CN116064453A - 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种α‑1,2‑岩藻糖基转移酶突变体及其制备方法和在制备岩藻糖基低聚糖中的用途，尤其是在制备2’‑岩藻糖基乳糖中的用途，对2’‑岩藻糖基乳糖的生物合成具有重要意义，适合工业化生产的需要，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其制备方法和在制备岩藻糖基低聚糖中的用途。
背景技术
母乳低聚糖(HMOs)是母乳中除乳糖和脂类物质之外占比最多的组分，HMOs成分复杂，目前已知有200多种成分，在构建新生儿肠道菌群、调节新生儿肠道功能中起着重要作用。但天然的HMOs难以大规模量产，同时现部分国家和地区批准应用于婴幼儿配方食品的组分主要是2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和乳糖-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose)。其中2’-FL的合成研究相对透彻，而生物合成则凭着成本低、工艺简单，安全性高等诸多优势成为主要选择。
目前为工业化生产2’-FL存在多种开发策略，相较于酶催化或化学酶合成，使用基因工程微生物全细胞合成2’-FL的方式显然是最优的选择。在可能影响2’-FL合成效率的各种因素中，α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化性能和有效表达对于2’-FL生物合成途径非常关键。2’-FL的从头合成途径或是补救合成途径都必须借由该酶将GDP-L-岩藻糖和乳糖为底物合成2’-FL。寻找在生产菌株中具有足够活性的α-1,2-岩藻糖基转移酶不仅能够有效催化岩藻糖基转移到受体乳糖上，而且有足够高的转化效率维持底物GDP-L-岩藻糖保持在较低浓度，避免GDP-L-岩藻糖对2-FL前半部分的合成通路形成负反馈抑制。
α-1,2-岩藻糖基转移酶是目前用于2’-FL生物合成的关键酶，2’-FL的从头合成途径或是补救合成途径都必须藉由该酶将GDP-L-岩藻糖以乳糖为底物合成2’-FL。自2006年起首次在大肠杆菌中表达了来源于幽门螺杆菌Helicobacter pylori NCTC11639的α-1,2-岩藻糖基转移酶(FutC)以来便广泛应用于2’-FL的生物合成。后续虽然发现多种α-1,2-岩藻糖基转移酶，但结果仍显示FutC对2’-FL和生物合成效率最高。
由于野生型FutC来源于幽门螺杆菌，其在大肠杆菌中异源表达往往会导致低溶解度蛋白表达和酶活性降低，这对工业化生产2’-FL来说无疑是需要改进的缺点。因此为了增强其在大肠杆菌中的催化效率，需要对现有的蛋白进行改造，进一步提升2’-FL产量。
发明内容
发明要解决的问题
以目前已知的2’-FL合成通路中，α-1,2-岩藻糖基转移酶的参与是必须步骤，其功能直接影响了最终产物的产量，而现有的改进方法包括增强FutC的表达、密码子优化、寻求不同来源的替代酶都未取得令人满意的效果。例如通过融合伴侣如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6xHis标记的前肽序列和硫氧还蛋白肽(Trx)连接在异源岩藻糖基转移酶的N端，以增强在大肠杆菌中的可溶性表达，但由于它们尺寸大，融合伴侣通常也具有固有的特性来干扰靶蛋白的结构和功能；例如在FutC的N-末端添加三个天冬氨酸分子，简单的氨基酸标签不仅促进其融合伴侣的纯化，而且以较低的代谢负担提高了溶解性，但工程化发酵所得到的2’-FL滴度仍然不足以工业生产。因此需要对现有的FutC进行蛋白突变筛选，从而提升2’-FL产量。
用于解决问题的方案
本发明提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：
(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶相比，所述突变体包括如下突变位点中的一个或多个：
T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S；
(b)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、添加或其任意组合的氨基酸序列，所述置换是保守置换；和
(c)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
优选地，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意一个；
或为T38S和S43N；
或为T38S、S43N和A79G；
或为T38S、S43N、A79G和L207I；
或为T38S、S43N、A79G、L207I和T210C；
或为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S；
或为L207I、T210C和Q239S；
或为T38S、L207I、T210C和Q239S；
或为S43N、L207I、T210C和Q239S；
或为A79G、L207I、T210C和Q239S；
或为T38S、S43N、L207I、T210C和Q239S；
或为S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S；
或为T38S、A79G、L207I、T210C和Q239S。
本发明提供一种编码上述突变体的核酸。
本发明提供一种载体，所述载体包含编码上述突变体的核酸。
本发明提供一种包含上述编码α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的核酸或上述载体的重组工程菌或重组工程细胞。
本发明提供一种制备上述突变体的方法，其特征在于，包括：培养上述重组工程菌或重组工程细胞，诱导所述突变体的表达。
本发明提供一种生物制剂，其特征在于，包括：上述突变体、上述核酸，上述载体，上述重组工程菌或上述制备方法制得的产物。
本发明提供上述突变体、上述核酸、上述载体、上述重组工程菌或重组工程细胞、上述制备方法制得的产物或上述生物制剂在制备岩藻糖基低聚糖中的应用；
优选地，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、双岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻四糖、乳-N-岩藻五糖I和乳-N-二岩藻六塘I；
更优选地，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖。
本发明提供一种体外酶法制备岩藻糖基低聚糖的方法，所述方法包括：
(1)提供上述α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体；
(2)提供供体底物和受体底物，在允许生产所述岩藻糖基低聚糖的适宜营养条件、以及允许α-1,2-岩藻糖基转移酶表达的条件下，培养宿主细胞，使步骤(1)中的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体与所述供体底物和受体底物接触，制备所述岩藻糖基低聚糖；
