CN107137440A - 一种抗肿瘤组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种抗肿瘤组合物及其制备方法和应用,属于抗肿瘤药物技术领域,该组合物由β‑葡萄糖苷酶降解三七总皂苷提取物而得。本发明提供的制备方法反应条件温和、副产物少、工艺操作简单,产品成分明确、质量可控。所制得的三七总皂苷转化物对乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌等肿瘤增殖的抑制作用明显优于三七总皂苷提取物。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物技术领域,尤其涉及一种利用极耐热糖苷酶制备的抗肿瘤组合物及其制备方法和应用。
背景技术
三七为五加科人参属植物,是我国名贵中药材,根茎入药,有散瘀止血,消肿止痛的功能。皂苷是三七的主要有效成分,迄今为止,已从三七的不同部位分离得到70余种单体皂苷,包括人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rg1和三七皂苷R1等。其中,人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1为三七总皂苷的主要成分。这三种成分在抗疲劳、维持血液循环、改善心肌缺血、抗心律失常、镇静、抗衰老及抗肿瘤等方面均显示出一定的药理作用。
三七总皂苷的抗肿瘤作用具有高效、低毒、多靶点等特点。其中,人参皂苷Rb1具有抗疲劳、舒张血管、提高免疫力等活性;人参皂苷Rg1具有抗衰老、防止动脉粥样硬化、提高免疫力等活性;三七皂苷R1具有心血管保护、神经保护、改善微循环等活性;人参皂苷Rg3对肝癌、结肠癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、白血病等具有显著的抑制作用,并且大量研究表明,Rg3是最具开发潜力的人参皂苷类抗肿瘤化合物;人参皂苷Rh1对肝癌、结肠癌、神经胶质瘤、卵巢癌、白血病等具有抑制作用;人参皂苷CK对肺癌、膀胱癌、慢性粒细胞白血病、胃癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、大肠癌、脊髓瘤、结肠癌等具有抑制作用。经不同的糖苷酶水解,人参皂苷和三七皂苷可以转化为其相同母核的不同糖苷形式。因此,可以以功能为导向,定向水解三七皂苷主要成分母核的糖苷,制备抗肿瘤活性更强的三七皂苷提取物精深加工产品。
对于皂苷类物质的转化,有化学转化法和生物转化法。化学转化法因其反应剧烈、选择性差、副产物多等缺点而不被采用。生物转化具有反应条件温和,特异性好、分离纯化容易等特点,而受到青睐。由于三七总皂苷成分中主要包含葡萄糖苷(Rb1,Rg1和R1等),因此,通过筛选葡萄糖苷酶有望实现三七总皂苷的去糖基转化。目前皂苷类物质的生物转化主要有微生物转化法和酶转化法,但还存在以下缺点:(1)通常是针对某一种皂苷进行微生物或酶的转化,还没有通过一种生物酶同时定向水解三七皂苷中富含的数种皂苷;(2)还没有以抗肿瘤的功能为导向,制备抗肿瘤活性更强的三七皂苷提取物的精深加工产品。(3)采用的生物酶活力、专一性、酶学特性还不能适应规模化、低成本的实际应用。因此,以功能为导向,利用酶学特性优异的生物酶对三七皂苷提取物进行精深加工意义重大,将显著提升三七及其提取物的附加值,拓宽和增强三七及其提取物在抗肿瘤方面的应用。
发明内容
解决的技术问题:针对上述现有技术缺陷和空白,本发明提供了一种抗肿瘤组合物及其制备方法和应用。
技术方案:一种抗肿瘤组合物,由β-葡萄糖苷酶降解三七总皂苷提取物而得。
上述β-葡萄糖苷酶来源于黑曲霉、里氏木霉、嗜热菌来源的微生物及其基因重组菌。
β-葡萄糖苷酶降解三七总皂苷提取物的转化条件为:底物浓度0.05-50mg/mL,β-葡萄糖苷酶用量为1~50U/mg,反应温度为30~95℃,反应2~4h。
上述抗肿瘤组合物在制备治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌或肝癌药物中的应用。
一种抗癌药物,有效成分为上述的抗肿瘤组合物。
有益效果:本发明提供了一种反应条件温和、副产物少、工艺操作简单的三七总皂苷精深加工的生物制备方法,产品成分明确、质量可控。创制了一种抗肿瘤功效显著的三七总皂苷精深加工产品。本发明的三七总皂苷转化物对乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌等肿瘤增殖的抑制作用明显优于三七总皂苷提取物。
