PT97068A - Processo para a preparcao de 2,8-dioxabiciclo{3,2.1}octanos uteis como anti-hipercolesterolemicos - Google Patents

Description

FUNDAMENTOS DO INVENTO é sabido que a hipercolesterolémia constitui um dos principais factores de risco em relação à doença cardiovascular isquémica, tal como a arteriosclerose, Foram utilizados seques-trantes de ácido biliar para o tratamento desta situação; parecem ser moderadamsnte eficazes mas devem ser consumidos em grandes quantidades, isto é várias aramas de uma só vez não tendo um paladar muito agradável..

R MEVACOR' Clovastatin>, actualmente comercializado, é um de um grupo de agentes antihipercolesterolémicos muito activos que funcionam limitando a biossintess do colesterol inibindo o enzima, HMS—CoA rsductase» A sintetase esqualsno é o enzima envolvido no primeiro passo realizado da nova via biossintética do colesterol, Este enzima catalisa a dimerização redutora de duas moléculas de pirofosfato de farnesilo a fim de formar esqualeno» A inibição da realização deste passo para a formação de colesterol deve levar a vias biossintáticas não impedidas para dar origem a ubiquinona, dolicol e isopentenilo t-RNA„

Esforços prévios para. inibir a sintetase do esqualeno utilizaram compostos contendo pirofosfato ou análogo de pirofos-fato tais como os descritos em P, Ortiz de Monteilano et al, J. Med,. Chem, 2Θ, 243 \1977) e E,J, Corsy and R„ Volante, J, Am» Chem. Soc.5 98, 1291 (197é), S. Billier ÍU.S. Patente 4,871,721) descreve isoprsnoide \fosf inilinetil )fosfonatos como inibidores da sintetase de esqualeno, 0 presente invento proporciona inibidores da sintetase do esqualsno contendo elementos não fosforosos.

DESCRIcao DETALHftDft DO INVENTO O presente invento é dirigido a novos compostos da fórmula est.ru.ral (I) que sMo inibi dores dai sintetsse do esqua leno s

0-C-CCH2D4-CB=CH-CCH2)4-CH=CH-CH3

CD em que ? . entre slo cada um deles independente-ments [··. \ p a 1 Í-;-. t 4 1 t .· ·_* J ...ST sl J. í-| -—i .£. w ^ ' 1 -5 alc!U1· ''“tituido com um membrc i) fenilo,

3.3./ ΤΟΠΙ IO SUDbtltUlQu LOm íuSIIÍD, ÍTíStuKl i. hãlOQÉniD i ] 1 .. Flh“* « T 1 i-ht t \'i *5 ri y í —· «=· ·» — 1 Η α· » » .* ww 1 j ví QU. um sal farmactuticamente aceitável de um composto da fórmula (I) em que pelo menos cada um de entre ZJÇ Z_ s Z~* é hidrogénio» I * jL ò

Numa apresentação do presente invento existem compostos da fórmula ÍI) em que a configuração estereoquimica relativa do anel 2P8-dioKabicicloC3u2»1Zoctano é tal como indicada a seguirs 0

II

Ao longo desta especificação e reivindicações onde é descrita estereoquimica para o anel dÍQKabiciclo|[3„2»1loctano a configuraçãc? indicada é relativa» A configuração real pode ser a indicada ou a do seu enantiómsro.

Ilustram ainda esta apresentação os compostos da fórmula estrutural (I) em que a configuração relativa nas posições 3f è e 7 é tal como indicada mais abaixo;

ο II

CH= CH- C CH2) 4- CH=CH-CH3

Numa c1 asse desta aprsssní.ação s?ncof 1 fcrõUH~‘S€í da estrutura (I) em que a configursçSo rslati% /a na p< tal corno iπdi cada mais abai V·*"4 a .· * -..i « compostos içâío 4 é o

II HOv 4D- C- ( CH2) 4- CH= CH- ( CH2) 4- CH= CH- CH3

ETv :lasse o composto em que £1;, e são cada um deles hidrogénio ou um seu sal fsrmac@uticamente aceitável... 0 composto em que Z.j ? Ze Z-. são cada um deles hl droqénio é aqui a seguir referido como Comdosto ft»

Ilustram ainda esta classs compostas sm que um ou. mais de entre 2^ t u .1 d o c om f en i 1 o *···? OU Z -r é C- .-alquilo ou C„ i *J * i. ~ ,-alqu ~o ou fenilo substituído em que O SU b1 lo substi-tituinte é

meiilo, metoxi, haiogénio du. hidroKi= Numa ilustração especifica, 2,, s Ι-r são cada um deles meti ia» Este composto é aqui a 1 ’ £. ·-♦ seguir referido como Composto B« fts duplas ligações na cadeia lateral dienoica podem apresentar-se -ambas numa configuração trans ou uma das duas pode apresentar-ss na configuração cis ou ambas podem apresentar—se na configuração cis»