优选地，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、双岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻四糖、乳-N-岩藻五糖I和乳-N-二岩藻六塘I；
更优选地，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖。
本发明提供上述突变体、上述核酸、上述载体、上述重组工程菌或重组工程细胞、上述制备方法制得的产物或上述生物制剂在制备食品或保健品中的应用。
发明的效果
本发明人经过大量实践研究，利用基因定向诱变技术，对幽门螺杆菌Helicobacter pylori NCTC11639来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶进行改造，从而显著改善了酶的活性，得到的突变体对于天然底物乳糖的催化活力提高，对2’-岩藻糖基乳糖的生物合成具有重要意义，适合工业化生产的需要，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：构建质粒BCGF-pET28a(+)图谱。
图2：构建质粒FutC.A.pRD图谱。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
本发明提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：
(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶相比，所述突变体包括如下突变位点中的一个或多个：
T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S；
(b)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、添加或其任意组合的氨基酸序列，所述置换是保守置换；和
(c)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，(b)中经过一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、添加或其任意组合的氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有相同或相似的功能。
在一些实施方式中，(c)中与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，(c)中得到的氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有相同或相似的功能。
SEQ ID NO:1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶氨基酸序列：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意一个。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意两个。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意三个。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意四个。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意五个。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意六个。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S。
SEQ ID NO:2所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体氨基酸序列T38S：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDISSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为S43N。
SEQ ID NO:3所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体氨基酸序列S43N：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWNDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为A79G。
SEQ ID NO:4所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体氨基酸序列A79G：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDGLKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为L207I。
SEQ ID NO:5所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体氨基酸序列L207I：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDIEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为T210C。
SEQ ID NO:6所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体氨基酸序列T210C：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFCQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为Q239S。
SEQ ID NO:7所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体氨基酸序列Q239S：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMSSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S和S43N。
SEQ ID NO:8所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体氨基酸序列T38S和S43N：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDISSFDWNDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N和A79G。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G和L207I。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I和T210C。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S。