附图说明
图1:三七皂苷R1结构式图;
图2:人参皂苷Rb1、Rg1、20-Rg3、Rh1结构式图;
图3:三七总皂苷提取物HPLC图谱;
图4:三七总皂苷提取物转化产物的HPLC图谱;
图5:三七总皂苷转化前后抗肿瘤活性比较图;
图6:三七总皂苷转化产物促进肿瘤细胞的凋亡图;
图7:三七总皂苷转化产物抑制AKT的磷酸化图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的目的在于提供一种提高三七总皂苷抗肿瘤活性的生物酶转化法,该方法将β-葡萄糖苷酶用于三七总皂苷中数种主要皂苷的去糖基转化,提高三七总皂苷对乳腺癌、肝癌、结肠癌和肺癌的增殖抑制作用。
本发明分为三步:筛选、利用特异性强、酶学特性优异的葡萄糖苷酶同时定向水解三七总皂苷提取物;优化、建立适宜的以功能为导向的产品制备工艺;将转化产品应用于肿瘤细胞的抑制。
本发明选用的β-葡萄糖苷酶能将人参皂苷Rb1、Rg1和三七总皂苷R1完全转化(利用的三七总皂苷材料中,人参皂苷Rb1的含量为30~45%,Rg1的含量为35~47%,三七皂苷R1含量为10%左右。)在本发明的实施例中,三七总皂苷纯度为98wt.%以上,其中人参皂苷Rb1含量为38.7wt.%,Rg1含量为40.5wt.%,三七皂苷R1含量为10.7wt.%。
本发明的三七总皂苷的转化条件为:底物浓度0.05-50mg/mL,β-葡萄糖苷酶用量为1~50U/mg,反应温度为30~95℃,反应2~4h的情况下,Rb1、Rg1和R1的转化率分别为90~100%、60~100%、70~100%。
在本发明的实施例中,三七总皂苷的剂量设置如下:50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL,300μg/mL,400μg/mL,600μg/mL,700μg/mL,800μg/mL。
在本发明实施例中,经葡萄糖苷酶转化后,三七总皂苷的抗肿瘤活性得到显著提高;三七总皂苷的转化产物能够诱导肿瘤细胞凋亡,并导致Caspase 3的剪切;另外,三七总皂苷的转化产物能够抑制AKT的磷酸化,进而阻断AKT相关增殖信号通路的活化。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1:
1.实验目的
比较不同来源β-葡萄糖苷酶对三七总皂苷的转化情况,筛选出特异性强、酶学特性优异、同时定向水解三七总皂苷提取物中三种主要皂苷,并能显著提升转化产品抗肿瘤活性的β-葡萄糖苷酶。
2.实验材料
2.1受试药品
三七总皂苷:纯度≥98%,购于成都曼思特生物科技有限公司.
2.2重组葡萄糖苷酶(均为本实验室构建的三种不同来源的β-葡萄糖苷酶)
GH3Thermotoga petrophila RKU-1(下面简称Tpebgl3);
GH3Thermotoga thermarum DSM 5069;
GH3Aspergillus niger NL-1。
2.3细胞
小鼠乳腺癌细胞4T1,人乳腺癌细胞MCF-7,小鼠结肠癌细胞CT26,人肝癌细胞HepG2,人肺癌细胞A549均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。选用DMEM(含10%胎牛血清)培养基,于37℃、5%CO2条件下培养。
3.实验方案
3.1糖苷酶的制备
3.1.1原核表达体系构建
将重组基因工程菌划线于LB平板(Kan或Amp抗性)上进行活化,37℃培养1d,至长出单菌落后接种于4mL LB液体培养基中,于37℃,180r/min摇床培养8h,接种至150mLLB液体培养基中于30℃,180r/min摇床培养,10h后离心收集菌体。
3.1.3重组酶的纯化
A.样品收集
(1)收集菌体,在5000×g,4℃离心20min,收集细胞;
(2)用30mL,pH 7.5,TE buffer重悬细胞,在按上步骤离心;
(3)用4mL 1×Binding buffer重悬细胞,再用超声波破碎;
(4)再加8mL的1×Binding buffer,在12000×g离心10min,取上清。
嗜热菌来源的糖苷酶预处理:将菌体离心回收,加入50mL 1×Binding buffer重悬,超声波破碎,随后80℃热处理30min,对蛋白进行初步纯化。
B.装柱
(1)用适量无菌水洗镍柱;
(2)用适量的1×charging buffer洗柱子;
(3)用适量1×Binding buffer洗柱子。.
