Curr.Genet.16：53-56(1989)(Campbell等人，《当代遗传学》，第16卷，第53-56页，1989年)；Pentilla et al.，Gene 61：155-164(1987)(Pentilla等人，《基因》，第61卷，第155-164页，1987年))。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的对丝状真菌的转化是已知的(参见de Groot et al.，Nat.Biotechnol.16：839-842(1998)(de Groot等人，《自然生物技术》，第16卷，第839-842页，1998年))。对于以丝状真菌宿主进行的转化程序，还可参考美国专利No.6,022,725和美国专利No.6,268,328。

在一些实施例中，用载体系统构建遗传上稳定的转化体，凭借所述载体系统编码变体葡糖淀粉酶的核酸被稳定整合进宿主菌株染色体中。然后通过已知的技术纯化转化体。

在一些其他实施例中，宿主细胞为植物细胞，诸如来自单子叶植物(例如玉米(玉蜀黍)、小麦和高粱)的细胞或来自双子叶植物(例如大豆)的细胞。用于制备可用于转化植物的DNA构建体的方法以及用于植物转化的方法是已知的。这些方法中的一些包括根癌农杆菌介导的基因转移；微粒子弹轰击、PEG介导的原生质体转化、电穿孔等等。参考美国专利No.6,803,499、美国专利No.6,777,589；Fromm et al.，BioTechnol.8：833-839(1990)(Fromm等人，《生物技术》，第8卷，第833-839页，1990年)；Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)(Potrykus等人，《分子遗传学和基因组学》，第199卷，第169-177页，1985年)。

葡糖淀粉酶的产生

本公开还涉及用于产生变体葡糖淀粉酶的方法，其包括用包含编码根据本公开的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，在适于表达和产生所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养所述宿主细胞，以及任选回收所述变体葡糖淀粉酶。在一个方面中，提供了表达根据本公开的变体葡糖淀粉酶的方法，所述方法包括获得如本文所公开的宿主细胞或细胞，并从所述细胞或宿主细胞表达所述葡糖淀粉酶变体，以及任选纯化所述葡糖淀粉酶变体。在一个方面中，将所述葡糖淀粉酶变体进行纯化。

在本公开的表达和产生方法中，使用含有生理盐和营养物的合适培养基，在合适的条件下在实验室或工业发酵罐中以摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵和补料分批发酵)来培养所述宿主细胞(参见例如Pourquie，J.et al.，Biochemistry And Genetics Of CelluloseDegradation，eds.Aubert，J.P.et al.，Academic Press，pp.71-86，1988(Pourquie，J.等人，《纤维素降解的生物化学和遗传学》，Aubert，J.P.等人编辑，学术出版社，第71-86页，1988年)和Ilmen，M.et al.，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306(1997)(Ilmen，M.等人，《应用和环境微生物学》，第63卷，第1298-1306页，1997年))。普通的商业制备的培养基(例如，酵母麦芽提取物(YM)液体培养基、Luria Bertani(LB)液体培养基和沙氏右旋糖(SD)液体培养基)可用于本公开中。用于细菌和丝状真菌细胞的培养条件是本领域中已知的并且可在科学文献中找到和/或可从真菌来源(例如美国典型培养物保藏中心和美国真菌遗传资源中心)获得。在葡糖淀粉酶编码序列处于诱导型启动子的控制下的情形中，以可有效诱导葡糖淀粉酶表达的浓度将诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)加入培养基中。

在一些实施例中，本公开涉及在植物宿主中产生变体葡糖淀粉酶的方法，所述方法包括用包含编码根据本公开的葡糖淀粉酶变体的多核苷酸的载体转化植物细胞以及在适于所述变体表达和产生的条件下培养所述植物细胞。

在一些实施例中，进行测定法来评价已用编码本公开所涵盖的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸转化的细胞系对所述变体葡糖淀粉酶的表达。可在蛋白质水平、RNA水平和/或通过使用特定于葡糖淀粉酶活性和/或产生的功能性生物测定法来进行测定法。这些测定法中的一些包括RNA印迹法、斑点印迹法(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)、使用经恰当标记的探针(基于核酸编码序列)进行的原位杂交和常规的DNA印迹法以及放射自显影术。

此外，可在样品中直接测量变体葡糖淀粉酶的产生和/或表达，例如通过直接测量培养基中的还原糖(例如葡萄糖)的测定法以及通过用于测量葡糖淀粉酶活性、表达和/或产生的测定法直接测量。具体地讲，可通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法来测定葡糖淀粉酶活性(参见Goto et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.58：49-54(1994)(Goto等人，《生物科学、生物技术和生物化学》，第58卷，第49-54页，1994年))。在另外的实施例中，通过免疫学方法(诸如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或组织培养基的免疫测定法(例如通过蛋白质印迹或ELISA))来评价蛋白质表达。此类免疫测定法可用于定性和定量地评价葡糖淀粉酶的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的并且用于实施此类方法的许多试剂都是可商业获得的。

可通过本领域中已知的多种程序(包括离心、过滤、提取、沉淀等)从培养基回收或纯化本公开的葡糖淀粉酶。

在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体将具有不止一个氨基酸置换。例如，与亲本葡糖淀粉酶相比，变体可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个氨基酸置换、缺失或插入。在一些实施例中，葡糖淀粉酶变体包含在与非保守氨基酸的区域对应的位置中的至少一个氨基酸位置中的置换、缺失或插入。如本文所设想的，葡糖淀粉酶变体可具有在成熟蛋白质序列中的任何位置中的置换、缺失或插入。

如本文所设想的，可使用表达载体以酶的形式表达编码葡糖淀粉酶或葡糖淀粉酶变体的DNA序列，该表达载体通常包含编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选的阻遏基因或各种激活基因的控制序列。携带编码本文所设想的葡糖淀粉酶的DNA序列的重组表达载体可为任何可方便地进行重组DNA程序的载体。该载体可以是这样的载体，其当被引入到亲本葡糖淀粉酶中时，整合到基因组中并且与其被整合到的染色体一起被复制。例如，可用编码葡糖淀粉酶的DNA构建体转化真菌细胞，并且将该DNA构建体以一个或多个拷贝整合到宿主染色体中。这种整合一般被认为是一个优势，因为DNA序列更有可能被稳定地保持。可根据常规方法来进行DNA构建体向宿主染色体中的整合，例如通过同源或异源重组来进行。

在并入了使用载体的实施例中，DNA序列应有效连接到合适的启动子序列。启动子可以是在亲本葡糖淀粉酶中显示出转录活性并且可源自编码与亲本葡糖淀粉酶同源或异源的蛋白质的基因的任何DNA序列。指导编码葡糖淀粉酶变体的DNA序列的转录的合适启动子的例子为(仅以非限制性例子的方式)源自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、里氏木霉(T.reesei)纤维二糖水解酶I、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、或构巢曲霉(A.nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶A的基因的那些启动子。所设想的任何表达载体还可包含合适的转录终止子和多腺苷酸化序列，它们有效连接到编码葡糖淀粉酶或变体的DNA序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适当地源自与启动子相同的来源。载体还可包含任何促成或实现载体在真菌宿主中复制的DNA序列。载体还可包含另外的基因，其产物可弥补真菌宿主中的缺陷。例如，可并入选择性标记以提供药物抗性。如本文所设想的，分别用于连接编码葡糖淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件，并且将它们插入到含有复制必需的信息的合适载体中的所有程序，是本领域的技术人员可理解的。

在一个方面，本发明涉及具有本文所述的多肽的异源表达的宿主细胞，例如木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉)的真菌细胞。在另一个方面，真菌细胞为红褐肉座菌物种。

在一个方面，宿主细胞包含质粒或表达载体，或者优选地用质粒或表达载体转化，因此能够表达本文所设想的多肽。在一个方面，表达载体包含核酸，并且本文所设想的表达载体或质粒可包含源自木霉属的启动子(例如里氏木霉cbhI来源启动子)，和/或源自木霉属的终止子(例如里氏木霉cbhI来源终止子)，和/或一个或多个选择性标记(例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS和pyrG)，和/或一个或多个端粒区域，所述端粒区域允许在宿主细胞中维持非染色体质粒。

6.组合物和用途

例如，本文所设想的葡糖淀粉酶可用于组合物中，该组合物包括但不限于淀粉水解和糖化组合物、清洁和洗涤剂组合物(例如衣物洗涤剂、盘碟洗涤剂和硬质表面清洁组合物)、乙醇发酵组合物，和动物饲料组合物。此外，这些葡糖淀粉酶可用于烘焙应用(例如面包和蛋糕生产)、酿造、医疗保健、纺织物、环境废物转化过程、生物制浆加工，和生物质转化应用。

在一些实施例中，包含本文所设想的葡糖淀粉酶的组合物将任选地与下述酶中的任一种组合使用或者与下述酶以任何组合使用：α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶、乙酰乳酸脱羧酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶，以及其他葡糖淀粉酶。

在一些实施例中，组合物将包含所述一种或多种其他酶。在一些实施例中，组合物将包含所述一种或多种其他酶，所述酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。

在另一个实施例中，本文所设想的变体和/或一种或多种其他酶通过巴氏灭菌来灭活，例如通过在啤酒(诸如比尔森啤酒)中使用小于50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16或15个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。

在一些实施例中，组合物将包含α-淀粉酶，诸如真菌α-淀粉酶(例如曲霉属物种)或细菌α-淀粉酶(例如芽孢杆菌属物种，诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(嗜热脂肪地芽孢杆菌)、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)，及其变体和杂合体。在一些实施例中，α-淀粉酶是酸稳定性α-淀粉酶。在一些实施例中，α-淀粉酶是白曲霉(Aspergillus kawachi)α-淀粉酶(AkAA)，参见美国专利No.7,037,704。考虑用于本公开的组合物中的市售α-淀粉酶是已知的，包括G-997、FRED、XTRA(丹尼斯克美国有限公司杰能科分公司(Danisco US，Inc，Genencor Division))、TERMAMYL 120-L和SUPRA(诺维信生物技术公司(Novozymes，Biotech.))。

在一些实施例中，组合物将包含酸性真菌蛋白酶。在又一个实施例中，组合物将包含源自微生物黑曲霉的变体的内切蛋白酶(EC 3.4.21.26)，其在2007年9月13日公布的WO 2007/101888中所公开的脯氨酸残基的羧基位点处水解肽。在又一个实施例中，酸性真菌蛋白酶源自木霉属物种并且可为2006年7月13日公布的US 2006/0154353中所公开的蛋白酶中的任一者，所述专利以引用的方式并入本文。在又一个实施例中，组合物将包含来自布丘氏菌属(Buttiauxiella)物种的植酸酶(例如BP-17，还可参见PCT专利公布WO 2006/043178中所公开的变体)。在又一个实施例中，组合物将包含例如来自地衣芽孢杆菌或来自在1986年10月14日公布的US4,617,273中所公开的枯草芽孢杆菌的修饰菌株中表达的短芽孢杆菌ALDC基因的乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)EC 4.1.1.5。

