JPH04217986A - 抗高コレステロール血症薬 - Google Patents

抗高コレステロール血症薬

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JPH04217986A
JPH04217986A JP3074158A JP7415891A JPH04217986A JP H04217986 A JPH04217986 A JP H04217986A JP 3074158 A JP3074158 A JP 3074158A JP 7415891 A JP7415891 A JP 7415891A JP H04217986 A JPH04217986 A JP H04217986A
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phenyl
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alkyl
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JP3074158A
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James D Bergstrom
ジエームス・デイー・バーグストロン
Otto D Hensens
オツトー・デイー・ヘンセンズ
Leeyuan Huang
リーユアン・ホアン
Janet C Onishi
ジヤネツト・シー・オーニシ
Deborah L Zink
デボラ・エル・ジンク
Gerald F Bills
ジエラルド・エフ・ビルズ
Mary Nallin
メアリー・ネイリン
F Kenneth Bertizal
ケネス・エフ・バーテイザル
James A Milligan
ジエームス・エイ・ミリガン
Walter Rozdilsky
ウオルター・ロズデイルスキー
Claude Dufresne
クロード・デユフレンヌ
Maria T Diez
マリア・テー・デイエズ
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Merck and Co Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 　　高コレステロール血症は動脈硬化症のような虚血性
心血管疾患に対する主要な危険因子の１つであることが
知られている。胆汁酸封鎖剤はこの症状を治療するため
に使われていて、それらはある程度有効であるらしいが
、多量、即ち１度に数グラムの消費を要し、非常に服用
し易いというものではない。
【０００２】現在市販で入手できるＭＥＶＡＣＯＲ（登
録商標）（ロバスタチン）は、高活性の抗高コレステロ
ール血症薬のグループの１つであって、その機能はヒド
ロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａ）還元酵素という酵素の阻害によってコレステロール
生合成を制限することによる。
【０００３】スクアレンシンテターゼはコレステロール
生合成新生経路の最初の始動段階（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ
　ｓｔｅｐ）に関与する酵素である。この酵素は２分子
のファルネシルピロリン酸の還元的二量化に触媒として
作用しスクアレンの生成を助ける。コレステロールに対
するこの始動段階の抑制はユビキノン、ドリコール及び
イソペンテニルｔ−ＲＮＡに対する生合成経路を阻害す
ることはない。
【０００４】スクアレンシンテターゼを阻害する従来の
試みでは、ピロリン酸エステル又はＰ．　Ｏｓｔｉｚ　
ｄｅ　Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ等，Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈ
ｅｍ．　２０，　２４３　（１９７７）並びにＥ．　Ｊ
．　Ｃｏｒｅｙ　及びＲ．　Ｖｏｌａｎｔｅ，　Ｊ．　
Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　９８，　１２９１　
（１９７６）に記載されたような化合物を含むピロリン
酸エステル類似物を使用した。Ｓ．　Ｂｉｌｌｅｒ（米
国特許第　４，８７１，７２１号）はスクアレンシンテ
ターゼの阻害剤としてイソプレノイド（ホスフィニルメ
チル）ホスホネートを記載している。
【０００５】本発明はスクアレンシンテターゼの燐を含
有しない阻害剤を提供する。
【０００６】詳細な説明 　　本発明は、スクアレンシンテターゼ阻害剤である構
造式（Ｉ）
【０００７】
【化８】 ［式中、Ｚ１　，Ｚ２　及びＺ３　はそれぞれ独立にａ
）　　Ｈ； ｂ）　　Ｃ１　〜５　アルキル； ｃ）　　ｉ）フェニル，ｉｉ）メチル，メトキシ，ハロ
ゲン（Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，Ｆ）若しくはヒドロキシにより
置換されたフェニルから成るグループの１個で置換され
たＣ１　〜５　アルキル；から選択される］の新規化合
物、又はＺ１　，Ｚ２　及びＺ３　の少くとも１つが水
素である式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容し得る塩を目
的とする。
【０００８】本発明の１つの実施態様としては、下記に
示すような２，８−ジオキサビシクロ［３．２．１］オ
クタン環の立体化学的相対配置にある式（Ｉ）の化合物
がある。
【０００９】
【化９】 本明細書及び請求項を通じて、ジオキサビシクロ［３．
２．１］オクタン環について立体化学の記載がある場合
、相対配置を意味する。実際の配置は表示と同じか又は
その鏡像体の配置であり得る。
【００１０】この実施態様を更に説明すると、３，６及
び７の位置の相対配置が下記に示されるような構造式（
Ｉ）の化合物である。
【００１１】
【化１０】 この実施態様の種類の１つとして、４位の相対配置が下
記に示されるような構造（Ｉ）の化合物がある。
【００１２】
【化１１】 この種類の例を示すと、Ｚ１　，Ｚ２　及びＺ３　がそ
れぞれ水素である化合物又はその薬学的に許容し得る塩
である。Ｚ１　，Ｚ２　及びＺ３　がそれぞれ水素であ
るこの化合物を本明細書では以後化合物Ａと称する。
【００１３】この種類について更に説明すると、Ｚ１　
，Ｚ２　又はＺ３　の１個以上がＣ１　〜５　アルキル
、フェニル、フェニルで置換されたＣ１　〜５　アルキ
ル又は置換基がメチル，メトキシ，ハロゲン若しくはヒ
ドロキシである置換フェニルである化合物である。特定
の例としては、Ｚ１　，Ｚ２　及びＺ３　がそれぞれメ
チルである。この化合物を本明細書で以後化合物Ｂと称
する。
【００１４】Ｃ１４ジエノイック側鎖中の二重結合は、
共にトランス配置であり得、又は２個中１個がシス配置
であり得、若しくは２個共シス配置であり得る。
【００１５】式（Ｉ）の化合物はスポロルミエラインテ
ルメジア（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａ）　として同定される新規菌株、ＭＦ５４４７を
使用して好気性醗酵操作で製造される。式（Ｉ）の化合
物はまた二重膜子嚢菌として同定される新規菌株ＭＦ５
４６６を使用する醗酵操作で得られる。これらの生物の
使用について本明細書中に詳細に説明するけれども、ス
ポロルミエラ及びプレウシア（Ｐｒｅｕｓｓｉａ）属の
他の生物は前記生物の変異体を含めて本発明の化合物を
同様に産生することができ、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】菌株ＭＦ５４４７はワタオウサギ糞（アリ
ゾナ州）から分離される糞生菌の培養物である。この菌
株はＡＴＣＣ（１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉ
ｖｅ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ２０８５２）にＡ
ＴＣＣ２０９８５　として寄託されている。菌株ＭＦ５
