CN105039283B - 一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1及其制备方法，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1得自脂环酸芽孢杆菌D‑1；内切葡聚糖酶GluE1总共含339个氨基酸，理论分子量为40.45kDa，GluE1不含信号肽；用重组载体转化宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21，得到重组菌株BL21(DE3)/gluE1；培养重组菌株，诱导内切葡聚糖酶基因gluE1表达；回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶GluE1。本发明体现了较强的耐盐性，用中性内切纤维素酶处理后的棉织物效果好，对织物损伤小，防沾色效果优良。

Description

一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1及其制备方法。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，而来源于低成本的可再生纤维素资源的生物制品和生物能源对于人类的可持续发展是很重要的。如果能充分的利用纤维素资源，将对缓解全球的能源危机，食品和饲料资源紧张以及环境污染有重大意义。

纤维素酶系广泛存在于多种微生物中，由三种酶组成：内切-1，4-β-D-葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanases,EC 3.2.1.4,EG)；1，4-β-D-纤维二糖水解酶(1,4-β-D-cellobiohydrolases,EC 3.2.1.91,CBH)；1，4-β-D-葡萄糖苷酶(1,4-β-D-glucosidases,EC 3.2.1.21,BGL)。纤维素通过这三种酶的协同作用，最终降解为葡萄糖(OKSANEN T,PEREJ,PAAVILAINEN L,et al.Journal of biotechnology,2000,78(1):39-48.)。其中内切-1，4-β-D-葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它首先作用纤维素，随机水解纤维素分子内部的β-1，4-糖苷键，将纤维素链打断，它对整个纤维素的降解起到至关重要的作用。近年来，内切葡聚糖酶的应用已经越来越广泛，如纺织，生物质能，造纸和食品工业等(BEGUINP,AUBERT J-P.FEMS，microbiology reviews,1994,13(1):25-58.)。目前，许多研究都集中在强耐热性的纤维素酶上，原因在于其在各种工业过程中潜在的应用，如对木质纤维性生物转化成发酵性的产品，改善动物饲料的消化率和果汁的澄清，并减少在造纸工业所需的氯等(BHAT M.Biotechnology advances,2000,18(5):355-383.)。

现如今对纤维素酶研究的范围越来越广泛，但是，一直以来纤维素酶的降解速率和高生产成本成了充分利用纤维素资源的限制因素；现如今所研究的纤维素酶难以满足食品、化工等工业快速发展，以及环境可持续、健康发展的需求，偏中性耐盐性较强的内切葡聚糖酶目前研究的还很少，因此，开发有此种特性的内切葡聚糖酶并将其应用于工业领域，将有很好的前景和价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1及其制备方法，旨在解决将纤维素酶更广泛，更高效的应用于各种工业领域。

本发明是这样实现的，一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1得自脂环酸芽孢杆菌D-1；

内切葡聚糖酶GluE1总共含339个氨基酸，理论分子量为40.45kDa，GluE1不含信号肽。GluE1可水解CMC-Na、可溶性淀粉、大麦β-葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖和微晶纤维素，表观最适pH为6.5，在pH 5.0–pH 10.0的范围内稳定并维持60％以上的酶活性。GluE1的表观最适温度为55℃，在37℃下稳定。GluE1受Ag⁺、Hg²⁺及SDS抑制，β-巯基乙醇、Pb⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和Na⁺对GluE1有微弱的促进作用；其余金属离子和有机试剂对GluE1的影响不大。3％-30％的NaCl对GluE1的影响不大，加入30％的NaCl，仍有64％以上的酶活性；经3％-30％的NaCl在37℃下处理60min，仍能保持93％以上的活性；体现了较强的耐盐性，用中性内切纤维素酶处理后的棉织物效果好，对织物损伤小，防沾色效果优良；

GluE1具有良好的pH稳定性和大部分的金属离子抗性，因此，GluE1可作为良好的出发材料，通过进一步的突变等研究以提高高温活性等，最终使其在中温到高温的生境和加工过程中具一定的应用潜力，纤维素是植物细胞壁的主要组成部分，利用纤维素酶能有效的应用于植物中有益营养成分的提取，GluE1表现出了较强的耐盐性，这使得内切葡聚糖酶能应用于从盐含量较高的植物中提取有用物质成为可能。

