CN108342374A

CN108342374A - 一种甲壳素酶及其应用

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Publication number: CN108342374A
Application number: CN201810345527.6A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 高丽; 孙建安; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: CN108342374B

Abstract

本发明的目的在于提供一种新的具有高效降解率的甲壳素酶，通过克隆白长链霉菌Streptomyces albolongus ATCC 27414基因组中编码甲壳素酶的基因，并构建重组载体，将其转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达，得到高活性的可溶性甲壳素酶。通过Ni柱亲和层析，纯化得到甲壳素纯酶，并对其酶学性质和水解机制进行研究，该酶的最适温度和最适pH分别为55℃和5.0，比酶活为66.2U/mg,降解甲壳素的主要产物为甲壳二糖。有望将本发明应用于甲壳寡糖的制备，具有潜在应用价值。

Description

一种甲壳素酶及其应用

技术领域

本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种甲壳素酶及其应用。

背景技术

甲壳素又称甲壳质、几丁质等，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)，通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性高分子多糖聚合物，甲壳素广泛存在于甲壳类动物外壳、真菌细胞壁、昆虫、藻类细胞以及软体动物的软骨或内壳，是自然界中仅次于纤维素的第二大多糖聚合物。但是甲壳素的不溶性是甲壳素应用的最大限制性因素，而甲壳素的降解产物甲壳寡糖(聚合度为2～10)，具有更广泛的生物活性，如；抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、治疗关节炎、肠道炎等药理功能活性，此外，甲壳寡糖也是肠道有益菌群的促生长因子，可作为功能性食品或饮料的补充剂。因此，制备甲壳寡糖是近年来国内外研究的热点，而且也是甲壳素高值化利用的有效途径。

目前，甲壳寡糖的制备方法主要分为：化学法、物理法和酶法。化学法主要利用盐酸、过氧化氢等化学试剂降解甲壳素，得到分子量<3000的低聚糖，但是由于反应条件比较剧烈，反应过程无法控制，反应产物纯度较低，而且需要消耗大量化学试剂，不仅造成资源的大量浪费，而且容易给环境带来负担。物理法是利用超声波、微波、γ射线和光等能量使甲壳素降解，但是物理法制备的产物产量低，产物分布不均一，在工业化生产中没有得到广泛的应用。酶法制备甲壳寡糖，反应条件较温和，反应过程容易控制，且产物较纯易分离，对大规模生产甲壳寡糖具有重要意义；但目前缺少特异性降解甲壳素来制备特定甲壳寡糖的甲壳素酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲壳素酶及其应用，克服目前现有技术的不足；

本发明的提供的甲壳素酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

用于编码上述甲壳素酶基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明提供一种表达载体，用于表达上述的甲壳素酶；

本发明还提供一种转化体，携带有上述的重组表达载体；

本发明再一个方面提供一种制备甲壳二糖的方法，是使用上述的甲壳素酶降解甲壳素来制备甲壳二糖。

本发明的甲壳素酶用于降解胶质甲壳素，主要产物为甲壳二糖，产量达72％，次要产物为N-乙酰-D-葡萄糖胺，产量达38％。

附图说明：

图1：本发明的甲壳素酶亲和层析后的SDS-PAGE电泳图，1：Marker；2：粗酶；3：纯酶

图2：本发明的甲壳素酶，pH变化对相对酶活的影响。

图3：本发明的甲壳素酶，温度变化对相对酶活的影响。

图4：本发明的甲壳素酶作用于甲壳六糖，产物的变化趋势。

图5：本发明的甲壳素酶，酶解产物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明的的方法作进一步说明，实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

对于本发明所涉及的术语如下：

1、甲壳素酶：糖苷水解酶，是一类水解甲壳素β-1,4-糖苷键的专一性酶。

2、甲壳二糖：两个N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,4-糖苷键连接形成聚合度为2的低聚寡糖。

3、甲壳六糖：六个N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,4-糖苷键连接形成聚合度为6的低聚寡糖。