在一些实施方式中，所述突变位点为L207I、T210C和Q239S。
SEQ ID NO:9所示的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体氨基酸序列L207I、T210C和Q239S：
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDIEFCQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMSSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA*
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、L207I、T210C和Q239S。
在一些实施方式中，所述突变位点为S43N、L207I、T210C和Q239S。
在一些实施方式中，所述突变位点为A79G、L207I、T210C和Q239S。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、S43N、L207I、T210C和Q239S。
在一些实施方式中，所述突变位点为S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S。
在一些实施方式中，所述突变位点为T38S、A79G、L207I、T210C和Q239S。
本发明提供一种编码上述突变体的核酸。
本发明提供一种载体，所述载体包含编码上述突变体的核酸。
本发明提供一种包含上述编码α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的核酸或上述载体的重组工程菌或重组工程细胞。
本发明提供一种制备上述突变体的方法，其特征在于，包括：培养上述重组工程菌或重组工程细胞，诱导所述突变体的表达。
本发明提供一种生物制剂，其特征在于，包括：上述突变体、上述核酸，上述载体，上述重组工程菌或上述制备方法制得的产物。
本发明提供上述突变体、上述核酸、上述载体、上述重组工程菌或重组工程细胞、上述制备方法制得的产物或上述生物制剂在制备岩藻糖基低聚糖中的应用；
在一些实施方式中，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、双岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻四糖、乳-N-岩藻五糖I和乳-N-二岩藻六塘I；
在一些实施方式中，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖。
本发明提供一种体外酶法制备岩藻糖基低聚糖的方法，所述方法包括：
(1)提供上述α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体；
(2)提供供体底物和受体底物，在允许生产所述岩藻糖基低聚糖的适宜营养条件、以及允许α-1,2-岩藻糖基转移酶表达的条件下，培养宿主细胞，使步骤(1)中的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体与所述供体底物和受体底物接触，制备所述岩藻糖基低聚糖；
在一些实施方式中，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、双岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻四糖、乳-N-岩藻五糖I和乳-N-二岩藻六塘I；
在一些实施方式中，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖。
本发明提供上述突变体、上述核酸、上述载体、上述重组工程菌或重组工程细胞、上述制备方法制得的产物或上述生物制剂在制备食品或保健品中的应用。
术语解释：
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
本发明所用的氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.Chem,1968,243,3558.中所述。
术语“保守置换”，指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
以上对本发明的涉及的术语进行了定义，本领域技术人员还可以结合现有技术对以上术语进行理解，以下基于本发明的内容以及对术语的定义进一步进行描述。
以下结合实施例进一步描述本发明所述的突变体的制备，但这些实施例并非限制本公开中的范围。
本发明中实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
在一些实施方式中，可以通过pET28a(+)质粒表达manB、manC、gmd、fcl；另外再使用一个高拷贝质粒表达FutC，在敲除lacZ基因的BL21(DE3)菌株中发酵得到2’-FL。因此，可以使用该方法进行FutC突变蛋白效率的测试。
1、委托基因合成公司将幽门螺杆菌来源的FutC基因进行生物合成，并安装在pRSFDuet-1质粒上，质粒名为FutC.pRD
2、将FutC.pRD的卡那霉素抗性更换为氨苄青霉素抗性，得到FutC.A.pRD
(1)从pUC19上PCR获取氨苄抗性DNA片段：984bp
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火56℃15s，延伸40s，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(2)将FutC.pRD进行扩增，得到FutC.pRD线性质粒：3483bp
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火52℃15s，延伸2min，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(3)将上述得到的两个目的片段使用Seamless Cloning master mix进行片段连接后化学转化至DH5α感受态细胞，涂板接种至100ug/ml的氨苄青霉素抗性LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑选单克隆扩培测序验证，得到FutC.A.pRD质粒。
3、构建用于合成GDP-L-岩藻糖的BCGF-pET28a(+)质粒：
(1)从大肠杆菌菌株BL21(DE3)基因组中PCR得到manB基因片段：1429bp
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火48℃15s，延伸50s，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(2)从大肠杆菌菌株BL21(DE3)基因组中PCR得到manC基因片段1479bp：