在其他实施例中，可将本文所设想的葡糖淀粉酶与其他此类葡糖淀粉酶组合。在一些实施例中，此类葡糖淀粉酶将与如下葡糖淀粉酶组合：源自高粱红曲霉的其他各种菌株或变体，或者曲霉属(Aspergillus)或其变体，例如米曲霉、黑曲霉、白曲霉、和泡盛曲霉(A.awamori)的一种或多种葡糖淀粉酶；源自腐质霉属(Humicola)的菌株或其变体的葡糖淀粉酶；源自篮状菌属(Talaromyces)的菌株或其变体(例如埃默森篮状菌(T.emersonii))的葡糖淀粉酶；源自阿太菌属(Athelia)的菌株(例如罗氏阿太菌(A.rolfsii))的葡糖淀粉酶；或源自青霉属(Penicillium)的菌株(例如产黄青霉(P.chrysogenum))的葡糖淀粉酶。

具体地讲，本文所设想的葡糖淀粉酶可用于淀粉转化工艺，特别是可用于果糖糖浆、特种糖的右旋糖的生产中，以及用于由含淀粉底物发酵而产生醇和其他终产物(例如有机酸、抗坏血酸和氨基酸)(G.M.A.vanBeynum et al.，Eds.(1985)STARCH CONVERSION TECHNOLOGY，MarcelDekker Inc.NY(G.M.A.van Beynum等人编辑，1985年，《淀粉转化技术》，纽约马塞尔·德克尔公司)。用本公开的变体葡糖淀粉酶组合物生产的糊精可导致至少80％、至少85％、至少90％和至少95％的葡萄糖产率。用本文所设想的葡糖淀粉酶由淀粉底物发酵产生醇可包括产生燃料醇或可饮用的醇。在一些实施例中，当在与亲本或野生型葡糖淀粉酶相同的条件下使用变体葡糖淀粉酶时，醇的产生将更多。在一些实施例中，与亲本或野生型葡糖淀粉酶相比，醇的产生将多出介于约0.5％和2.5％之间，包括但不限于多出0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％和2.4％的醇。

在一些实施例中，本文所设想的葡糖淀粉酶将可用于水解来自各种基于植物的底物的淀粉，所述底物通常为用于醇产生的含有淀粉和/或糖的植物材料。在一些实施例中，所述基于植物的底物将包括玉米(玉蜀黍)、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、稻米、甘蔗、马铃薯、木薯以及它们的组合。在一些实施例中，所述基于植物的底物将为分级的植物材料，例如被分级为诸如纤维、胚、蛋白质和淀粉(胚乳)之类的组分的谷物谷粒(诸如玉米(玉蜀黍))(美国专利No.6,254,914和美国专利No.6,899,910)。醇发酵的方法描述于THE ALCOHOL TEXTBOOK，A REFERENCE FOR THEBEVERAGE，FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES，3rd Ed.，Eds K.A.Jacques et al.，1999，Nottingham University Press，UK(《醇教科书：饮料、燃料和工业酒精行业参考》，第3版，K.A.Jacques等人编辑，1999年，英国诺丁汉大学出版社)中。在某些实施例中，所述醇将为乙醇。特别地，醇发酵生产工艺表征为湿磨或干磨工艺。在一些实施例中，葡糖淀粉酶将用于湿磨发酵工艺中，而在其他实施例中，葡糖淀粉酶将可用于干磨工艺中。

干谷粒研磨涉及多个基本步骤，其通常包括：碾磨、蒸煮、液化、糖化、发酵、和将液体与固体分离以产生醇和其他副产物。对植物材料，特别是全谷物谷粒，诸如玉米(玉蜀黍)、小麦或黑麦进行碾磨。在一些情况下，可将谷粒首先分级为组成部分。可研磨经碾磨的植物材料以获得粗颗粒或细颗粒。可将经碾磨的植物材料与液体(例如水和/或酒糟水(thinstillage))在浆料槽中混合。使浆料在喷射式蒸煮锅中与液化酶(例如α-淀粉酶)一起经受高温(例如90℃至105℃或更高)以将谷粒中的淀粉溶解并水解为糊精。可使混合物冷却并用糖化酶(例如本公开所涵盖的葡糖淀粉酶)进一步处理，以产生葡萄糖。然后，可在发酵微生物(诸如产乙醇微生物，特别是酵母(酵母菌属物种))的存在下，使含有葡萄糖的醪液发酵大约24至120小时。将醪液中的固体与液相分离，获得醇(诸如乙醇)和有用的副产物(诸如酒糟)。

在一些实施例中，将糖化步骤与发酵步骤相结合，该工艺称为同时糖化和发酵或同时糖化、酵母增殖和发酵。在一个方面，本文公开的葡糖淀粉酶变体在将纤维素类生物质转化为醇的一步工艺中使用，该工艺将纤维素分解酶和微生物结合用于发酵。在该工艺中，酶作用释放的糖可通过微生物发酵同时转化为醇。

在其他实施例中，这些葡糖淀粉酶可用于淀粉水解工艺中，其中该工艺的温度介于25℃和50℃之间，在一些实施例中，介于30℃和40℃之间。在一些实施例中，葡糖淀粉酶可在pH 3.0和pH 6.5之间的pH下用于淀粉水解工艺中。一些实施例中的发酵工艺包括研磨谷物谷粒或经分级的谷粒，以及将经碾磨的谷物谷粒与液体结合以形成浆料，然后可在单个容器中将该浆料与根据本公开的葡糖淀粉酶和任选其他的酶以及酵母混合以产生乙醇和其他副产物(参见例如美国专利No.4,514,496、WO 04/081193和WO 04/080923)，所述其他的酶为例如但不限于α-淀粉酶、其他葡糖淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶或具有颗粒淀粉水解活性的其他酶。

在一些实施例中，本公开涉及糖化液体淀粉溶液的方法，该方法包括使用本文所设想的一种或多种葡糖淀粉酶的酶促糖化步骤。

在一些实施例中，本公开涉及水解和糖化待用于酿造的经糊化和液化(通常是液化)的谷粉淀粉的方法，由此将包含一种或多种本文所设想的葡糖淀粉酶的组合物用于增加从淀粉获得的酿造啤酒用酵母可发酵糖的量。将酿造工艺用于生产可饮用的产品，啤酒，其中通过用酿造啤酒用酵母发酵而使可发酵糖转化为乙醇和CO₂。传统上可发酵糖源自谷物谷粒中的淀粉，该淀粉任选补充有诸如葡萄糖和麦芽糖糖浆以及蔗糖之类的可发酵糖源。简而言之，本领域所熟知的啤酒生产通常包括下列步骤：制麦芽、淀粉糖化和发酵。

历史上，啤酒生产的第一步是制麦芽-谷物谷粒(例如大麦)的浸渍、萌发和干燥。在制麦芽过程中，在谷物(例如大麦)去壳谷粒的萌发中产生酶并且其化学组成中有某些改变(称为修饰)，包括淀粉、蛋白质和β-葡聚糖的某些降解。

研磨发芽的谷物以提供谷粉，可将谷粉与经研磨的辅料(例如非萌发的谷物谷粒)混合以提供混合的谷粉。谷粉还可主要由或单独由辅料组成。将该谷粉与水混合并使其经受淀粉糖化；可将之前蒸煮的(糊化和液化)辅料(“辅料蒸煮”的所得物)添加到醪液。在多种温度下在一段时间中进行淀粉糖化工艺，以水解谷物蛋白质、降解β-葡聚糖并溶解和水解淀粉。在传统的淀粉糖化中，麦芽和辅料中的谷粉淀粉的水解被认为是由发芽大麦内源性的两种主要的酶催化的。α-淀粉酶随机裂解淀粉分子内部的α-1，4键而将其片段化为更小的糊精。β-淀粉酶从这些糊精的非还原末端顺次裂解α-1，4键，从而主要产生麦芽糖。α-和β-淀粉酶二者都不能水解α-1，6键(其形成淀粉分子中淀粉链的分支点)，这导致极限糊精在醪液中积聚。麦芽确实含有酶，即极限糊精酶，其催化α-1，6键的水解但由于其不耐热性，其在淀粉糖化温度下仅显示出弱的活性。在淀粉糖化后，将液体提取物(麦芽汁)与废糟固体(即形成谷粉的部分的不可溶谷粒和壳材料)分离。麦芽汁分离的目的包括：·获得良好的提取物回收率，·获得良好的过滤性，以及·产生澄清的麦芽汁。麦芽汁的提取物回收率和过滤性在酿造工艺的经济性方面是重要的。

麦芽汁的组成取决于原材料、淀粉糖化工艺和特征以及其他变量。典型的麦芽汁包含65-80％的可发酵糖(葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖)，以及20-35％的非可发酵极限糊精(具有比麦芽三糖更高的聚合度的糖)。当以高水平的附加的未出芽谷物酿造时，可引起淀粉糖化工艺中淀粉水解酶的不足。因此需要外源性酶来源，所述外源性酶能够在淀粉糖化的过程中产生可发酵的糖。此外，也需要此类外源性酶以降低麦芽汁中非可发酵糖的水平，伴有可发酵糖的相应增加，以酿造具有低碳水化合物含量的高度稀释的啤酒。本文中公开的是用于淀粉水解的酶组合物，其包含至少一种本文中所考虑的葡糖淀粉酶，可将其加入醪液中或用于酿造工艺的淀粉糖化步骤中，以便裂解淀粉谷粉中的α-1，4键和/或α-1，6键并从而增加麦芽汁中的可发酵糖含量和减少成品啤酒中的非可发酵糖残余。此外，可干燥(通过例如喷雾干燥)或浓缩(例如煮沸和蒸发)如此制备的麦芽汁以提供糖浆或粉末。

本文所设想的谷粉可包含任何含有淀粉和/或糖的植物材料，所述植物材料可源自任何植物和植物部分，包括例如之前所述的块茎、根、茎、叶和种子。优选地，谷粉包含谷粒，诸如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(玉蜀黍)、稻米、蜀黍、粟和高粱的谷粒，并且更优选地，至少10％、或更优选至少15％、甚至更优选至少25％、或最优选至少35％(诸如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量))的麦芽汁的谷粉源自谷粒。最优选地，所述谷粉包含发芽的谷粒，诸如大麦麦芽。优选地，至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％(诸如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量))的麦芽汁的谷粉源自发芽的谷粒。优选地，所述谷粉包含辅料，诸如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(玉蜀黍)、稻米、蜀黍、粟和高粱的未出芽谷粒，更优选地，至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％(诸如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(重量/重量))的所述麦芽汁的谷粉源自未出芽谷粒或其他辅料。可在本发明的淀粉糖化工艺之前、期间或之后将包含可容易发酵的碳水化合物(如糖或糖浆)的辅料加入麦芽醪液，但优选在淀粉糖化工艺之后加入。在加入到醪液中之前，可用α-淀粉酶，和/或内切肽酶(蛋白酶)和/或内切葡聚糖酶处理辅料的一部分，和/或对其进行热处理。如本文所设想的用于水解淀粉的酶组合物可包含另外的酶，优选选自如下的酶：α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。在淀粉糖化的过程中，将从谷粉中提取的淀粉逐渐水解为可发酵糖和更小的糊精。优选地，在麦芽汁分离之前，醪液对于碘测试是淀粉阴性的。

