CN107475273A

CN107475273A - 新几丁质酶p1724及其应用

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Publication number: CN107475273A
Application number: CN201710933796.XA
Authority: CN
Inventors: 代玉梅; 李艳; 杨凤; 张玲利; 刘晓风
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-10-10
Also published as: CN107475273B

Abstract

本发明属于转基因工程技术领域。目的是提供一个具有2个催化域，且在低温条件下有较高活性的几丁质酶。采用的技术方案是：从低温环境中富集和培养微生物群落、分析微生物群落元基因组、克隆几丁质酶P1724基因、构建重组菌、表达P1724蛋白、纯化HIS‑TAG，并鉴定重组蛋白作为几丁质酶的性质。本发明首次从环境中，通过宏基因方法，从未经分离微生物菌株中，直接获得了具有2个催化域的几丁质酶，且在低温条件下有较好的活性，应用过程中具有比中、高温酶的处理时间短、生产成本低、更加节约能源等优点，更适于工业生产，在工程应用中可以有较好的应用前景。

Description

新几丁质酶P1724及其应用

技术领域

本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及从青藏高原湿地环境微生物基因组中获得的低温几丁质酶P1724基因及其潜在的应用方法。

背景技术

几丁质又称为甲壳素、壳多糖,它是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的长链多聚物,也是自然界中第二丰富的多聚糖。每年自然界中产生的几丁质数量极其巨大，它及其降解产物作为重要的有机碳源和氮源参与生态系统的物质交换和能量流动。几丁质酶能催化分解几丁质,产生几丁寡糖和几丁二糖。几丁质酶的水解产物低聚糖有抗菌作用，可以调节生物体的免疫力，还可抑制肿瘤细胞的生长等。几丁质酶对植物真菌病害的防治也有作用。因此，几丁质酶在食品、医药、农业以及化妆品等行业具有独特的使用价值。

几丁质酶一般是多结构域(或多模块的)组装的，从N端到C端依次为信号肽(signal peptide)、催化结构域(catalytic domain)、碳水化合物结合模块(carbon-binding modules,CBM)以及一个短的C端区。催化域负责几丁质的水解,是几丁质酶真正起作用的部分。通常情况下，一个微生物酶只具有一个催化域，但少数微生物菌株被报道具有2个催化域几丁质酶。如Microbulbifer degradans 2-40株的几丁质酶ChiB含有2个催化域，且试验证明这两个催化域之间存在着协同作用。

2012年，研究曾发现具有杀狄斯瓦螨活性的几丁质酶ChiC1，并对其应用做了一定研究(CN 101613682B，2012.05.23)：研究人员从沙雷氏菌GEI Serratia marcescens GEI的基因组DNA中克隆出一段基因碱基序列，应用原核表达载体pET-32a(+)，在大肠杆菌中表达该基因，对该基因的编码蛋白进行纯化、复性、生物测定，试验结果表明：该蛋白对狄斯瓦螨具有毒性。

ChiC1为具有一个催化域，属中温酶，最适反应温度为37℃。重组蛋白几丁质酶ChiC1在大肠杆菌中是以不溶性的包涵体形式存在，而包涵体往往没有生物活性，需要对表达的重组蛋白进行复性。重组蛋白复性过程复杂、易受多方面因素影响，涉及试剂较贵，易影响工业生产稳定性、提高成本。

2014年，研究曾发现几丁质酶CHI-X及其编码基因(CN 103013957B，2014.07.02)：从冰鲜大黄鱼内容物里，通过稀释平板法分离得到柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)菌株P，从菌株P中发现一个具有几丁质酶功能的蛋白，将其命名为CHI-X蛋白。通过PCR方法，获得CHI-X基因，克隆到载体pET-28a上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，获得CHI-X重组蛋白，CHI-X蛋白最适的酶学反应温度为60℃。

CHI-X只具有一个催化域，且属高温酶。为维持CHI-X所需的较高反应温度，将消耗更多能源。故CHI-X不适于环境温度低于30℃的食品、生物防治等领域。

目前，拥有两个催化域，且在低温条件下有较高活性的几丁质酶，还几乎未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个具有2个催化域，且在低温条件下有较高活性的几丁质酶。

本发明实际和确认的技术方案是：

一种几丁质酶P1724基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1。

相应的具有上述基因的几丁质酶P1724，其核苷酸序列如SEQ ID NO1，氨基酸序列如SEQ ID NO 2。

所述几丁质酶P1724的应用，作用温度为4-37℃，环境pH 3.0-5.0。用于酶解胶体几丁质。优选酶解几丁质底物的作用温度为4-37℃，体系pH 3.0-5.0。最好是所述作用温度为30℃。更进一步，体系中加入有Mn2+，浓度为5mmol/L以上，促进酶解进行。