C.上样
(1)将含有目的蛋白的样品液过膜后上样;
(2)用10mM咪唑缓冲液平衡柱子;
(3)用不同浓度咪唑缓冲液进行梯度洗脱,分段收集洗脱液,留下目的蛋白较纯的部分。
D.清洗
(1)用适量1×Strip buffer洗柱子;
(2)用适量无菌水洗柱子;
(3)加入适量无菌水,盖上上下帽盖。
对于嗜热菌来源的通过热处理和镍柱两步纯化,获得电泳纯重组蛋白,比酶活提高了6.1倍,得率为50%。
3.2三七总皂苷的转化产物制备
取500mg三七总皂苷,溶于3mL蒸馏水中,加入5mL Tpebgl3酶(100U/mL)于85℃水浴中反应2h。
称取预处理好的HPD 400树脂20g,湿法装填于直径10mm,高300mm的吸附柱。将三七总皂苷溶液稀释到10mg/mL,过滤去掉沉淀物,得到上柱液。然后以每1mL/min的速度上柱,再分别用蒸馏水洗涤和50mL 80%乙醇洗脱。洗脱液经浓缩后,干燥得到产品。
3.3体外抗肿瘤活性检测
在96孔板中每孔接种3000个细胞,放入37℃培养,待细胞贴壁6h后,每孔加入不同浓度的三七总皂苷培养72h,于实验终点前4h向每孔加入20μL MTT(4mg/mL),实验终点时取出96孔板,于1000×g离心,然后吸去上清,加入200μL DMSO,570nm处测吸光值。根据以下公式计算待测样品对肿瘤细胞体外增殖的抑制率:
抑制率=[100-(OD570(实验孔)-OD570(空白对照))/(OD(不加药对照空)-OD570(空白对照)×100]%
4.实验结果
4.1三七总皂苷主要有效成分的含量
参照2015版《中国药典》中三七总皂苷的含量测定方法,分别检测并计算三七总皂苷中各主要成分含量,人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1的含量分别为38.7%,40.5%和10.7%三七总皂苷提取物原料HPLC图谱如图3所示。
4.2三七总皂苷经葡萄糖苷酶Tpebgl3转化后成分的变化
选取本实验室构建的三种性能优良的3种葡萄糖苷酶分别对三七总皂苷进行转化,结果显示葡萄糖苷酶Tpebgl3(基因来源于GH3Thermotoga petrophila RKU-1的大肠杆菌重组菌)的转化效果最好,Rb1、Rg1和R1能被完全转化。转化前样品、经Tpebgl3转化后产物HPLC图谱分别见图3、图4.
4.3三七总皂苷经葡萄糖苷酶Tpebgl3转化后抗肿瘤活性的变化
按照上述方法,对500mg三七总皂苷进行转化,获得转化产物。分别比较三七总皂苷经酶转化前后的体外抗肿瘤活性,结果如图5所示。三七总皂苷对小鼠乳腺癌细胞4T1、人乳腺癌细胞MCF-7、小鼠结肠癌细胞CT26、肝癌HepG2和肺癌细胞A549的IC50分别为204μg/mL、681μg/mL、258μg/mL、334μg/mL和>1600μg/mL。三七总皂苷经Tpebgl3转化后,对4T1、MCF-7、CT26、HepG2和A549细胞的IC50分别为132μg/mL、243μg/mL、166μg/mL、251μg/mL和681μg/mL,均显著低于未经酶转化的结果。其中,三七总皂苷本身并未显示出对A549细胞的抑制作用,而经酶转化后,在800μg/mL的剂量下对A549细胞的体外增殖抑制率可达94.5%。
实施例2
1.实验目的
三七总皂苷转化产物作用肿瘤细胞的凋亡检测及免疫印迹分析
2.实验材料
2.1受试药品
实施例1中提到的三七总皂苷经葡萄糖苷酶Tpebgl3处理后的转化产物。
2.2细胞
小鼠乳腺癌细胞4T1,培养方法见实施例1中2.3。
3.实验方案
3.1凋亡检测
细胞(约1×106个)悬液转入流式细胞仪管,4℃,1000rpm离心5min,收集细胞。弃上清后,加入200μL binding buffer(10mM HEPES,pH 7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2),混匀后分别加入1.25μL Annexin V溶液(1μg/mL)和2μL PI溶液(碘化丙啶,100μg/mL PI,20mM HEPES,pH 7.4),室温避光共孵20min后再加入300μL binding buffer,用流式细胞仪测定FL-1和FL-3通道的荧光,数据收集使用CellQuest软件(BD ImmunocytometrySystems),数据分析使用FlowJo软件。
3.2免疫印迹分析(Western blotting)