Os cosspostos da fórmula (I) são preparados por meio de ura processo de fermentação aeróbica utilizando uma nova cultura, HF5447, identificada corno Sporomisl la intermédia,= Os compostos da fórmula (!) podem também ser obtidos num processo de fermentação utilizando uma nova cultura MF54ó6s identificada como um ascoray-cete bitunicado» Embora a utilização destes organismos seja aqui descrita específicamente, outros organismos do genero Sporomiella e Preussia incluindo mutantes dos organismos anteriormente descritos são também capazes de produzir compostos deste invento,; e são incluídos neste invento» A cultura MF5447 é a de um fungo coprofila, Sporomiella intermédia» isolada a partir de excrementos de coelho-bravo (Arizona), Esta cultura foi depositada na American Type Culture Collection em 123Θ1 Parklawn Drive, Rockville, MD 2Θ852 como ATCC 20985» A cultura MF5466 é a de ura fungo coprofilo, um ascomycete bitunicato, isolado a. partir de eKcreraentos de carneiro com chifres grandes (Tucson, Arizona). Esta cultura foi depositada em ATCC 20989= A cultura Γ1Ρ5447, identificada como Sporomisl la inter-medla apresenta os aspectos morfológicos que se seguem. 8 - 5 8 - 5

Pseudothecia com uma maturação de 4-5 semanas quer em excrementos de veado inoculado ou em agar de farinha de aveia (Difeo) a 25°C em luz fluorescente contínua, Pseudothecia na superfície de excrementos de veado inoculado simples a densamente qregária, implantada, com 1Θ~5Θ% ds protuberância superior acima da superfície, 2ΦΦ-ΖΘΘ um de diâmetro, globesas a subglobcs-as não estioladas, glabras, baças, uniformemente pretas, Psridium delgado, í-2 células de espessura, uma textura angulosa, Células peridiais isodiamétricas, com 4-8 um ds diâmetro, cinzentas a carde azeitona escura em KDH, Células ascíticas abundantes, com origem numa área basal comum, bitunicadas, com 8 esporos, cilíndricas, lineares a ligeiraments curvadas, com apex redondo amplo, 12θ-ί8Θ p.m X 2Θ-35, com uma haste basal distinta, com haste basal com 7—11 pm de comprimento, Parafises abundantes, intermisturadas com células asciticas, filamentosas, septadas, com um comprimento aproxima— damente igual ao das células asciticas, ftscosporos faiseriadas nos ascus, 45-53 X í©-12 pm, com 4 células, profundamente apertadas nos seotos, células terminais com aspiess arredondados ou afuni-lados, células médias oblongas ou doliformes, cada uma das células com uma ranhura no germe lateral escura, rodeada por um revestimento delgado, refractivo, hialino, com células frequente-mente separando—se fácilmente, cinzentas cõr de azeitona escura em KOH.

Colónias em agar dextross-hatata (Difeo) com 10-12 mm ds diâmetro em 7 dias á temperatura ambiente elevaram-se ligeiramente, com cerca ds 0,5-1 mm de profundidade , com margem submersa, com superfície com aspecto de feltro ou aveludada, de c:8r creme quando jovens, e logo a seguir cinzento claro a cinzento escuro, ou finalmente cinzento cor de azeitona escura a quase preto, Cartridge Buff (nomes de cores capitalizados a partir de

Ridgwayj, H. Cplor Standards and Nomencl ature ,* 'Washington, D.C„ 1912), Amarelo Margarida, Amarelo Azeitona, Azeitona Acinzentado Claro, Azeitona Acinzentado, Azeitona Acinzentado Escuro, Cinzento Ferroso, Preto Azeitona» No reverso azeitona amarelado escuro a cinzento azeitona a cinzenta azeitona escuro» Cheiros s sxsuda™ dos ausentes, Frequentemente regiões estromáticas pretas extensas desenvolvem-se em colónias com msis de 2-3 semanas. As regiões estromáticas podem conter muitas pseudothecia implantadas, confluentes a gregárias, A cultura MF5466, um ascomycete bitúnicato não identificado apresenta os seguintes aspectos morfológicos?