在淀粉糖化之后，麦芽汁(液体提取物麦芽汁)通过滤清或醪液过滤的过程从废糟固形物分离。麦芽汁分离的目的包括：良好的提取物回收率；良好的过滤性，以及澄清的麦芽汁(更多信息可见于“TechnologyBrewing and Malting”by Wolfgang Kunze of the Research and TeachingInstitute of Brewing，Berlin(VLB)，3rd completely updated edition，2004，ISBN3-921690-49-8(柏林酿造研究学院的Wolfgang Kunze所著的《酿造和制麦技术》，第三完全更新版，2004年，ISBN 3-921690-49-8))。

在酿造工艺的第三步(发酵)之前，通常将麦芽汁转移到酿造罐中并剧烈煮沸50-60分钟。在麦芽汁沸腾期间中发生多个重要的过程(更多信息可见于“Technology Brewing and Malting”by Wolfgang Kunze of theResearch and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB)，3rd completelyupdated edition，2004，ISBN 3-921690-49-8(柏林酿造研究学院的WolfgangKunze所著的《酿造和制麦技术》，第三完全更新版，2004年，ISBN 3-921690-49-8))，包括内源性麦芽酶和加入到醪液或辅料中的任何外源性酶的失活。然后冷却煮沸的麦芽汁，用酿造啤酒用酵母接种，并且在8-16℃范围内的温度下发酵以将可发酵糖转化为乙醇。可通过用于选择性除去醇的真空蒸发过程而从最终的啤酒产生低醇啤酒。此外，可将啤酒花添加到麦芽汁中。

在一个方面，本发明涉及如本文所设想的变体或组合物在发酵中的用途，其中在发酵步骤之前或期间添加所述变体或组合物。在又一个方面，所述发酵步骤之后是巴氏灭菌步骤。在一个方面，所述发酵饮料选自啤酒，诸如低醇啤酒或低卡路里啤酒。在另一个方面，所述变体或所述组合物与一种或多种另外的酶组合在一起添加，所述酶选自α-淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。在又一个方面，所述变体和/或一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中被灭活。

在一个方面，本文所设想的变体以例如0.01-50mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.05-25mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.1-15mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.2-10mg/ml发酵麦芽汁，诸如1-5mg/ml发酵麦芽汁的量添加。

在一个方面，本文所设想的变体以例如至少0.001、0.01、0.05、0.10、0.200、0.300、0.500、0.800、0.100、0.500或1.000mg/ml发酵麦芽汁的量添加。

在一个方面，本文所设想的变体以例如0.01-20GAU/ml发酵麦芽汁，诸如0.02-10GAU/ml发酵麦芽汁，诸如0.05-5GAU/ml发酵麦芽汁，诸如0.08-2GAU/ml发酵麦芽汁，诸如0.1-1GAU/ml发酵麦芽汁的量添加。

在一个方面，本文所设想的变体以例如至少0.010、0.050、0.100、0.150、0.300、0.500、0.800、1.00、5.00或10.0GAU/ml发酵麦芽汁的量添加。

在一个替代实施例中，本发明涉及一种方法，诸如在其中发酵被包括在用于制造发酵饮料的工艺中的方法中，该方法包括在发酵步骤之前或期间添加如本文所述的变体或组合物，诸如在包括发酵步骤或任选的啤酒过滤步骤之后的巴氏灭菌步骤的方法中。

在一个方面，本发明涉及生产发酵饮料的方法，该方法包括以下步骤：

a)制备醪液(例如得自谷粉)，其中所述谷粉例如包含发芽和/或未发芽的谷粒，或来自另一种作物的基于淀粉的材料中的一者或多者，并且其中该步骤任选地还包括将所述醪液与一种或多种另外的酶接触，

b)过滤醪液以获得麦芽汁，以及

c)对麦芽汁进行发酵以获得发酵饮料，

以及任选地进行巴氏灭菌步骤(d)，

其中将如本文所述的变体或组合物添加到：

i.步骤(a)的醪液和/或

ii步骤(b)的麦芽汁和/或

iii.步骤(c)的麦芽汁。

在一个方面，可任选地添加到步骤a中的一种或多种酶可选自淀粉脱支酶、R-酶、极限糊精酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。在另一个方面，还可通过将步骤(b)或(c)的麦芽汁与一种或多种另外的酶接触来添加一种或多种酶，其中所述酶选自淀粉脱支酶、异淀粉酶和极限糊精酶，包括它们的任何组合。

在一个替代实施例中，本公开涉及使用包含一种或多种本文所设想的葡糖淀粉酶(例如不耐热的葡糖淀粉酶)的组合物来提高麦芽汁中可发酵糖的量的方法，由此在麦芽汁煮沸后将所述组合物加入麦芽汁中，使得一种或多种葡糖淀粉酶在发酵步骤中是有活性的。可在用酿造啤酒用酵母接种麦芽汁之前、与之同时或在之后将组合物加入到煮沸的麦芽汁中。在发酵和成熟步骤结束时，接着对啤酒(其可任选经受真空蒸发以产生低醇啤酒)进行任选地过滤和/或巴氏灭菌。该方法的内在优势在于发酵过程的持续时间为约6-15天(取决于接种率、发酵、温度等)，与短的淀粉糖化步骤(2-4小时的持续时间)相比，这使得有更多的时间来对非可发酵糖进行酶促裂解。该方法的另外的优点在于实现所期望的非可发酵糖减少(和可发酵糖增加)所需的组合物的量，与实现非可发酵糖的类似减少而将需要向醪液中加入的量相比，其对应于显著更低数目的酶活性单位(例如葡糖淀粉酶活性单位)。此外，其消除了当在醪液中加入高剂量率的葡糖淀粉酶时，在麦芽汁分离(特别是通过过滤)过程中通常所见的困难。已经出乎意料地发现，与葡糖淀粉酶的替代来源相比，本文所设想的葡糖淀粉酶是足够温度敏感的，使得成品啤酒的最终热处理步骤(标准巴氏灭菌条件)足以使其催化活性失活。因此包含本文所设想的一种或多种葡糖淀粉酶的组合物的一个重要优点在于，其可用于在酿造的发酵步骤期间减少麦芽汁中的非可发酵糖的量以便酿造具有低碳水化合物含量的高发酵度啤酒，并且其中该组合物的催化活性易通过啤酒巴氏灭菌过程中的热处理而失活，从而避免固定化酶反应器的费用或基因工程酿造啤酒用酵母的使用。

本公开还提供生产食品、饲料或饮料产品(诸如醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒或威士忌的基于谷物或麦芽的饮料，例如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁)的方法，所述方法包括用如本文所述的变体或组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。在另一个方面，本发明还涉及试剂盒，其包含如本文所设想的变体或组合物；以及所述变体或组合物的使用说明。本发明还涉及通过本文所述的方法生产的发酵饮料。

本公开还提供包含至少一种本文所设想的葡糖淀粉酶的动物饲料组合物或配方。例如WO 03/049550(以引用的方式全文并入本文)中提供了在制备包含淀粉的饲料中使用葡糖淀粉酶的方法。简而言之，将葡糖淀粉酶与包含淀粉的饲料混合。所述葡糖淀粉酶能够降解抗性淀粉以用于动物使用。

根据本说明书，本公开的其他目标和优势将显而易见。

6.根据本发明的另外的编号实施例：

实施例1：一种葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO：2的残基29、43、48、116和502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。

实施例2：一种葡糖淀粉酶变体，其包含

实施例3：一种葡糖淀粉酶变体，其包含

实施例4：一种葡糖淀粉酶变体，其包含

实施例5：一种葡糖淀粉酶变体，其包含

实施例6：一种葡糖淀粉酶变体，其包含SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换H502S；SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换L98E；和SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换Y48V，或者SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换Y147R；其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：2或13具有至少80％的序列同一性。

实施例7：根据实施例1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中亲本葡糖淀粉酶是SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22。

实施例8：根据实施例1-7中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中亲本葡糖淀粉酶是SEQ ID NO：2或13。

实施例9：根据实施例1-8中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO：2的残基24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118、119、500、502、504、534、536、537、539、541、542、543、544、546、547、548、580、583、585、587、588、589、590、591、592、594和596或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换。

实施例10：根据实施例1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含由在SEQ ID NO：2的位置1至484中除位置24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118和119之外的位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中的不与淀粉结合结构域直接接触的残基组成的催化核心氨基酸组中的一个、两个或三个氨基酸置换。

实施例11：根据实施例1-10中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其具有至少74.5％的RDF。

实施例12：根据实施例1-11中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少80％的序列同一性。

实施例13：根据实施例1-12中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少85％的序列同一性。

实施例14：根据实施例1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少90％的序列同一性。

实施例15：根据实施例1-14中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少95％的序列同一性。

实施例16：根据实施例1-15中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少99.5％的序列同一性。

实施例17：根据实施例1-16中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：2或13具有至少80％的序列同一性，诸如至少85％、90％、95％或99.5％的序列同一性。

实施例18：根据实施例1-17中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由氨基酸的SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22的亲本序列组成，氨基酸的该序列具有由SEQ ID NO：2的残基F29、I43、Y48、F116和H502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换，其中I43中的置换为I43Q，并且Y48中的置换为Y48V；以及由SEQ ID NO：2的残基S97、L98、Y147、F175、G483和T484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中S97中的置换为S97M，G483中的置换为G483S，并且T484中的置换为T484W。

实施例19：根据实施例1-18中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由氨基酸的SEQ ID NO：2的序列组成，氨基酸的该序列具有由SEQ ID NO：2的残基F29、I43、Y48、F116和H502组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换，其中I43中的置换为I43Q，并且Y48中的置换为Y48V；以及由SEQ ID NO：2的残基S97、L98、Y147、F175、G483和T484组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中S97中的置换为S97M，G483中的置换为G483S，并且T484中的置换为T484W。

实施例20：根据实施例1-19中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由氨基酸的SEQ ID NO：13的序列组成，氨基酸的该序列具有由SEQ ID NO：13的残基F29、I43、Y48、F116和H502组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换，其中I43中的置换为I43Q，并且Y48中的置换为Y48V；以及由SEQ ID NO：13的残基S97、L98、Y147、F175、G483和T484组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中SEQ IDNO：13中的S97中的置换为S97M，G483中的置换为G483S，并且T484中的置换为T484W。

实施例21：根据实施例1-20中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶变体显示出下降的热稳定性。

实施例22：根据实施例1-21中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体通过巴氏灭菌来灭活，诸如在啤酒中使用小于16.8、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。

实施例23：根据实施例1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体在处于其晶体形式时，具有的晶体结构的主链原子的原子坐标与TrGA的等价主链原子的原子坐标(如WO2009/067218中的表20中所定义)在等价主链原子比对后具有小于0.13nm的均方根偏差，并且所述葡糖淀粉酶变体具有连接区、淀粉结合结构域和催化结构域。

实施例24：根据实施例1-23中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO：2的残基F29、I43、Y48、F116和H502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换，其中I43中的置换为I43Q，并且Y48中的置换为Y48V；以及由SEQ ID NO：2的残基S97、L98、Y147、F175、G483和T484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中S97中的置换为S97M，G483中的置换为G483S，并且T484中的置换为T484W。