相应的，所述的几丁质酶P1724的制备方法：从环境中富集和培养微生物群落、分析微生物群落元基因组、克隆几丁质酶P1724基因、构建重组菌、表达P1724蛋白和纯化HIS-TAG后获得。

相应的，为得到本发明几丁质酶P1724用到的PCR扩增引物：P1724F_KpnI5’-CCGGGGTACCCACGTATCGGCAAATGAGAACT-3’和P1724R_BamHI5’-GCGCGGATCCCTATTCAAACTCAGCAAAAC-3’；以及含有本发明几丁质酶P1724基因，的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明具有如下有益效果：首次从环境中，通过宏基因方法，从未经分离微生物菌株中，直接获得了具有2个催化域的低温几丁质酶，且在低温条件下有较好的活性，应用过程中具有比中、高温酶(45-65℃)的处理时间短、生产成本低、更加节约能源等优点，更适于工业生产，在工程应用中可以有较好的应用前景。

附图说明

图1为P1724蛋白的一级结构示意图；

图2为大肠杆菌中诱导表达P1724蛋白的SDS-PAGE。其中：M为分子量标准，从上至下依次为150kD、100kD、80kD、60kD、40kD和30kD；1.为重组菌IPTG为诱导前的；2.为重组菌经过诱导的；

图3为纯化后P1724蛋白液的SDS-PAGE。其中：M为分子量标准，从上至下依次为150kD、100kD、80kD、60kD、40kD和30kD；1.为His-tag纯化后P1724蛋白；

图4为P1724蛋白作为几丁质酶的最适温度(A)及热稳定性(B)测定结果；

图5为P1724蛋白作为几丁质酶的最适pH(A)及pH稳定性(B)测定结果；

图6为不同试剂对P1724蛋白作为几丁质酶酶活的影响；

图7为N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线；

图8为酶解反应进程曲线；

图9为P1724动力学Lineweaver-Burk曲线。

具体实施方式

为优选出获取的具有2个催化域，且在低温条件下有较高活性的几丁质酶P1724的最佳技术参数，本发明经过多次反复试验，下面为具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果。

实施例一

配置微生物培养基

(1)按照表1、表2、表3、表4，配置微生物培养基，其中，表1中所述的溶液B为8g/L的K₂HPO₄。

表1 培养基成分表

序号	组成	体积/重量
			1	溶液A	50ml/L
2	溶液B	50ml/L
			3	微量金属溶液	10ml/L
4	沃尔夫维生素溶液	10ml/L
			5	酵母提取物	1g
6	刃天青(0.1％)	1ml/L

表2 溶液A成分表

表3 微量金属溶液成分表(100×)

序号	组成	重量(g/L)
			1	氨三乙酸	12.8
2	FeSO₄·7H₂O	0.42
			3	MnCl₂·4H₂O	0.1
4	CoCl₂·6H₂O	0.17
			5	CuCl₂·2H₂O	0.02
6	ZnSO₄·7H₂O	0.21
			7	Na₂MoO₄·2H₂O	0.01

表4 沃尔夫维生素溶液成分表(100×)

(2)将培养基煮沸，直至变成粉红色。

(3)在N₂/CO₂(80:20，v/v)下冷却。

(4)向培养基中加入3.52g/L NaHCO₃，pH约为7.0-7.2。如果不在此范围内，则用NaOH调节。在N₂/CO₂气体下将溶液分配到血清瓶中。

(4)通过高压灭菌灭菌。

(5)在室温下冷却。

(6)向10ml培养基中加入0.1ml还原剂(1％，v/v)。

(7)上述还原剂制备方法为：半胱氨酸/Na₂S溶液(每个1.25％)，在N₂下冲洗溶液20分钟，塞子，高压灭菌，冷却。

实施例二

富集微生物群落

(1)用所述微生物培养基将采自青藏高原的土壤调至含水量为90％的匀浆样品。

(2)将匀浆后的土壤样品放在厌氧瓶中用纯N₂置换瓶内空气，以建立一个厌氧环境。

(3)将样品置于4℃环境内24小时，以平衡气相与残留的氧气。

(4)在厌氧箱中将约50ml的混合均匀、厌氧条件的土壤匀浆样品与片状几丁质(0.8％，w/v)在100ml血清瓶中混合，充入适量的氮气，置于4℃培养。

(5)当厌氧瓶中的甲烷产量达到35％左右时，取出5ml培养液与新鲜的含有0.8％片状几丁质50ml培养混合，继续在4℃培养。

(6)以此方式传代3次，共计培养2年时间后，停止培养，将培养液离心，弃上清，沉淀留做下步的总DNA的提取。

实施例三

分析微生物群落元基因组

(1)用MOBIO公司的PowerSoil^TM DNA Isolation Kit对样品总DNA进行提取。元基因组测序模式主要采用Hiseq X-ten和150P。分析流程为得到下机原始数据后进行序列过滤、组装和基因及物种分类注释。进行基因序列的功能注释的数据库主要有COG、Uniprot、KEGG、eggNOG、EC等。CAZy注释是本发明涉及的最主要分析。主要的糖类降解酶(如纤维素酶、几丁质酶)属于GHs类。