Colónias com 1Θ-12 mm de diâmetro em agar de dextros© de batata CDifco> è, temperatura ambiente, com aspecto da feltra, aveludado, macio a ligeiramente irregular em corte lateral, com até í mm de profundidade, com margem submersa, frequentemente com vários sectores com diferentes cores das colónias co® textura dura a semelhante à da borracha. Margens das colónias hialinas a claras, e logo a seguir cinzento claro a cinzento azeitona, finalmente cinzento escura a cinzenta azeitona, Côr Creme, Cinzento Fumado Claro, Cinzento ferroso. Preto Azeitona, Nalguns sectores de culturas velhas, formam-se tecidos de estornas pretos co® pseudothecia rudimentares ou estruturas semelhantes a pseudothecia, Pigmentação reversa semelhante, Cheiros e exsudsdos ausentes, Pigmentação e diferenciação das colónias reduzidas em meios nutritivos pobres, por exemplo agar de farinha de milha, agar de extracto de malte, agar de extracto de excrementos, ou agar de extracto de feno,

Micè-lio septado, altamente ramificado, fiexuoso, frequentemente contorcida a noduloso, com elemento até 8 μ® de diSmetro, hialino a côr de azeitona ou cinzento azeitona em KOH,

Desenvolvendo uma zona estromática basal de células isodisméticas em rsgíSes mais velhas da colónias,,

As estruturas semelhantes à pseudotecia com até 40© pm de diâmetro, escuras, pretas,, compostas por células isodiametri-cas, de parede delgada e hifas filamentosas , urna textura angulosa ou uma combinação de textura angulosa s de textura intrincada,, com células isodiamétricas com até 8 μο de diâmetro, Células ascíticas hitunisadas imaturas foram observadas nalgumas destas pseudotecia rudimentares após 4-6 semanas em agar de farinha de aveia,, mas as culturas tornaram-se moribundas antes das células asc íticas amadurecerem =

Os compostos deste inventa podem ser obtidos por cultura de um microorganismo indicado anteriormente num maio nutritivo aquoso contendo fontes de carbono e de azoto assimiláveis,. de preferência em condições aeróbicas. Os meias nutritivos podem também conter sais minerais e -agentes anti formação de espuma.

As fontes preferidas de carbono no meio nutritivo são hidrates de carbono tais como glucose,, glicerina, amido, dextrina,, etc. Outras fontes que podem ser incluidas são maltose, manose, sucross, etc, Além disso,, fontes nutritivas complexas tais como farinha de aveia., farinha de milho, painço, milho, etc podem fornecer carbono utilizável» A quantidade exacta de fonte de carbono que é usada no meio irá depender, em parte, dos outros ingredientes no meio, mas situa-se usual mente numa. quantidade variando entre ®,õ e 5 por cento em peso» Estas fontes de carbono podem ser usadas individualmente num determinado meio ou várias fontes em combinação no mesmo meio» - 11 -

As fontes preferidas de azoto são amino ácidos tais como glicina, metionina, prol ina , treonina , etc», assim como fontes complexas tais como extractos de levedura Chidrolisados, autolisados), levedura seca, pasta de tomate, farinha de soja, peptona, licor de milho, produtos solúveis de destilação, extractos de malte, etc» Fontes de azoto inorgânicas tais como sais de amónio (por exemplo nitrato de amónio, sulfata de amónio, fosfato de amónio, etc») podem também ser utilizadas, As várias fontes de azoto podem ser usadas isoladamente ou em combinação em quantidades variando entre cerca de 0,2 a 9Θ por cento em peso do meio,

As fontes da carbono e azoto são geraimente utilizadas em combinação, mas não precisam de se apresentar sob uma forma pura. Materiais menos puros que contfm vestígios de factores de crescimento, vitaminas, e elementos nutritivos minerais podem também ser usados, Os sais minerais podem também ser adicionados ao meio tal como (mas não se limitando a) carbonato de cálcio, fosfata de sódio ou potássio, cloreto de sódio ou potássio, sais de magnésio, sais de cobre, sais de cobalto, etc, São também incluídos metais vestigiais tais como msnganésio, ferro, molibde-no, zinco, etc. Além disso, se necessário, pode ser adicionado um agente anti formação de espuma tal como polieteilene glicol ou. silicone, especialmente se no meio de cultura se verificar uma formação de espuma grave» 0 processo preferido para produção de compostos deste inventa consiste na inoculação de esporos ou micslios do organismo produtor num meio apropriado seguida por cultura em situação asróhica* 0 processo de fermentação consiste geralmente em inocular em primeiro lugar uma fonte preservada de cultura num meio de sementeira nutritivo a fim de se obter, por vezes por

meio de um processa em dois passos, o crescimento dos organismos que servem de sementes na produção dos compostos activos* Após inoculação, os frascos s!o incubados com agitação a temperaturas variando entre 29 a 39°C, de preferfncia 25 a 28°C» As taxas de agitação podem variar até 4Θ© rpm» de preferfncia 2ΦΦ a 229 rpm» Os frascos semeados são incubados durante um período de 2 a 1Θ dias, de preferfncia 2 a 4 dias» Quando se atinge um crescimento pleno, usualmente 2a 4 dias» a cultura pode ser usada para inocular frascos com meio de produção» Pode ser utilizada um segundo estádio de crescimento da sementeira, particularmente quando se passa para recipientes maiores» Quando isto é realizado, uma porção do meio de cultura é usada para inocular um segundo frasco para sementeira incubado em condições semelhantes mas usando um tempo mais curto»