进一步，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1对CMC-Na、可溶性淀粉、大麦β-葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖和微晶纤维素的比活分别为5.902±0.331U/mg，6.362±0.331U/mg，130.655±0.694U/mg，6.117±0.598U/mg，6.974±0.371U/mg和11.384±1.581U/mg，表观最适pH为6.5，在pH 5.0–pH 10.0的范围内稳定并维持60％以上的酶活性。

本发明的另一目的在于提供一种一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法包括以下步骤：

步骤一，用重组载体转化宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21，进行阳性克隆子验证并送测序，得到重组菌株BL21(DE3)/gluE1；

步骤二，培养重组菌株，诱导内切葡聚糖酶基因gluE1表达；取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/gluE1，以0.1％的接种量接种于LB(含100mg/mLAmp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100mg/mL Amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD₆₀₀达到0.6–1.0)后，加入终浓度0.7mmol/L的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。9500g离心5min，收集菌体；

步骤三，回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶GluE1。(用适量的pH 7.0McIlvainebuffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经12000r离心10min，吸取上清并用Nickel-NTA树脂纯化目的蛋白。纯化的蛋白进行12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和Bradford法蛋白定量。)

进一步，内切葡聚糖酶基因编码的内切葡聚糖酶以大麦β-葡聚糖为底物：最适pH6.5，最适温度55℃；在pH为6.0～7.0的范围内酶活稳定。

进一步，通过PCR的方法分离克隆了内切葡聚糖酶GluE1的编码基因gluE1，全长1020bp，GC含量50.5％，编码339个氨基酸。

进一步，将重组载体优选为pEASY-E2-gluE1。将本发明的内切葡聚糖酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的内切葡聚糖酶基因和表达载体pEASY-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒。

本发明还提供了包含上述内切葡聚糖酶基因gluE1的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/gluE1。

本发明的另一目的在于提供一种所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1，其最适pH为6.5；最适温度为55℃；较强的耐盐性和金属离子抗性。本发明的内切葡聚糖酶可应用于饲料、食品、洗涤等行业。

附图说明

图1是本发明实施例提供的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组内切葡聚糖酶GluE1的SDS-PAGE分析示意图；

图中：1、蛋白质Marker；2、500mM咪唑洗脱亲和于Nickel-NTAAgarose中的重组内切葡聚糖酶GluE1；

图3是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的pH活性示意图

图4是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的pH稳定性示意图；

图5是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的最适温度示意图；

图6是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的热稳定性示意图；

图7是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的NaCl抗性示意图；

图8是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的NaCl稳定性示意图；

图9是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1在不同时间下水解大麦β-葡聚糖的产物分析示意图；

图中：CK为大麦β-葡聚糖和失活的GluE1(100℃下处理5min)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明的目的是提供一种偏中性耐盐性较强的内切葡聚糖酶GluE1。

本发明的再一目的是提供编码上述内切葡聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明从脂环酸芽孢杆菌D-1(Alicyclobacillus tengchongensis CGMCC1504)的基因组中克隆到内切葡聚糖酶基因gluE1，属于GH5家族的内切葡聚糖酶。gluE1与表达载体pEASY-E2连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对其酶学性质进行了初步研究。

本发明所述内切葡聚糖酶GluE1可得自脂环酸芽孢杆菌D-1(Alicyclobacillussp.)。GluE1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的内切葡聚糖酶GluE1总共含339个氨基酸，理论分子量为40.45kDa，GluE1不含信号肽。该酶对CMC-Na、可溶性淀粉、大麦β-葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖和微晶纤维素的比活分别为5.902±0.331U/mg，6.362±0.331U/mg，130.655±0.694U/mg，6.117±0.598U/mg，6.974±0.371U/mg和11.384±1.581U/mg，表观最适pH为6.5，在pH 5.0–pH10.0的范围内稳定并维持60％以上的酶活性。GluE1的表观最适温度为55℃，在37℃下稳定，在55℃和60℃下半衰期均分别为4min和90s。GluE1受Ag⁺、Hg²⁺及SDS抑制，β-巯基乙醇、Pb⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和Na⁺对GluE1有微弱的促进作用；其余金属离子和有机试剂对GluE1的影响不大。3％-30％的NaCl对GluE1的影响不大，加入30％的NaCl，仍有64％以上的酶活性；经3％-30％的NaCl在37℃下处理60min，仍能保持93％以上的活性。