４６６はオオツノヒツジ（Ｔｕｃｓｏｎ，アリゾナ州）
糞から分離される糞生菌、二重膜子嚢菌の菌である。こ
の菌株はＡＴＣＣ２０９８９　として寄託されている。
【００１７】スポロルミエラインテルメジアとして同定
される菌株ＭＦ５４４７は、以下の形態学的の特徴を示
す。
【００１８】シカ糞又はオートミール寒天（Ｄｉｆｃｏ
製）のどちらかに接種すると、連続蛍光光線下２５℃で
１〜４週間で偽被子器が成熟する。接種したシカ糞の表
面の偽被子器は単独ないし濃く群生、埋没、上側は１０
〜５０％が表面上に突出、直径　２００〜３００　μｍ
、球形ないしほぼ球形、無孔口形、無毛性、鈍重、一様
な黒色、薄い殻壁、厚み細胞１〜２個、多角菌組織。殻
壁細胞は等径、直径４〜８μｍ、ＫＯＨ中で灰色ないし
暗いオリーブ色を帯びた灰色。
【００１９】子嚢多数、共通の基底区域から生じる。二
重膜、８−胞子、円柱形、直線ないしわずか湾曲、尖端
部広く丸みあり、　１２０〜１８０　×２０〜３５μｍ
、明確な基底菌柄があり、基底菌柄の長さ７〜１１μｍ
。側系多数、子嚢と混在、繊維状、隔壁あり、長さは子
嚢と大体同じ。 二重鋸歯状子嚢胞子、子嚢に内臓、４５〜５３×１０〜
１２μｍ、４細胞（４−ｃｅｌｌｅｄ）、隔膜が深く狭
窄、終端細胞は円いか又は先細の形、中間細胞は長円又
は壷形（ｄｏｌｉｆｏｒｍ）で、各細胞は不鮮明な側面
の生殖質細隙（ｇｅｒｍ　ｓｌｉｔ）　を有する。薄い
、屈折性のガラス質鞘で包囲される。細胞は容易に分離
することが多い。ＫＯＨ中で暗いオリーブ色を帯びた灰
色。
【００２０】馬鈴薯デキストロース（Ｄｉｆｃｏ製）寒
天上、室温７日間で直径１０〜１２ｍｍの集落、僅かに
突起、奥行約　０．５〜１ｍｍ、余白部水浸。表面はフ
ェルト状ないしビロード状、早期はクリーム色、間もな
く淡い灰色ないし黒ずんだ灰色、又は最後に暗いオリー
ブ色を帯びた灰色ないしほとんど黒色。火薬筒草色（Ｃ
ａｒｔｒｉｄｇｅ　Ｂｕｆｆ）（色名はＲ．　Ｒｉｄｇ
ｗａｙ著、Ｃｏｌｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，
　Ｄ．　Ｃ．　１９１２年刊による）、マーガレット黄
色（Ｍａｒｇｕｅｒｉｔｅ　Ｙｅｌｌｏｗ）　、オリー
ブ草色（ＯｌｉｖｅＢｕｆｆ）、明るい灰色を帯びたオ
リーブ色（Ｌｉｇｈｔ　Ｇｒａｙｉｓｈ　Ｏｌｉｖｅ）
　、灰色を帯びたオリーブ色（Ｇｒａｙｉｓｈ　Ｏｌｉ
ｖｅ）　、濃い灰色を帯びたオリーブ色（Ｄｅｅｐ　Ｇ
ｒａｙｉｓｈ　Ｏｌｉｖｅ）、鉄灰色（Ｉｒｏｎ　Ｇｒ
ａｙ）　、オリーブ色を帯びた黒色（Ｏｌｉｖａｃｅｏ
ｕｓ　Ｂｌａｃｋ）。背面は鈍い黄色がかったオリーブ
色ないしオリーブ色帯びた灰色ないし、暗いオリーブ色
を帯びた灰色。匂いと出液はない。２〜３週間より古い
集落では広範囲の黒い子座区域がしばしば発生する。子
座区域には埋没した融合性ないし群生の偽被子器を多数
含み得る。
【００２１】菌株ＭＦ５４６６は、同定されない二重膜
子嚢菌であって、以下の形態学的特徴を示す。
【００２２】集落は室温で馬鈴薯デキストロース寒天（
Ｄｉｆｃｏ製）上で直径１０〜１２ｍｍ。フェルト状、
ビロード状、側面が平滑ないし僅かおうとつ、奥行１ｍ
ｍまで、余白部水浸、しばしば集落色の異なる扇状化を
する。組織は靭性ないし弾性。集落周辺部はガラス質な
いし淡色、間もなく淡い灰色ないしオリーブ色がかった
灰色、最後に暗い灰色ないしオリーブ色がかった灰色、
クリーム色（Ｃｒｅａｍ　Ｃｏｌｏｒ）　、淡いスモー
クグレー（Ｐａｌｅ　Ｓｍｏｋｅ　Ｇｒａｙ）　、スモ
ークグレー（Ｓｍｏｋｅ　Ｇｒａｙ）、明るい灰色がか
ったオリーブ色（Ｌｉｇｈｔ　Ｇｒａｙｉｓｈ　Ｏｌｉ
ｖｅ）　、濃いオリーブグレー（Ｄｅｅｐ　Ｏｌｉｖｅ
　Ｇｒａｙ）　、鉄灰色（Ｉｒｏｎ　Ｇｒａｙ）　、オ
リーブ色がかった黒色。古い培養の扇状部によっては、
痕跡偽被子嚢器又は偽被子嚢器状構造を有する黒色小孔
組織（ｓｔｏｍａｔｉｃ　ｔｉｓｓｕｅ）　を形成する
ことがある。逆の色素形成は同様。匂いと出液はない。 色素形成と集落分化は栄養素の少い媒地、たとえばコー
ンミール寒天、麦芽エキス寒天、糞抽出物寒天、又は干
し草抽出物寒天では低下する。
【００２３】菌糸体は隔膜があり、高度に分枝し、波状
。しばしば回旋性ないし、小節があり、成分の直径は８
μｍまで、ＫＯＨ中で透明ないしオリーブ色又はオリー
ブ色がかった灰色。集落の古い区域では直径の同じ細胞
の基底子座帯を発生する。
【００２４】偽被子器状構造は直径　４００μｍまで、
鈍重、黒色、壁の薄い、直径の同じ細胞及び糸状菌糸、
多角菌組織又は多角菌組織と絡み合い菌組織の組合せ、
直径８μｍまでの直径の同じ細胞を有する。オートミー
ル寒天上で４〜６週後にこれらの痕跡偽被子器のいくつ
かで未完成の二重膜子嚢が観察されたが、子嚢の成熟前
に培養菌は絶滅する。
【００２５】本発明の化合物は、同化可能な炭素源及び
窒素源を含有する水性栄養培地中で好ましくは好気的条
件下に、前記の微生物を培養することによりつくること
ができる。栄養培地には無機塩及び消泡剤をも含有し得
る。
【００２６】栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコー
ス、グリセリン、澱粉、デキストリン等の炭水化物であ
る。含有し得る他の源泉としてはマルトース、マンノー
ス、サクロース等がある。更に、オート麦粉、ひき割ト
ウモロキシ、キビ（ｍｉｌｌｅｔ）、トウモロコシ等の
ような複合栄養源も利用可能な炭素を供給し得る。培地
中に使用される炭素源の正確な量は、多少は培地中の他
の配合成分に応じて変るが、通常　０．５〜５重量％の
範囲の量であると認められる。これらの炭素源は所定の
培地に個別に使用し、又は同じ媒地で幾つかの源泉を組
合せて使用することができる。
【００２７】好ましい窒素源は、グリシン、メチオニン
、プロリン、スレオニン等のようなアミノ酸と同様に、
酵母エキス（加水分解物、自己分解物）、乾燥酵母、ト
マトペースト、あらびき大豆粉、ペプトン、コーンステ
ィープリカー、ディスティラースソルブルス（ｄｉｓｔ
ｉｌｌｅｒｓ　ｓｏｌｕｂｌｅｓ）　、麦芽エキス等の
ような複合源がある。アンモニウム塩（たとえば硝酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等）
のような無機窒素源も使用することができる。いろいろ
の窒素源を単独か又は組合せて媒地に対し　０．２〜９
０重量％の範囲の量を使用することができる。
【００２８】炭素源と窒素源は組合せて使用されるのが
一般的であるが、純粋な形である必要はない。痕跡の成
長因子、ビタミンを含有する余り純粋でない材料、及び
無機栄養源も使用し得る。炭酸カルシウム、燐酸ナトリ
ウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、マグ
ネシウム塩、銅塩、コバルト塩等のような（但しこれら
に限定するのではない）無機塩も媒質に添加し得る。マ
ンガン、鉄、モリブデン、亜鉛等のような痕跡金属も含
められる。更に、必要の場合、特に培地がひどく泡立つ
場合、ポリエチレングリコール又はシリコーンのような
消泡剤を添加し得る。
【００２９】本発明の化合物の好ましい製造方法は、適
切な媒地中に産生生物の胞子又は菌糸体を接種し、次い
で好気的条件下に培養することから成る。
【００３０】醗酵操作は一般に保存した種株を栄養種培
地に先ず接種し、次いで活性化合物の製造に種として役
立つ生物の増殖を、時により２段階で達成することであ
る。接種後、フラスコを２０〜３０℃、好ましくは２５
〜２８℃の範囲の温度で撹拌下に温置した。撹拌速度は
４００ｒｐｍまで、好ましくは　２００〜２２０ｒｐｍ
の範囲であり得る。種フラスコは２〜１０日、好ましく
は２〜４日の間にわたり温置する。増殖が充分になった
とき、通常２〜４日で、この培養物を製造用の媒地フラ
スコに接種するのに使う。次の段階の種の増殖は、特に
より大きい容器に進む場合に使用し得る。これを行う場
合は培養増殖の１部を使用して第２の種フラスコに接種
し同様な条件であるがもっと短時間の使用により温置す
る。
【００３１】接種後、醗酵産生媒地は３〜３０日、好ま
しくは４〜１４日間温置し、撹拌を使用し又は使用しな