(2)P1724基因的核苷酸序列：SEQ ID NO 1.

实施例四

克隆几丁质酶P1724基因

(1)设计PCR扩增引物P1724F_KpnI5’-CCGGGGTACCCACGTATCGGCAAATGAGAACT-3’和P1724R_BamHI5’-GCGCGGATCCCTA TTCAAACTCAGCAAAAC-3’，扩增出该基因的全长。

(2)上述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃30sec、60℃30sec、72℃2min，30个循环；最后在72℃下延伸5min。

(3)用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

(4)用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切载体pColdI，回收载体骨架(约4400bp)。

(5)将上述步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pColdI-P1724。

(6)根据上述测序结果，对重组质粒pColdI-P1724进行结构描述如下：在载体pColdI-P1724的KpnI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第1至1482位核苷酸所示的双链DNA分子，其中，插入的双链DNA分子的5’末端与载体上的His标签编码基因融合，以进行后续的蛋白纯化。

实施例五

重组菌的构建、P1724蛋白的表达和HIS-TAG纯化

(1)将重组质粒pColdI-P1724导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pColdI-P1724的大肠杆菌BL21(DE3)，命名为重组菌。

(2)挑取重组菌(表达含有His标签pColdI-P1724)的单克隆，接至含100μg/mL氨苄青霉素的3mL LB液体培养基，在37℃、200rpm的振荡中培养过夜。

(3)将上述菌液以1：100的体积比接种至3mL LB含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，在37℃、200rpm的振荡中培养至OD600达到0.6-0.8。

(4)取一部分上述菌液作为未诱导的对照，其它部分加入诱导剂IPTG至浓度为1mmo/L，15℃、200rpm振荡培养24小时。将上述未诱导的菌液和诱导的菌液离心，收集菌体进行SDS-PAGE，结果如图2所示，含有预期分子量约为100kD的蛋白条带。

(5)将上述(2)的菌液以1：100的体积比接种至1L LB含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600达到0.6-0.8；然后加入IPTG(诱导剂)至浓度为1mmo/L，15℃、200rpm振荡培养24小时。

(6)收集上述菌液至离心管中，4℃，4000g离心20min，弃上清，收集沉淀。

(7)向细菌沉淀按照每克细菌湿重加入4ml非变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。

(8)加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。

(9)冰上超声裂解细菌。超声功率300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。

(10)4℃ 10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。

(11)收集的上清液用碧云天生物技术公司的His标签蛋白纯化试剂盒(P2226)进行重组蛋白纯化，操作过程严格按照说明书进行操作。纯化后的重组蛋白溶液进行SDS-PAGE，获得100kD的蛋白条带(结果如图3所示)。

(12)P1724蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO 2.

实施例六

几丁质酶内切酶、外切酶活性鉴定

(1)利用Sigma公司的几丁质酶活荧光试剂盒(CS1030)进行测试，以4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide、4-Methylumbelliferyl N,N′-diacetyl-β-D-chitobioside和4-Methylumbelliferylβ-D-N,N′,N″-triacetylchitotriose为底物分别测试重组蛋白的几丁质外切酶、几丁二糖酶和几丁内切酶的活性。

(2)试验方法严格按试剂盒说明书进行。具体测试方法：酶液与以上三种为底物混合，在30℃、pH 3.0条件下反应1h，随后终止反应，在激发波长360nm，发射波长450nm的荧光条件下测其荧光值，然后(3)中的公式计算酶活，结果为2次重复取平均值。

(3)酶活计算公式为：

Units/ml＝(FLUsample-FLUblank)×1.9×0.3×DF/FLUstandard×time×Venv。其中FLUsample为样品的荧光值，FLUblank为空白对照的荧光值，0.3为添加终止液后的总体积，DF为稀释系数，FLUstandard为标准溶液的荧光值减去空白标准值，time为反应时间，Venz为测试样品的体积。以酶分钟产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的量为一个酶活性单位。结果为2次重复取平均值。

