CN106754483A - 一种氨氮流加‑间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种氨氮流加‑间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，属于水处理技术领域。以含有氨氧化细菌的活性污泥为接种污泥，利用细菌发酵罐，通过氨氮流加‑间歇式运行方法实现氨氧化细菌菌群的筛选和富集培养。利用游离氨和游离亚硝酸抑制亚硝酸盐氧化细菌，采用高溶解氧有助于提高氨氮氧化速率。采用此方法可以在短期内实现氨氧化细菌菌群的筛选和富集培养。本发明所获得的氨氧化细菌菌群在总细菌中占有数量优势，可以实现高氨氮氧化速率和高亚硝酸盐积累率。
Description
技术领域
本发明属于水处理领域，特别涉及一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法。
背景技术
在生物脱氮过程中尽可能节省曝气能耗和有机碳源是污水生物处理实现可持续发展的有效途径。传统的生物脱氮过程为自养硝化和异养反硝化。(1)由氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria，AOB)将NH4 +氧化为NO2 -；(2)由亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-oxidizing bacteria，NOB)将NO2 -氧化为NO3 -；(3)反硝化细菌将NO3 -还原为N2。前两步被称为全程硝化，第一步被称为短程硝化。污水脱氮工艺过程中，相对于传统全程硝化，短程硝化可节约25％的曝气量，之后进行反硝化可节约40％的有机碳源。实际中活性污泥系统在一般条件下将氨氮氧化控制为短程硝化比较困难，亚硝化反应生成的NO2 -很快被NOB氧化为NO3 -。短程硝化的核心细菌是氨氧化细菌(AOB)。迄今为止，研究者们通常都是通过控制运行条件来抑制NOB的生化活性以实现短程硝化，如控制适宜的溶解氧(DO)、温度、pH、游离氨(Free ammonia，FA)、游离亚硝酸(Free nitrous acid，FNA)浓度，以及控制曝气时间等。相关研究证实，AOB相对于NOB对溶解氧具有更强的亲和力，所以在低溶解氧(0.5mg/L左右)环境中，AOB的竞争力强于NOB。DO浓度低于1.0mg/L时，AOB的生长速率比NOB约快2.6倍。但另有研究表明高DO有利于提高氨氮氧化速率。相关研究表明，AOB比NOB承受FA的抑制能力更强，其抑制作用的阈值一般在10～150mg/L和0.1～1.0mg/L。另有研究显示，FA浓度大于6mg/L对NOB产生明显抑制，16mg/L时仍未对AOB产生抑制影响，而达到25mg/L时AOB的活性下降40％。FNA对NOB的抑制作用比对AOB更加明显，FNA浓度高于0.02mg/L时，抑制NOB的代谢作用，高于0.10mg/L时开始抑制AOB的生长，当达到0.40mg/L时，对AOB的活性抑制严重。
实际中因运行条件所限，短程硝化难以维持，污水处理厂目前普遍采用A2/O工艺进行全程硝化。随着国内外对水体氮污染问题的日益关注和高度重视，污水处理厂的出水标准越发严格。我国污水处理厂普遍要求严格执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)一级A标准。然而现有工艺的硝化反应速率较慢、冬季低温硝化细菌活性降低导致硝化速率明显减慢，且污水处理厂进水C/N较低，反硝化阶段需外加碳源，因此对现有技术进行升级具有极其重要的经济价值。一些研究人员采用添加载体填料、细胞固定化生物活性填料或生物添加等方式增加反应器内硝化细菌浓度，以提高硝化反应速率。此外与纯种细菌相比，复合菌群因具有生物多样性而更易适应实际污水复杂的水质情况。
针对上述问题，开发出一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，可以在短期内获得在总细菌中占有数量优势同时实现高氨氮氧化速率和高亚硝酸盐积累率的氨氧化细菌菌群，为进行工业化氨氧化细菌菌群培养提供理论指导，在水处理生物硝化领域具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于开发出一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，利用该方法筛选和富集培养的氨氧化细菌菌群，应用于水处理生物硝化领域，可以实现高氨氮氧化速率、高亚硝酸盐积累率、氨氧化细菌菌群在总细菌中占有数量优势、硝化阶段节省曝气能耗、反硝化阶段节省碳源等实际应用价值。为了实现上述状态，本发明采用了以下技术方案。