实施例1甲壳素酶基因saChiA4的克隆

申请人在使用白长链霉菌Streptomyces albolongus(ATCC 27414)对甲壳素进行发酵研究中，发现其产物中甲壳二糖的量明显多于其它的菌株。因此，对该菌株的基因组进行分析，发现了本发明所获得的甲壳素酶。

根据已经得到的甲壳素酶基因的全长序列，设计扩增用的上、下游引物，分别为SaChiA4F 5’-CCGGAATTCATGGAACGCGTACTACCC-3’和SaChiA4R5’-CCCAAGCTTGCAGGCGCCGTTGTCCGC-3’，以白长链霉菌Streptomyces albolongus ATCC 27414的基因组为模板，进行PCR扩增。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 5μl，上、下游引物各1μl，模板1μl，KOD Fx DNA聚合酶(TOYOBO，KFX-101)1μl，加无菌水至终体积为50μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸80s，反应30个循环，68℃后延伸10min。

将获得的目的基因片段saChiA4用BamHI and HindIII进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pET28a(+)进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并均匀涂布于带有卡那抗性(50μg/ml)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，用pET系列载体的通用引物T7及T7ter,以克隆子为模板进行PCR扩增，电泳条带的大小与pET28a(+)及甲壳素酶基因saChiA4的全长总和相对应，进行测序，测序结果表明筛选获得的甲壳素酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，编码的酶蛋白的序列为SEQ ID NO：1。

确定载体pET28a::saChiA4构建成功。

实施例2重组蛋白的表达

将验证正确的重组质粒pET28a::saChiA4转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞，并均匀涂布带有卡那抗性(50ug/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。挑取一个单菌落接入含有卡那抗性(50ug/ml)的试管中，37℃、220rpm培养12h。按1％～2％的接种量接到ZYP-5052自诱导培养基中，在20℃低温诱导48h,诱导结束后，将菌液转移到50mL离心管中，4℃离心10min，收集菌体。

ZYP-5052培养基：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.7％Na₂HPO4，0.7％KH₂PO4，0.3％(NH4)₂SO4，0.05％MgSO₄，0.5％甘油，0.05％葡萄糖，0.2％α-乳糖。

利用亲和层析原理，采用Ni柱纯化含有2个组氨酸的标签表达载体的蛋白。先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)重悬细胞沉淀并超声破碎。在4℃、8000×g条件下离心20min除去细胞碎片并收集含有粗酶的上清液。将粗酶加到用缓冲液A(50mM Tris-HCl，5mM咪唑和500mM NaCl)预平衡的Ni-NTA柱(8×1cm)上，然后加入缓冲液B(50mM Tris-HCl，50mM咪唑和500mM NaCl)洗脱以除去结合力较弱的蛋白质或杂质，然后，用缓冲液C(50mMTris-HCl，100mM咪唑和500mM NaCl)洗脱含有甲壳素酶活性的组分，并使用30kDa超滤管浓缩，收集截留液，即甲壳素纯酶，通过SDS-PAGE鉴定条带，分子大小约为47kDa，如图1所示。

实施例3酶活的测定

甲壳素酶酶活测定使用DNS法。

反应体系：195μL胶质甲壳素(0.1g/mL)，5μL纯酶(5U/mL)，在55℃下孵育30分钟，反应结束后，沸水浴10min，加300μL DNS，煮沸10min，显色，10000rpm离心5min，取200μL上清，测定OD₅₄₀。根据Bradford法，使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准物，测量蛋白质浓度。酶单位的定义：一个酶活单位(U)是指在酶的最适反应条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量。

测定甲壳素酶的最适反应条件。

取等量的酶液(5μL)在55℃下，在不同的pH条件下(pH 3.0-10.0)进行反应，测甲壳素酶酶活，确定甲壳素酶的最适pH。取等量的酶液溶于pH为5.0的缓冲液，在不同的温度下(30-80℃)反应30min，测定甲壳素酶酶活，确定壳聚糖酶的最适反应温度。最终确定甲壳素酶的最适反应条件为pH 5.0、55℃，如图2、图3。