(4)试验结果为：该酶在30℃的几丁二糖酶、几丁内切酶的酶活和几丁质外切酶的酶活分别为1858.5U/mg、1996.6U/mg和2.7U/mg。结果表明：该酶在30℃具有较强的几丁二糖酶和几丁内切酶的活性，几丁质外切酶较低。

实施例七

最适反应温度测定

(1)利用Sigma公司的几丁质酶活荧光试剂盒，以4-Methylumbelliferylβ-D-N,N′,N″-triacetylchitotriose为底物，在反应温度分别为4℃、15℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃时，测试P1724的酶活性。结果为2次重复取平均值。

(2)结果如图4中的A图所示，反应温度为30℃时酶活最高。

(3)将上述最高酶活作为100％，计算出在反应温度分别为4℃、15℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃时，相对酶活依次为：41.3％、79.5％、84.6％、100％、26.6％、26.5％、19.0％、6.9％。

(4)结果表明：P1724蛋白作为几丁质酶的最适反应温度为30℃，在4℃时可保存40％的活性。

实施例八

热稳定性测定

(1)将P1724蛋白液分别在4℃、15℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃下预处理60分钟。

(2)利用Sigma公司的几丁质酶活荧光试剂盒，以4-Methylumbelliferylβ-D-N,N′,N″-triacetylchitotriose为底物，在30℃时，测试处理后P1724的酶活性。结果为2次重复取平均值。

(3)将不进行预处理的P1724蛋白液的酶活作为100％，计算采用各温度预处理的相对酶活(％)，结果如图4中的B图所示。

(4)结果表明：P1724蛋白在4℃、15℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃处理60min后，相对酶活依次为：86.7％、90.4％、90.3％、100％、98.8％、59.4％和0.7％。P1724蛋白在4-40℃的范围内稳定；温度≥50℃时，酶活急剧下降。

实施例九

最适反应pH测定

(1)反应温度为30℃，以4-Methylumbelliferylβ-D-N,N’,N”-triacetylchitotriose为底物，在pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的50mmol/L缓冲液中测定酶活。

(2)上述不同缓冲液分别为：pH＝2.0时，缓冲液为KCl-HCL,pH＝3.0-6.0时，缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠，pH＝7.0-9.0时，缓冲液为Tris–HCl。

(3)酶活计算公式为

(4)Units/ml＝(FLUsample-FLUblank)×1.9×0.3×DF/FLUstandard×time×Venv。其中FLUsample为样品的荧光值，FLUblank为空白对照的荧光值，0.3为添加终止液后的总体积，DF为稀释系数，FLUstandard为标准溶液的荧光值减去空白标准值，time为反应时间，Venz为测试样品的体积。以酶分钟产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的量为一个酶活性单位。根据酶在不同的pH值下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH值。结果为2次重复取平均值。

(5)pH＝3.0时酶活最高，将该最高酶活作为100％，计算其它反应温度下的相对酶活(％)，结果如图5中的A图所示。在反应pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9时，相对酶活依次为：78.3％、100％、90.9％、88.9％、82.4％、65.0％、42.0％、39.7％。结果表明：P1724蛋白作为几丁质酶的最适pH＝3.0，在pH＝3.0～5.0范围内活性较高，剩余几丁质酶酶活保持90％以上，为酸性酶。

实施例十

pH稳定性测定

(1)将P1724蛋白液与不同缓冲液按体积比1:10混合，4℃处理12小时。

(3)将上述预处理后的蛋白液透析后(透析方法：先将蛋白液放置在透析膜中，然后于1x PH7.0的PBS缓冲液中4℃透析过夜)，以4-Methylumbelliferylβ-D-N,N′,N″-triacetylchitotriose为底物，在30℃、pH 3.0条件下，方法同实施6的(2)，(3)。结果为2次重复取平均值。

(4)结果如图5中的B图所示。P1724蛋白保存于pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9时，相对酶活依次为：78.0％、100％、98.8％、98.8％、93.0％、91.4％、65.6％、61.6％。结果表明：P1724蛋白在pH 3.0-7.0范围内较稳定，剩余几丁质酶酶活保持90％以上，说明此酶在酸性及中性条件下具有较好的pH稳定性。

实施例十一

不同金属离子及相关化学试剂对酶活影响的测定

(1)以4-Methylumbelliferylβ-D-N,N′,N″-triacetylchitotriose为底物，在几丁质酶酶活测定的反应体系中加入不同试剂(详见表5)，检测不同试剂对P1724蛋白的几丁质酶酶活的影响,试剂在反应体系中终浓度为1mmol/L或5mmol/L。