一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，其特征在于：培养后氨氧化细菌菌群在总细菌中占有数量优势并且可以实现高氨氮氧化速率和高亚硝酸盐积累率。
一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法的具体实施步骤如下：
(1)以含有氨氧化细菌的活性污泥为接种污泥(本发明优选污水处理厂A2/O工艺回流污泥)，一次性投加氨氮(本研究采用NH4Cl提供氨氮)作为反应底物间歇运行，体系中初始NH4 +-N浓度[NH4 +-N]开始，反应时间t1，反应结束NH4 +-N浓度[NH4 +-N]结束，使得[NH4 +-N]结束为[NH4 +-N]开始的0.3～0.8倍，计算此反应段的接种污泥的氨氮氧化速率AOR；之后进行污泥沉淀、排水、补静置24h以上去除余氯的自来水搅拌后，再重复进行污泥沉淀、排水过程，该过程称为“污泥清洗”，减小反应产物造成背景值的影响；
(2)然后采用氨氮流加-间歇式运行方法，进行进水、反应、污泥沉淀、排水的间歇式运行模式；采用氨氮流加-间歇式运行方法是每个周期氨氮投加分为两种方式，即进水时先通过投加氨氮作为反应初始底物间歇方式运行，运行开始时再通过流加方式向反应器中连续补充氨氮；具体实施步骤如下：
1)每周期开始向反应器内加入水和基础培养液提供反应底物溶液即为进水，进水后反应液的初始NH4 +-N浓度记为[NH4 +-N]0(本发明优选浓度50～150mg/L)；开启温度控制(本发明优选温度20～35℃)、pH(本发明优选pH7.5～8.5)、搅拌和曝气装置(本发明优选DO0.5～1.5mg/L)进行本周期反应、污泥沉淀、排水；
2)氨氮流加即配制氨氮流加液于一储备器中、在每个间歇式运行周期连续不断地滴加供应于反应器内，即随着氨氮氧化的进行连续不断地补充氨氮，以此种方式尽量减小氨氮流加对反应液整体体积变化的影响；其中优选不同周期加入氨氮流加液的体积速率相同(所有周期的体积速率相同)，可通过改变储备器中氨氮流加液的浓度(每个周期内的浓度相同)，从而改变氨氮流加速率[NH4 +-N]add；
3)第n个周期的氨氮氧化速率记为AORn，第n个周期反应体系中的氨氮流加速率[NH4 +-N]add按照[NH4 +-N]add＝(0.8～1.4)*AORn-1进行计算，以实现氨氮流加速率基本等于氨氮氧化速率，即实现每小时氨氮反应量近似于每小时流加补充氨氮量；
4)采用氨氮流加-间歇式运行方法，通过控制氨氮流加速率和氨氮氧化速率的关系，控制整个反应周期内反应液的NH4 +-N浓度，使得控制FA水平以抑制NOB，而未对AOB产生抑制；每周期反应产物亚硝酸盐积累在反应器内，随着反应进行亚硝酸盐生成量逐步提高，利于提高FNA浓度从而抑制NOB；
5)每个周期后补静置24h以上去除余氯的自来水搅拌后，再重复进行污泥沉淀、排水过程，进行“污泥清洗”，根据本周期亚硝酸盐和硝酸盐积累情况确定该过程次数，通过“污泥清洗”，去掉本周期90％以上的反应产物为宜；
6)每个周期硝化反应消耗碱度，pH下降，反应期间设置加碱装置，根据设定pH值自动调节pH、补充碱度和无机碳源，加碱装置中添加的物质为碳酸钠、碳酸氢钠溶液，即可实现调节pH、补充碱度，同时也能实现无机碳源的补加；
7)通过运行周期数确定最终需要的活性污泥氨氮氧化速率，结束氨氧化细菌菌群的筛选和富集培养；
(3)计算公式如下：
1)步骤(1)中间歇运行的氨氮氧化速率计算如下：
式中AOR：氨氮氧化速率，mg/(L·h)；
[NH4 +-N]开始：初始NH4 +-N浓度，mg/L；
[NH4 +-N]结束：反应结束NH4 +-N浓度，mg/L；
t1：反应时间，h；
2)根据氨氮流加-间歇式运行方法，本发明建立计算公式(2)和(3)，在步骤(2)的反应周期开始和结束时取样进行分析以考察各周期的氨氮氧化速率AORn，计算如下：
式中AORn：每个周期氨氮氧化速率，mg/(L·h)；
[NH4 +-N]0：每个周期初始NH4 +-N浓度，mg/L；
[NH4 +-N]add：每个周期氨氮流加速率至反应液，mg/(L·h)；