い（使用する醗酵培地が液体か固体かに左右される）。 醗酵は２０〜４０℃の範囲の温度で好気的に実施される
。撹拌を使用する場合、　２００〜４００ｒｐｍの速度
であり得る。最適の結果を得るには、温度は２２〜２８
℃、もっとも好ましくは２４〜２６℃の範囲である。活
性化合物の産生に適する栄養培地のｐＨは　３．５〜８
．５　、もっとも好ましくは　５．０〜７．５　の範囲
である。所望の化合物の産生に対する適切な時間の後、
醗酵フラスコから収穫し、活性化合物を分離する。
【００３２】アルコール系溶媒及びエステル又はケトン
のような酸素含有溶媒の混合物を使用して固体の醗酵培
地から本発明の化合物を抽出する。
【００３３】混合物を激しく撹拌して濾過し、濾液を減
圧下に濃縮する。濃縮物に水を加え、鉱酸を用いてｐＨ
を約３に調節する。次いで水性濃縮物を水と混和しない
酸素含有溶媒を用いて繰返し抽出する。水と混和しない
有機層を分けて蒸発乾固する。次いで一般的には、吸着
及び分配クロマトグラフィー並びに沈降のような幾つか
の分離ステップに付する。各分離ステップについて、画
分を集め検定及び／又はＨＰＬＣ／ＴＬＣ分析による結
果に基いてまとめる。
【００３４】固体醗酵の抽出用の好ましい溶媒はメタノ
ールと２−ブタノンの１：１混合物である。最初の抽出
物を濃縮して水で希釈した後は、分配溶媒はジクロルメ
タンが好ましい。
【００３５】クロマトグラフィーによる分離はイオン性
又は非イオン性樹脂により慣用のカラムクロマトグラフ
ィーを使用して実施し得る。Ｅ．　Ｍｅｒｃｋ社から入
手し得るようなシリカゲルは好ましい吸着剤である。シ
リカゲルが吸着剤である場合、メタノール／クロロホル
ム／酢酸／水のようなアルコール／塩素化炭化水素／有
機酸混合物が溶離剤として有用である。逆相クロマトグ
ラフィーについては、好ましい吸着剤はＣ８　結合相シ
リカゲルである。逆相クロマトグラフィーに好ましい溶
離剤は、　０．１％燐酸、又はトリフルオロ酢酸により
低いｐＨに緩衝したアセトニトリル及び水の混合物であ
る。Ｄｏｗｅｘ−１（Ｃｌ−　）又はＤｏｗｅｘ−５０
（Ｃａ＋＋）のようなイオン性樹脂も精製に有用である
。活性化合物はキニーネ塩のような無極性溶媒から沈降
させることができる。沈降用の好ましい溶媒はジエチル
エーテルである。
【００３６】本発明は、コレステロール生合成を制御す
る方法をも目的とし、その方法は、構造式（Ｉ）で表わ
される化合物及びその薬学的に許容し得る塩の無毒性で
医療上有効な量を、この種の治療を要する患者に投与す
ることを含む。詳細には、本発明の化合物はヒトの動脈
硬化症、高脂質血症、家族性高コレステロール血症及び
疾患の治療のための抗高コレステロール血症薬として有
用である。それらはカプセル剤、錠剤、注射用製剤等の
形で経口又は非経口で投与し得る。用量はヒト患者の年
齢、重篤度、体重及び他の症状に応じて変化し得るが、
成人に対する日用量は約２０〜２０００ｍｇ（好ましく
は２０〜１００ｍｇ）の範囲内であり、２〜４回の分割
量で与え得る。必要により更に高い用量を有利に使用し
得る。
【００３７】本発明の化合物の薬学的に許容し得る塩に
は、陽イオン、たとえばナトリウム、カリウム、アルミ
ニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛か
ら形成される塩、及び塩基、たとえばアンモニア、エチ
レンジアミン、Ｎ−メチル−グルカミン、リジン、アル
ギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエ
チレンジアミン，クロロプロカイン，ジエタノールアミ
ン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエ
チルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、及びテトラメチルアンモニウムヒドロキ
シドから形成される塩が挙げられる。本明細書に含まれ
る塩は１個、２個又は３個全部のカルボキシル基が塩の
形であるものを包含する。
【００３８】本発明の化合物は、胃腸管内で非再吸収性
の形に胆汁酸を結合することのできる薬学的に許容し得
る無毒性陽イオンポリマーと共に同時投与もし得る。こ
のようなポリマーの例にはコレスチラミン、コレスチポ
ール及びポリ［メチル−（３−トリメチルアミノプロピ
ル）イミノ−トリメチレンジハロゲン化物］が挙げられ
る。本発明の化合物とこれらのポリマーの相対的な量は
　１：１００〜１：１５，０００の間である。
【００３９】本発明の代表的な化合物の内因的スクアレ
ンシンテターゼ阻害作用を下記の標準的生体外プロトコ
ルにより測定した。
【００４０】ミクロソームの調製 　　雄のＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　ＣＤラット（１
２０〜１５０ｇ）にロバスタチン　０．１％含有の飼料
を４日間与えた。これらのラットの肝を、５倍容（ｍｌ
／ｇ）の氷冷したＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエ
チル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）５０ｍＭ
、ＥＤＴＡ（エレチンジアミン四酢酸）５ｍＭ、ｐＨ　
７．５液中でポッター−エルベージェム組織摩砕機を用
いて均質化した。ホモジェネートを４℃で１５分間２０
，０００×ｇで２回遠心分離し、そのつどペレットを捨
てた。次いで上澄を４℃で１時間　１００，０００×ｇ
で遠心分離した。元のホモジェネートの体積の５分の１
に相当する容積の前記均質化緩衝液中に、得られたミク
ロソームペレットを再懸濁した。このミクロソーム製剤
は蛋白質濃度約７ｍｇ／ｍｌを有する。ミクロソーム懸
濁液を小分けして−７０℃で貯蔵した。これらのアリコ
ート中のスクアレンシンテターゼ活性は少くとも数ヶ月
間安定である。
【００４１】プレニルトランスフェラーゼの一部精製　
　プレニルトランスフェラーゼを精製して放射性標識し
たファルネシルピロリン酸の酵素的合成に使用した。プ
レニルトランスフェラーゼはＲｉｌｌｉｎｇ（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１１０，１２５
〜１２９　（１９８５））　の方法により検定し、活性
の単位は、標準的検定で３０℃で毎分１μｍｏｌ　のフ
ァルネシルピロリン酸を産生する酵素の量として定義す
る。
【００４２】５％コレスチラミン＋　０．１％ロバスタ
チンで飼育した２３頭の４０日令の雄ラットの肝を、　
０．１トリプシン阻害体単位のアプロチニン／ｍｌを含
有するメルカプトエタノール１０ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ
、ロイペプチン２５μＭ　、フェニルメチルスルホニル
フルオリド　０．００５％、ｐＨ　７．０溶液１ｌ中で
ワーリングブレンダーで均質化した。 ホモジェネートを２０，０００×ｇで２０分間遠心分離
した。上澄を６Ｎ酢酸を用いてｐＨ５．５に調整し、　
１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。この上澄を
３Ｎ　　ＫＯＨを用いてｐＨ　７．０に調整し３５〜６
０％硫酸アンモニウム画分を採集した。ペレット６０％
をリン酸カリウム１０ｍＭ、メルカプトエタノール１０
ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ　７．０（緩衝液Ａ）６０
ｍｌに再溶解して、１ｌの緩衝液Ａを２度交換し透析し
た。 この透析した画分を緩衝液Ａを用いて平衡にしたＤＥＡ
Ｅ−セファロース４Ｂの１２．５×５ｃｍカラムにかけ
る。カラムを　７００ｍｌの緩衝液Ａを用い、緩衝液Ａ
からリン酸カリウム　１００ｍＭ、メルカプトエタノー
ル１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ　７．０溶液までの
勾配で計１ｌの液で洗浄した。０．２０単位／ｍｇより
大きい比活性を有する画分をまとめ、固体の硫酸アンモ
ニウムを加えて飽和の６０％にしペレットにした。ペレ