实施例25：根据实施例1-24中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置F29或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例26：根据实施例1-25中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F29A/R/N/D/C/E/F/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例27：根据实施例1-26中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F29V，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例28：根据实施例1-27中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置I43或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例29：根据实施例1-28中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的I43Q，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例30：根据实施例1-29中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置Y48或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例31：根据实施例1-30中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的Y48V，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例32：根据实施例1-31中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置Fl 16或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例33：根据实施例1-32中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F116M，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例34：根据实施例1-33中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置H502或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例35：根据实施例1-34中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的H502A/N/D/C/E/F/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V/W/Y，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例36：根据实施例1-35中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的H502S/E，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例37：根据实施例1-36中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置S97或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例38：根据实施例1-37中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的S97M，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例39：根据实施例1-38中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置L98或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例40：根据实施例1-39中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的L98A/R/N/E/G/H/K/S/T/Q/I/L/M/P/V/Y，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例41：根据实施例1-40中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的L98E，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例42：根据实施例1-41中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置Y147或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例43：根据实施例1-42中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的Y147R，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例44：根据实施例1-43中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置F175或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例45：根据实施例1-44中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F175V/I/L，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例46：根据实施例1-45中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置G483或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例47：根据实施例1-46中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的G483S，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例48：根据实施例1-47中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含与SEQ ID NO：2的位置T484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置对应的残基处的氨基酸置换。

实施例49：根据实施例1-48中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的T484W，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例50：根据实施例1-49中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中以下组中的氨基酸置换的总数为二、三或四：

(1)由SEQ ID NO：2的残基24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118、119、500、502、504、534、536、537、539、541、542、543、544、546、547、548、580、583、585、587、588、589、590、591、592、594和596或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸残基组；和

(2)由在SEQ ID NO：2的位置1至484中除位置24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、110、111、112、114、116、117、118和119之外的位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中的不与淀粉结合结构域直接接触的残基组成的催化核心氨基酸组。

实施例51：根据实施例1-50中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的F29V-G483S、Y48V-L98E-H502S、F116M-F175V、F175V-H502E、I43Q-F175I-H502S、I43Q-F175I、F29V-S97M-G483S-T484W或L98E-Y147R-H502S，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

实施例52：根据实施例1-51中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其还包含以下氨基酸置换：L417V、T430A、Q511H、A539R和N563I。

实施例53：根据实施例1-52中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由SEQ ID NO：14组成。

实施例54：根据实施例1-52中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由SEQ ID NO：15组成。

实施例55：根据实施例1-52中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由SEQ ID NO：16组成。

实施例56：根据实施例1-52中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由SEQ ID NO：17组成。

实施例57：根据实施例1-56中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21和/或22具有至少80％的序列同一性的催化结构域。

实施例58：根据实施例1-57中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO：11、24、25、26、27、28和/或29具有至少80％的序列同一性的淀粉结合结构域。

实施例59：根据实施例1-58中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶选自获自下列物种的葡糖淀粉酶：木霉属物种、曲霉属物种、腐质霉属物种、青霉属物种、篮状菌属物种、或裂殖酵母属物种。

实施例60：根据实施例59所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶获自木霉属物种或曲霉属物种。

实施例61：根据实施例1-60中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶变体显示出改变的热稳定性。

实施例62：根据实施例61所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述改变的热稳定性是下降的热稳定性。

实施例63：根据实施例1-62中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶变体显示出改变的比活性。

实施例64：根据实施例63所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述改变的比活性是类似或增加的比活性。

实施例65：根据实施例1-64中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶变体不仅显示出下降的热稳定性，还显示出类似或增加的比活性。

实施例66：根据实施例1-65中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中一个氨基酸序列与，或对，另一个氨基酸序列的同一性百分比通过使用具有如下默认设置的蛋白质-蛋白质Blast搜索(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)来测定：得分矩阵：blosum62，非冗余蛋白质序列数据库和blast算法

实施例67：根据实施例1-66中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体通过巴氏灭菌来灭活，诸如在啤酒中使用小于16.8、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。

实施例68：根据实施例1-67中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体的葡糖淀粉酶活性(GAU)为0.05-10GAU/mg，诸如0.1-5GAU/mg，诸如0.5-4GAU/mg，诸如0.7-4GAU/mg，或诸如2-4GAU/mg。

实施例69：根据实施例1-68中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其通过在宿主细胞中的重组表达获得。

实施例70：一种核酸，其能够编码根据实施例1-69中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。

实施例71：一种表达载体或质粒，其包含根据实施例70所述的核酸，或能够表达根据实施例1-69中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。

实施例72：根据实施例71所述的表达载体或质粒，其包含源自木霉属的启动子，诸如源自里氏木霉cbhI的启动子。

实施例73：根据实施例71-72中任一项所述的表达载体或质粒，其包含源自木霉属的终止子，诸如源自里氏木霉cbhI的终止子。

实施例74：根据实施例71-73中任一项所述的表达载体或质粒，其包含一个或多个选择性标记，例如构巢曲霉amdS和pyrG。

实施例75：根据实施例71-74中任一项所述的表达载体或质粒，其包含一个或多个端粒区域，所述端粒区域使得可以在宿主细胞中维持非染色体质粒。

实施例76：一种宿主细胞，其具有如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体的异源表达。

实施例77：根据实施例76所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌细胞。

实施例78：根据实施例77所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于木霉属。

实施例79：根据实施例78所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于里氏木霉物种。

实施例80：根据实施例77所述的宿主细胞，其中所述真菌细胞属于红褐肉座菌物种。

实施例81：一种宿主细胞，其包含如实施例71-75中任一项所定义的质粒或表达载体，或者优选地用所述质粒或表达载体转化。

实施例82：一种分离如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括以下步骤：诱导葡糖淀粉酶变体在如实施例76-81中任一项所定义的具有所述葡糖淀粉酶变体的异源表达的宿主细胞中合成，并且回收由所述宿主细胞分泌的细胞外蛋白，以及任选地纯化所述葡糖淀粉酶变体。

实施例83：一种生成如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括以下步骤：诱导葡糖淀粉酶变体在如实施例76-81中任一项所定义的具有所述葡糖淀粉酶变体的异源表达的宿主细胞中合成，以及任选地纯化所述葡糖淀粉酶变体。

实施例84：一种表达如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括获得如实施例76-81中任一项所定义的宿主细胞，并且从所述宿主细胞表达所述葡糖淀粉酶变体，以及任选地纯化所述葡糖淀粉酶变体。

实施例85：根据实施例82-84中任一项所述的方法，其中如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体为优势分泌蛋白。

实施例86：一种组合物，其包含一种或多种如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体。

实施例87：根据实施例86所述的组合物，其中所述组合物选自淀粉水解组合物、糖化组合物、洗涤剂组合物、醇发酵酶组合物，以及动物饲料、动物饲料组合物。

实施例88：根据实施例86-87中任一项所述的组合物，其包含一种或多种另外的酶。

实施例89：根据实施例88所述的组合物，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。

实施例90：根据实施例86-89中任一项所述的组合物，其中葡糖淀粉酶变体和/或一种或多种另外的酶通过巴氏灭菌来灭活。

实施例91：根据实施例90所述的组合物，其中所述葡糖淀粉酶变体和/或所述一种或多种另外的酶通过巴氏灭菌来灭活，诸如在啤酒中通过使用小于50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。

实施例92：如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体或如实施例86-91中任一项所定义的组合物在发酵中的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体或组合物在发酵步骤之前或期间添加。

实施例93：根据实施例92所述的用途，其中所述发酵步骤和任选的啤酒过滤步骤之后是巴氏灭菌步骤。

实施例94：根据实施例92-93中任一项所述的用途，其中所述发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中。

实施例95：根据实施例92-94中任一项所述的用途，其中所述发酵饮料选自啤酒，诸如低醇啤酒或低卡路里啤酒。

实施例96：根据实施例92-95中任一项所述的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体或所述组合物与一种或多种另外的酶相结合来添加。

实施例97：根据实施例96所述的用途，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。

实施例98：根据实施例92-97中任一项所述的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体和/或所述一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中被灭活。

实施例99：根据实施例92-98中任一项所述的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体以例如0.01-50mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.05-25mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.1-15mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.2-10mg/ml发酵麦芽汁，诸如1-5mg/ml发酵麦芽汁的量添加。

实施例100：不耐热的葡糖淀粉酶变体用于提高酿造工艺的发酵步骤中的可发酵糖的产量的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体如实施例1-69中任一项所定义。

实施例101：一种方法，其包括在发酵步骤(诸如利用酵母的发酵步骤)之前或期间添加如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体或如实施例86-91中任一项所定义的组合物。

实施例102：根据实施例101所述的方法，其包括发酵步骤或任选的啤酒过滤步骤之后的巴氏灭菌步骤。

实施例103：根据实施例101-102中任一项所述的方法，其中所述发酵包括在用于制造发酵饮料的工艺中。

实施例104：根据实施例101-103中任一项所述的方法，其中所述发酵饮料选自啤酒，诸如低醇啤酒、低卡路里啤酒。

实施例105：根据实施例101-104中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶变体或所述组合物与一种或多种另外的酶相结合来添加。

实施例106：根据实施例105所述的方法，其中所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。

实施例107：根据实施例101-106中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶变体和/或所述一种或多种另外的酶在巴氏灭菌步骤中被灭活。

实施例108：根据实施例101-107中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶变体以例如0.01-50mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.05-25mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.1-15mg/ml发酵麦芽汁，诸如0.2-10mg/ml发酵麦芽汁，诸如1-5mg/ml发酵麦芽汁的量添加。

实施例109：根据实施例101-108中任一项所述的用于生产发酵饮料的方法，其包括以下步骤：

a)制备醪液，

b)过滤醪液以获得麦芽汁，以及

c)对麦芽汁进行发酵以获得发酵饮料。

实施例110：根据实施例109所述的方法，其中将如实施例1-69中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体或如实施例86-91中任一项所定义的组合物添加到：

步骤(a)的醪液和/或

步骤(b)的麦芽汁和/或

步骤(c)的麦芽汁。

实施例111：根据实施例109或110所述的方法，其中对所述发酵饮料经受巴氏灭菌步骤(d)。

实施例112：根据实施例109-111中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的醪液得自谷粉。

实施例113：根据实施例112所述的方法，其中所述谷粉包含发芽和/或未发芽的谷粒，或来自另一种作物的基于淀粉的材料中的一者或多者。

实施例114：根据实施例109-113中任一项所述的方法，还包括将步骤(a)的醪液与一种或多种另外的酶接触。

实施例115：根据实施例114所述的方法，其中所述酶选自淀粉脱支酶、R-酶、极限糊精酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。

实施例116：根据实施例109-115中任一项所述的方法，还包括将步骤(b)或(c)的麦芽汁与一种或多种另外的酶接触，其中所述酶选自淀粉脱支酶、异淀粉酶和极限糊精酶，包括它们的任何组合。