[NH4 +-N]end：每个周期反应结束NH4 +-N浓度，mg/L；
t2：每个周期氨氮流加时间也即反应时间，h；
注：此公式可通用于计算各种反应底物流加-间歇式运行的底物反应速率；
3)根据前一周期氨氮氧化速率确定本周期预期的氨氮流加速率[NH4 +-N]add，每周期开始需要向氨氮流加液储备器中配制氨氮流加液，本发明采用NH4Cl溶液作为氨氮流加液；每个周期所用NH4Cl的总质量根据以下公式计算：
式中m：每个周期所用NH4Cl的总质量，g；
[NH4 +-N]add：每个周期氨氮流加速率至反应液，mg/(L·h)；
t2：每个周期氨氮流加时间也即反应时间，h；
V：反应液体积，L；
S：基准值：NH4Cl(g)为1L反应液提供NH4 +-N浓度，取100mg/L，计算方法本发明取0.382，即0.382gNH4Cl对应1L反应液的NH4 +-N浓度100mg/L；
注：此公式可通用于计算各种反应底物流加-间歇式运行的底物流加液配制，其中计算基准值S视具体反应底物而定；
4)根据氨氮流加-间歇式运行方法，在步骤(2)的反应周期开始和结束时取样进行分析以考察各周期的亚硝酸盐积累率NAR，由于试验过程中每周期“污泥清洗”后，系统内仍存在亚硝酸盐和硝酸盐，因此以每周期NO2 --N和NO3 --N的生成量计算亚硝酸盐积累率：
式中NAR：每个周期亚硝酸盐积累率；
[NO2 --N]0：每个周期初始NO2 --N浓度，mg/L；
[NO2 --N]end：每个周期反应结束NO2 --N浓度，mg/L；
[NO3 --N]0：每个周期初始NO3 --N浓度，mg/L；
[NO3 --N]end：每个周期反应结束NO3 --N浓度，mg/L。
将筛选和富集培养的氨氧化细菌菌群应用于水处理生物硝化领域。
本发明所述的一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法的有益效果主要体现在：
1.氨氮流加-间歇式运行方法可以持续供应硝化反应所需的反应底物氨氮；
2.采用氨氮流加-间歇式运行，通过控制氨氮流加速率和实际反应速率的关系以及间歇运行周期时间，可以控制反应体系NH4 +-N、NO2 --N浓度保证整个反应周期内的FA、FNA水平以抑制NOB；
3.采用氨氮流加-间歇式运行，每周期反应产物亚硝酸盐积累在反应器内，随着反应进行亚硝酸盐生成量逐渐提高，利于提高FNA浓度从而抑制NOB；
4.采用此方法筛选和富集培养的氨氧化细菌菌群为主要功能微生物可以实现高氨氮氧化速率和高亚硝酸盐积累率；
5.采用此方法培养的氨氧化细菌菌群在总细菌中占有数量优势；
6.此方法培养的氨氧化细菌菌群保留了接种污泥(如污水处理厂A2/O工艺回流污泥)氨氧化细菌的菌群组成，因具有生物多样性而较纯种细菌更具优势；
7.硝化阶段节省曝气能耗，反硝化阶段节省碳源；
8.本方法可以用于指导工业化氨氧化细菌菌群培养，获得的菌种可用于细胞固定化菌源、制作菌剂、生物添加至好氧反应池以提高污水、废水处理的硝化反应速率。
附图说明
图1为全自动细菌发酵罐示意图；
图中：1.显示屏 2.搅拌器 3.传热板 4.pH探头 5.温度探头 6.穿孔管曝气装置7.取样口 8.气体流量计 9.空气泵 10.Na2CO3、NaHCO3原液储备器 11.Na2CO3、NaHCO3进液泵 12.NH4Cl流加液储备器 13.NH4Cl进液泵；
图2氨氧化细菌菌群培养期间各天每周期初始和反应结束NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N浓度；
图3各周期的氨氮流加速率、计算得到的相应周期氨氮氧化速率和亚硝酸盐积累率；
图4高通量测序结果(属(Genus)水平)：yao1为培养第27天污泥样品，yao2为接种污泥样品。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步具体描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.接种污泥氨氮氧化速率测定