ットをトリス１０ｍＭ、β−メルカプトエタノール１０
ｍＭ、ｐＨ　７．０溶液８ｍｌ（緩衝液Ｂ）に溶解した
。再溶解したペレットに、緩衝液Ｂに硫酸アンモニウム
を飽和した液を　１．５倍体積を加えて、硫酸アンモニ
ウムの飽和の６０％にした。この硫酸アンモニウム懸濁
液は０．２３単位／ｍｇの比活性を有し　３．５単位／
ｍｌを含有して、イソペンテニルピロリン酸イソメラー
ゼ活性がなかった。この硫酸アンモニウム懸濁液を［４
−１４Ｃ］ファルネシルピロリン酸の合成用に使用し、
その活性は少くとも６ヶ月間４℃で貯蔵して安定であっ
た。
【００４３】［４−１４Ｃ］ファルネシルピロリン酸の
酵素的合成 　　５５μＣｉの［４−１４Ｃ］イソペンテニルピロリ
ン酸（４７．９μＣｉ／μｍｏｌ）からロータリーエバ
ポレータにより溶媒（エタノール：０．１５Ｎ　　ＮＨ
４　ＯＨ，１：１）を除去した。トリス　１００ｍＭ，
ＭｇＣｌ２　１０ｍＭ，ジチオトレイトール４ｍＭ，ｐ
Ｈ　７．５溶液　６００μｌを添加して、溶液を１．５
ｍｌのエッペンドルフ遠心管に移した。ゲラニルピロリ
ン酸、２０ｍＭ溶液　２５０μｌ、及び５０μｌのプレ
ニルトランスフェラーゼの硫酸アンモニウム懸濁液を加
えて反応を開始させた。この温置物　９００μｌは５μ
ｍｏｌ　のゲラニルピロリン酸、１．１５μｍｏｌ　の
イソペンテニルピロリン酸、６μｍｏｌ　のＭｇＣｌ２
　及び０．１８単位のプレニルトランスフェラーゼを含
有していた。温置中に、ファルネシルピロリン酸のマグ
ネウム錯塩が生成して溶液から沈降するのに伴って、混
合物は白濁した。［４−１４Ｃ］ファルネシルピロリン
酸をエッペンドルフ遠心管中で　１４，０００ｒｐｍで
３分間遠心分離して捕集し、上澄を除いて、ペレットを
ＨＥＰＥＳ５０ｍＭ，ＥＤＴＡ５ｍＭ，ｐＨ　７．５溶
液　１．０ｍｌに溶解した。収量は［４−１４Ｃ］ファ
ルネシルピロリン酸５０．７μＣｉ（９２％）であった
。［４−１４Ｃ］ファルネシルピロリン酸は小分けして
−７０℃で貯蔵した。
【００４４】スクアレンシンテターゼ検定　　１６×１
２５ｍｍ　のねじぶた試験官中で反応を行った。各検定
用の混合物を次の溶液から調製した。
【００４５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１検定当りμｌ　
　５０検定用体積１．ＨＥＰＥＳ　　２５０ｍＭ，　ｐ
Ｈ　７．５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
０　　　　　　　　　　　　１０００２．ＮａＦ　　１
１０ｍＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　
５００３．ＭｇＣｌ２　５５ｍＭ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　
　　　　　　　　　　５００４．ジチオトレイトール　
　３０ｍＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　５００５．ＮＡＤＰＨ
１０ｍＭ（新しくつくる）　　　　　　　　　　　　　
　１０　　　　　　　　　　　　　５００６．［４−１
４Ｃ］ファルネシルピロリン酸　　　　　　４７．９μ
Ｃｉ／μｍｏｌ　及び　０．０２５μＣｉ／　３．０μ
ｌ　　　３．０　　　　　　　　　　　１５０７．Ｈ２
　Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２４　　　　　　　　
　　　　１２００ この検定混合物は真空によりガスを抜き、Ｎ２　でフラ
ッシュした。スクアレンシンテターゼ阻害剤の溶液をＤ
ＭＳＯかＭｅＯＨのどちらかで調製し、ミクロソーム蛋
白質の１：１２０　溶液を元の均質化緩衝液を用いてつ
くった。各反応について、８７μｌの検定混合物を３μ
ｌの阻害剤（対照の場合にはＤＭＳＯ又はＭｅＯＨ）と
共に、水浴で３０℃に温め、次いで１０μｌのミクロソ
ーム蛋白質の１：１２０　希釈液（検定中の蛋白質合計
　０．６μｇ）の添加により反応を開始した。２０分後
に１００μｌの４０％ＫＯＨと９５％ＥｔＯＨの１：１
混合液の添加により反応を止めた。止めた混合物を６５
℃に３０分間加熱して、冷却し、１０ｍｌのヘプタンを
加えて混合物を渦動させた。次いで２ｇの活性化アルミ
ナを加えて、再び混合物を渦動させ、アルミナを沈ませ
て、５ｍｌのヘプタン層を除いた。１０ｍｌのシンチレ
ーション流体をヘプタン溶液に加えて、液体シンチレー
ション計数により放射能を測定した。
【００４６】阻害百分率は次式により計算する。
【００４７】 　　　　　　　　｛１−（試料−ブランク）／（対照−
ブランク）｝×１００ ＩＣ５０値は試験化合物の濃度の対数阻害百分率をグラ
フ化して決定した。ＩＣ５０はこれらのグラフから決定
される５０％阻害を生じる阻害剤の濃度である。
【００４８】本発明の化合物の内因性スクアレンシンチ
ターゼ阻害活性を表現する。ＩＣ５０のデータを以下に
表示する。
【００４９】 　　　　　　　　　　　　　　化合物　　　　　　　　
　　　　スクアレンシンテターゼＩＣ５０　　　　　　
　　　　　　　　化合物Ａ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　＜５μＭ　　　　　　　　　　　　　　
化合物Ｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜
５μＭ本発明化合物は、肉汁／寒天希釈法で測定される
広範なスペクトルの抗真菌活性をも実際に示す。化合物
はカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）及びクリプトコッカスネオホルマンス（Ｃｒｙ
ｐｔ．　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）　を含めて糸状菌及び
酵母に対して特に活性である。糸状菌及び酵母の感受性
は、マイクロタイター型式の阻害剤希釈検定を使用して
測定した。化合物をＤＭＳＯ中に溶解して２ｍｇ／ｍｌ
とし、マイクロタイター皿で　０．１Ｍリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．０）で順次希釈して　１００〜０．００６　
μｇ／ｍｌとした。 寒天　１．５％を含有する抗生物質培地＃３に胞子を接
種して　１．５×１０３　コロニー形成単位をウェル毎
に添加したようにして糸状菌を試験するための標準化し
た胞子懸濁液を調製した。マイクロタイターウェルには
化合物を含有する５０μｌの緩衝液と５０μｌの接種さ
れた培地とを入れた。酵母の感受性を定量するには、３
５℃で酵母形態（ＹＭ）培地で増殖した終夜酵母培養物
のアリコートを用いてデキストロース１％を含有する酵
母窒素塩基（ＹＮＢ／Ｇ）に接種し、ＹＮＢ／Ｇ中の希
釈により　１．５〜７．５　×１０３　コロニー形成単
位／ウェルの最終濃度を生じるようにすることによった
。　１５０μｌの接種培地をウェル毎に添加した。酵母
の感受性を試験するため、化合物をＤＭＳＯ１０％水溶
液中で可溶化して２．５６ｍｇ／ｍｌとした。化合物を
ＹＮＢ／Ｇ中で　１２８〜０．０６μｇ／ｍｌに順次希
釈した。ウェルに薬剤含有培地　１５０μｌを入れた。 最小阻止濃度（ＭＩＣ）とは、糸状菌に対しては２８℃
で４２時間、酵母に対しては３５℃で２４〜４８時間、
温置した後増殖を阻止する最低濃度と定義する。最小殺
真菌濃度（μｇ／ｍｌ）とは、集落の増殖を全く阻止す
るか又は３個未満しか許さない薬物の最低濃度と定義す
る。抗真菌活性を表現する最小阻止濃度及び最小殺真菌
濃度を下記に示す。
【００５０】 このように本発明は真菌感染を治療する方法をも目的と
し、その方法は構造式（Ｉ）で表わされる化合物及びそ
の薬学的に許容し得る塩の無毒性で医療上有効な量を、
この種の治療を要する生物に投与することから成る。抗
真菌治療の１回量として一般に２〜５ｍｇ／ｋｇを使用
しなければならないことが、前記ＭＩＣデータに基いて
決定される。
【００５１】本発明の化合物は抗真菌性組成物の種々の
用途に利用されるように適合できる。この種の使用には