实施例117：一种发酵饮料，其中该发酵饮料通过如实施例109-116中任一项所定义的方法来生产。

实施例118：根据实施例117所述的发酵饮料，其为啤酒，诸如低醇啤酒或低卡路里啤酒。

实施例119：一种用于生产食品、饲料或饮料产品(例如醇饮料或无醇饮料，诸如像啤酒或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，诸如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁)的方法，所述方法包括用根据实施例1-69所述的葡糖淀粉酶变体或如实施例86-91中任一项所定义的组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料的步骤。

实施例120：一种试剂盒，其包含根据实施例1-69中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，或如实施例86-91中任一项所定义的组合物；以及所述葡糖淀粉酶变体或组合物的使用说明。

实施例121：根据实施例1-69中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，或根据实施例86-91和117-118中任一项所述的组合物在生产第一代或第二代生物燃料(诸如生物乙醇和/或生物丁醇)中的用途。

实施例122：根据实施例1-69中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，或根据实施例86-91和117-118中任一项所述的组合物在生产生物化学品(诸如生物基异戊二烯)中的用途。

实施例123：一种用于生产第一代或第二代生物燃料(诸如生物乙醇和/或生物丁醇)的方法，所述方法包括用根据实施例1-69中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，或根据实施例86-91和117-118中任一项所述的组合物处理含淀粉材料的步骤。

实施例124：一种用于生产生物化学品(诸如生物基异戊二烯)的方法，所述方法包括用根据实施例1-69中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，或根据实施例86-91和117-118中任一项所述的组合物处理含淀粉材料的步骤。

实施例125：一种根据实施例82-85中任一项所述的方法获得的葡糖淀粉酶变体。

实施例126：一种组合物，其包含根据实施例125所述的产品，诸如其中该产品在0.1％-99.9％的范围内。

提供了以下实例，并且应当理解，在不脱离所讨论的实施例的实质的情况下可进行各种修改。

实例

测定法和方法

下列测定法和方法用于下文中所提供的实例中。下面描述了用于提供变体的方法。然而，应该指出的是可将不同的方法用于提供亲本酶的变体且本发明不限于实例中所使用的方法。意图是可使用任何适用于制备变体和选择变体的手段。

通过发酵产生GA

400x痕量元素溶液：在1000ml去矿物质水中稀释：无水柠檬酸(175g)、FeSO₄*7H₂O(200g)、ZnSO₄*7H₂O(16g)、CuSO₄*5H₂O(3.2g)、MnSO₄*H₂O(1.4g)、H₃BO₃(0.8g)。对其进行酸化而使所有的组分进入溶液可能是有帮助的。将该溶液过滤并灭菌。

LD-培养基：向约800ml去矿物质水中添加：酪蛋白氨基酸(9g)、MgSO₄*7H₂O(1g)、(NH₄)₂SO₄(5g)、KH₂PO₄(4.5g)、CaCl₂*2H₂O(1g)、哌嗪-1，4-双-丙磺酸(PIPPS)缓冲液(33g)、400x里氏木霉痕量元素(2.5ml)，用NaOH 4N将pH调节至5.5。将终体积调节至920ml。

2xAmd S Base琼脂(1升)：混合KH₂PO₄(30g)、1M乙酰胺(20ml)、1M CsCl(20ml)、20％MgSO4.7H₂O(6ml)、20％CaCl₂.2H₂O(6ml)、里氏木霉孢子素400x(2ml)、50％一水葡萄糖(80ml)。用4N NaOH将pH调节至4.5，补足至1L并过滤灭菌。4℃下保存。

初始培养：里氏木霉菌株在AmdS-Base琼脂平板上生长。为了制备琼脂平板，将基本培养基琼脂煮沸，冷却到大约50℃后，用2x AmdS Base1∶1稀释并倾倒在培养皿上。在孢子形成后(大约6-7天)，用2ml盐水0.015％Tween 80刮抹平板。将大约1ml添加至装有500-600μl 35％甘油的甘油管中，并在-80℃下保存。由该孢子悬浮物直接开始进行预培养发酵。

预培养：通过向LD培养基中添加2.5％葡萄糖，随后补足至IL而制备培养基。为了制备生物质，将50μl孢子悬浮物添加至100ml培养基中(在500ml摇瓶中灭菌)。将摇瓶置于旋转摇床上，于30℃、180rpm下温育2天，然后将10ml悬浮物用于接种新的带挡板摇瓶，将其在类似的条件下温育1天。将该摇瓶的内容物用于接种发酵罐。作为另外一种选择，对预培养物的发酵通过一块(约1cm²)含里氏木霉的新鲜PDA平板引发。

主培养：为了制备1L的培养基，将40ml葡萄糖/槐糖混合物(芬兰占姆沙的丹尼斯科公司(Danisco，Jamsa，Finland))添加至LD-培养基中并补足至1L。用预培养物接种装有4L培养基的6L发酵罐，并于34℃在pH 3.5下培养大约16小时，直到CER/OUR(二氧化碳排出率/氧气摄入率)开始下降。然后使温度降至28℃，pH升至5.5并使发酵继续进行大约80小时。收获细胞培养物并且通过离心(在4000rpm下25分钟)和过滤(VacuCap 90，0.2μm)使培养基澄清。随后，浓缩发酵物并保存在-20℃下。

TrGA变体的纯化

使用BioRAD DUO-Flow FPLC系统(美国BioRAD公司(BioRAD，U.S.))，通过亲合色谱法来一步纯化所表达的TrGA变体的培养物上清液。在BioRAD FPLC系统上手动进行色谱法。通过将β-环糊精(荷兰兹韦恩德雷赫特的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Zwijndrecht，TheNetherlands)，目录号68168-23-0)固定在环氧活化的Sepharose^TM6B(比利时迪海姆的通用电气医疗公司(GE Healthcare，Diegem，Belgium)；批号：10021987)上而制备15mlβ-环糊精柱。该β-CD柱用流速为2ml/min的缓冲液A平衡。在整个纯化过程中保持该流速。将包含500GAU单位的样品通过入口管上样到柱上，并且在整个纯化过程中收集10ml的级分。弃去流出液，并且在通过用缓冲液A充分洗涤而稳定基线之后将缓冲液转换为100％缓冲液B(pH为4.3的25mM乙酸钠中的10mMα-环糊精溶液(西格玛公司(Sigma)，28705))。将结合的TrGA变体从柱洗脱，并且在所有蛋白质洗脱之后将缓冲液最终转换回缓冲液A。将洗脱的蛋白质脱盐以移除α-环糊精，随后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析葡糖淀粉酶活性。

纯化的TrGA变体的蛋白质定量

使用Bradford测定法进行总蛋白定量。试剂溶液为Bradford Quikstart工作溶液(伯乐公司(BioRad)目录号500-0205)。将100μl的上清液置于新的96孔平底板中。向每个孔中添加200UI试剂，随后在室温下温育5分钟。在MTP读板仪(分子仪器公司(Molecular Devices)Spectramax 190)中在595nm处测量吸光度。根据牛血清白蛋白(BSA)(0-50Ug/ml)标准曲线来计算蛋白质浓度。

凝胶电泳分析

所有十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)均根据制造商的方案，用12孔的1.0mm英杰公司(Invitrogen)Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(目录号NP0321box)、Novex See-Plus2预染标准品(目录号LC5925)、英杰公司(Invitrogen)Simply Blue Safestain(目录号C6060)和MES SDS电泳缓冲液(目录号NP0002)运行。

用于96孔微量滴定板的pNPG葡糖淀粉酶活性测定法

试剂溶液是：NaAc缓冲液：200mM醋酸钠缓冲液，pH 4.5；底物：50mM对硝基苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma N-1377)于NaAc缓冲液中的溶液(0.3g/20ml)，且终止溶液：800mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH 10。将30μl经过滤的上清液置于新鲜的96孔平底微量滴定板(MTP)中。向每个孔中添加50μl NaAc缓冲液和120μl底物并在50℃下温育(热电雷勃公司(Thermolab systems)iEMS培养箱/摇荡器HT)30分钟。通过加入100μl终止溶液而使反应终止。在MTP读板仪(分子仪器公司(Molecular Devices)Spectramax 384 plus)中在405nm处测量吸光度，并用0.011μM/cm的摩尔消光系数来计算活性。

在96孔微量滴定板中测定GAU活性

所述GAU活性通过特定的葡糖淀粉酶显色测定法，利用pNP-β-麦芽糖苷底物测定，并将其表示为由底物在限定的测定条件下所生成的对硝基酚的量。特定的底物对硝基苯基-β-麦芽糖苷不被α-淀粉酶、α-葡糖苷酶和转葡糖苷酶水解，其可视为商业化葡糖淀粉酶制剂中的污染物。

底物：新鲜制备对硝基苯基-β-麦芽糖苷(4mM)，以及热稳定性β-葡糖苷酶(5U/ml)(来自测定法R-AMGR3 05/04；爱尔兰威克洛的美格兹密国际公司(Megazyme International Wicklow，Ireland))。

缓冲液：200mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)。

将酶样品用醋酸钠缓冲液在96孔板中稀释至少10倍：将20μL底物与20μL酶溶液相混合并在40℃下伴随搅拌温育10分钟。加入300μL 2％的氨基丁三醇(Trizma)碱来终止反应并显色。相对于试剂空白测量400nm处的吸光度。

通过伴随剧烈搅拌，向20μL底物中加入300μL氨基丁三醇碱溶液(2％)，随后加入酶溶液(20μL)而制备空白溶液。如下计算活性：

其中：GAU＝酶活性的国际单位。一个单位是在限定的pH和温度下每分钟从底物释放1微摩尔对硝基酚的酶的量。ΔA₄₀₀＝吸光度(反应)-吸光度(空白)。10＝温育时间(min)。340＝最终反应体积(μL)。20＝被测定的酶的体积(μL)18.1＝2％Trizma碱(pH约8.5)中的对硝基酚在400nm处的EmM(单位：μM^-1*cm^-1)。0.88＝光程(cm)。

热稳定性测定法

以实验室规模的巴氏灭菌测定法在脱气啤酒或乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中测定葡糖淀粉酶活性的相对损失。将样品在啤酒或缓冲液中1∶10稀释，转移到薄玻璃管中，置于72℃下的水浴中，在此处测量时间和温度。随时间推移(0至100秒)取出样品，并且在测定残余GAU活性之前保持在冰上。在Biomek 3000(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))上于96孔ELISA板中进行稀释和混合。为了在用于本实验的条件下测量酶的热稳定性，在酶的温育之前或之后测定GAU活性。将不含葡糖淀粉酶的啤酒或缓冲液用作空白。通过以下所述的公式将累积的能量输入转化成巴氏灭菌单位(PU)(能量当量指数)。

巴氏灭菌单位或PU是指对巴氏灭菌的定量度量。对于啤酒而言一个巴氏灭菌单位(1PU)被定义为在60摄氏度下保热一分钟。可计算如下：

PU＝t×1.393^(T-60)，其中：

t＝在巴氏灭菌器中在巴氏灭菌温度下的时间(分钟)，

T＝在巴氏灭菌器中的温度(摄氏度)，

[^(T-60)表示指数(T-60)]