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火57℃15s，延伸50s，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(3)从大肠杆菌菌株BL21(DE3)基因组中PCR得到gmd基因片段1122bp：
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火54℃15s，延伸50s，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(4)从大肠杆菌菌株BL21(DE3)基因组中PCR得到fcl基因片段1009bp：
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火50℃15s，延伸40s，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(5)扩增pET28a(+)质粒获取线性片段5209bp：
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火46℃15s，延伸3min，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
将上述得到的五个目的片段使用Seamless Cloning master mix进行片段连接后化学转化至DH5α感受态细胞，涂板接种至50ug/ml的卡那霉素抗性LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑选单克隆扩培测序验证，得到BCGF-pET28a(+)质粒。
4、将BL21(DE3)菌株敲除能代谢乳糖的基因lacZ，然后再将其制备成电转感受态细胞，将BCGF-pET28a(+)质粒转入胞内。涂板接种至50ug/ml的卡那霉素抗性LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑选单克隆培养即得到BCGF.BL21(DE3)菌株。
实施例1
1、构建FutC突变体质粒：
(1)根据不同的突变位点设计引物：
(2)使用FutC.A.pRD质粒作为模板，使用上述引物扩增得到4500bp左右的突变线性质粒：
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火15s(退火温度见表格)，延伸3min，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(3)将线性质粒使用Seamless Cloning master mix进行片段连接后化学转化至DH5α感受态细胞，涂板接种至100ug/ml的氨苄青霉素抗性LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑选单克隆扩培测序验证，得到不同突变的FutC.A.pRD质粒。
2、将BCGF.BL21(DE3)菌株制备成电转感受态细胞，分别转入野生型或突变型的FutC.A.pRD质粒，得到测试菌株：
3、为最大程度提高2’-FL产量，使用如下组分的培养基1：
4、蛋白诱导表达和2’-FL检测：
(1)将上述各菌株接种到20ml的含氨苄青霉素(100ug/ml)和卡那霉素(50ng/ml)抗性培养基1(后续简称SE(A/K)培养基)，37℃，220rpm培养16h。
(2)将过夜菌测量600nm波长的吸光度，然后按照OD600/1.0的倍数稀释菌液。稀释后按照1：10比例接种到100ml SE(A/K)培养基，37℃，220rpm培养。
(3)在菌株培养OD600到达0.4时，将培养瓶转移至30℃，220rpm培养1h，然后添加IPTG终浓度至0.2mM，乳糖终浓度至8.5g/L，继续培养72h。
(4)培养结束，取2.0ml培养液8000xg离心10min，取上清进行HPLC检测2’-FL产量。
2’-FL产物检测：通过高效液相色谱(HPLC)系统(岛津LC-20AT)和CarbohydrateAnalysis(Rezex ROA-organic acid H+(8％))色谱柱对样品进行分析。流动相：5mmolLH2SO4；流速：0.2-0.6mL/min；柱温：40-50℃；进样量：10μL。
测试结果：
结果显示，本发明对所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶中特定位点进行单一突变，所获得的突变体的酶活力均得到了不同程度的提升，2’-FL的产量均有所提升。
实施例2
1、构建T38S-S43N双突变质粒：
(1)以T38S质粒为模板，进一步PCR扩增获得T38S-S43N突变线性质粒(4447bp)：
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火49℃15s，延伸2min30s，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(2)将线性质粒使用Seamless Cloning master mix进行片段连接后化学转化至DH5α感受态细胞，涂板接种至100ug/ml的氨苄青霉素抗性LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑选单克隆扩培测序验证，得到同时包含T38S、S43N突变的T38S-S43N质粒。
2、构建L207I-T210C-Q239S多突变质粒：
(1)使用Q239S质粒作为模板，进一步PCR扩增获得L207I-T210C-Q239S线性质粒(4451bp)：
PCR反应体系：
反应条件为预变性95℃30s，变性95℃15s，退火53℃15s，延伸2min30s，补充延伸5min，30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
(2)将线性质粒使用Seamless Cloning master mix进行片段连接后化学转化至DH5α感受态细胞，涂板接种至100ug/ml的氨苄青霉素抗性LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑选单克隆扩培测序验证，得到L207I-T210C-Q239S质粒。
3、将BCGF.BL21(DE3)菌株制备成电转感受态细胞，分别转入野生型或突变型的FutC.A.pRD质粒，得到测试菌株：
4、蛋白诱导表达和2’-FL检测：
(1)将上述各菌株接种到20ml的含氨苄青霉素(100ug/ml)和卡那霉素(50ng/ml)抗性培养基1，37℃，220rpm培养16h。
(2)将过夜菌测量600nm波长的吸光度，然后按照OD600/1.0的倍数稀释菌液。稀释后按照1：10比例接种到100ml SE(A/K)培养基，37℃，220rpm培养。
(3)在菌株培养OD600到达0.4时，将培养瓶转移至30℃，220rpm培养1h，然后添加IPTG终浓度至0.2mM，乳糖终浓度至8.5g/L，继续培养72h。
(4)培养结束，取2.0ml培养液8000xg离心10min，取上清进行HPLC检测2’-FL产量。
培养结束，取2.0ml培养液5000xg离心10min，取上清进行HPLC检测2’-FL产量：
