CN112746030B - 一种硝化细菌的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硝化细菌的培养方法，包括：（1）确定培养体系内溶解氧浓度的上限值记为DOmax以及相应的曝气量Q；（2）确定硝化细菌最佳生长状态期的溶解氧浓度记为DOtop；（3）在硝化细菌培养过程中，当培养体系内溶解氧浓度上升到35%‑60%DOmax，则启动补料系统，当DO浓度下降10‑30个百分点时停止补料系统，此时的溶解氧浓度记为DOs；停止补料后，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比降低或升高3个百分点以上时，启动溶解氧浓度调控系统，直到达到溶解氧浓度维持在DOtop，停止溶解氧浓度调控系统；如此循环，直至培养结束。该方法可以实现菌体的自动控制培养、实现快速生长繁殖，所获得的硝化细菌活性高、氨氮去除率高，解决工业应用所需菌源生长缓慢的难题。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体地说涉及一种硝化细菌的培养方法。
背景技术
硝化细菌主要作用是脱除含氮污染物，包括氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌两类。其中氨氧化细菌负责把氨氧化成亚硝酸盐，亚硝酸盐氧化细菌负责把亚硝酸盐进一步氧化成硝酸盐。硝化细菌属于好氧自养型微生物，在供养充分的条件下，从氧化氨和亚硝酸盐过程中获得能量进而同化CO2而生长，因此自身生长缓慢，世代时间长，特别是在生长过程中还容易受到底物浓度、溶解氧 （DO）浓度、pH等多种因素的影响，因此增值速度慢，不容易快速培养，在工业上大规模应用存在难度。对于这种对环境条件敏感、底物相对单一的好氧微生物来说，如何调控补料措施，降低底物浓度对硝化细菌的影响程度，对于菌体酶活性的提高及菌体生长速率都有重要作用。
现有的技术都是采用批次补料、批次流加的方式，虽然能够将底物浓度控制在一定的范围，但是并不能实现自动控制。
CN201611066275.0提供了一种间歇式、氨氮流加-间歇式运行交替的硝化细菌菌群筛选和富集培养方法，主要是利用间歇式运行逐渐提高初始氨氮负荷以提高氨氮氧化速率，氨氮流加-间歇式运行以维持氨氮氧化速率和实现低亚硝酸盐积累率。该方法可以在短期内实现硝化细菌菌群的筛选和富集培养，但是控制过程相对复杂，仍然不能实现自动化补料培养。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种硝化细菌的培养方法。该方法可以实现菌体的自动控制培养、实现快速生长繁殖，所获得的硝化细菌活性高、氨氮去除率高，解决工业应用所需菌源生长缓慢的难题。
本发明提供了一种硝化细菌的培养方法，包括：
（1）确定培养体系内溶解氧浓度的上限值记为DOmax以及相应的曝气量Q；
（2）确定硝化细菌最佳生长状态期的溶解氧浓度记为DOtop；
（3）在硝化细菌培养过程中，当培养体系内溶解氧浓度上升到35%-60%DOmax，则启动补料系统，当DO浓度下降10-30个百分点时停止补料系统，此时的溶解氧浓度记为DOs；停止补料后，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比降低或升高3个百分点以上时，启动溶解氧浓度调控系统，直到达到溶解氧浓度维持在DOtop，停止溶解氧浓度调控系统；如此循环，直至培养结束。
本发明步骤（1）所述的溶解氧浓度上限值DOmax是指在曝气反应器内加入硝化细菌初始培养液，在不接种微生物并开启搅拌的情况下调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量Q。
本发明步骤（1）中，所述初始培养液的组成包括氮氨以及微量元素，其中提供氮氨的物质可以是硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸氢铵、碳酸铵等中的至少一种。氮氨浓度不大于300 mg/L，微量元素可以包括含有K+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、HPO4 2-和 H2PO4 -等中的至少一种，总离子浓度为0.3-10g/L。
在步骤（2）确定该硝化细菌的最佳生长状态期以及在步骤（3）该细菌的培养过程中，采用不变的曝气量Q。
本发明步骤（2）所述的最佳生长状态期的溶解氧浓度DOtop，是指接种硝化细菌微生物并经培养后DO浓度会逐渐下降，直到DO趋于最低并稳定1-2h，这个时期为微生物的最佳活性生长状态期，此时的DO浓度控制在15%-25%DOmax。
本发明步骤（3）中，优选地，在硝化细菌培养过程中，当培养体系内溶解氧浓度上升到35%-60%DOmax，则启动补料系统，当DO浓度下降10-30个百分点时停止补料系统，此时的溶解氧浓度记为DOs。