以污水处理厂A2/O工艺回流污泥为接种污泥，以全自动细菌发酵罐为试验装置，有效容积3.5L，如图1所示。接种污泥的污泥浓度(MLSS)为3970mg/L。温度25±1℃，pH8.1～8.4，搅拌转速120rpm，Na2CO3原液浓度200g/L。一次性投加氨氮(NH4Cl)间歇运行测定接种污泥的氨氮氧化速率，DO0.8～1.1mg/L，初始NH4 +-N浓度即[NH4 +-N]开始为54.43mg/L，反应时间t1为2h，反应结束NH4 +-N浓度即[NH4 +-N]结束为24.58mg/L，根据公式(1)计算接种污泥的氨氮氧化速率AOR为14.93mg/(L·h)。
2.氨氮流加-间歇式运行方法培养氨氧化细菌菌群
采用氨氮流加-间歇式运行方法培养氨氧化细菌菌群，每周期加入氨氮流加液的体积速率为20mL/h，反应器共运行27天，第1天测定接种污泥氨氮氧化速率后，只运行12h周期，之后每天运行2周期(即t2分别为8h和12h)，每个周期DO0.7～1.5mg/L。基础培养液成分及浓度见表1：
表1基础培养液成分(以下成分不是混合物，是多个单独的溶液)
注：NH4Cl、FeSO4·7H2O溶液分别现用现配；KH2PO4、K2HPO4·3H2O为单独的混合溶液；MgSO4·7H2O、CaCl2为单独的混合溶液；微量元素为单独的混合溶液；此三种溶液为储备液，可供多个周期使用。
每周期开始向反应器内加入去离子水和计算好体积(NH4Cl；KH2PO4、K2HPO4·3H2O；MgSO4·7H2O、CaCl2；FeSO4·7H2O溶液各100mL；微量元素溶液3.5mL)的基础培养液至3.5L(反应液体积V)，进水后使得体系中水质指标为：60mg/LNH4 +-N即[NH4 +-N]0，30mg/LPO4 3--P，30mg/LMgSO4·7H2O，15mg/LCaCl2，30mg/LFeSO4·7H2O和1mL/L微量元素(0.5mg/LZnSO4·7H2O，0.5mg/LMnCl2·4H2O，0.4mg/LCoCl2·6H2O，0.4mg/LCuSO4·5H2O，0.2mg/LNiCl2·6H2O，0.05mg/LNa2MoO4·2H2O)。每周期结束，根据亚硝酸盐和硝酸盐积累量进行“污泥清洗”1～2次，去掉本周期90％以上的反应产物。
根据图2各周期初始浓度[NH4 +-N]0、[NO2 --N]0、[NO3 --N]0和反应结束浓度[NH4 +-N]end、[NO2 --N]end、[NO3 --N]end，采用公式(2)和(4)计算各周期的氨氮氧化速率和亚硝酸盐积累率，考察氨氧化细菌菌群筛选和富集培养期间反应器运行效果，结果如图3所示。在每个周期DO0.8～1.1mg/L的条件下，培养7天左右，氨氧化细菌生长进入对数生长期。第21周期后，每个周期DO0.7～1.5mg/L，每天12h运行周期内的氨氮流加速率略低于8h的氨氮流加速率，同时12h运行周期的DO略低于8h的DO水平，以控制反应结束时的亚硝酸盐浓度，从而控制FNA浓度未抑制AOB的活性。反应器运行至20天第8h周期(第38周期)氨氮流加速率[NH4 +-N]add采用170mg/(L·h)，计算得到氨氮氧化速率达到173.78mg/(L·h)，亚硝酸盐积累率达到82.12％。此后8h周期氨氮氧化速率可基本保持在170mg/(L·h)以上，亚硝酸盐积累率可保持在80％以上，氨氮氧化速率是接种时的11倍之多。MLSS在第10、18和27天分别为2248、3154和3918mg/L，MLSS下降而氨氮氧化速率显著提高表明氨氧化细菌菌群得到了有效的筛选和富集，已在总细菌中占有数量优势。根据高通量测序结果，在属(Genus)水平上，见图4，检测到培养后Nitrosomonas(AOB)的比例高达53.03％(yao1序号2)，显著高于接种时的0.24％(yao2序号2)；而Nitrospira(NOB)的比例由2.70％(yao2序号10)下降至仅为0.01％(yao1序号10)，表明在培养期间AOB得以大量生长，而NOB受到FA和FNA的有效抑制，NOB和其他细菌通过“污泥清洗”逐渐被淘洗出反应器，与反应器高氨氮氧化速率(大于170mg/(L·h))和亚硝酸盐积累率(大于80％)的试验结果相符。
上述实例表明，本氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法可以在短期内筛选和富集培养氨氧化细菌菌群，实现高氨氮氧化速率和高亚硝酸盐积累率，本方法可以用于指导工业化氨氧化细菌菌群培养，获得的菌种可用于细胞固定化菌源、制作菌剂或生物添加至好氧反应池，应用于水处理生物硝化领域，具有极其富有经济价值的应用前景。
Claims (6)