Após inoculação, o meio de fermentação de produção é incubado durante 3 a 39 dias, de preferfncia 4 a 14 dias, com ou sem agitação (dependendo de se utilizar meio de fermentação liquido ou sólido)» A fermentação è realizada aerobícamente a temperaturas variando entre 2Θ e 4©°C» Se usada, a agitação pode ser feita a 2ΦΘ a 4©ô rpm» Para se obterem resultados óptimos, as temperataras irão variar entre 22 e 28°C, com a maior preferfncia entre 24 s 26*0» 0 pH do meio nutritivo apropriado para a produção de compostos activos varia entre 3,5 e 8,5, com a maior preferfncia entre 5,9 e 7,5» Após o período apropriado para a produção do composto desejado, os frascos de fermentação são recolhidas e o composto activo é isolado» lima mistura de um solvente alcoólica e de um solvente oxigenado, tal como um éster ou uma cetona, é utilizada para extrair um composta deste invento a partir do meio de fermentação sólido»

•I

e α A mistura é agitada vigorosamente e filtrada, filtrado é concentrado sob pressão reduzida* Adiciona-se água ao concentrado e o pH é ajustado para cerca de 3 com uw Acida mineral» 0 concentrado aquoso é então e?ítraido repetidamente com um solvente oxigenado n'ao miscivel com a água» A camada orgânica, não miscivel com a água. è removida e evaporada até á secura» O resídua é então geralmente submetido a vários passos de separação tais como cromatografia de adsorçlo s de separação, e precipitação» Para cada passo de separação, fracçSes são colhidas e combinadas tendo como base os resultados de um ensaio e/ou de análise por HPLC/TLC» 0 solvente preferido para extracção da fermentação sólida é uma mistura ísi de metanol a 2-butanona» Após concentração do eKtracto inicial e de diluição com água, o solvente de separação preferido é diclorometano»

As separações cromatográfícas podem ser realizadas utilizando cromatograf ia em coluna convencional com resina .tónica ou. não iónics» 0 gel de sílica, tal como o fornecido por E, Merck5 é o absorvente -preferido» Quando gel de sílica é o adsor-vente, uma mistura alcool/clorohidrocarboneto/ácido orgânico tal como metanol/clorofórmio/ácido acético/água é útil como um eluente» Para a cromatografia de fase reversa, o sdsorvente preferido é um gel de sílica de fase ligado a CS» Q eluente preferido para a cromatografia de fase reversa é uma mistura de acetonitrilo e água tamponada para um pH baixo, tal como ácido fosfórico a Q,í%? ou ácido trifluoroacético. As resinas iónicas tais como Dowsk—I (C1 ) ou Βοκεκ-50 (Ca1"1") são também úteis na purificação» 0 composto activo ρο-de ser precipitado a partir de um solvente não polar como o sal quinina» 0 solvente preferido para precipitação é éter dieta, lico» 14

0 presente inventa é também dirigido a um método para a inibição da bíossíntese de colesterol que compreende a administração a um indivíduo necessitado desse tratamento ds uma quantidade eficaz não tóKiea de um composto representado pela fórmula estrutural (I) e seus sais farmacê'uticamente aceitáveis» Específicamente., os compostos deste invente* sito úteis como agentes anticolesterolémicos para o tratamento da arteriosclerose, hiperlipidémia„ hipercoiesterolêmia familiar e doenças afins em seres humanos» Podem ser administrados por via oral ou parentéri-ca sob a forma de uma cápsula, um comprimido, uma preparação injectável, etc» é usualmente desejável utilizar a via oral. As doses podem variar, dependendo da idade, gravidade, peso corporal e outras condiçSes dos doentes humanas, mas a dose diária para adultos varia de cerca de 2Θ mg a 2.ΦΘΦ mg (de preferência 2Θ a mg) que pode ser -administrada em duas ou quatro doses divididas» Doses ff;aís elevadas podem ser favorávelmente utilizadas tal como seja requerido»

Os sais farmacêuticamente aceitáveis dos compostos deste invento incluem os formados a partir de ca ti Ó-es tais como sódio, potássio-, alumínio, cálcio, litio, magnésio, zinco, e a partir de bases tais como amónia, etilenedlamina, N-metil-gluca-mina, lisina, arginina, ornitina, colina, n ,N* -dibenziletilenedi-amina, cloroprocaina, distanolamina, procaina, N—benziIfeneiil-amina, diet.ilamina, piperazlna, tri <hidrOKimetil)aminometa.no, e hidróxido ds tetrametilamónio» Qs sais aqui incluídos abrangem aqueles em que um, dois ou três dos grupos csrb-oxilo se apresentam sob a forma salina»