本发明步骤（3）中，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比降低或升高3个百分点以上（优选为3~5个百分点）时，启动溶解氧浓度调控系统，直到达到溶解氧浓度维持在DOtop，停止溶解氧浓度调控系统。
本发明步骤（3）中，所述的溶解氧浓度调控系统优选为溶氧速率调控系统，调控方法包括调控搅拌转数、反应压力等中的至少一种方法。下面以调整搅拌转数为例进行说明：
当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每降低3~5个百分点时，搅拌转数就可以提高5-10转，反之，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每升高1~3个百分点时，搅拌转数就可以降低5-10转，直到溶解氧浓度维持DOtop不变时，停止溶解氧浓度调控系统。
本发明中，所述的DOmax是在开启搅拌的情况下，由曝气系统通过调整曝气量来确定的，其浓度一般为6-9mg/L。
本发明中，所述的曝气反应器为底部设有曝气和搅拌功能的密闭反应器。
本发明中，所述硝化细菌的接种量为初始培养液体积的0.5%~5%。
本发明所接种的硝化细菌可以是本领域公知的所有经过富集培养后的菌体，如可以采用CN201410585640.3富集培养的硝化细菌。
本发明中，补料系统补加的物料是用于硝化细菌生长的培养液，即为无机培养液，主要成份为氨氮，可以是硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸氢铵、碳酸铵等中的至少一种。所述无机培养液中，氨氮浓度为2000-8000mg/L。
本发明中，所述硝化细菌培养条件为：pH值为7-9，温度为25-38℃。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明方法，发明人研究发现，在维持通气量不变的情况下，通过在一定的DO浓度范围内、依靠DO浓度控制补料时机，再通过控制补料后培养体系内最适溶解氧浓度，为硝化细菌的生长创造了最佳的底物浓度和溶解氧环境，解决了底物抑制和溶解氧浓度的限制，从而可以保证菌体长期处于较佳的生长状态期，所获得的菌体活性高，繁殖速度快，解决工业应用所需菌源生长缓慢的难题。
2、本发明方法可以实现自动控制培养硝化细菌，适于工业上大规模应用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明中，以培养体系内溶解氧浓度的上限值记为DOmax（即初始培养液中的饱和溶解氧浓度），各溶解氧浓度均以相对于DOmax的相对值计，升高或降低的百分点是指某一DO浓度相对于DOmax的浓度与另一DO浓度相对于DOmax浓度之间相差的百分点数。比如，启动补料系统时，控制的溶解氧的浓度为60%DOmax，而停止补料时，控制体系的溶解氧的浓度为30%DOmax（记为DOs），此时DO浓度下降30个百分点。再比如，停止补料后，体系内溶解氧浓度比DOs升高或降低3个百分点（即为33%DOmax或27%DOmax）时，启动溶解氧浓度调控系统。
本发明中，溶解氧采用WTW-300i溶解氧在线仪测得，pH值采用Hanna在线测定仪测得。
本发明硝化细菌的培养方法，具体过程包括：
（1）首先在曝气反应器内加入硝化细菌初始培养液，在不接种微生物并开启搅拌的情况下调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量Q，并在整个细菌培养过程中以维持该曝气量Q不变；
（2）在按初始培养液体积的0.5%~5%接种硝化细菌微生物，并经培养后DO浓度会逐渐下降，直到DO趋于最低并稳定1-2h，这个时期为微生物的最佳活性生长状态期，此时的DO浓度控制在15%-25%DOmax，确定硝化细菌最佳生长状态期的溶解氧浓度记为DOtop；
（3）在硝化细菌培养过程中，当培养体系内溶解氧浓度上升到35%-60%DOmax，则启动补料系统，当DO浓度下降10-30个百分点时停止补料系统，此时的溶解氧浓度记为DOs；停止补料后，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比降低或升高3个百分点以上（优选为3-5个百分点）时，启动溶解氧浓度调控系统，直到达到溶解氧浓度维持在DOtop，停止溶解氧浓度调控系统；如此循环，直至培养结束。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
本发明实施例和比较例中，氨氮浓度采用GB7478-87《水质-铵的测定-蒸馏和滴定法》测定；氨氮去除速率是指单位时间单位体积内能够去除的氨氮量，氨氮去除速率=（进水氨氮浓度-出水氨氮浓度）/培养时间。
实施例1 硝化细菌培养
在100L的曝气反应器内进行硝化细菌的培养。该反应器同时安装搅拌、pH、补料自控系统和溶解氧浓度调控系统。培养过程中温度设定在32℃，pH设置在7.6-7.7。