本发明提供了编码上述内切葡聚糖酶GluE1的基因gluE1，该基因序列如SEQIDNO.2所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了内切葡聚糖酶GluE1的编码基因gluE1，与NCBI数据库中GH5的内切葡聚糖酶具有较高的相似性，全长1020bp，GC含量50.5％，编码339个氨基酸(40.45kDa)。GluE1与数据库中序列的最高一致性为97％，与其余纤维素酶酶的一致性<60％。

本发明还提供了包含上述内切葡聚糖酶基因gluE1的重组载体，优选为pEASY-E2-gluE1。作为本发明的一个优选的实施方案，将本发明的内切葡聚糖酶基因和表达载体pEASY-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY-E2-gluE1。

本发明还提供了包含上述内切葡聚糖酶基因gluE1的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/gluE1。

如图1所示，本发明制备内切葡聚糖酶GluE1的方法按以下步骤进行：

S101：用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

S102：培养重组菌株，诱导内切葡聚糖酶基因gluE1表达；

S103：回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶GluE1。

该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法包括以下步骤：

步骤一，用重组载体转化宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21，进行阳性克隆子验证并送测序，得到重组菌株BL21(DE3)/gluE1；

步骤二，培养重组菌株，诱导内切葡聚糖酶基因gluE1表达；取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/gluE1，以0.1％的接种量接种于LB(含100mg/mLAmp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100mg/mL Amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD₆₀₀达到0.6–1.0)后，加入终浓度0.7mmol/L的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。9500g离心5min，收集菌体；

步骤三，回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶GluE1。(用适量的pH 7.0McIlvainebuffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经12000r离心10min，吸取上清并用Nickel-NTA树脂纯化目的蛋白。纯化的蛋白进行12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和Bradford法蛋白定量。)

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/gluE1。

本发明提供了一个内切葡聚糖酶基因，其编码的内切葡聚糖酶以大麦β-葡聚糖为底物：最适pH 6.5，最适温度55℃；在pH为6.0～7.0的范围内酶活稳定，是一种中性的内切纤维素酶，经pH 5.0-10.0的缓冲液处理1h后，仍能保持60％以上的活性，37℃保温1h，酶活没有损失；1mM和10mM的Hg²⁺、Ag⁺和SDS可以完全抑制GluE1活性；1mM和10mM的β-巯基乙醇、Pb⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和Na⁺对GluE1有微弱的促进作用；其余金属离子和有机试剂对GluE1的影响较小(剩余酶活大于71％)，可能具有更大应用潜力。经3％-30％的NaCl在37℃下处理60min，仍能保持93％以上的活性，体现了较强的耐盐性。用中性内切纤维素酶处理后的棉织物效果好，对织物损伤小，防沾色效果优良。此外，如果能将中性内切葡聚糖酶应用于洗涤行业将能大幅度的减小洗涤污染物对环境的影响。因此中性内切型纤维素酶在纺织可能有重要的应用价值。除此之外，GluE1具有良好的pH稳定性和大部分的金属离子抗性，因此，GluE1可作为良好的出发材料，通过进一步的突变等研究以提高高温活性等，最终使其在中温到高温的生境和加工过程中具一定的应用潜力。纤维素是植物细胞壁的主要组成部分，利用纤维素酶能有效的应用于植物中有益营养成分的提取，GluE1表现出了较强的耐盐性，这使得内切葡聚糖酶能应用于从盐含量较高的植物中提取有用物质成为可能。

通过以下试验的本发明的应用效果做进一步的说明：

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)同文献报道菌种性质，如Alicyclobacillus sp.CGMCC1504来自于实验室筛选；大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEASY-E2。

2、DNA聚合酶和dNTPs购于日本TaKaRa公司，Nickel-NTA树脂、大麦β-葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖和微晶纤维素，其余试剂皆为国产分析纯。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)，固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

实施例1：内切葡聚糖酶基因gluE1的克隆

提取脂环酸芽孢杆菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，NaCl 500mM，2％SDS(w/v)，pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min；取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据A.tengchongensis CGMCC1504基因组功能注释、gluE1基因序列分析和载体信息设计引物Dgh5F/Dgh5R:

Dgh5F：5’-ATGTCTGGCGTCAACCTTGG-3’；

Dgh5R：5’-GCGGGCGCTTACGATGCGAACTAATTC-3’；

以A.tengchongensis CGMCC1504基因组为模板，用引物Dgh5F/Dgh5R rDNA扩增，扩增条件为：94℃ 5min；95℃ 30sec，70℃-56℃ 30sec(每个循环降0.5℃)，72℃ 2min，28个循环；95℃30sec，56℃ 30sec，72℃ 2min，7个循环；72℃ 10min。扩增得到内切葡聚糖酶基因gluE1，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。