Os compostos deste invento podem também ser coadminletrados com polímeros catiónicos não tóxicas farmacêuticamente aceitáveis capazes de se ligarem aos ácidos biliares sob uma forma, não—reabsorvivel a partir do tracto gastrointestinal» 15

Exe iTípiOS Utebi-SS pui in cluem colestiramina. pol i l d i haleto de metil—(3— trim til am i η ο ρ r o o i 1) i m i η o n _ Ηϊ» Çj Udf! ·_ 3. U riU tfi i '•slativas _i ... UU1» compostos deste inv colestipol pol imeros varitsm i=nír 10Θ e 15 15,.000: A actividade- inihidora intrínseca da esqualeno de compostos representativos deste invento foi medida por meio do protocolo in vi tro descrito ma is sbaixoí

Preparação de Microsomass

Ratos i ur C h a r 1 bs R i v e r aliffsentados cora uma dieta contenda dias·» Os ficados destes ratos machos C12€s a 150 g> foram Θ51 % de lovast.at.in durante 4 Sm homoqenei zados em 5 volumes

Cml/g) de HEPfc.3 íácido 4~(2—HidroKieti 1) — l—piperasine—etanessul-fónico) 50 sTili arrefecido com gelo» EDTA ζâj~ido etilenedisminete— traacético) 5 mM pH 7,5 com um triturador de tecidos da tipo Potter—EIvehjem» 0 produto homeqeneizsdo foi centrifugado duas vezes a 2Θ.ΘΘΘ x g durante 15 minutos a 4°GS eliminando a pílula de cada vez» 0 produto flutuante foi então centrifugado a 10Θ.0Θ0 k g durante I hora a. 4*C. A pílula microsomal resultante foi suspensa de novo num volume do tampão homogeneizado sntsriormente igual a um quinto do volume do produto homogeneizado originai» Esta preparação microsomal tem uma concentração de proteína de cerca de / mg/ml., hs suspensões mxcrosomais foram armazenadas em porções a1íquotas a —70°C„ A actividade da sintetase do esqualeno nestas porções alíquotas é estável durante pelo menos vários 16

Furificacão Parcial de Frenil Transferase A prenil transferase foi purificada para utilização na síntese enzimática de pirofosfato de farnesilo marcado com rádio. A prenil trsnsfsrass foi ensaiada pelo método de Rilling ÍMethods in Enzymology 1íê. 125-129 (1985)) e uma unidade de actividade é definida como a quantidade de enzima, que irá produzir Ipmole de pirofosfato de farnesilo por minuto a 3©'5C no ensaio padrão.

Os fígados de 23 ratos machos com quarenta dias de idade que tinham sido alimentados com 5% de colestiramina mais 0,1¾ de lovastatin foram homogeneizados num misturador de Waring em 1 litro de mercaptoetanol 1© mH, EDTA 2 mM, 25 μΜ de leupepti-na. ©,005% de íluoreto de fsnilmetil sulfonilo pH 7,© contendo ®»I unidades de inihidor da tripsina de aprotinina/ml» 0 produto homogeneizado foi centrifugado a 2Θ = ©©© x g durante 20 minutos. 0 produto flutuante foi ajustado para pH 5,5 com HOAc 6W e centrifugado a 100,00© x g durante 1 hora, Este produto flutuante foi ajustado para pB 7,ô com KOH 3M e foi retirada uma íracção de 35-6©% de sulfato de amónio, A pílula a 6©% foi redissolvida e.® 60 ml de fosfato de potássio 10 mil, mercaptoetanol i© mii, EDTA 1 ®M pH 7,0 (Tampão A) e dialisada por meio de duas mudanças de í litro de Tampão A» Esta íracção dialisada foi aplicada a uma coluna de 12,5 x 5 cm de DEAE-sefarose 4B equilibrada com Tampão A. A coluna foi lavada com 70© ml de Tampão A e um gradiente de 1 litro de Tampão A a fosfato de potássio 1ΘΘ mii, mercaptoetanol 1© mii, EDTA 1 rnM pH 7,©, Fracçass tendo um actividade específica superior a ©,2© unitíades/mg foram combinadas, adicionando-se sulfato de amónio sólido para levar a uma saturação de 6©% e foram transformadas em pílulas, A pílula foi dissolvida em 8 ml de Tris 10 iiiM, β-mercaptoetanol 1© mii pH /,© (Tampão B), A pílula redissolvitía foi misturada co® sulfato de amónio a uma concentração de 60% adicionando 1,5 volumes de sulfato de amónio saturado

em Tampão Eh Esta suspensão de sulfato de amónia continha 3,5 unidades/ml com uma actividade específica, de 0,23 unidades/mg e apresentava-se livre de actividade da isomerass pirofosfato de isopentenilo» Esta suspensão de sulfato de amónio foi usada para ia a síntese de pirofosfato de £4— ‘01 farnêsi 1 o e a sua actividade manteve-se estável em armazenamento a 4°C durante pelo menos & meses. Síntese Enzimâtica de Pirofosfato de C4-1.4Clfa.rnesilo 0 solvente Cstanoln ΝΗ»ΟΗ â,í5 N, tsl) foi removido de _ 1A **