1.一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，其特征在于，具体实施步骤如下：
(1)以含有氨氧化细菌的活性污泥为接种污泥，一次性投加氨氮作为反应底物间歇运行，体系中初始NH4 +-N浓度[NH4 +-N]开始，反应时间t1，反应结束NH4 +-N浓度[NH4 +-N]结束，使得[NH4 +-N]结束为[NH4 +-N]开始的0.3～0.8倍，计算此反应段的接种污泥的氨氮氧化速率AOR；
(2)然后采用氨氮流加-间歇式运行方法，进行进水、反应、污泥沉淀、排水的间歇式运行模式，具体实施步骤如下：
1)采用氨氮流加-间歇式运行方法是每个周期氨氮投加分为两种方式，即进水时先通过投加氨氮作为反应初始底物，反应开始时再通过流加方式向反应器中连续补充氨氮；进水后反应体系内初始NH4 +-N浓度记为[NH4 +-N]0；
2)开启温度控制、pH、搅拌和曝气装置进行本周期反应、污泥沉淀、排水；
3)氨氮流加即配制氨氮流加液于一储备器中、在每个间歇式运行周期连续不断地滴加供应于反应器内，即随着氨氮氧化的进行连续不断地补充氨氮；
4)第n个周期的氨氮氧化速率记为AORn，第n个周期反应体系中的氨氮流加速率[NH4 +-N]add按照[NH4 +-N]add＝(0.8～1.4)*AORn-1进行计算；
步骤(1)间歇运行的氨氮氧化速率计算如下：
式中AOR：氨氮氧化速率，mg/(L·h)；
[NH4 +-N]开始：初始NH4 +-N浓度，mg/L；
[NH4 +-N]结束：反应结束NH4 +-N浓度，mg/L；
t1：反应时间，h；
步骤(2)氨氮流加-间歇式运行的氨氮氧化速率计算如下：
式中AORn：每个周期氨氮氧化速率，mg/(L·h)；
[NH4 +-N]0：每个周期初始NH4 +-N浓度，mg/L；
[NH4 +-N]add：每个周期氨氮流加速率至反应液，mg/(L·h)；
[NH4 +-N]end：每个周期反应结束NH4 +-N浓度，mg/L；
t2：每个周期氨氮流加时间也即反应时间，h；
步骤(2)氨氮流加-间歇式运行的亚硝酸盐积累率计算如下：
式中NAR：每个周期亚硝酸盐积累率；
[NO2 --N]0：每个周期初始NO2 --N浓度，mg/L；
[NO2 --N]end：每个周期反应结束NO2 --N浓度，mg/L；
[NO3 --N]0：每个周期初始NO3 --N浓度，mg/L；
[NO3 --N]end：每个周期反应结束NO3 --N浓度，mg/L。
2.按照权利要求1所述的一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，其特征在于，
每个周期所用NH4Cl的总质量根据以下公式计算：
式中m：每个周期所用NH4Cl的总质量，g；
[NH4 +-N]add：每个周期氨氮流加速率至反应液，mg/(L·h)；
t2：每个周期氨氮流加时间也即反应时间，h；
V：反应液体积，L；
S：NH4Cl为1L反应液提供NH4 +-N浓度，取100mg/L，作为计算基准值。
3.按照权利要求1所述的一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，其特征在于，不同周期加入氨氮流加液的体积速率相同，可通过改变储备器中氨氮流加液的浓度，从而改变氨氮流加速率[NH4 +-N]add。
4.按照权利要求1所述的一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，其特征在于，每周期结束后补静置24h以上去除余氯的自来水搅拌后，再重复进行污泥沉淀、排水过程，该过程称为“污泥清洗”，根据本周期亚硝酸盐和硝酸盐积累情况确定该过程次数，通过“污泥清洗”，去掉本周期90％以上的反应产物。
5.按照权利要求1所述的一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，其特征在于，每个周期硝化反应消耗碱度，pH下降，反应期间设置加碱装置，根据设定pH值自动调节pH、补充碱度和无机碳源，加碱装置中添加的物质为碳酸钠、碳酸氢钠溶液。
6.按照权利要求1所述的一种氨氮流加-间歇式运行的氨氧化细菌菌群筛选和富集培养方法，其特征在于，每个周期反应温度20～35℃、pH7.5～8.5、DO0.5～1.5mg/L。
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