（1）首先在曝气反应器内加入50L微生物初始培养液，在不接种微生物的情况下打开曝气系统并调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养所需DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量Q，并在整个细菌培养过程中以维持该通气量不变。其中微生物培养基的组成及含量为：硫酸铵50g、硫酸亚铁1.5g、氯化钙0.5g、七水合硫酸镁7g、磷酸二氢钾7g。
（2）按照初始培养液体积的1%接种按照CN201410585640.3实施例2中3号反应器富集方法得到的硝化细菌，系统内的溶解氧浓度开始逐渐下降，最后DO浓度趋于最低并稳定在25%DOmax，硝化细菌进入最佳活性生长状态期；
（3）在硝化细菌培养过程中，当DO浓度上升到60%DOmax时启动补料系统补加氨氮浓度为8000mg/L的培养液；随着培养液的补加体系内溶解氧浓度又开始呈现下降趋势，当DO浓度降至30%DOmax则停止补料，此时的溶解氧浓度记为DOs；停止补料后，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每降低3个百分点时，搅拌转数就提高5转，反之，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每升高1.5个百分点时，搅拌转数就降低5转，直到溶解氧浓度维持DOtop不变时，停止溶解氧浓度调控系统；如此循环，直至培养体系达反应器总体积的80%时，关掉自动补料系统和溶解氧浓度调控系统，待培养液中氨氮浓度耗尽，结束本批次的培养，停止曝气和搅拌，沉降后排出上清液，收获菌体。
所收获菌体的氨氮去除速率由接种时的10mg/(L·h)提高到74mg/(L·h)。
实施例2 硝化细菌培养
在100L的曝气反应器内进行硝化细菌的培养。该反应器同时安装搅拌、pH、补料自控系统和溶解氧浓度调控系统。培养过程中温度设定在33℃，pH设置在7.9-8.0。
（1）首先在曝气反应器内加入50L微生物初始培养液，在不接种微生物的情况下打开曝气系统并调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养所需DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量Q，并在整个细菌培养过程中以维持该通气量不变。其中微生物培养液的组成及含量为：硫酸铵50g、硫酸亚铁1.5g、氯化钙0.5g、七水合硫酸镁7g、磷酸二氢钾7g。
（2）按照初始培养液体积的2%接种按照CN201410585640.3实施例2中3号反应器富集方法得到的硝化细菌，系统内的溶解氧浓度开始逐渐下降，最后DO浓度趋于最低并稳定在20%DOmax，硝化细菌进入最佳活性生长状态期；
（3）在硝化细菌培养过程中，当DO浓度上升到50%DOmax时启动补料系统补加氨氮浓度为5000mg/L的培养液；随着培养液的补加体系内溶解氧浓度又开始呈现下降趋势，当DO浓度降至30%DOmax则停止补料，此时的溶解氧浓度记为DOs；停止补料后，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每降低5个百分点时，搅拌转数就提高10转，反之，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每升高2个百分点时，搅拌转数就降低7转，直到溶解氧浓度维持DOtop不变时，停止溶解氧浓度调控系统；如此循环，直至培养体系达反应器总体积的80%时，关掉自动补料系统和溶解氧浓度调控系统，待培养液中氨氮浓度耗尽，结束本批次的培养，停止曝气和搅拌，沉降后排出上清液，收获菌体。
所收获菌体的氨氮去除速率由接种时的11mg/(L·h)提高到75mg/(L·h)。
实施例3 硝化细菌培养
在100L的曝气反应器内进行硝化细菌的培养。该反应器同时安装搅拌、pH、补料自控系统和溶解氧浓度调控系统。培养过程中温度设定在35℃，pH设置在8.0-8.1。
（1）首先在曝气反应器内加入50L微生物初始培养液，在不接种微生物的情况下打开曝气系统并调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养所需DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量Q，并在整个细菌培养过程中以维持该通气量不变。其中微生物培养液的组成及含量为：硫酸铵50g、硫酸亚铁1.5g、氯化钙0.5g、七水合硫酸镁7g、磷酸二氢钾7g。
（2）按照初始培养液体积的5%接种按照CN201410585640.3实施例2中3号反应器富集方法得到的硝化细菌，系统内的溶解氧浓度开始逐渐下降，最后DO浓度趋于最低并稳定在15%DOmax，硝化细菌进入最佳活性生长状态期；
