CN112940973B - 一种慢生型大豆根瘤菌高密度培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种慢生型大豆根瘤菌高密度培养方法，属于异养培养发酵工艺技术领域。本发明解决了现有传统发酵罐培养大豆根瘤菌的方法对数期碳氮比失衡，代谢产物增加对菌体生长不良，无法实现慢生型大豆根瘤菌的高密度培养的问题。本发明采用恒速流加补料方式，有效维持发酵液中碳氮比例和浓度，有效提高对数期慢生型大豆根瘤菌的活菌数，使发酵最终的有效活菌数稳定在6.8×109cfu/mL，实现大豆根瘤菌的高密度培养。此外，本发明采用的恒速流加补料的方式操作简单，放大培养更加容易，更适用于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种慢生型大豆根瘤菌高密度培养方法，属于异养培养发酵工艺技术领域。
背景技术
大豆生长所需的氮素营养基本上由根瘤菌提供，如果没有根瘤菌的存在，每亩要施一百多公斤尿素才能满足亩产180公斤大豆的氮肥需求，所以说大豆的氮肥基本上是根瘤菌贡献的。
目前，现有技术通常采用发酵罐培养，增加搅拌速度和通气量的方法，来提高慢生型大豆根瘤菌的有效活菌数，但是现有常规发酵培养最终有效活菌数约为1.9×108cfu/mL，仍然没有实现慢生型大豆根瘤菌的高密度培养。因此，提供一种能够有效的解决对数期碳氮比失衡，代谢产物增加对菌体生长不良的问题，从而实现慢生型大豆根瘤菌高密度培养的方法是十分必要的。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供一种慢生型大豆根瘤菌高密度培养方法。
本发明的技术方案：
一种慢生型大豆根瘤菌高密度培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)发酵罐培养慢生型大豆根瘤菌48-60h，使其处于对数生长期；
(2)慢生型大豆根瘤菌进入对数生长期后，采用恒速流加补料方式进行补料，补料液的流加速度为1mL/min，1L补料液中含有碳源和氮源的总质量为100g，补料时间为10-12h。
进一步地，步骤(1)中发酵罐培养慢生型大豆根瘤菌的条件为：空气流速20L/min，搅拌转速不低于400rpm，溶解氧饱和浓度不低于85％，温度为28℃，初始pH值为6.8。
进一步地，步骤(1)中发酵罐培养慢生型大豆根瘤菌的培养基为YMA培养基，1L培养基中含有K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.2g、NaCl 0.1g、酵母粉0.4g、甘露醇10g和琼脂20g。
进一步的，步骤(2)中采用恒速流加补料方式进行补料的起点为培养慢生型大豆根瘤菌48h。
进一步地，步骤(2)中采用甘露醇和酵母膏在补料液中的比例调整来保证发酵罐中碳氮比。
更进一步地，补料液中甘露醇和酵母膏的浓度比为3:2。
应用上述方法培养的慢生型大豆根瘤菌的最终有效活菌数为6.8×109cfu/mL。
本发明具有以下有益效果：本发明采用恒速流加补料方式，有效维持发酵液中碳氮比例和浓度，有效提高对数期慢生型大豆根瘤菌的活菌数，使发酵最终的有效活菌数稳定在6.8×109cfu/mL，实现大豆根瘤菌的高密度培养。
同时，本发明针对甘露醇和酵母膏在补料液中的比例，来对发酵液中碳氮比进行优化，解决了当发酵液中碳氮比偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；碳氮比过大，菌体繁殖数量少，细菌代谢不平衡的问题。
此外，恒速流加补料的方式操作简单，放大培养更加容易，更适用于规模化生产。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：
(1)慢生型大豆根瘤菌HW-05发酵罐中培养48h，使其处于对数生长期；
具体操作过程如下：
20L发酵罐培养，以摇瓶优化的培养条件为基础，确定发酵罐的发酵条件为：空气流速20L/min。最低搅拌转速设为400rpm，最低溶氧设为85％(当培养基溶氧降至85％以下时，溶氧联动转速会自动提速来增加溶氧)，温度为28℃，初始pH值为6.8。
其中，发酵罐培养慢生型大豆根瘤菌的培养基为YMA培养基，1L培养基中含有K2HPO40.5g、MgSO4 0.2g、NaCl 0.1g、酵母粉0.4g、甘露醇10g和琼脂20g。
大豆根瘤菌HW-05接种量为2％。
(2)慢生型大豆根瘤菌进入对数生长期后，采用恒速流加补料方式进行补料；
具体操作过程如下：大豆根瘤菌HW-05培养48h后，采用恒速流加补料，从48h开始补料，流加速度为1mL/min，补料液浓度为100g/L，补料时间为10h。
具体的补料流加方式如下表所示：
其中，补料液的组分为：甘露醇和酵母膏以3:2混合，终浓度为100g/L，发酵20L加入甘露醇1200g，酵母膏800g。
最终测得发酵液有效活菌数稳定在68.2±1.3亿/mL。
对比例1：
本对比例1与实施例1的不同处为：
(2)慢生型大豆根瘤菌进入对数生长期后，在保证发酵罐中碳氮比为3:2的条件下，采用变速流加补料方式进行补料；
变速流加补料操作过程如下：大豆根瘤菌HW-05培养48h后，从48h开始补料，流加速度为1.8mL/min，50h开始改变流加速度为1.8mL/min，52h开始改变流加速度为1.2mL/min，54h开始改变流加速度为0.8mL/min，56h开始改变流加速度为0.5mL/min，58h开始改变流加速度为0.2mL/min。
具体的补料流加方式如下表所示：
最终测得发酵液有效活菌数稳定在46.2±0.7亿/mL。
对比实施例1和对比例1的最终有效活菌数可知，本发明提供的培养方法的最终活菌数明显提高，且较为稳定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种慢生型大豆根瘤菌高密度培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)发酵罐培养慢生型大豆根瘤菌48-60h，使其处于对数生长期；
所述的步骤(1)中发酵罐培养慢生型大豆根瘤菌的培养基为YMA培养基，1L培养基中含有K2HPO40.5g、MgSO40.2g、NaCl0.1g、酵母粉0.4g、甘露醇10g和琼脂20g；
(2)慢生型大豆根瘤菌进入对数生长期后，采用恒速流加补料方式进行补料，补料液的流加速度为1mL/min，1L补料液中含有碳源和氮源的总质量为100g，补料时间为10-12h；
所述的步骤(2)中采用恒速流加补料方式进行补料的起点为培养慢生型大豆根瘤菌48h；
所述的步骤(2)中采用甘露醇和酵母膏在补料液中的比例调整来保证发酵罐中碳氮比；
所述的补料液中甘露醇和酵母膏的浓度比为3:2。
2.根据权利要求1所述的一种慢生型大豆根瘤菌高密度培养方法，其特征在于，所述的步骤(1)中发酵罐培养慢生型大豆根瘤菌的条件为：空气流速20L/min，搅拌转速不低于400rpm，溶解氧饱和浓度不低于85％，温度为28℃，初始pH值为6.8。
3.根据权利要求1所述的一种慢生型大豆根瘤菌高密度培养方法，其特征在于，所述的慢生型大豆根瘤菌为大豆根瘤菌HW-05。
4.权利要求1所述的培养方法培养的慢生型大豆根瘤菌，其特征在于，慢生型大豆根瘤菌的最终有效活菌数为6.8×109cfu/mL。
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