、生理的に不活性なキャリアと、一般には界面活性分散
化剤の力を借りて化合物を混和し得る。キャリアの種類
は、使用目的が人のような哺乳動物、又は鳥類若しくは
爬虫類に感染する病原体の規制とか、土壌又は植物局部
におけるような農業における菌類の規制とか、無生物対
象での菌類の規制であることに応じて変るであろう。
【００５２】医薬用の組成物では、化合物を薬学的に許
容し得るキャリヤと混和し得る。キャリアの性質は組成
物が局所用、非経口用又は経口用を目的とするかどうか
に応じて変る。
【００５３】前記の適用が局所性である場合、薬物は白
色ワセリン、無水ラノリン、セチルアルコール、コール
ドクリーム、モノステアリン酸グリセリン、バラ香水等
を用いて、慣用のクリーム剤及び軟膏剤に配合し得る。
【００５４】非経口的適用には、塩化ナトリウム０．８
５％若しくはデキストロース５％の水溶液のような慣用
の注射液、又は他の薬学的に許容し得る組成物に、化合
物を配合し得る。
【００５５】経口投与用組成物は、成分薬剤を通常の医
薬用基剤のいずれかとよく混合することにより調製し得
る。液剤の調製には、水、グリコール、油、アルコール
等のような液体キャリヤを含め、カプセル剤及び錠剤の
ような固形製剤には、一般にステアリン酸カルシウムの
ような滑剤と共にデンプン、糖、カオリン、エチルセル
ロースのような固体キャリヤ、界面活性分散剤と一緒に
、結合剤、崩壊剤等を含める。
【００５６】次いでこれらの組成物を、所望の抗真菌効
果を得るのに充分な量で投与する。医療用適用の方法は
、治療上有効な抗真菌的量の式Ｉの化合物を治療を要す
る患者に投与することを含む。適切な用量は年齢、重篤
度、体重及び他の症状に応じて変る。局所用の組成物は
抑制を望む区域に直接適用される。体内の投与には、組
成物を注射により、又は経口的に投与し得る。
【００５７】医療外の適用には、本発明の化合物は単独
又は混合物としてのいずれかで、不活性キャリヤ中で組
成物にして使用し得る。キャリヤには微粉化した乾燥又
は液状の希釈剤、増量剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）、充填剤
（ｆｉｌｌｅｒ）、調整剤（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）
　及び賦形剤が挙げられ、各種の粘土、珪藻土、タルク
等、又は水並びに各種の有機液体、たとえばエタノール
及びイソプロパノールのような低級アルカノール、若し
くは灯油、ベンゼン、トルエン及び他の石油留分又はそ
の混合物が含まれる。
【００５８】これらの組成物は防疫される媒体の表面に
施用し、又はそれに混入することにより使用し得る。イ
ネいもち病、トマト疫病、トマト輪紋病、コムギ赤サビ
病、マメうどんこ病及びトマト萎ちょう病の防除用には
、組成物を局所施用で植物に直接適用し、又は全体施用
のため土壌に投与し得る。その方法は防疫される病害植
物、土壌又は媒体に、抗真菌的に有効な量の式Ｉの化合
物を投与することを含む。
【００５９】
【実施例】次の実施例により式（Ｉ）の化合物の製造及
びそれらの医薬組成物への配合を説明するが、それ自体
として、本発明の前記請求項を限定すると考えてはいけ
ない。化合物Ａを得る好ましい経路は実施例２である。
【００６０】次の実施例で使用される培地の組成を下記
に表示する。
【００６１】 ＹＭＥ平板培養培地 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　成　　分　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　酵母エキ
ス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
．０ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　麦芽エキ
ス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
．０ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　グルコー
ス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
．０ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　蒸溜水　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０００ｍｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　カ
ンテン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２５．０ｇＫＦ種培地 　　　　　　　　　　　　　　　　　　トウモロコシ浸
出液　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ／ｌ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　トマトペースト　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇ／ｌ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　オート麦粉　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ／ｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　グルコース　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ
／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　微量元素ミ
ックス　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｌ
／ｌ　　ｐＨ　６．８に調整（事前滅菌） バッフルのない　２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ
中に５０ｍｌ採取。
【００６２】 　　オートクレーブ２０分（１２１℃，１５ｐｓｉ）微
量元素ミックス 　　　　　　　　　　ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０ｇ／ｌ　
　　　　　　　　　ＭｎＳＯ４　・４Ｈ２　Ｏ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０ｇ／ｌ　　
　　　　　　　　ＣｕＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２５ｇ／ｌ　
　　　　　　　　　ＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ／ｌ　　
　　　　　　　　Ｈ３　ＢＯ３　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５
６ｇ／ｌ　　　　　　　　　　（ＮＨ４　）６　Ｍｏ７
　Ｏ２４・４Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　０．０１９ｇ
／ｌ　　　　　　　　　　ＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２ｇ／
ｌ　　　０．６Ｎ　　ＨＣｌ　　１ｌ中に溶解製造培地 　　Ｆ２０４ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　キビ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５