（3）在硝化细菌培养过程中，当DO浓度上升到35%DOmax时启动补料系统补加氨氮浓度为2000mg/L的培养液；随着培养液的补加体系内溶解氧浓度又开始呈现下降趋势，当DO浓度降至20%DOmax则停止补料，此时的溶解氧浓度记为DOs；停止补料后，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每降低4个百分点时，搅拌转数就提高7转，反之，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每升高3个百分点时，搅拌转数就降低10转，直到溶解氧浓度维持DOtop不变时，停止溶解氧浓度调控系统；如此循环，直至培养体系达反应器总体积的80%时，关掉自动补料系统和溶解氧浓度调控系统，待培养液中氨氮浓度耗尽，结束本批次的培养，停止曝气和搅拌，沉降后排出上清液，收获菌体。
所收获菌体的氨氮去除速率由接种时的12mg/(L·h)提高到73mg/(L·h)。
比较例1
同实施例1，不同在于：步骤（3）在硝化细菌培养过程中，停止补料后，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比有波动的情况时不启动溶解氧调控系统。所收获菌体的氨氮去除速率为70mg/(L·h)。
比较例2
同实施例1，不同在于：在整个培养过程中控制溶解氧浓度为1-3mg/L，等量的基质采用流加补料的方式。所收获菌体的氨氮去除速率只有40mg/(L·h)。
Claims (9)
1.一种硝化细菌的培养方法，包括：
(1) 确定培养体系内溶解氧浓度的上限值记为DOmax以及相应的曝气量Q；
(2) 确定硝化细菌最佳生长状态期的溶解氧浓度记为DOtop；
(3) 在硝化细菌培养过程中，当培养体系内溶解氧浓度上升到35%-60% DOmax，则启动补料系统，当DO浓度下降10-30个百分点时停止补料系统，此时的溶解氧浓度记为DOs；停止补料后，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比降低或升高3个百分点以上时，启动溶解氧浓度调控系统，直到达到溶解氧浓度维持在DOtop，停止溶解氧浓度调控系统；如此循环，直至培养结束；
所述步骤(1)所述的溶解氧浓度上限值DOmax是指在曝气反应器内加入硝化细菌初始培养液，在不接种微生物并开启搅拌的情况下调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量Q；
步骤(2)所述的最佳生长状态期的溶解氧浓度DOtop，是指接种硝化细菌微生物并经培养后DO浓度会逐渐下降，直到DO趋于最低并稳定1-2 h，这个时期为微生物的最佳活性生长状态期，此时的DO浓度控制在15%-25% DOmax；
步骤(3)中，在硝化细菌培养过程中，当培养体系内溶解氧浓度上升到35%-60% DOmax，则启动补料系统，当DO浓度下降10-30个百分点时停止补料系统，此时的溶解氧浓度记为Dos；
所述的DOmax是在开启搅拌的情况下，由曝气系统通过调整曝气量来确定的，其浓度为6-9 mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，初始培养液中氨氮浓度不大于300 mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)确定该硝化细菌的最佳生长状态期以及在步骤(3)该细菌的培养过程中，采用不变的曝气量Q。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比降低或升高3~5个百分点时，启动溶解氧浓度调控系统，直到达到溶解氧浓度维持在DOtop，停止溶解氧浓度调控系统。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的溶解氧浓度调控系统为溶氧速率调控系统，调控方法包括调控搅拌转数、反应压力中的至少一种方法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，调控方法采用调控搅拌转数的方法时，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每降低3~5个百分点时，搅拌转数就提高5-10转，反之，当培养体系内溶解氧浓度与DOs相比每升高1~3个百分点时，搅拌转数就降低5-10转，直到溶解氧浓度维持DOtop不变时，停止溶解氧浓度调控系统。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝化细菌的接种量为初始培养液体积的0.5%~5%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，补料系统补加的培养基质为无机培养基质，主要包括能够提供氨氮的物质为氨氮，所述无机培养基中，氨氮浓度为2000-8000 mg/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝化细菌培养条件为：pH值为7-9，温度为25-38℃。
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