Sb pCi de pirofosfato de C4- '03isopentenilo (47,9 pCi/umole) por evaporação rotativa» Seiscentos microlitros ds Tris 100 mM, MgCI^ 10 mM, ditiotreitol 4 mM pH 7,5 foram adicionados e a solução foi transferida para u.m tubo de centrifugação de Eppendorf» Pirofosfato de geranila, 250 μΐ de uma solução 2Φ mM, e 56 μΐ da suspensão de sulfato de amónio de prenil transferase foram adicionados a fim de iniciar a reacção, Esta incubação continha 5 p.moles de pirofosfato de geranila, 1,15 pmolss de pirofosfato de isopenti-1 o3 óamoles de MgCl^, de 0,18 unidades de frenil transferase num volume de 900 μΐ. A incubação foi conduzida a 37 °C. Durante a incubação, a mistura tornou—se turva branca à medida que o compleno recentemente formado de pirofosfato de farnesilo se ia separando da solução por precipitação» 0 pirofosfato ds E4-^C3~ farnesilo foi recolhido por centrifugaçãoo durante 3 minutos a 14=,000 rpm num tubo ds centrifugação de Eppendorf, o produto flutuante foi removido, e s pílula foi dissolvida em 1,0 ml de HEPE3 50 MM, DETA 5 mM, pH 7,5« 0 rendimento foi de 50,7 μΟχ (92%) de pirofosfato ds farnesilo* 0 pirofosfato de 14 C4-" CJfarnesilo foi armazenado em porções alíquotas a -70°u.

Ensaio da Sinteta.se de Esqualeno

As reacções foram realizadas em tubos de ensaio com tampas de enroscar» Um lote de mistura de ensaio foi preparado a partir da solução que se segues volume para

Ei_ por ensaio 5Θ ensaios l» Hepes 25Θ mM pH 7,5 20 1000 2» NaF 110 mH í® 5Θ0 3» MgCl^ 55 mH í© 500 4» Ditiotrsitoi 30 mM 1© 500 5 a NADPH 1© mM ífeiti recentemente) 10 50® 6» 1Λ Pirofosfato de C4- 'Clfarnesilo 47,9 pCi/pmole, e 31= Í50 0, ©25 u.C i /3, © μ 1 7» Ho0 24 í 2Φ0

Esta mistura de ensaio foi desgaseifiçada sob vácuo s irrigada com Soluções dos inxbidores da sintetase do esqualeno foram preparadas ou em BMSO ou HeOH e foi feita uma diluição 1s 120 de proteína microsomal com o tampão de homogeneização original» Para cada reacçlo, 87 μΐ da mistura do ensaio foram misturados com 3 μΐ de uma solução inibidora CDpISO ou MeOH nos controlos), aquecidos até 3®°C num banho de água e então a reacção foi iniciada pela adição de í© μΐ da diluição í;12® de proteína microsomal (Φ,ό μα de proteína total no ensaio). As reacçSes foram interrompidas após 2© minutos pela adição de 100 μΐ de uma mistura 1s i de KOH a 4©% com EtDH a 95%. A mistura interrompida foi aquecida a g5°C durante 3® minutos». arrefecida, adicionando-se 10 ml de heptano e a mistura foi submetida a vórtice» Adicionaram-se então dois g de alumina actívada, sendo a mistura de novo submetida a vórtice, dei^ando-se a alumina assentar e foram removidos 5 ml da camada de heptano» Adicionaram-se dez ml de líquido de cintilação á solução de heptano e a radioactividade foi determinada por contagem da cintilação líquida» A inibição percentual é calculada pela fórmulas 1 ·“ kMgstra - Vazia 1 tControlo - Vazio! κ

Valores IC^ foram determinados registando o log da concentração do composto do teste versus a inibição percentual. A IC,_A é a concentração do inibidor que origina 50% de inibição tal como foi determinado a partir destes registos» Representativas das actividades inifaidoras da sintetase intrinseda do esqualeno são os dados 1 C^_a indicados no quadro mais abaisto:

Composto Sintetase Esqualeno

Cl LA50 = 4·.-

uUíiípU

uM

Jonipos to tí 0 presente composto também demonstra uma actividade antifungica de amplo espectro tal como é determinado pelo métodos de diluição de caldo e agar* Os compostos são particularmente activos em relação a fungos filamentosos e leveduras incluindo EãOSMã albicans e Crypt. negfprmans» A sensibilidade dos fungos filamentosos e da levedura foi determinada usando ensaios de diluição do inibidor em formato de microtitulação. Os compostos foram dissolvidos em DMBu a 2 mg/mi e diluidos seriadamente em

tampão fosfata Θ,ΙΜ, ρΗ 7,® na placa de microtitulaçao a partir de Í00 a 0?006 pq/ml» Uma suspensão de esporos normalizada para teste dos fungos filamentosos foi preparada por inoculação de Meio Antibiótico #3 contendo 1,5% de aqar com esporos de modo a serem adicionadadas por recipiente 1,5 x i0"“‘ unidades formadoras de colónia* Os recipientes de microtituiaçlo foram cheios com 5ô ui de composto contendo tampão e 50 μΐ de meio inoculado. h sensibilidade das leveduras foi determinada inoculando base azoto da levedura contendo 1% de dextrose CYMB/BÍ com porções alíquotas de uma cultura de levedura durante a noite feita crescer em Morfologia de levedura (Y!í> a 35°C e diluindo em YNB/B para proporcionar uma concentração final de 1,5-7,5 κ 1®'“' de unida-des/recipiente formadoras ds colónias. Foram adicionados por recipiente cento e cinquenta μ! de meio inoculado* A fim de testar a sensibilidade da levedura, d composto foi solubilizado em 10 por cento de DM50 aquoso a 2,56 mg/ml. 0 composto foi diluido seriadamente em YMB/S de 12S a 0,06 pg/ml. Os recipientes foram cheios com 15® μϊ de meio contendo droga. A concentração inibidora mínima \riIC) ê definida como a concentração mais baixa que evita o crescimento após uma incubação durante 24 horas, a 28*0 para os fungos filamentosos e 24 a 48 horas, a 35°C para as leveduras. A concentração fungicida mínima em μρ/ml é definida como a concentração mais baixa de droga que evitou totalmente o crescimento ou que permitiu o crescimento de não mais do que tris colónias. Representativas da actividade antifúngica são a concentração inibidora mínima e a concentração fungicida mínima indicadas mais abaixos

Concentração Inibidora Mínima Cmcg/ml)

Organismo Composto A Composto B Fungos Filamentosos A„ fumigatus MF4839 0, ®98 12B A» flavus MF383 0 ç 09S >128 A« niqer MF442 1 Fus. DKysporum MF4014 > 1 @0 Pen» italicum MF2819 0 s @25 Coch» miyabeanus MF4626 1,6 — MsntaqrQptfVt.es MF4864 — >128 Levedura Composto A Composto B C a a1bi cans Μ Y1@55 >128 trogica 1 is MY i0 12 Ji > 128 C. parsosilosis ΗΥ1Θ1Θ ·'£ >128 Crypt» neoformans ΜΥ1Θ5ί 4 >128

Concentração inibidora Mínima í ug/ml>

Levedura Composto A Composto B C* albicans HY1@55 4 *> 1 9R t r ο ρ i c. a lis Μ Y1S12 1 >12« C c naraosilosis MY1@1@ i ,·- £ ^9 Cry Pt, nsoformans ΜΥ1Θ51 *““x X .sT» Λ S.Í0i f_ i j f C·.: .UiUVÍUi dfc* mΓeucoes oor Γ5 inoi tração a um organismo necessitandr que compreende a adminis-desse tratamento de uina

quantidade terapêuticamente eficaz não tóxica de um composto representado peia fórmula estruturai (I) e de seus sais farmacêu-ticamente aceitáveis.· Com ba.se nos dados MIC an ter iormen te referidos é determinado que na generalidade devem ser utilizados 2 a 5 mg/kg como uma unidade de dosagem num tratamento antifungi--

Os compostos deste invento são adaptáveis para serem utilizados em várias aplicações de composições antifúngicas.Nessa utilização, os compostos podem ser misturados com um veiculo biologicamente inerte., geral mente com α auxilio de um agente ds dispersão tensio aetivo, cuja natureza irá depender da utilização para o controla de agentes pafcogénicos infectando mamíferos tais como o homem, ou pássaros ou repteis, ou para o controlo de fungos na agricultura tal coma na sala au partes de plantas, ou para o controlo de fungos em objecfcos inanimados.

Em composições para aplicaçSes médicas, os compostos podem ser misturados com um veículo ís.rmacêuticamente aceitável, cuja natureza irá variar dependendo da composição ser .administrada por via tópica, parentérica ou oral«

Se a referida aplicação for tópica, a droga poderá ser formulada em cremes e unguentos convencionais tais como petróleo branco, lanolina anidra, álcool cetilico, base para creme de beleza, monoestearato de gliceriio, água de rosas, etc.