．０ｇ／フラスコ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　基剤液＃１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１０．０ｍｌ／フラスコ　　基剤液＃１ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　酵母エキス　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０．０ｇ
／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　グルタミン
酸モノナトリウム　　　　　　１０．０ｇ／ｌ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　トウモロコシ油　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｍｌ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　酒石酸ナトリウム　　　　
　　　　　　　　　　　　１０．０ｇ／ｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　
　　　　　　　　　　　　１．０ｇ／ｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　蒸留水　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１０００．０ｍｌ　　（ｐ
Ｈ調整なし） 　　オートクレーブ１５分（１２１℃，１５ｐｓｉ）　
　蒸溜水１５．０ｍｌ／フラスコ添加　　オートクレー
ブ２０分（１２１℃，１５ｐｓｉ）　　ＢＲＦ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　玄米　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
．０ｇ／フラスコ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　基剤液＃２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２０．０ｍｌ／フラスコ　　基剤液＃２ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　酵母エキス　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０ｇ
／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　酒石酸ナト
リウム　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＫＨ２　ＰＯ
４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
５ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　蒸溜水
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０００．０ｍｌ　　（ｐＨ調整なし） 　　オートクレーブ１５分（１２１℃，１５ｐｓｉ）　
　蒸溜水１５．０ｍｌ／フラスコ添加　　オートクレー
ブ２０分（１２１℃，１５ｐｓｉ） 実施例１　　化合物Ａの製造 Ａ．ＭＦ５４４７の培養 　　ガラスさじ１杯の土壌を使用して土壌管から接種し
て、菌株ＭＦ５４４７をＫＦ種培地中で２５℃、２２０
ｒｐｍ、湿度８５％で７２時間増殖した。この温置期の
最後に、アリコート　２．０ｍｌを４５個のＦ２０４　
２５０ｍｌ　容エルレンマイヤー製造フラスコのそれぞ
れに無菌的に移した。製造フラスコを２５℃で２１日間
静置して温置した後収穫した。収穫時に各フラスコに４
０ｍｌのメチルエチルケトンを添加し、固体の増殖物を
細片に手でほぐした。次いでフラスコを旋回振とう機に
載せ、菌糸体の塊を更に解体すると同時に溶媒と細胞と
の接触を増進するため、２２０ｒｐｍで３０分振とうし
た。振とう後、フラスコの内容物全部（固体も含め全部
）を４ｌビーカーに注いで混合物のフラスコの内容と一
緒にした。
【００６３】Ｂ．化合物Ａの単離 　　実施例１Ａに記載の２１日間培養した、約２ｌの醗
酵抽出物からメチルエチルケトン液を濾して除いた。次
いで酢酸エチルとメタノールの混合物（１：１，２ｌ）
を固体残留物に添加した。これを機械的撹拌機を使用し
て１８時間撹拌した。混合物を濾過して、濾液を濃縮（
Ｒｏｔｏｖａｐ装置，４０℃）して大体７００ｍｌ　と
した。酢酸エチル（７００ｍｌ）　を加え、さらに５％
食塩水５００ｍｌ　を追加した。１５分間撹拌した後、
水層を除いて捨てた。酢酸エチル層を濃縮（Ｒｏｔｏｖ
ａｐ装置，４０℃）して大体１５０ｍｌ　とした。ヘキ
サン（５００ｍｌ）　とメタノール（５００ｍｌ）　を
加えて、混合物を１５分間撹拌した。ヘキサン層を除去
して捨てた。メタノール層を乾燥（Ｒｏｔｏｖａｐ装置
，４０℃）して粗抽出物を得た。
【００６４】粗抽出物（１．４ｇ）を２５ｍｌの３：１
：１ヘキサン／トルエン／メタノール中に溶解して　Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０クロマトグラフィーカラム
（樹脂１ｌ）に対し、同じ混合媒体を用いて約３ｍｌ／
分の流速で溶離した。最初の１６００ｍｌの溶離液は捨
てた。次の３６００ｍｌの溶離液を濃縮して乾固し、Ｌ
Ｈ−２０溶出物を得た。約　３１０ｍｇのＬＨ−２０溶
出物を５ｍｌの５％メタノール／クロロホルムに溶解し
た。これをシリカゲルクロマトグラフィーカラム（５０
ｍｌのＥ．　Ｍｅｒｃｋ製Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　４０〜
６３μｍ）に通した。 カラムを後記の表１ａに示すように段階的に溶離した。 画分４〜６をまとめ、乾燥して油状残留物を得た。残留
物（１１５ｍｇ）　を４ｍｌのテトラヒドロフランに溶
解して、５ｍｌの　０．００５Ｎ塩酸を加えた。生じた
懸濁液を遠心分離した（１０，０００ｒｐｍ；２０分）
。上澄を除去して捨て沈降物を得た。
【００６５】この沈降物の２４ｍｇを　０．２ｍｌのテ
トラヒドロフランに溶解して　０．２ｍｌのジメチルス
ルホキシドを添加した。次いで１０％テトラヒドロフラ
ン／水を用いて平衡にしたＲＰ−１８クロマトグラフィ
ーカラム（３０ｍｌの　Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ製４０μｍ
　　ＲＰ−１８）の樹脂床にこれを吸着させた。段階的
溶離（後記表１ｂ）に続いて、画分のＨＰＬＣ分析及び
バイオ検定を行った。画分２〜７をまとめて濃縮し約５
０ｍｌにした。水溶液を５０ｍｌの酢酸エチルを用いて
抽出した。酢酸エチル抽出物を乾燥して、　０．３ｍｌ
のメタノールに溶解し、続いてジメチルスルホキシド　
０．４ｍｌ、水　０．１ｍｌ及びアセトニトリル４３％
／リン酸カリウム１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ　７）　０．０
５ｍｌを添加した。この溶液をＨＰＬＣカラム（Ａｍｉ
ｃｏｎ　Ｍａｔｒｅｘ　Ｓｉｌｉｃａ　ＭＣ−１００Ａ
　　Ｃ８　１５μｍ、内径４．６ｍｍ×２５ｃｍ）に注
入し、アセトニトリル４３％／リン酸カリウム１０ｍＭ
緩衝液（ｐＨ７）を用いて、１ｍｌ／分で溶離した。画
分９〜１２をまとめて、０．０５ｍｌの　０．５Ｎ塩酸
を加え、続いて１０ｍｌの酢酸エチルを加えた。酢酸エ
チル層を乾燥して化合物Ａを得た。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】 実施例２　　化合物Ａの製造 Ａ．ＭＦ５４４７の培養 　　２３個のＦ２０４　フラスコに接種して醗酵時間を
１４日としたほかは、醗酵操作は実施例１と同じであっ
た。５０ｍｌのメタノールを各フラスコに添加し、次い
で増殖物を手でほぐし、実施例１Ａに前記したようにフ
ラスコを振とうした。フラスコの内容物は、３ｌビーカ
ーに内容物全体を注ぎ込むことによりまとめた。
【００６８】Ｂ．化合物Ａの単離 　　実施例２Ａに記載の１４日間培養した約２ｌの醗酵