测试结果：
| 菌株 | 2’-FL产量(g/L) |
| FC.BLD | 3.022 |
| T38S-S43N.BLD | 3.561 |
| L207I-T210C-Q239S.BLD | 4.222 |
结果显示，本发明对所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶中特定位点进行组合突变，所获得的突变体的酶活力均得到了不同程度的提升，2’-FL的产量均有所提升。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。
Claims (10)
1.一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：
(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶相比，所述突变体包括如下突变位点中的一个或多个：
T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S；
(b)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、添加或其任意组合的氨基酸序列，所述置换是保守置换；和
(c)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意一个；
或为T38S和S43N；
或为T38S、S43N和A79G；
或为T38S、S43N、A79G和L207I；
或为T38S、S43N、A79G、L207I和T210C；
或为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S；
或为L207I、T210C和Q239S；
或为T38S、L207I、T210C和Q239S；
或为S43N、L207I、T210C和Q239S；
或为A79G、L207I、T210C和Q239S；
或为T38S、S43N、L207I、T210C和Q239S；
或为S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S；
或为T38S、A79G、L207I、T210C和Q239S。
3.一种编码权利要求1-2任一项所述的突变体的核酸。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的编码α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的核酸。
5.一种包含如权利要求3所述的编码α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的核酸或如权利要求4所述的载体的重组工程菌或重组工程细胞。
6.一种制备权利要求1或2所述的突变体的方法，其特征在于，包括：培养权利要求5所述的重组工程菌或重组工程细胞，诱导所述突变体的表达。
7.一种生物制剂，其特征在于，包括：权利要求1-2任一项所述的突变体、权利要求3所述的核酸，权利要求4所述的载体，权利要求5所述的重组工程菌或重组工程细胞或权利要求6所述制备方法制得的产物。
8.权利要求1-2任一项所述的突变体、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的重组工程菌或重组工程细胞、权利要求6所述制备方法制得的产物或权利要求7所述的生物制剂在制备岩藻糖基低聚糖中的应用；
优选地，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、双岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻四糖、乳-N-岩藻五糖I和乳-N-二岩藻六塘I；
更优选地，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖。
9.一种体外酶法制备岩藻糖基低聚糖的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供如权利要求1或2所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体；
(2)提供供体底物和受体底物，在允许生产所述岩藻糖基低聚糖的适宜营养条件、以及允许α-1,2-岩藻糖基转移酶表达的条件下，培养宿主细胞，使步骤(1)中的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体与所述供体底物和受体底物接触，制备所述岩藻糖基低聚糖；
优选地，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、双岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻四糖、乳-N-岩藻五糖I和乳-N-二岩藻六塘I；
更优选地，所述岩藻糖基低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖。
10.权利要求1-2任一项所述的突变体、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的重组工程菌或重组工程细胞、权利要求6所述制备方法制得的产物或权利要求7所述的生物制剂在制备食品或保健品中的应用。
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| CN113151211A (zh) * | 2021-03-11 | 2021-07-23 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用 |
| CN113528480A (zh) * | 2021-07-07 | 2021-10-22 | 上海交通大学 | 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其构建方法和应用 |
| CN113667656A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-19 | 光明乳业股份有限公司 | 岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法 |
-
2022
- 2022-10-27 CN CN202211339864.7A patent/CN116064453B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150176044A1 (en) * | 2012-05-23 | 2015-06-25 | Glykos Finland Oy | Production of Fucosylated Glycoproteins |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116064453B (zh) | 2023-11-24 |
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