取细胞(约1×106个)用150μL的裂解液(10mM HEPES,2mM EDTA,0.1%CHAPS,5mMDTT和1mM PMSF)裂解。冰浴0.5h,离心12000g,2min,4℃,取上清。用BCATM蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。根据制备10%的SDS-PAGE胶,以50μg的蛋白量上样,4℃低温下电泳,恒定电流20mA,时间为1h。电泳结束后,用湿转法将胶上的蛋白转至PVDF膜。转移完后,将膜放在blocking buffer(2%free fat milk,10mM Tris-Cl,50mM NaCl,0.1%Tween 20,pH 7.4)中室温孵育2h封闭PVDF膜上没有蛋白的区域,根据蛋白预染Ladder的指示位置将膜剪成所需大小,与所需的一抗在4℃转炉上孵育过夜。次日将膜放在washingbuffer(10mM Tris-Cl,50mM NaCl,0.1%Tween 20,pH 7.4)中轻轻振荡洗涤三次,第一、二次5min,第三次10min,去除非特异性结合的一抗。然后与适当稀释的二抗共孵,室温1.5h。最后,用washingbuffer洗涤膜去除非特异性结合的二抗,与底物共孵适当的时间,通过化学成像仪曝光并拍照。
4.实验结果
4.1三七总皂苷转化产物能够诱导肿瘤细胞凋亡
凋亡是清除肿瘤细胞的一个主要机制,它不会给正常的细胞或周边组织带来损伤。为了探究三七总皂苷转化产物的抗肿瘤作用机制,我们通过Annexin V和PI双染的方法,考察三七总皂苷转化产物对乳腺癌细胞4T1的促凋亡作用。结果如图6所示,三七总皂苷转化产物能够时间和剂量依赖性地诱导肿瘤细胞的凋亡,在200μg/mL的浓度下与4T1细胞共孵48h导致47%的细胞凋亡。同时,我们考察了三七总皂苷转化产物与4T1共孵24h后与凋亡启动相关蛋白的表达情况,结果显示,三七总皂苷转化产物能够导致Caspase 3的剪切。
4.2三七总皂苷转化产物能够抑制AKT的磷酸化
PI3K/AKT信号通路是人类肿瘤,包括乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌等中,最常见的被活化的通路,可以造成凋亡抵抗。激酶AKT的473位丝氨酸(Ser)的磷酸化对于AKT最大程度的活化是必须的。AKT不仅可以抑制凋亡,也是促进增殖信号的关键分子。如图7所示,通过考察,我们发现,三七总皂苷的转化产物能够抑制AKT的磷酸化,因此,其抗肿瘤活性可能是通过对AKT通路的阻断作用实现的。
结论
本发明实施例公开了一种葡萄糖苷酶在提高三七总皂苷抗肿瘤活性的生物催化转化中的应用。该酶在水相体系,底物浓度为10mg/mL,葡萄糖苷酶用量为1~10U/mL,温度为85℃,反应2~4h后,可让三七总皂苷中的Rb1、Rg1和R1等物质实现转化。三七总皂苷转化产物在Rb1、Rg1和R1的转化率为100%的情况下,对小鼠乳腺癌细胞4T1、人乳腺癌细胞MCF-7、小鼠结肠癌细胞CT26、肝癌HepG2和肺癌细胞A549的IC50分别为132μg/mL、243μg/mL、166μg/mL、251μg/mL和681μg/mL,均显著低于未经酶转化的三七总皂苷。三七总皂苷的转化产物能够诱导肿瘤细胞的凋亡,导致Caspase 3的剪切,可以抑制AKT的磷酸化,进而抑制AKT相关增殖信号通路的活化,最终实现对肿瘤的抑制作用。本发明提供的三七总皂苷酶转化技术操作简单,有利于三七总皂苷在抗肿瘤防治上的推广与应用,同时为三七总皂苷在抗疲劳、防治心脑血管等疾病中的应用提供了一种方法。
以上仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种抗肿瘤组合物,其特征在于由β-葡萄糖苷酶降解三七总皂苷提取物而得。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤组合物,其特征在于所述β-葡萄糖苷酶来源于黑曲霉、里氏木霉、嗜热菌来源的微生物及其基因重组菌。
3.权利要求1所述抗肿瘤组合物的制备方法,其特征在于β-葡萄糖苷酶降解三七总皂苷提取物的转化条件为:底物浓度0.05-50 mg/mL,β-葡萄糖苷酶用量为1~50 U/mg,反应温度为30~95℃,反应2~4 h。
4.权利要求1或2所述抗肿瘤组合物在制备治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌或肝癌药物中的应用。
5.一种抗癌药物,其特征在于有效成分为权利要求1或2所述的抗肿瘤组合物。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170908 |
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