表5 各试剂列表

序号	试剂
		1	CK(空白组)
2	NaCl
		3	CaCl₂
4	CuCl₂
		5	ZnCl₂
6	MgCl₂
		7	LiCl
8	BaCl₂
		9	MnC l₂

(2)以不加入试剂的反应体系作为对照(CK)。以CK处理组的酶活作为100％，计算各个处理组的相对酶活(％)。结果为2次重复取平均值。结果如图4所示：Na⁺、Ca⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、K⁺、Mg²⁺、Li⁺和Ba²⁺在1mmol/L和5mmol/L对P1724蛋白的几丁质酶酶活有明显的抑制作用，而Mn²⁺在2个浓度下都有激活作用，5mmol/L激活程度更高。

实施例十二

P1724蛋白作为几丁质酶对不同底物特异性的测定

(1)配置2uM/ml的N-乙酰-D-氨基葡萄糖母液，按照表6绘制NAG标准曲线，标准曲线如图7所示。

表6 N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线的制作

(2)样品处理：将20ul P1724蛋白液、180ul底物母液和200ul的PH3缓冲液混合。用到的底物母液为：1％的胶体几丁质、0.5％的微晶纤维素、pectin、壳聚糖、几丁质粉末。底物母液制备方法：将胶体几丁质用PBS稀释至1％，微晶纤维素、Pectin、壳聚糖及几丁质粉末用无菌水配制成浓度0.5％的溶液。

(3)缓冲混合获得的测试液振荡混均后于30℃水浴中反应30min，加入300ulDNS试剂，振荡混匀，沸水浴加热5min，冷却至室温，于分光光度计540nm处测定光吸收值。

(4)对照NAG标准曲线计算出还原糖含量，折算成酶活力单位，重复三次。酶活力定义为：在37℃反应条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。结果：P1724蛋白只对胶体几丁质溶液有降解作用，酶活为1.65U/mg，具有底物特异性强的特点。

实施例十三

P1724蛋白作为几丁质酶的动力学常数测定

(1)以胶体几丁质为底物，在30℃和pH＝3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，将20ulP1724蛋白液、180ul底物溶液和200ul的PH3缓冲液混合。将测试液振荡混均后于30℃水浴中反应30min，加入300ulDNS试剂，振荡混匀，沸水浴加热5min，冷却至室温，于分光光度计540nm处测定光吸收值。对照NAG标准曲线计算出还原糖含量，折算成酶活力单位，重复三次。

(2)依次在反应10min、20min、40min、60min、80min、100min、120min时终止酶活反应。如酶活性与反应时间的比值在某个时间段内不发生改变，则在该时间段内的酶促反应为一级反应，基于此来确定测Km和Vmax的反应的最佳时间。根据确定的一级反应时间，测定P1724的Km值及Vmax的反应时间为15min。一级反应时间的确定见图8，由原始数据及图中数据计算可以得出反应的初速度为259.65ug/ml·h。

(3)依次采用浓度分别为10g/L、8g/L、6g/L、4g/L、3g/L、2g/L的胶体几丁质溶液为底物：在30℃和pH＝3.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，将20ul P1724蛋白液、180ul底物溶液和200ul的PH3缓冲液混合。将测试液振荡混均后于30℃水浴中反应30min，加入300ulDNS试剂，振荡混匀，沸水浴加热5min，冷却至室温，于分光光度计540nm处测定光吸收值。对照NAG标准曲线计算出还原糖含量，折算成酶活力单位，重复三次。

(4)在反应时间＝40min时，分别通过上述不同的底物浓度[S]测定相对应的反应速度V，求出两者的倒数，以1/V对1/[S]作图，即采用米氏方程双倒数方法求得K_m值及V_max。计算方程为：1/V＝(K_m/V_max)×(1/[S])+1/V_max。最大反应速度及米氏常数Km的确定由图9(P1724动力学Lineweaver-Burk曲线)得出斜率为Km/Vm，Y轴截距为1/Vm其中[E]＝1.23mg/ml，结果为：P1724蛋白对胶体几丁质的K_m＝2.345mg/mL，V_max＝1.209mg/ml·h。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 新几丁质酶P1724及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2883

<212> DNA

<213> 人工序列( )