实施例4甲壳素酶的降解模式

利用实施例2得到的甲壳素纯酶，以198μL甲壳六糖(0.02g/mL)为底物，加入2μL稀释5倍的纯酶液，通过测定不同时间段(0min、2min、3min、7min、10min)产物的变化，确定甲壳素酶的降解方式。如图4，在反应最初时间段内，甲壳二糖和甲壳四糖的产量以接近相同的速度增加，因此确定甲壳素酶为内切酶。

用实施例2中制备得到的甲壳素酶水解甲壳素制备甲壳寡糖。10μL(5U/mL)甲壳素纯酶，加入190μL(0.1mg/mL)胶质甲壳素(溶于pH＝5.0的柠檬酸缓冲溶液),55℃反应24h，用高效液相色谱(HPLC)检测其产物，如图5。相较于其它的甲壳素酶，本发明的甲壳素酶具有良好的pH稳定性、温度稳定性以及生物催化活性，且其产物比较单一，主要为甲壳二糖，其次为N-乙酰-D-葡萄糖胺，此外，反应条件温和、对环境污染少，这些特点使得本发明对工业化生物酶法制备甲壳二糖具有重要意义。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种甲壳素酶及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 427

<212> PRT

<213> aritificial sequence

<400> 1

Met Glu Arg Val Leu Pro Pro His Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Arg

1 5 10 15

Arg Pro Arg Arg Val Leu Ala Val Ala Leu Ser Val Phe Gly Leu Leu

20 25 30

Ala Gly Ala Ala Thr Ala Val Thr Thr Thr Gly Thr Ala Asn Ala Ala

35 40 45

Ala Gly Ile Gly Ser Asn Trp Tyr Ala Ser Ala Pro Tyr Leu Met Pro

50 55 60

Glu Asp Asn Ser Pro Pro Asn Ala Ala Ala Val Met Asp Ala Thr Gly

65 70 75 80

Gln Lys Ala Phe Gln Leu Ala Phe Ile Leu Ala Gln Gly Ser Ser Cys

85 90 95

Ser Pro Ala Trp Gly Gly Thr Ser Ser Ile Asp Thr Asp Thr Thr Met

100 105 110

Pro Ala Val Ile Gln Thr Ile Arg Asn Lys Gly Gly Asp Val Ser Val

115 120 125

Ser Val Gly Gly Tyr Gly Gly Thr Lys Leu Gly Gln Thr Cys Gly Thr

130 135 140

Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Thr Lys Tyr Gly

145 150 155 160

Leu Lys Ala Ile Asp Phe Asp Leu Glu Glu Pro Glu Tyr Glu Asn Thr

165 170 175

Ala Ala Ile His Asn Glu Ile Gly Ala Ala Arg Ile Leu Gln Gln Asn

180 185 190

Asn Pro Gly Ile Tyr Ile Ser Ile Thr Thr Ala Gly Thr Asn Ala Gly

195 200 205

Thr Gly Trp Phe Gly Thr Gln Met Leu Leu Glu Ala Lys Ser Gln Gly

210 215 220

Phe Thr Pro Asp Asn Tyr Ser Ile Met Pro Phe Asp Gly Gly Phe Asn

225 230 235 240

Gly Ala Ala Ala Gln Thr Asp Ala Leu Val Lys Phe Asn Gly Ile Leu

245 250 255

Gln Ser Thr Phe Gly Trp Ser Glu Ala Thr Ala Tyr Ala His Glu Gly

260 265 270

Val Ser Leu Met Asn Gly Arg Thr Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Arg Gln