在常规的脱气比尔森啤酒(Royal Export Pilsner)(pH 4.5)中测定TrGA变体的热稳定性。数据以％相对活性计算如下：

测定实际发酵程度(RDF)的酿造分析

纯麦芽酿造分析

将340g Munton麦芽提取物溶解于1500ml热水中。向该浆料添加5粒来自Hopfenveredlung，St.Johann公司的苦味啤酒花：α含量为16.0％(EBC7.7 0特定HPLC分析)，通过H₂SO₄将pH调整为5.2，并煮沸1小时，随后在121℃下高压灭菌15分钟，以便破坏任何残余的葡糖淀粉酶活性和微生物污染。在淀粉糖化结束时，使醪液冷却，补足至350g并过滤。在30分钟后测量滤液体积，并对经过滤的麦芽汁取样进行比重测定。最终麦芽汁具有的初始比重为1058.6(即14.41柏拉图度数)。将60ml麦芽汁添加到每个100ml烧瓶(发酵容器；FV)中，然后冷却至18℃。酶基于类似的蛋白质的量(0.058mgGA/mL麦芽汁)或类似的β-D-麦芽糖苷活性(0.16GAU/mL麦芽汁)剂量施用。

对烧瓶进行以下添加：

-阴性对照烧瓶容纳2ml无菌水；

-阳性对照烧瓶容纳由杰能科国际公司(Genencor International)提供的2ml经稀释X4(源自黑曲霉菌株的浓缩葡糖淀粉酶)；2ml来自里氏木霉(TrGA wt)过滤发酵液体培养基的经稀释野生型葡糖淀粉酶；以及2ml来自里氏木霉(TrGA CS4)过滤发酵液体培养基的经稀释CS4葡糖淀粉酶变体。

-测试烧瓶容纳：2ml的3.5mg→2ml不耐热的葡糖淀粉酶变体稀释物，就每hl接种的麦芽汁添加的葡糖淀粉酶的量(mg)而言，相当于用于阳性对照中的X4的相同添加率。

向每个锥形烧瓶以0.6g/100mL麦芽汁的剂量率剂量施加W34/70(唯森公司(Weihenstephan))新鲜制备的酵母，使发酵在标准化实验室测试条件(18.5℃的高温，150rpm的轻柔搅拌，在轨道培养箱中长达88小时)下进行。在预定间隔针对重量损失和比重来分析每个烧瓶，同时计算最终发酵麦芽汁(啤酒)的实际发酵程度(RDF，其为以百分比形式表示的实际发酵度)。使用液体比重计或安东帕密度计(例如DMA 4100M)来测量发酵之前、期间和之后的麦芽汁比重，并且根据Ensminger列出的公式(参见http：//hbd.org/ensmingr/“Beer data：Alcohol，Calorie，and AttenuationLevels of Beer”(“啤酒数据：啤酒的醇、卡路里和发酵水平”))来计算实际发酵度，并且以百分比的形式表示为RDF。在发酵过程中监测重量损失提供CO2生成的间接量度，因此也提供了乙醇形成的间接量度。

在发酵之前和之后测量残余活性。通过发酵物的重量损失来间接测量乙醇的产量。醇在安东帕密度计上测量。

麦芽-辅料酿造分析

采用了经改进的煮出糖化，将玉米(玉蜀黍)谷粉用作辅料。该酿造方案由US 2009014247改进而来。将40％的麦芽用含水量为12.6％的玉米(玉蜀黍)谷粉(Benntag Nordic公司；德国吕贝克的北方谷物有限两合公司(Nordgetreide GmBH Lübec，Germany))代替。将全部的玉米(玉蜀黍)谷粉连同54％的水和5％的麦芽(良好改性的比尔森麦芽；丹麦福格桑公司(Fuglsang Denmark))以2℃/min加热至100℃。在72℃和80℃下保持5分钟，在100℃下保持10分钟。此后将辅料冷却至64℃并与也处于64℃的主醪液合并。在该阶段添加酶，接着将64℃下的保持延长至250分钟。在发酵后，测定RDF值。

根据下面的等式计算实际发酵程度(RDF)值：

其中：RE＝实际提取率＝(0.1808×°P_初始)+(0.8192×°p_最终)，°P_初始为发酵前标准化的麦芽汁的比重，而°P_最终为发酵的麦芽汁的比重，以柏拉图度数表示。

在本发明的上下文中，实际发酵程度(RDF)由比重和醇浓度确定。

用Alcolyzer Plus啤酒分析仪(Beer Alcolyzer Plus)和DMA 5000密度计(均购自奥地利格拉茨的安东帕公司(Anton Paar，Gratz，Austria))测定发酵物的比重和醇浓度。基于这些测量值，根据如下公式，计算实际发酵程度(RDF)值：

RDF (%) = \frac{OE - E (r)}{OE} \times 100

其中：E(r)为单位为柏拉图度数(°P)的实际提取率，OE为单位为°P的初始提取率。

实例1：在pTTT载体中构建TrGA变体用于在里氏木霉中表达

通过BP重组反应(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))将经红褐肉座菌(无性型里氏木霉)优化的cDNA序列(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31)编码的TrGA wt和TrGA CS4变体(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13)克隆进pDONR^TM201中，从而得到入门载体pEntry-CS4和pEntry-GA(图1)，如美国专利申请No.US20110020899、美国专利申请No.US 20110014681中所描述。为了能够在红褐肉座菌中表达蛋白质，通过LR重组反应将TrGA CS4/GAwt编码序列克隆进Gateway相容性目的载体pTTT-pyrG13或pTTT-pyr2中。

pTTT-pyrG13载体在wO2010141779A1中有所描述。该载体包含源自里氏木霉cbhI的启动子和终止子区域(使所关注基因能够进行强的诱导型表达)、构巢曲霉amdS和pyrG选择性标记(使得转化株能以乙酰胺作为唯一的氮源在不存在尿苷的情况下生长)，以及里氏木霉端粒区域(使得可以在真菌细胞中维持非染色体质粒)。cbhI启动子与终止子区域被旁侧为基于噬菌体λ的特异性重组位点attR1、attR2的氯霉素抗性基因Cm^R和致死性大肠杆菌基因ccdB分隔开。这种构型使得可以直接选择含有通过LR重组反应而处于正确取向的cbhI调控元件控制下的TrGA基因的重组体。pTTT-pyr2目的载体是pTTT-pyrG13的衍生物，其中pyrG被红褐肉座菌pyr2基因替换，其中pyr2基因使得红褐肉座菌尿苷营养缺陷体能够在不存在尿苷的情况下生长。最终表达载体pTTT-pyrG13-GACS4和pTTTpyr2-GACS4在图2中示出。

将pEntry-CS4和pEntry-GA wt质粒用作由荷兰莱顿BASEClear公司(BASEClear(Leiden，The Netherlands))构建的组合诱变的模板。请求供应商以成熟TrGA wt(SEQ ID NO.2)和成熟TrGA CS4变体(SEQ ID NO.13)为基础生成特定的单个变体和组合变体，如表1中所示。与TrGA(wt)相比，TrGA-CS4变体包括以下突变：L417V-T430A-Q511H-A539R-N563I。

表1TrGA(wt)和TrGA-CS4变体中的突变

实例2：将TrGA变体转化进里氏木霉中

使用PEG原生质体方法将TrGA变体转化进里氏木霉中。通过序列分析确认的质粒DNA由荷兰莱顿BASEClear公司(BASEClear(Leiden，TheNetherlands))提供，并且使用有下述修改的PEG-原生质体方法(etal.(1987)Gene 61：155-164(等人，1987年，《基因》，第61卷，第155-164页))将所述质粒DNA单独转化进源自携带四个基因缺失(Δcbh1、Δcbh2、Δegl1、Δegl2，即“四重缺失的”；参见美国专利No.5,847,276、WO 92/06184和WO 05/001036)的RL-P37的里氏木霉宿主菌株中。

对于原生质体制备物，在木霉属基本培养基(MM)(20g/L葡萄糖、15g/L KH₂PO₄(pH 4.5)、5g/L(NH₄)₂SO₄、0.6g/L MgSO_4×7H₂O、0.6g/LCaCl_2×2H₂O、1ml的1000×里氏木霉痕量元素溶液{5g/L FeSO_4×7H₂O、1.4g/L ZnSO_4×7H₂O、1.6g/L MnSO_4×H₂O、3.7g/L CoCl_2×6H₂O})中，伴随150rpm的振荡，将孢子在24℃下培养16-24小时。通过离心收获萌发的孢子并用15mg/ml的β-D-葡聚糖酶-G(Interspex-商品号为0439-1)溶液处理以裂解真菌细胞壁。通过标准方法对原生质体进行进一步制备，如et al.(1987supra)(等人，1987年，出处同上)所述。

将转化方法按比例缩小10倍。通常，用200ml的25％PEG溶液处理总体积为25μl的含有至多600ng DNA和1-5×10⁵个原生质体的转化混合物，用2体积的1.2M山梨醇溶液稀释，与含有乙酰胺的3％选择性顶层琼脂糖MM(与上文所述相同的基本培养基，但是用20mM乙酰胺替代(NH₄)₂SO₄)相混合，并倾倒于24孔微量滴定板中或分为48孔的20×20cm的Q-托盘中的含有乙酰胺的2％选择性琼脂糖上。将板在28℃下温育5至8天。使用0.85％NaCl、0.015％Tween 80的溶液从板上收获来自在每个单独的孔上再生的转化体总群体的孢子。将孢子悬浮物在96孔MTP中接种发酵。在24孔MTP的情形中，引入额外的在具有选择性乙酰胺MM的新鲜24孔MTP上进行的涂布接种步骤以富集孢子数。

实例3：来自里氏木霉(TrGA)的葡糖淀粉酶变体的发酵液体培养基中的酶活性分析。

如上文在“测定法和方法”一节中所描述的那样将转化株发酵，并测试含有表达的变体TrGA蛋白的上清液的各种特性。

简而言之，通过离心从培养物样品中移除菌丝体并就总蛋白质含量(BCA蛋白质测定试剂盒，Pierce公司，目录号为23225)分析上清液和GA活性，如上文在“测定法和方法”一节中所描述的。

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)来测定全发酵液样品的蛋白质表达谱。将培养物上清液的样品与等体积的含有还原剂的5×上样缓冲液相混合，煮沸10分钟，随后在含有MES SDS电泳缓冲液(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))的Novex 4-12％Bis-Tris凝胶上分离。根据制造商的方案，利用SIMPLYBLUE SafeStain(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))使多肽条带在SDS凝胶中显现。如图3、4和5中所描绘，分析来自TrGA(wt)和TrGA-CS4主链(与TrGA(wt)相比，CS4包括L417V-T430A-Q511H-A539R-N563I)两者的里氏木霉变体的发酵液体培养基é。测量里氏木霉变体发酵液体培养基的葡糖淀粉酶活性，结果在表2中示出。