<400> 1

atgttagttc tacttgcctt cggtaataat cacgtatcgg caaatgagaa ctattcggct 60

agcgcagcct caacagaata ccggtgcatt gggtattatg catcatgggg aggatatgct 120

agaaacttcg caattgacaa ggtagattac tcgaaactta cacatctgaa ttttgcattt 180

gcaaacttga atgtagatgg atctgtagtg gtaggagatc catgggttga ctctcagatt 240

acttcaattt atccgaatgc cggcttcacc tgggaagacc aaagcaacaa cacagctggt 300

cactttggaa tgttaacaaa aattaaagaa gaatatccaa atctcaagac acttatttct 360

attggtggat ggacatggtc taaaaatttc tccgatgttg cggcagattc aaccaaactt 420

gagagaatgg ccaatactgc agttgatttc atcttgaaat atggatttga tggaattgat 480

atcgactggg agtaccctgt ggaaggtgga gacaatatta cacatcgtcc tagtgataaa 540

gataattatg tggagatggt taggctaatc agagcaaagc taaatgcaca gagtgcaata 600

gatggcaaga cctatttgct cactattgct gcacctgcaa gtcaatatta tgctaataat 660

attgatattt ctggtatgat gaattatctg gactggatta acctgatgac ctatgattat 720

catggtggat ttgatgcaac gactaaccat aacgcacctc tatacttaaa tcctaacgat 780

acaacaggtt ccaccttcag tattgatgca acagtgaatg catatattaa cggtggtgca 840

aatccacagg atctgaattt gggcttgcca tactatggcc gtgggtggat taatgtagct 900

gcaacaccag gcacagcatt gttccatagt ggatcaggta gcacatccat ggggatggac 960

agaggtactt gggaaggctc atcgtgggat tatggagata taaaagataa ttacatagga 1020

cagagaggtt atgtaagata ctgggacaat tacgcaaaat gcccatatct atatagcgaa 1080

cagacggatg tgtttattac atatgatgat ccggaatctt taggatacaa gattgattac 1140

ttaatcagta agaatcttgg cggagcaatg ttctgggagt gcagtgctga caaggagggc 1200

gatcttctgt catttactgc taataaatta ggaattaata atcaaggaac aacaccaacg 1260

gttgcaccaa cggtagcacc aacggtagca ccaaccgtag caccaaccgt agcaccaacg 1320

gtagcaccaa ccgtaacgcc aaccatagcg ccaaccataa caccgacaat cataccgact 1380

cctacaccaa tcgttgatga tgagattact gcatgggata ggaatgcgac ttatgtaaag 1440

gacgatcagg taagctataa tggaagtatt tataggtcta aatggtggac agtaggtaat 1500

gtaccagggg cagagcaatg gggaccatgg gaatatgtag gacaaatagg agtaacaaca 1560

ccgacaccta taccgacaat tgcaccaaca cctataccga caattgcacc aacagccaca 1620

cctataccga caattgcacc aacagccaca cctgtaccga caattgcacc aacagccaca 1680

ccaactccaa ctacagcgcc aacaccaacg ccaatcgttg atgatgattt tgctgcatgg 1740

gatagtaacg cgacttatgt aaagaacgat caggtaagct ataatggaag tatctataga 1800

gctaaatggt ggacattggg taatgtaccc ggaacagagc aatggggagt atgggaatat 1860

atgggcaaaa tagggggtgt aataccaaca ccaattccta caccgattcc aactccgata 1920

ccaacattga taccaacacc aacacctcca gcaggagacc ctacaccaac accaatacct 1980

acaggtgatt tgccaaccta cgttttgaca ggatattggc agaatttcaa taatggagca 2040

aaatgtttaa agattagcga ggtgcctgcc gattataata ttatttgtgt tgcttttgca 2100

gaagcaactg caacattggg tgaagtaaca tttaagttgg attctacttt aagttcatta 2160

ctgggtggat acacagaaac acagttcatt agcgatattg cagccgttca gtcaaagggg 2220

caaaaggtaa taatctcaat tggcggcgaa accggaacgg taagcgtaac taatgagaca 2280

caggcgaaca attttgctaa cagtgtatat gcgttaatga ccaaatacgg ttttgatgga 2340

gtagatatag atttagagca tggtattaat tctgtctata tggagtctgc acttcgcaaa 2400

ctgtataaca gggtgggctc ggatttgatt attacaatgg ctcctcagac tctggatatg 2460

caaaatacag gaacgcagta tttcaaatta gcagtagcta ttaaggatat tcttacggtc 2520

tgcaacacac agtattataa ttcgggtgca atgctaggat atgatggcaa agtatattca 2580

cagggcagtg cagatttctt aacagcgctt gcgacaatac tattagagaa tggtttgagg 2640

cctgatcaag taggccttgg agctccggca tccagtcggg gttcaagcag cggatacgtt 2700

gatccttcca ttgtttgtaa tgcattcagg agcttagcaa atggtacttc ttctggaagc 2760

tttactccac ctaaagcata tccaacccta agaggtatca tgacttggtc aatcaattgg 2820

gatgcctcca acaattataa tttctcgaat gcagtagatg cttgttttgc tgagtttgaa 2880

tag 2883

<210> 2

<211> 960

<212> PRT

<213> 人工序列( )