将PCR产物连接进入pEASY-E2载体，转化大肠杆菌Trans1-T1后(方法参照试剂盒说明书)，提取所有阳性克隆子的混合质粒(方法参照试剂盒说明书)，获得含有gluE1的重组质粒pEASY-E2-gluE1。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/gluE1，并送华大基因组测序中心测序以进行验证。

实施例2：重组内切葡聚糖酶GluE1的制备：

取含有重组质粒pEASY-E2-gluE1的BL21(DE3)菌株以0.1％的接种量接种于LB(含100μg/mL Ampr)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100ug/mLAmpr)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD₆₀₀达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h，12000rpm离心10min，收集菌体；用适量的pH 7.0柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(图2)表明，重组内切葡聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTAAgarose纯化后为单一条带。

实施例3：纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的性质测定：

1、纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的活性分析：

实施例2纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的活性测定方法采用DNS法：将大麦β-葡聚糖溶于缓冲液中，使其终浓度为0.7％(w/v)；反应体系含100μL稀释酶液，900μL的底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液反应10min，然后加1.5mLDNS终止反应，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖所需的酶量。缓冲液为：McIlvaine buffer(pH 2.0-8.0)、0.1M Tris-HCl(pH8.0-9.0)和0.1M glycine-NaOH(pH 9.0-12.0)。

2、纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1对底物的降解：

在pH 5.0和50℃条件下，GluE1对0.7％(w/v)CMC-Na、可溶性淀粉、大麦β-葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖和微晶纤维素的比活分别为5.902±0.331U/mg，6.362±0.331U/mg，130.655±0.694U/mg，6.117±0.598U/mg，6.974±0.371U/mg和11.384±1.581U/mg。

3、纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的pH活性和pH稳定性测定：

酶的最适pH测定：将纯化的GluE1在50℃下和pH 2.0–pH 12.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于pH 2.0–pH 12.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH 6.5及55℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。结果表明：GluE1的最适pH为6.5(图3)；在pH 5.0–pH 10.0的范围内稳定并维持60％以上的酶活性(图4)。

4、纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的最适温度及热稳定性测定：

酶的最适温度测定：在pH 6.5的缓冲液中，于10℃–80℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于37℃、55℃和60℃中，处理0–60min后，在pH 6.5及55℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。结果表明：GluE1的表观最适温度为55℃(图5)；在37℃下稳定，在55℃和60℃下半衰期均分别为4min和90s(图6)。

5、纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的动力学参数测定：

酶的动力学参数测定：用0.05％-1.5％大麦β-葡聚糖为底物，在pH 6.5和55℃下，根据Lineweaver-Burk方法测定K_m、V_max和k_cat。经测定，在55℃ pH 6.5条件下，GluE1对大麦β-葡聚糖的K_m、V_max和k_cat分别为8.583mg/ml、416.667U/mg和280.903s^-1。

6、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1活力的影响：

酶的金属离子和有机试剂抗性测定：在酶促反应体系中加入终浓度为1mM和10mM的CaCl₂、CuSO_4、NiSO₄、CoCl₂、MgSO₄、KCl、ZnSO₄、FeCl₃、Pb(CH₃COO)₂、MnSO₄、FeSO₄、HgCl₂、AgNO₃、NaCl、EDTA、β-Mercaptoethanol、SDS，以及终浓度分别为1.0％(v/v)和0.5％(v/v)的Tween-80和Triton X-100，在pH 6.5和55℃条件下测定酶活性，以不含金属离子和有机试剂的反应体系作为对照。结果(表1)表明：1mM和10mM的Hg²⁺、Ag⁺和SDS可以完全抑制GluE1活性；较多数据表明，Hg²⁺会抑制大多数酶的活性。1mM和10mM的β-巯基乙醇、Pb⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和Na⁺对GluE1有微弱的促进作用；其余金属离子和有机试剂对GluE1的影响较小(剩余酶活大于71％)。

表1.金属离子及化学试剂对纯化的重组GluE1活力的影响

a Values represent the means±SD(n＝3)relative to the untreatedcontrolsamples.

b The final concentration of Triton X-100or Tween 80is 1.0％(v/v).

c The final concentration of Triton X-100or Tween80is 0.5％(v/v).