表2里氏木霉葡糖淀粉酶变体发酵液体培养基的葡糖淀粉酶活性。使用pNP-β-麦芽糖苷测定法测量活性(GAU/ml)，且结果为三次测量的平均值。

大多数里氏木霉变体的发酵液体培养基在TrGA(wt)葡糖淀粉酶的尺寸(64kDa)处显示出明亮蛋白条带。然而，在不同变体的表达水平以及发酵液之间的测得GAU活性中观察到了很大的不同。将发酵液的总GAU活性与总蛋白质含量进行比较，从比活性最高的变体到比活性最低的变体，观察到表观比活性相差52倍。因此，涉及某些位点的若干突变组合就表达性或GAU活性而言均具有破坏性，故不将其计入酿造分析。

来自一步β-环糊精色谱法的对经纯化R_C_1和R_C_2变体的SDS-PAGE分析结果在图5中示出。所有经纯化变体均在由25mM乙酸钠(pH4.3)(西格玛公司(Sigma)，28705)平衡的PD-10柱(通用电气医疗公司(GE Healthcare)，目录号17-0851-01)上脱盐，以避免残余α-环糊精的任何抑制作用。

实例4：来自里氏木霉(TrGA)的葡糖淀粉酶变体的热稳定性测定。

根据上文的测定法“热稳定性测定法”测量热稳定性。

热稳定性测定的结果以及变体的残余活性在表3中示出，所述变体选自对大规模表达和发酵的初始筛选：CPS3-B01、CPS2-F07、CPS2-A12、CPS2-F05、CPS2-D11、CPS2-F09、CPS2-E08、R_A_1、R_A_2、R_A_6、R_A_7、R_C_1、R_C_2、R_C_5、R_C_7、R_C_12、R_C_13、R_C_22、R_D_2、R_D_3和R_D_5。所述条件下的亲本分子(TrGA-wt和TrGA-CS4)在巴氏灭菌100秒后分别显示出24％和38％的残余活性。包括来自黑曲霉的葡糖淀粉酶X4作为基准，其在温育100秒后显示出45％的残余活性。纯化所用的材料并将蛋白质脱盐(25mM乙酸钠(pH4.3))。残余活性基于在72℃下的常规脱气比尔森啤酒(Royal Export Pilsner)(pH(4.5))中增加(最多100秒)温育之前和之后的GAU活性(pNP-β-麦芽糖苷底物)计算。残余活性显示为温育时间：0、10、20、30、40、50、70和100秒以及相应的巴氏灭菌单位：0.0、0.0、0.0、0.2、1.6、4.0、16.8和42.6PU的函数。FV应用的相关变体选择定义为被16.8PU完全灭活的所述组变体。这得到了以下14个所关注变体：CPS3-B01、CPS2-F07、CPS2-A12、CPS2-F05、CPS2-D11、R_A_1、R_A_6、R_C_1、R_C_2、R_C_5、R_C_7、R_C_13和R_C_22。

取决于啤酒类型、原材料和微生物污染、酿造者和对啤酒风味的感知效果，可以使用不同的最小PU。通常，对于啤酒巴氏灭菌，需要14-16PU。取决于巴氏灭菌的设备，巴氏灭菌温度通常在64-72摄氏度的范围内，相应地计算巴氏灭菌时间。另外的信息可在如下文献中找到：“Technology Brewing and Malting”by Wolfgang Kunze of the Research andTeaching Institute of Brewing，Berlin(VLB)，3rd completely updated edition，2004，ISBN 3-921690-49-8(柏林酿造研究学院的Wolfgang Kunze所著的《(酿造和制麦技术》，第三完全更新版，2004年，ISBN 3-921690-49-8)。

相比之下，如上所述确定MkGA I、MkGA II、X4(AnGA)、TrGA(wt)和TrGA-CS4在常规脱气比尔森啤酒(Royal ExportPilsner)(pH 4.5)中的热稳定性。缺乏SDB的截短葡糖淀粉酶MkGA I在72℃的巴氏灭菌温度下被小于26个巴氏灭菌单位(PU)完全灭活(先前在EP12151285.9中有所描述)，要将MkGA II灭活需要100PU，且要将AnGA和TrGA灭活需要大于200PU。

表3在常规比尔森啤酒中以各种时间/PU进行的72℃巴氏灭菌之后测得的残余葡糖淀粉酶活性。结果为三次测量的平均值。

实例5：来自发酵液体培养基的里氏木霉葡糖淀粉酶变体在酿造发酵步骤中的用途

酿造分析：

将高粱红曲霉葡糖淀粉酶用于糖化麦芽汁碳水化合物和支持乙醇发酵的用途与包含来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(AnGA)的X4、来自里氏木霉的野生型葡糖淀粉酶(TrGA wt)、来自里氏木霉的CS4葡糖淀粉酶变体(TrGA CS4)以及先前针对酿造应用所考察的来自高粱红曲霉的两种葡糖淀粉酶(MkGAI和MkGAII)(EP 12151285.9)进行比较。发酵试验如“测定法和方法”一节中所描述的那样使用由Munton麦芽提取物制备的麦芽汁进行。

使用液体比重计或安东帕密度计(例如DMA 4100M)来测量发酵之前、期间和之后的麦芽汁比重，并且根据Ensminger列出的公式(参见http：//hbd.org/ensmingr/“Beer data：Alcohol，Calorie，and Attenuation Levelsof Beer”(“啤酒数据：啤酒的醇、卡路里和发酵水平”))来计算实际发酵度，并且以百分比的形式表示为RDF。酶基于mg蛋白质(0.058mgGA/ml麦芽汁)剂量施用时所获得的RDF值在表4中示出。

表4针对以类似浓度(0.058mg GA/ml麦芽汁)施加到FV的下列GA (纯化的蛋白质)测得的RDF值。结果为两次测量的平均值±标准误差。

若干变体显示出与参考物(TrGA(wt)、TrGA(CS4)和X4)类似的在标准误差内的性能，然而，对于组合变体中的一些也观察到了显著的差异。值得注意的是，多个组合变体显示出性能显著下降(RDF％减小)，这可能是底物特异性变化的结果，因为它们的性能在基于GAU活性剂量施用时也发生下降(CPS3 B01、CPS2 E08、CPS2 F09、R_A_2、R_A_7、R_C_2、R_C_5、R_C_7和R_C_12)。其余9个GA(CPS2-A12、CPS2-F05、CPS2-D11、CPS2-F07、R_A_1、R_A_6、R_C_1、R_C_13和R_C_22)生成与通过参考物(TrGA wt、TrGA CS4和X4)获得的RDF值相当/类似的RDF值。与通过参考物(TrGA(wt)、TrGA-CS4和X4)、以及来自高粱红曲霉的葡糖淀粉酶(MkGAI和MkGAII)获得的RDF相比，所测试的组合变体均未显著增大RDF值。FV应用的相关变体选择定义为当其剂量为0.058mg GA/ml麦芽汁时生成最低为74.5的RDF值的所述组变体。这得到了以下9个所关注变体：CPS2-A12、CPS2-F05、CPS2-D11、CPS2-F07、R_A_1、R_A_6、R_C_1、R_C_13和R_C_22。

在FV中发挥作用的该组9个变体，就根据如上所述的“热稳定性测定”的不耐热性而言均获得了关注。每个变体均可被16.8PU完全灭活，并且当其在FV中的剂量为0.058mg GA/ml麦芽汁时，在给定的一组条件下生成最低为74.5的RDF值。

这9个变体就是在筛选不耐热性和糖化性能两者中获得的所谓“胜出命中物(winner hit)”。

序列

如下为序列，以引用的方式将其全部并入本文。

SEQ ID NO：1：里氏木霉葡糖淀粉酶，全长；带信号肽

SEQ ID NO：2：里氏木霉葡糖淀粉酶，成熟蛋白质；不带信号肽

SEQ ID NO：4：里氏木霉葡糖淀粉酶cDNA

SEQ ID NO：5：泡盛曲霉GA(AaGA)；CD

SEQ ID NO：6：黑曲霉(AnGA)，CD

SEQ ID NO：7：米曲霉(AoGA)，CD

SEQ ID NO：8：灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)；CD

SEQ ID NO：9：酒色肉座菌葡糖淀粉酶(HvGA)；CD

SEQ ID NO：10：TrGA，连接区

SEQ ID NO：11：TrGA，SBD

SEQ ID NO：12SVDDFI：TrGA成熟蛋白质的起点

SEQ ID NO：18：泡盛曲霉葡糖淀粉酶(AaGA)，成熟全长，不带信号肽

SEQ ID NO：19：黑曲霉葡糖淀粉酶(AnGA)，成熟全长，不带信号肽

SEQ ID NO：20：米曲霉葡糖淀粉酶(AoGA)，成熟全长，不带信号肽

SEQ ID NO：21：灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)，成熟全长，不带信号肽

SEQ ID NO：22：酒色肉座菌葡糖淀粉酶(HvGA)，成熟全长，不带信号肽

SEQ ID NO：23：篮状菌属GA，成熟蛋白质

SEQ ID NO：24：灰腐质霉GA，SBD

SEQ ID NO：25：疏棉状嗜热丝孢菌GA，SBD

SEQ ID NO：26：埃默森篮状菌GA，SBD

SEQ ID NO：27：黑曲霉GA，SBD

SEQ ID NO：28：泡盛曲霉GA，SBD

SEQ ID NO：29：太瑞斯梭孢壳霉GA，SBD

SEQ ID NO：30：经里氏木霉wt葡糖淀粉酶优化的cDNA(2535bp-4433bp，直接)1899bp(pEntry-GA WT)