<400> 2

Met Leu Val Leu Leu Ala Phe Gly Asn Asn His Val Ser Ala Asn Glu

1 5 10 15

Asn Tyr Ser Ala Ser Ala Ala Ser Thr Glu Tyr Arg Cys Ile Gly Tyr

20 25 30

Tyr Ala Ser Trp Gly Gly Tyr Ala Arg Asn Phe Ala Ile Asp Lys Val

35 40 45

Asp Tyr Ser Lys Leu Thr His Leu Asn Phe Ala Phe Ala Asn Leu Asn

50 55 60

Val Asp Gly Ser Val Val Val Gly Asp Pro Trp Val Asp Ser Gln Ile

65 70 75 80

Thr Ser Ile Tyr Pro Asn Ala Gly Phe Thr Trp Glu Asp Gln Ser Asn

85 90 95

Asn Thr Ala Gly His Phe Gly Met Leu Thr Lys Ile Lys Glu Glu Tyr

100 105 110

Pro Asn Leu Lys Thr Leu Ile Ser Ile Gly Gly Trp Thr Trp Ser Lys

115 120 125

Asn Phe Ser Asp Val Ala Ala Asp Ser Thr Lys Leu Glu Arg Met Ala

130 135 140

Asn Thr Ala Val Asp Phe Ile Leu Lys Tyr Gly Phe Asp Gly Ile Asp

145 150 155 160

Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Val Glu Gly Gly Asp Asn Ile Thr His Arg

165 170 175

Pro Ser Asp Lys Asp Asn Tyr Val Glu Met Val Arg Leu Ile Arg Ala

180 185 190

Lys Leu Asn Ala Gln Ser Ala Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Thr

195 200 205

Ile Ala Ala Pro Ala Ser Gln Tyr Tyr Ala Asn Asn Ile Asp Ile Ser

210 215 220

Gly Met Met Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Asn Leu Met Thr Tyr Asp Tyr

225 230 235 240

His Gly Gly Phe Asp Ala Thr Thr Asn His Asn Ala Pro Leu Tyr Leu

245 250 255

Asn Pro Asn Asp Thr Thr Gly Ser Thr Phe Ser Ile Asp Ala Thr Val

260 265 270

Asn Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ala Asn Pro Gln Asp Leu Asn Leu Gly

275 280 285

Leu Pro Tyr Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Asn Val Ala Ala Thr Pro Gly

290 295 300

Thr Ala Leu Phe His Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Met Gly Met Asp