抽出物に１ｌのメタノールを追加し、１６時間激しく撹
拌して濾過した。もう一度１ｌのメタノールを残った固
体に加え、４時間撹拌して濾過した。メタノール抽出物
と合せて濃縮（Ｒｏｔｏｖａｐ装置，４７℃）し大体　
２００ｍｌにした。水（３００ｍｌ）　を濃縮物に添加
して、塩酸を用いてｐＨを３に調整した。ｎ−ブタノー
ル（５００ｍｌ）　を加えて２０分間撹拌した。有機層
を取って、蒸発乾固し、黒いタールを得た。 実施例１及び３に記載したのと同様な仕方で、これをシ
リカゲル上でクロマトグラフにかけた（２．９ｇ）。化
合物Ａを含有する画分（ＨＰＬＣ分析の結果による）を
まとめて蒸発乾固した（Ｒｏｔｏｖａｐ装置，４０℃）
。油状残留物（２３０ｍｇ）　を１ｍｌのジメチルスル
ホキシドに溶解してＨＰＬＣカラム（ＤＹＮＡＭＡＸ　
　６０Ａ　　８μ　　Ｃ８　；内径２１．４ｍｍ×２５
ｃｍ，防護素子付）に注入し、表２ａに示す溶媒勾配に
より１０ｍｌ／分の流速で溶離した。５ｍｌごとに画分
を捕集し、画分３７〜４２をまとめた。酢酸エチル（５
０ｍｌ）と水（５０ｍｌ）を添加した。抽出後、酢酸エ
チル層を分離して乾燥（Ｒｏｔｏｖａｐ装置，４０℃）
し、化合物Ａを得た。
【００６９】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　２ａ　　　　　　　　　　　　シ
リカゲル濃厚カットの分取精製ＨＰＬＣの濃度勾配　　
　　時間（分）　　　　　　Ｈ３　ＰＯ４　　０．１％
／水中の溶媒（アセトニトリル）％　　　　　　０〜１
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０
％一定　　　　　　１０〜２０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　７０〜９０％，直線勾配　　　
　　　２０〜３０　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　９０％一定分析用ＨＰＬＣ系： カラム：Ｄｙｎａｍａｘ−６０Ａ　８μ　　Ｃ８　，内
径　４．６ｍｍ×２５ｃｍ，防護付（長さ　１．５ｃｍ
）　溶離液：８０：２０アセトニトリル／　０．１％リ
ン酸水溶液流　　速：　１．０ｍｌ／分 検　　出：　２５０ｎｍ紫外線 化合物Ａの保持時間：５．５２分 実施例３　　化合物Ａの製造 Ａ．ＭＦ５４６６の培養 　　菌株ＭＦ５４６６をＹＭＥ斜面で２５℃で少くとも
２週間増殖した。斜面上の増殖物の５分の１を、５４ｍ
ｌのＫＦ培地を含有する種フラスコに移した。次いで種
フラスコを２４℃、２２０ｒｐｍで７２時間温置した。 この温置を終って、Ｆ２０４　培地を含有する多数の　
２５０ｍｌエルレンマイヤー製造フラスコに２ｍｌずつ
アリコートを移した。次いで製造フラスコを２４℃で２
１時間静置のまま温置した。収穫時に、５０ｍｌの７０
％メタノールを製造フラスコに添加し、菌糸体増殖物を
ピペットを用いて手でほぐした。フラスコを２２０ｒｐ
ｍで３０分間振とうした。メタノール抽出物を一緒にし
て、濾過し残留物をまとめた。
【００７０】Ｂ．化合物Ａの単離 　　実施例３Ａの記載に従って生成した固体をまとめ、
１ｌのメタノールを用いて１５時間充分に抽出した。１
ｌの抽出物を　２５０ｍｌに濃縮して、同じ体積の水で
希釈し、ｐＨ　８．５に調整して　５００ｍｌの酢酸イ
ソプロピルを用いて抽出した。次いで水溶液を酸性化し
てｐＨ　４．０にし、酢酸エチルを用いて２回、１−ブ
タノールを用いて１回引続いて抽出した。各抽出物（酢
酸エチル抽出１，酢酸エチル抽出２，ブタノール抽出１
）を別々に濃縮して４０ｍｌにした。
【００７１】酢酸エチル抽出１の２０ｍｌ（総固形分２
５０ｍｇ）を濃縮して乾固し、５ｍｌ　９３　／４／１
／２クロロホルム−メタノール−水−酢酸に溶かした。 同じ溶媒で平衡にしておいたシリカゲル６０の１０ｍｌ
カラムに試料を充填した。次いでカラムを段階的に溶離
した（表３ａ参照）。
【００７２】 各画分の体積はそれぞれ５ｍｌであった。画分１８〜２
８をまとめて濃縮し乾固した。残留物（総固形分４０ｍ
ｇ）　を４ｍｌのテトラヒドロフランに溶解して、これ
を撹拌しながら５ｍｌの水を添加した。得られた不透明
な混合物を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。 油状沈降物（ｐｐｔ１）を生じ、回収した。
【００７３】酢酸エチル抽出２（４０ｍｌ）と酢酸エチ
ル抽出１の残り（２０ｍｌ）とを、シリカゲル及び沈降
ステップを介して同様な仕方で処理し、油状沈降物（ｐ
ｐｔ２）を生じた。２つの沈降物をまとめ（４３ｍｇ）
、　０．５ｍｌのジメチルスルホキシド及び　０．５ｍ
ｌのメタノールに溶解した。溶液をＨＰＬＣカラム（Ｄ
ＹＮＡＭＡＸ　　６０Ａ　　８μ　　Ｃ８　；内径２１
．４ｍｍ×２５ｃｍ，防護素子付）に注入し、表３ｂに
示す溶媒勾配により１０ｍｌ／分の流速で溶離した。５
ｍｌずつ画分を集め、画分２１〜３６をまとめた。酢酸
エチル（１００ｍｌ）を添加して、塩酸を用いて水性相
のｐＨを３に調整した。抽出後、酢酸エチル層を乾燥（
Ｒｏｔｏｖａｐ装置，４０℃）して化合物Ａを得た。
【００７４】 実施例４ 　　本発明の化合物の経口用組成物の詳細な実施態様と
して、実施例１の化合物２０ｍｇを、合計　５８０〜５
９０ｍｇ　となるように、微粉化した乳糖を用いて配合
し、大きさ０号の硬ゼラチンカプセルに充填する。
【００７５】実施例５　　アンモニウム塩の製造　　式
（Ｉ）の化合物の遊離酸　０．１ｍｍｏｌ試料を１０ｍ
ｌの酢酸エチルに溶解する。得られる溶液を気体アンモ
ニアで飽和することにより、アンモニウム塩が溶液から
沈澱する。
【００７６】実施例６　　カリウム塩の製造　　１０ｍ
ｌのメタノール中の式（Ｉ）の化合物の遊離酸　０．１
ｍｍｏｌの溶液を、　０．３ｍｍｏｌの水酸化カリウム
を含有する水溶液又はメタノール溶液を用いて処理する
。溶媒の蒸発によりトリカリウム塩を生じる。０．１〜
０．３ｍｍｏｌ　の水酸化カリウムの添加により同様に
モノカリウム塩、ジカリウム塩及びトリカリウム塩の混
合物を生じ、その組成は添加される水酸化カリウムの正
確な量に応じて変る。
【００７７】同様にしてナトリウム塩及びリチウム塩を
形成することができる。
【００７８】実施例７　　カルシウム塩の製造　　２０
ｍｌの６：４メタノール／水中の式（Ｉ）の化合物の遊
離酸　０．１ｍｍｏｌの溶液を水酸化カルシウム　０．
１ｍｍｏｌの水溶液を用いて処理する。溶媒を蒸発して
対応するカルシウム塩を得る。
【００７９】実施例８　　エチレンジアミン塩の製造　
　１０ｍｌのメノール中の式（Ｉ）の化合物の遊離酸　
０．１ｍｍｏｌの溶液を　０．１ｍｍｏｌのエチレンジ
アミンを用いて処理する。溶媒の蒸発によりエチレンジ
アミン塩を得る。
【００８０】Ｎ，Ｎ″−ジベンジルエチレンジアミン塩
の製造にもこの操作を適用することができる。
【００８１】実施例９　　トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン塩の製造 　　１０ｍｌのメタノール中の式（Ｉ）の化合物の遊離
酸　０．１ｍｍｏｌの溶液に、１０ｍｌのメタノールに
溶解した　０．１〜０．３ｍｍｏｌ　のトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンを添加する。溶媒の蒸発によ
り対応する塩を生じ、その正確な組成は添加されるアミ
ンのモル比が決定する。同様にしてＬ−オルニチン、Ｌ
−リジン及びＮ−メチルグルカミンの塩が製造される。
【００８２】実施例１０　　Ｌ−アルギニン塩の製造　
　１０ｍｌの６：４メタノール／水中の、式（Ｉ）の化
合物の遊離酸　０．１ｍｍｏｌの溶液を　０．１〜０．
３ｍｍｏｌ　のＬ−アルギニンの水溶液を用いて処理す
る。溶媒の蒸発により標題の塩を生じ、その正確な組成
は、使用する式（Ｉ）の遊離酸に対するアミノ酸のモル
比が決定する。
【００８３】実施例１１　　化合物Ｂの製造（方法１）
　　５ｍｌのメタノール／エーテル（１：１）中の化合
物Ａ　　２ｍｇの溶液を、僅か過剰のエーテル性ジアゾ
メタンを用いて処理した。５分後に過剰のジアゾメタン
を除去し、溶媒を蒸発して化合物Ｂを得た。