7、纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1的NaCl抗性及NaCl稳定性测定：

酶的NaCl抗性测定：在酶促反应体系中加入终浓度为3％-30％的NaCl，在pH 6.5和55℃条件下测定酶活性，以不含NaCl的反应体系作为对照。酶的NaCl稳定性测定：将纯化的酶液置于3％-30％的NaCl水溶液中，在37℃下处理60min，然后在pH6.5及55℃下进行酶促反应，以未加NaCl但在37℃下保温60min的酶液作为对照。

结果表明：3％-30％的NaCl对GluE1的影响不大，加入30％的NaCl，仍有64％以上的酶活性，体现了较强的盐抗性(图7)；经3％-30％的NaCl在37℃下处理60min，该酶仍能保持93％以上的活性(图8)。

8、纯化的重组内切葡聚糖酶GluE1水解大麦β-葡聚糖的产物分析：

产物分析反应体系含4.5mL0.7％(w/v)的大麦β-葡聚糖，0.5mL适当稀释酶液，在pH6.5及55℃下，依次在酶促反应的1h、3h内终止反应并分析水解产物，产物分析采用薄层层析法。

薄层层析步骤如下所示：

(1)配制展开剂(冰醋酸20mL，双蒸水20mL，正丁醇40mL，混匀)，取适量倒入展开槽，静置30min左右；

(2)将硅胶板放在110℃烘箱中活化30min，冷却后划线，点样(每次0.5μL，吹干，共点3次)；

(3)将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中，点样点不要没入展开剂；

(4)待展开剂到距硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展开一次；

(5)第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂(1g二苯胺溶于50mL丙酮中，溶解后加入1mL苯胺及5mL85％的磷酸，混匀，现用现配)；

(6)几秒钟后，立即取出硅胶板并放置于90℃烘箱中10–15min，使斑点显色。

TLC法分析水解产物结果表明，GluE1可将大麦β-葡聚糖水解为二糖、三糖、四糖和五糖等。说明GluE1为内切葡聚糖酶(图9)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1，其特征在于，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1得自脂环酸芽孢杆菌D-1；GluE1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1；

内切葡聚糖酶GluE1总共含339个氨基酸，理论分子量为40.45kDa，GluE1不含信号肽。

2.如权利要求1所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1，其特征在于，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1对CMC-Na、可溶性淀粉、大麦β-葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖和微晶纤维素的比活分别为5.902±0.331U/mg，6.362±0.331U/mg，130.655±0.694U/mg，6.117±0.598U/mg，6.974±0.371U/mg和11.384±1.581U/mg，表观最适pH为6.5，在pH 5.0–pH10.0的范围内稳定并维持60％以上的酶活性。

3.如权利要求1所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1，其特征在于，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的表观最适温度为55℃，在37℃下稳定，在55℃和60℃下半衰期均分别为4min和90s。

4.一种如权利要求1所述偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法，其特征在于，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法包括以下步骤：

步骤一，用重组载体转化宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21，进行阳性克隆子验证并送测序，得到重组菌株BL21(DE3)/gluE1；

步骤二，培养重组菌株，诱导内切葡聚糖酶基因GluE1表达；取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/gluE1，以0.1％的接种量接种于LB培养液中，37℃快速振荡16h；然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB培养液中，快速振荡培养2–3h，OD₆₀₀达到0.6–1.后，加入终浓度0.7mmol/L的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养20h，9500g离心5min，收集菌体；

步骤三，回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶GluE1，用pH 7.0McIlvaine buffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体，胞内浓缩的初酶液经12000r离心10min，吸取上清并用Nickel-NTA树脂纯化目的蛋白，纯化的蛋白进行12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和Bradford法蛋白定量；

通过PCR的方法分离克隆了内切葡聚糖酶GluE1的编码基因gluE1，全长1020bp，GC含量50.5％，编码339个氨基酸。

5.如权利要求4所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法，其特征在于，内切葡聚糖酶基因编码的内切葡聚糖酶以大麦β-葡聚糖为底物：最适pH 6.5，最适温度55℃；在pH为6.0～7.0的范围内酶活稳定。

6.如权利要求4所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法，其特征在于，重组载体为pEASY-E2-gluE1；内切葡聚糖酶基因和表达载体pEASY-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY-E2-gluE1。

7.如权利要求4所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1的制备方法，其特征在于，重组菌株为BL21(DE3)/gluE1。

8.一种如权利要求1所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1在饲料中的应用。

9.一种如权利要求1所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1在生物燃料中的应用。