305 310 315 320

Arg Gly Thr Trp Glu Gly Ser Ser Trp Asp Tyr Gly Asp Ile Lys Asp

325 330 335

Asn Tyr Ile Gly Gln Arg Gly Tyr Val Arg Tyr Trp Asp Asn Tyr Ala

340 345 350

Lys Cys Pro Tyr Leu Tyr Ser Glu Gln Thr Asp Val Phe Ile Thr Tyr

355 360 365

Asp Asp Pro Glu Ser Leu Gly Tyr Lys Ile Asp Tyr Leu Ile Ser Lys

370 375 380

Asn Leu Gly Gly Ala Met Phe Trp Glu Cys Ser Ala Asp Lys Glu Gly

385 390 395 400

Asp Leu Leu Ser Phe Thr Ala Asn Lys Leu Gly Ile Asn Asn Gln Gly

405 410 415

Thr Thr Pro Thr Val Ala Pro Thr Val Ala Pro Thr Val Ala Pro Thr

420 425 430

Val Ala Pro Thr Val Ala Pro Thr Val Ala Pro Thr Val Thr Pro Thr

435 440 445

Ile Ala Pro Thr Ile Thr Pro Thr Ile Ile Pro Thr Pro Thr Pro Ile

450 455 460

Val Asp Asp Glu Ile Thr Ala Trp Asp Arg Asn Ala Thr Tyr Val Lys

465 470 475 480

Asp Asp Gln Val Ser Tyr Asn Gly Ser Ile Tyr Arg Ser Lys Trp Trp

485 490 495

Thr Val Gly Asn Val Pro Gly Ala Glu Gln Trp Gly Pro Trp Glu Tyr

500 505 510

Val Gly Gln Ile Gly Val Thr Thr Pro Thr Pro Ile Pro Thr Ile Ala

515 520 525

Pro Thr Pro Ile Pro Thr Ile Ala Pro Thr Ala Thr Pro Ile Pro Thr

530 535 540

Ile Ala Pro Thr Ala Thr Pro Val Pro Thr Ile Ala Pro Thr Ala Thr

545 550 555 560

Pro Thr Pro Thr Thr Ala Pro Thr Pro Thr Pro Ile Val Asp Asp Asp

565 570 575

Phe Ala Ala Trp Asp Ser Asn Ala Thr Tyr Val Lys Asn Asp Gln Val

580 585 590

Ser Tyr Asn Gly Ser Ile Tyr Arg Ala Lys Trp Trp Thr Leu Gly Asn

595 600 605

Val Pro Gly Thr Glu Gln Trp Gly Val Trp Glu Tyr Met Gly Lys Ile

610 615 620

Gly Gly Val Ile Pro Thr Pro Ile Pro Thr Pro Ile Pro Thr Pro Ile

625 630 635 640

Pro Thr Leu Ile Pro Thr Pro Thr Pro Pro Ala Gly Asp Pro Thr Pro

645 650 655

Thr Pro Ile Pro Thr Gly Asp Leu Pro Thr Tyr Val Leu Thr Gly Tyr

660 665 670

Trp Gln Asn Phe Asn Asn Gly Ala Lys Cys Leu Lys Ile Ser Glu Val

675 680 685

Pro Ala Asp Tyr Asn Ile Ile Cys Val Ala Phe Ala Glu Ala Thr Ala

690 695 700

Thr Leu Gly Glu Val Thr Phe Lys Leu Asp Ser Thr Leu Ser Ser Leu

705 710 715 720

Leu Gly Gly Tyr Thr Glu Thr Gln Phe Ile Ser Asp Ile Ala Ala Val

725 730 735

Gln Ser Lys Gly Gln Lys Val Ile Ile Ser Ile Gly Gly Glu Thr Gly

740 745 750

Thr Val Ser Val Thr Asn Glu Thr Gln Ala Asn Asn Phe Ala Asn Ser

755 760 765

Val Tyr Ala Leu Met Thr Lys Tyr Gly Phe Asp Gly Val Asp Ile Asp

770 775 780

Leu Glu His Gly Ile Asn Ser Val Tyr Met Glu Ser Ala Leu Arg Lys

785 790 795 800

Leu Tyr Asn Arg Val Gly Ser Asp Leu Ile Ile Thr Met Ala Pro Gln

805 810 815

Thr Leu Asp Met Gln Asn Thr Gly Thr Gln Tyr Phe Lys Leu Ala Val

820 825 830

Ala Ile Lys Asp Ile Leu Thr Val Cys Asn Thr Gln Tyr Tyr Asn Ser

835 840 845

Gly Ala Met Leu Gly Tyr Asp Gly Lys Val Tyr Ser Gln Gly Ser Ala

850 855 860

Asp Phe Leu Thr Ala Leu Ala Thr Ile Leu Leu Glu Asn Gly Leu Arg

865 870 875 880

Pro Asp Gln Val Gly Leu Gly Ala Pro Ala Ser Ser Arg Gly Ser Ser

885 890 895

Ser Gly Tyr Val Asp Pro Ser Ile Val Cys Asn Ala Phe Arg Ser Leu

900 905 910

Ala Asn Gly Thr Ser Ser Gly Ser Phe Thr Pro Pro Lys Ala Tyr Pro

915 920 925

Thr Leu Arg Gly Ile Met Thr Trp Ser Ile Asn Trp Asp Ala Ser Asn

930 935 940

Asn Tyr Asn Phe Ser Asn Ala Val Asp Ala Cys Phe Ala Glu Phe Glu

945 950 955 960

Claims

1.一种几丁质酶P1724基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO 1。

2.一种几丁质酶P1724，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO1，氨基酸序列如SEQID NO 2。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的几丁质酶P1724作用温度为4-37℃，环境pH 3.0-5.0。

4.根据权利要求2所述的几丁质酶P1724，在酶解几丁质中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：酶解几丁质底物的作用温度为4-37℃，体系pH 3.0-5.0。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述作用温度为30℃。

7.根据权利要求4或5或6所述的应用，其特征在于：体系中加入有Mn²⁺，浓度为5mmol/L以上。

8.根据权利要求2所述的几丁质酶P1724的制备方法，从环境中富集和培养微生物群落、分析微生物群落元基因组、克隆几丁质酶P1724基因、构建重组菌、表达P1724蛋白和纯化HIS-TAG后获得。

9.为得到权利要求2-8任意一项所述的几丁质酶P1724用到的PCR扩增引物：P1724F_KpnI5’-CCGGGGTACCCACGTATCGGCAAATGAGAACT-3’和P1724R_BamHI5’-GCGCGGATCCCTATTCAAACTCAGCAAAAC-3’。

10.含有权利要求1-8所述的几丁质酶P1724基因，的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。