【００８４】実施例１２　　化合物Ｂの製造（方法２）
　　　０．５ｍｌのアセトニトリル中の化合物Ａ　　２
ｍｇの溶液を、１０当量のＤＢＵ及び１０当量のＭｅＩ
を用いて室温で処理する。２時間後に１０ｍｌのジクロ
ロメタンを用いて反応物を希釈し、１０ｍｌの０．１Ｍ
リン酸、１０ｍｌの水、１０ｍｌの重炭酸ナトリウム飽
和溶液及び１０ｍｌの水を用いて逐次洗浄する。硫酸ナ
トリウム上で脱水した後、有機層を濃縮し、残留物をヘ
キサンと酢酸エチルの混合物を使用してシリカゲル上で
クロマトグラフィーにより化合物Ｂを得る。
【００８５】実施例１２の方法は、１）エチル及び他の
低級アルキルのエステル並びに２）ベンジル及び置換ベ
ンジルのエステルのような他のエステル誘導体の製造に
も適当である。
【００８６】質量スペクトルデータ 　　質量スペクトルはＦｉｎｎｉｇａｎ−ＭＡＴモデル
ＭＡＴ２１２　（電子衝撃（ＥＩ）９０ｅＶ）、ＭＡＴ
９０（高速原子衝撃（ＦＡＢ））、及びＴＳＱ７０Ｂ（
ＦＡＢ，ＥＩ）質量分析計で記録した。正確な質量測定
は、内部標準としてペルフルオロケロシン（ＰＦＫ）又
はペルフルオロポリプロピレンオキシド（Ｕｌｔｒａｍ
ａｒｋ　Ｕ１６００Ｆ）を使用し高分解能（ＨＲ−ＥＩ
）で実施した。トリメチルシリル誘導体はＢＳＴＦＡ−
ピリジンの１：１混合物を用い室温で製造した。
【００８７】１３Ｃ　　ＮＭＲデータ 　　化合物Ａの１３Ｃ　　ＮＭＲスペクトルはＣＤ３　
ＯＤ中　１００ＭＨｚでＶａｒｉａｎ　　ＸＬ４００　
分光計で記録した。化学シフトは、内部標準として４９
．０ｐｐｍ　の溶媒ピークを使用しテトラメチルシラン
（ＴＭＳ）を０ｐｐｍ　としたｐｐｍ　で表す。
【００８８】　１Ｈ　　ＮＭＲスペクトル　　　１Ｈ　
　ＮＭＲスペクトルは、ＣＤ３　ＯＤ及びＣ６　Ｄ６　
中　４００ＭＨｚでＶａｒｉａｎＸＬ４００　分光計で
記録した。化学シフトは、内部標準として３．３０ｐｐ
ｍ　（ＣＤ３　ＯＤ）及び７．１５ｐｐｍ　（Ｃ６　Ｄ
６　）の溶媒ピークを使用し、ＴＭＳを０ｐｐｍ　とし
た　ｐｐｍで表す。
【００８９】構造Ｉの化合物の物理的性質：化合物Ａ−
構造（Ｉ）のＺ１　，Ｚ２　及びＺ３　がそれぞれ水素
である化合物。
【００９０】質量スペクトルデータ：　　この化合物は
ＦＡＢ−ＭＳによる分子量　７３０を有する（実測結果
［Ｍ＋Ｈ］＋　ｍ／ｚ　７３１。酢酸リチウムの付加を
伴う［Ｍ・Ｌｉ３　＋Ｌｉ］＋　即ちトリリチウム塩の
リチウム付加物ではｍ／ｚ　７５５）。ヘキサ−トリメ
チルシリル誘導体のＨＲ−ＥＩ測定により分子式Ｃ３９
Ｈ５４Ｏ１３が決定された（Ｃ３９Ｈ５４Ｏ１３＋（Ｓ
ｉＣ３　Ｈ８　）６　−ＣＨ３　に対する計算値　１１
４７．５７０１，測定値　１１４７．５７５１）。
【００９１】　１Ｈ　　ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨ
ｚ）（ＣＤ３　ＯＤ，２２℃）：第１図参照 １３Ｃ　　ＮＭＲ化学シフト（ＣＤ３　ＯＤ，２２℃）
：１４．８，１５．２，１８．１，２５．３，２７．５
，３０．１，３０．３（２ｘ），３３．２，３３．５（
２ｘ），３３．９，３４．８，３６．７，３６．９，３
８．６，７５．７，７６．７，７８．４，８１．０，８
２．０，９１．１，　１０７．５，　１２５．７，　１
２７．０（２ｘ），１２７．９，　１２９．５（２ｘ）
，　１３０．２，　１３１．０，　１３１．９，１３２
．５７，１３２．６３，　１３９．３，　１６８．６，
　１７０．３，　１７２．６，１７３．６ｐｐｍ。
【００９２】ＵＶ（ＭｅＯＨ）：λｍａｘ　は２５０ｎ
ｍ（ε２３，０００）ＩＲ（遊離酸として；ＺｎＳｅ上
のフィルム）：３３２０ｂｒ，２９２４，２８５５，２
４８９ｂｒ，１７４１，１４３６，１４１７，１２６６
，１１５２，１１２２，１００４，　９６７，　９５０
，　８０４，　７４４，　６９５ｃｍ−１。
【００９３】化合物Ｂ−化合物Ａのトリメチルエステル
、即ち構造（Ｉ）のＺ１　，Ｚ２　及びＺ３　がそれぞ
れメチルである化合物。
【００９４】質量スペクトルデータ：この化合物はＦＡ
Ｂ−ＭＳによる分子量　７７２を有する（リチウム化ス
ペクトルではｍ／ｚ　７７９に［Ｍ＋Ｌｉ］＋　が実測
された）。 トリス−トリメチルシリル誘導体のＨＲ−ＥＩ測定によ
り分子式Ｃ４２Ｈ６０Ｏ１３が決定された（Ｃ４２Ｈ６
０Ｏ１３＋（ＳｉＣ３　Ｈ８　）３　に対する計算値９
８８．５２２０，測定値９８８．５１７２）。
【００９５】　１Ｈ　　ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨ
ｚ）（Ｃ６　Ｄ６　，２２℃）：第２図参照。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は本発明の化合物Ａの　１Ｈ　　ＮＭＲ
スペクトルを示す。
【図２】第２図は本発明の化合物Ｂの　１Ｈ　　ＮＭＲ
スペクトルを示す。
【化１２】

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　構造式Ｉ 【化１】 ［式中、Ｚ１　，Ｚ２　及びＺ３　はそれぞれ独立して
    ａ）　　Ｈ； ｂ）　　Ｃ１　〜５　アルキル； ｃ）　　ｉ）フェニル，ｉｉ）メチル，メトキシ，ハロ
    ゲン（Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，Ｆ ）若しくはヒドロキシにより置換されたフェニルから成
    るグループの１個で置換されたＣ１　〜５　アルキル；
    から選択される］の化合物、又はＺ１　，Ｚ２　及びＺ
    ３　の少くとも１つが水素である式（Ｉ）の化合物の薬
    学的に許容し得る塩。
  2. 【請求項２】　　構造式（Ｉ）の相対配置が【化２】 である請求項１の化合物。
  3. 【請求項３】　　Ｚ１　，Ｚ２　及びＺ３　がそれぞれ
    水素である、請求項２の化合物又はその薬学的に許容し
    得る塩。
  4. 【請求項４】　　Ｚ１　，Ｚ２　及びＺ３　がそれぞれ
    メチルである、請求項２の化合物。
  5. 【請求項５】　　無毒性で医療上有効な量の請求項１の
    化合物及び薬学的に許容し得るキャリヤから成る医薬組
    成物。
  6. 【請求項６】　　無毒性で医薬上有効な量の請求項１の
    化合物を高コレステロール血症の治療を要する患者に投
    与することを特徴とするこの種の化合物の用途。
  7. 【請求項７】　　構造 【化３】 の化合物を回収し得る量で産生することのできる、ＭＦ
    ５４４７（ＡＴＴＣ２０９８５）又はその活性変異体の
    菌株。
  8. 【請求項８】　　構造 【化４】 の化合物を回収し得る量で産生することのできる、ＭＦ
    ５４６６（ＡＴＴＣ２０９８９）又はその活性変異体の
    菌株。
  9. 【請求項９】　　式Ｉ： 【化５】 ［式中、Ｚ１　，Ｚ２　及びＺ３　はそれぞれ独立にａ
    ）　　Ｈ； ｂ）　　Ｃ１　〜５　アルキル； ｃ）　　ｉ）フェニル，ｉｉ）メチル，メトキシ，ハロ
    ゲン（Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，Ｆ）若しくはヒドロキシにより
    置換されたフェニルから成るグループの１個で置換され
    たＣ１　〜Ｃ５　アルキル；から選択される］の化合物
    、又はＺ１　，Ｚ２　及びＺ３　の少くとも１つが水素
    である式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容し得る塩の抗真
    菌的に有効な量を増殖の調節を要する部位（但しヒトの
    身体を除く）に投与することを含む、真菌増殖を阻害す
    る方法。
  10. 【請求項１０】　　抗真菌的に有効な量の請求項９記載
    の化合物の経口的、深在的又は非経口的の投与を含む、
    この種の治療を要するヒト以外の生物の真菌増殖を阻害
    する方法。
  11. 【請求項１１】　　化合物を（１） 【化６】 及び（２） 【化７】 から成るグループから選択する、請求項１０の方法。
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