275 280 285

Ala Asp Phe Gln Thr Val Leu Asp Phe Ala Thr Ala His Arg Leu Ala

290 295 300

Arg Tyr Thr Tyr Trp Ser Val Asn Arg Asp Arg Gln Cys Pro Gly Thr

305 310 315 320

Val Asp Pro Gly Leu Ser Gly Ala Cys Ser Ser Val Val Gln Asn Asp

325 330 335

Trp Asp Phe Thr Lys Phe Thr Val Lys Phe Ala Gly Ala Thr Pro Pro

340 345 350

Thr Ser Thr Pro Ser Pro Ser Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Ser Pro

355 360 365

Ser Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Ala Ala Pro Ser Trp Ser Ala Thr

370 375 380

Thr Thr Tyr Ala Thr Ala Gly Thr Lys Val Ser Trp Lys Gly His Tyr

385 390 395 400

Trp Thr Asn Lys Trp Trp Thr Leu Asn Glu Asp Pro Thr Leu Ser Gly

405 410 415

Gln Trp Gly Val Trp Ala Asp Asn Gly Ala Cys

420 425

<210> 2

<211> 1275

<212> DNA

<213> 人工序列(aritificial sequence)

<400> 2

atggaacgcg tactaccccc acatgccccc gcgcccgcac ccgcccgccg gccccgccgc 60

gtcctcgccg tcgccctgtc ggtcttcgga ctgctggccg gcgcggccac cgcggtcacc 120

acgaccggca cggcgaacgc cgccgccggg atcggctcca actggtacgc ctccgcgccg 180

tacctgatgc ccgaggacaa cagcccgccg aacgccgccg cggtgatgga cgcgaccggc 240

cagaaggcgt tccagctggc cttcatcctg gcccagggca gcagttgcag ccccgcctgg 300

ggcggcacgt cctcgatcga cacggacacc accatgcccg ccgtgatcca gaccatccgg 360

aacaagggcg gtgacgtctc ggtctcggtc ggcggctacg gcggcaccaa gctcggccag 420

acctgtggta ccccggaggc gaccgccgcc gcctaccaga aggtggtgac caagtacggc 480

ctcaaggcca tcgacttcga cctggaggag ccggagtacg agaacaccgc cgcgatccac 540

aacgagatcg gcgcggcccg gatcctgcag cagaacaacc cgggcatcta catctccatc 600

accacggccg ggaccaacgc cggcacgggc tggttcggca cccagatgct gctggaggcg 660

aagtcgcagg gcttcactcc cgacaactac tcgatcatgc cgttcgacgg cggcttcaac 720

ggcgccgcgg cgcagaccga cgcgctggtg aagttcaacg gcatcctgca gtccaccttc 780

ggctggagcg aggcgacggc gtacgcgcac gagggcgtgt cgctgatgaa cggccgcacc 840

gacgccgccg agtacttccg gcaggccgac ttccagacgg tgctggactt cgcgaccgcg 900

caccggctgg cccgctacac ctactggtcc gtcaaccgcg accgccagtg cccgggcacg 960

gtggacccgg gcctgtccgg tgcctgttcg agcgtggtgc agaacgactg ggacttcacc 1020

aagttcaccg tgaagttcgc cggggcgacc ccgcccacca gcacccccag cccgtcaccg 1080

agcagcagcg gcagccccag tccgagcccg tccggcggca gttgcacggc cgcgccgagc 1140

tggagcgcga ccaccaccta cgccaccgcc ggcaccaagg tctcctggaa gggccactac 1200

tggaccaaca agtggtggac cctgaacgag gacccgacgc tcagcggcca gtggggcgtg 1260

tgggcggaca acggc 1275

Claims

1.一种甲壳素酶，其特征在于，所述的甲壳素酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)在1)的酶的序列上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白酶功能的酶。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因的编码权利要求1所述的甲壳素酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQID NO:2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中插入有权利要求2所述的基因。

5.一种转化体，其特征在于，所述的转化体携带有权利要求4所述的重组表达载体。

6.权利要求1所述的甲壳素酶在制备壳寡糖中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的壳寡糖为甲壳二糖。

8.一种制备甲壳二糖的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的甲壳素酶降解甲壳素来制备甲壳二糖。