ATGCACGTCCTGTCGACTGCGGTGCTGCTCGGCTCCGTTGCCGTTCAAAAGGTCCTGGGAAGACCAGGATCAAGCGGTCTGTCCGACGTCACCAAGAGGTCTGTTGACGACTTCATCAGCACCGAGACGCCTATTGCACTGAACAATCTTCTTTGCAATGTTGGTCCTGATGGATGCCGTGCATTCGGCACATCAGCTGGTGCGGTGATTGCATCTCCCAGCACAATTGACCCGGACTACTATTACATGTGGACGCGAGATAGCGCTCTTGTCTTCAAGAACCTCATCGACCGCTTCACCGAAACGTACGATGCGGGCCTGCAGCGCCGCATCGAGCAGTACATTACTGCCCAGGTCACTCTCCAGGGCCTCTCTAACCCCTCGGGCTCCCTCGCGGACGGCTCTGGTCTCGGCGAGCCCAAGTTTGAGTTGACCCTGAAGCCTTTCACCGGCAACTGGGGTCGACCGCAGCGGGATGGCCCAGCTCTGCGAGCCATTGCCTTGATTGGATACTCAAAGTGGCTCATCAACAACAACTATCAGTCGACTGTGTCCAACGTCATCTGGCCTATTGTGCGCAACGACCTCAACTATGTTGCCCAGTACTGGAACCAAACCGGCTTTGACCTCTGGGAAGAAGTCAATGGGAGCTCATTCTTTACTGTTGCCAACCAGCACCGAGCACTTGTCGAGGGCGCCACTCTTGCTGCCACTCTTGGCCAGTCGGGAAGCGCTTATTCATCTGTTGCTCCCCAGGTTTTGTGCTTTCTCCAACGATTCTGGGTGTCGTCTGGTGGATACGTCGACTCCAACATCAACACCAACGAGGGCAGGACTGGCAAGGATGTCAACTCCGTCCTGACTTCCATCCACACCTTCGATCCCAACCTTGGCTGTGACGCAGGCACCTTCCAGCCATGCAGTGACAAAGCGCTCTCCAACCTCAAGGTTGTTGTCGACTCCTTCCGCTCCATCTACGGCGTGAACAAGGGCATTCCTGCCGGTGCTGCCGTCGCCATTGGCCGGTATGCAGAGGATGTGTACTACAACGGCAACCCTTGGTATCTTGCTACATTTGCTGCTGCCGAGCAGCTGTACGATGCCATCTACGTCTGGAAGAAGACGGGCTCCATCACGGTGACCGCCACCTCCCTGGCCTTCTTCCAGGAGCTTGTTCCTGGCGTGACGGCCGGGACCTACTCCAGCAGCTCTTCGACCTTTACCAACATCATCAACGCCGTCTCGACATACGCCGATGGCTTCCTCAGCGAGGCTGCCAAGTACGTCCCCGCCGACGGTTCGCTGGCCGAGCAGTTTGACCGCAACAGCGGCACTCCGCTGTCTGCGCTTCACCTGACGTGGTCGTACGCCTCGTTCTTGACAGCCACGGCCCGTCGGGCTGGCATCGTGCCCCCCTCGTGGGCCAACAGCAGCGCTAGCACGATCCCCTCGACGTGCTCCGGCGCGTCCGTGGTCGGATCCTACTCGCGTCCCACCGCCACGTCATTCCCTCCGTCGCAGACGCCCAAGCCTGGCGTGCCTTCCGGTACTCCCTACACGCCCCTGCCCTGCGCGACCCCAACCTCCGTGGCCGTCACCTTCCACGAGCTCGTGTCGACACAGTTTGGCCAGACGGTCAAGGTGGCGGGCAACGCCGCGGCCCTGGGCAACTGGAGCACGAGCGCCGCCGTGGCTCTGGACGCCGTCAACTATGCCGATAACCACCCCCTGTGGATTGGGACGGTCAACCTCGAGGCTGGAGACGTCGTGGAGTACAAGTACATCAATGTGGGCCAAGATGGCTCCGTGACCTGGGAGAGTGATCCCAACCACACTTACACGGTTCCTGCGGTGGCTTGTGTGACGCAGGTTGTCAAGGAGGACACCTGGCAGTCGTAA

SEQ ID NO：31：经里氏木霉CS4变体葡糖淀粉酶优化的cDNA(2535bp-4433bp，直接)1899bp(pEntry-GA CS4)

ATGCACGTCCTGTCGACTGCGGTGCTGCTCGGCTCCGTTGCCGTTCAAAAGGTCCTGGGAAGACCAGGATCAAGCGGTCTGTCCGACGTCACCAAGAGGTCTGTTGACGACTTCATCAGCACCGAGACGCCTATTGCACTGAACAATCTTCTTTGCAATGTTGGTCCTGATGGATGCCGTGCATTCGGCACATCAGCTGGTGCGGTGATTGCATCTCCCAGCACAATTGACCCGGACTACTATTACATGTGGACGCGAGATAGCGCTCTTGTCTTCAAGAACCTCATCGACCGCTTCACCGAAACGTACGATGCGGGCCTGCAGCGCCGCATCGAGCAGTACATTACTGCCCAGGTCACTCTCCAGGGCCTCTCTAACCCCTCGGGCTCCCTCGCGGACGGCTCTGGTCTCGGCGAGCCCAAGTTTGAGTTGACCCTGAAGCCTTTCACCGGCAACTGGGGTCGACCGCAGCGGGATGGCCCAGCTCTGCGAGCCATTGCCTTGATTGGATACTCAAAGTGGCTCATCAACAACAACTATCAGTCGACTGTGTCCAACGTCATCTGGCCTATTGTGCGCAACGACCTCAACTATGTTGCCCAGTACTGGAACCAAACCGGCTTTGACCTCTGGGAAGAAGTCAATGGGAGCTCATTCTTTACTGTTGCCAACCAGCACCGAGCACTTGTCGAGGGCGCCACTCTTGCTGCCACTCTTGGCCAGTCGGGAAGCGCTTATTCATCTGTTGCTCCCCAGGTTTTGTGCTTTCTCCAACGATTCTGGGTGTCGTCTGGTGGATACGTCGACTCCAACATCAACACCAACGAGGGCAGGACTGGCAAGGATGTCAACTCCGTCCTGACTTCCATCCACACCTTCGATCCCAACCTTGGCTGTGACGCAGGCACCTTCCAGCCATGCAGTGACAAAGCGCTCTCCAACCTCAAGGTTGTTGTCGACTCCTTCCGCTCCATCTACGGCGTGAACAAGGGCATTCCTGCCGGTGCTGCCGTCGCCATTGGCCGGTATGCAGAGGATGTGTACTACAACGGCAACCCTTGGTATCTTGCTACATTTGCTGCTGCCGAGCAGCTGTACGATGCCATCTACGTCTGGAAGAAGACGGGCTCCATCACGGTGACCGCCACCTCCCTGGCCTTCTTCCAGGAGCTTGTTCCTGGCGTGACGGCCGGGACCTACTCCAGCAGCTCTTCGACCTTTACCAACATCATCAACGCCGTCTCGACATACGCCGATGGCTTCCTCAGCGAGGCTGCCAAGTACGTCCCCGCCGACGGTTCGCTGGCCGAGCAGTTTGACCGCAACAGCGGCACTCCGCTGTCTGCGGTTCACCTGACGTGGTCGTACGCCTCGTTCTTGACAGCCGCGGCCCGTCGGGCTGGCATCGTGCCCCCCTCGTGGGCCAACAGCAGCGCTAGCACGATCCCCTCGACGTGCTCCGGCGCGTCCGTGGTCGGATCCTACTCGCGTCCCACCGCCACGTCATTCCCTCCGTCGCAGACGCCCAAGCCTGGCGTGCCTTCCGGTACTCCCTACACGCCCCTGCCCTGCGCGACCCCAACCTCCGTGGCCGTCACCTTCCACGAGCTCGTGTCGACACAGTTTGGCCATACGGTCAAGGTGGCGGGCAACGCCGCGGCCCTGGGCAACTGGAGCACGAGCGCCGCCGTGGCTCTGGACGCCGTCAACTATCGTGATAACCACCCCCTGTGGATTGGGACGGTCAACCTCGAGGCTGGAGACGTCGTGGAGTACAAGTACATCATTGTGGGCCAAGATGGCTCCGTGACCTGGGAGAGTGATCCCAACCACACTTACACGGTTCCTGCGGTGGCTTGTGTGACGCAGGTTGTCAAGGAGGACACCTGGCAGTCGTAA

上述专利申请，以及其中引用的或在其申请过程中引用的所有文献(“专利申请引用文献”)和专利申请引用文献中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献(“本文引用文献”)，以及本文引用文献中引用或参考的所有文献，连同本文提及的或以引用方式并入本文的任何文献中的任何产品的任何生产商使用说明、说明书、产品说明书和产品卡，均特此以引用的方式并入本文，并且用于实践本发明。

对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离本文所述的实施例的范围和实质的情况下对这些实施例作出各种修改和变化。应当理解，如要求权利要求保护的主题不应不当地限于此类具体的实施例。实际上，对于本领域技术人员而言显而易见的对所描述的执行实施例的模式的各种修改，也旨在处于以下权利要求书的范围内。

Claims

1.一种葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO：2的残基502、29、43、48和116或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由SEQ ID NO：2的残基98、97、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少80％的序列同一性。

2.根据权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体，其包含

其中所述葡糖淀粉酶变体至少具有选自所述界面氨基酸组或所述催化核心氨基酸残基组的一个氨基酸置换；

3.根据权利要求1-2中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含

4.根据权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含

5.根据权利要求1-4中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含

6.根据权利要求1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的H502S，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的L98E，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的Y48V，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含以下氨基酸置换：SEQ ID NO：2的Y147R，或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置的相应置换。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其包含：SEQID NO：2或13的氨基酸置换H502S；SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换L98E；以及SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换Y48V，或者SEQ ID NO：2或13的氨基酸置换Y147R；其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：2或13具有至少80％的序列同一性。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶是SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述亲本葡糖淀粉酶是SEQ ID NO：2或13。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其还包含由SEQ ID NO：2的残基24、26、27、30、40、42、44、46、49、110、111、112、114、117、118、119、500、504、534、536、537、539、541、542、543、544、546、547、548、580、583、585、587、588、589、590、591、592、594和596或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其还包含由SEQ ID NO：2的位置1至484中除位置24、26、27、29、30、40、42、43、44、46、48、49、97、98、110、111、112、114、116、117、118、119、147、175、483和484之外的位置或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置中的残基组成的催化核心氨基酸组中的一个、两个或三个氨基酸置换。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体显示出至少74.5％的RDF。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：1、2、13、18、19、20、21或22具有至少85％的序列同一性。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述葡糖淀粉酶变体与SEQ ID NO：2或13具有至少80％的序列同一性，诸如至少85％、90％、95％或99.5％的序列同一性。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与所述亲本葡糖淀粉酶相比，所述葡糖淀粉酶变体显示出下降的热稳定性。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，所述葡糖淀粉酶变体通过巴氏灭菌来灭活，诸如在啤酒中使用小于16.8、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个巴氏灭菌单位(PU)来灭活。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其由SEQ IDNO：14、15或17组成。

21.一种生成如权利要求1-20中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括以下步骤：诱导所述葡糖淀粉酶变体在具有所述葡糖淀粉酶变体的异源表达的宿主细胞中合成，以及任选地纯化所述葡糖淀粉酶变体。

22.一种包含一种或多种如权利要求1-20中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体的组合物，诸如醇发酵酶组合物，所述组合物任选地包含一种或多种另外的酶，所述一种或多种另外的酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、内肽酶、外肽酶)、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶和相关的β-葡聚糖水解辅助酶、木聚糖酶和木聚糖酶辅助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶)、乙酰乳酸脱羧酶和葡糖淀粉酶，包括它们的任何组合。

23.如权利要求1-20中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体或如权利要求22所定义的组合物在发酵中的用途，其中所述葡糖淀粉酶变体或组合物在发酵步骤之前或期间添加，其中所述发酵步骤任选地之后是巴氏灭菌步骤，诸如其中所述发酵被包括在用于制备发酵饮料的工艺中。

24.一种方法，其包括在发酵步骤之前或期间添加如权利要求1-20中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体或如权利要求22所定义的组合物，任选所述发酵步骤之后还包括巴氏灭菌步骤。

25.一种生产发酵饮料的方法，其包括以下步骤：

a)制备醪液，

b)过滤所述醪液以获得麦芽汁，以及

c)对所述麦芽汁进行发酵以获得发酵饮料，

其中将如权利要求1-20中任一项所定义的葡糖淀粉酶变体或如权利要求22所定义的组合物添加到：

i.步骤(a)的所述醪液和/或

ii步骤(b)的所述麦芽汁和/或

iii.步骤(c)的所述麦芽汁。