Para aplicações parentêricas, os compostos podem ser formulados em soluções parentêricas convencionais tais como cloreto de sódio a Θ,85 por cento ou dextrose em água a 5 porcento, ou outras composições farmacfuticamente aceitáveis.

As composições para administração oral podem ser preparadas misturando intimamsnts as drogas componentes cch?! qualquer meio farmacêutico usual, incluindo, para preparações liquidas, veículos líquidos tais como água, glicois, óleos, álcoois, etc»| s para preparações sólidas tais como cápsulas e comprimidos, veículos sólidos tais como amidos, açucares, caoli-no, celulose etílica, agentes de dispersão tensio activos, gsraisBsnte com luforificantes tais cocno estearato de cálcio, juntamente com agentes de ligação, agentes de desintegração, etc»

Estas composições são então administradas em quantidades suficientes para se obter o desejado efeito arstifungico. Para aplicação médica, o método compreende a administração a um indivíduo necessitando desse tratamento de uma quantidade anii-fungica teraptuticamente eficaz de um composto da fórmula I» As doses apropriadas irão variar com a idade, gravidade, peso corporal e outras condições» Para aplicação tópica as composições são aplicadas directamente à zona onde se deseja efestuar o controlo» Para administração interna, a composição pode ser aplicada por injecçlo ou pode ser administrada por via oral..

Para aplicação não médica, o produto do presente invento, quer simplesmente quer como mistura, pode ser utilizado em composições num veiculo inerte que incluí diluentss secos ou líquidos finamente divididos, agentes de εκtensão, agentes de enchimento, agentes de condicionamento e BKcipientes, incluindo várias argilas, terra diatomécea, talco, etc», ou. água e vários líquidos orgânicos tais como alcanois inferiores, por exemplo stanol e isopropanol, ou qusrossno, henzeno, tolueno e outras fracções da distilação do petróleo ou suas misturas»

Estas composições podem ser utilizadas aplicando â superfície de ou incorporando no meio a ser protegido» Para o

contraia da explosão <"biastH3 do arras, mildio tardia do tomate,, mildio precoce do tomate, ferrugem da folha, do trigo, mildio pulverulento da fava e definhamento por Fusarium . , , • do tomate, as composições podem ser aplicadas· directamente à planta em aplicação tópica ou administradas, ao solo para aplicação sistémica·. 0 método compreende a administração à planta, sala ou meia afects— dos a serem protegidos de uma quantidade antifunqicamente eficaz do composto da Fórmula 1=

Os exemplos que se seguem ilustram a. preparação dos compostas da fórmula <Π e a sua incorporação em composições farmacêuticas a, como tal, não slo considerados como limitativos do invento indicado nas reivindicações que lhe estão apensas» A via preferida para o composto A é o Exemplo 2» A composição do mexo utilizado nos Exemplos que se seguem são indicados mais abaixes

Meio da Placa YME

Comραπente Quantidade Eí-itracto de Levedura 4,0 g Extracto de Malte 10*0 g Blucose 4 5 & g H._0 Disti 1 ado i 000 zV; 1 Hyar 25 5 0 g MEIO DE SEMENTEIRA KF Mistura Elementos Vestíqiais por litro a/L Lic.or de Mi 1 no 5 g FeSQ„»7H„0 £i .£ 1,0 Pasta de Tomate .•3.0 q fvfrvQn i·. Π s :2 1 s0 Farinha, de Aveia 10 0 U· u. i_· Is is 10 Θ 5 Θ25 Blucose 10 Q CaCl„-2H^Q j£. .w 0,1 Mis tu Γ’β. E1 βιηβπ tos Vestigiais 10 ml TI 0,056 , >.M0_Q _»4W_0 .*1 , » n t - —t “T O : cL 0 , & 19 pH ajustado para ó ,8 (présstéril) ZnSO* *=7H^0 *Ϋ jC 0,2 50 mis/20Θ mis sem S £' D 3. Γ B.d Ο Γ ha1Ma Er1enmeyer dissolvidos em 1L de HCL 0,6N autoclave 2Θ minut? Lib Í Lu. u- ,

Meio· de Produção

BRF F204 Pãinço i Ci g/ f rase. Base·? liquida #1 10,0 rnls/fra

Arroz castanho 5,Sg/frasco Ba. sb 1 iqaida#2 2Θ,0 mls/fra

Base liquida #1

Base liquida #2

q/L g/L

<sem ajustamento pH 15 minute í5 psi>

121 °C

Exiracto levedura 50,0 tíStrâuto 1 «vedara 1,0 G 3. u t s m a to ?n ο η o s s ó d i c CS 10,0 Tartrato de sódio 0,5 óleo de milho 10,0 mis KH PO a 5 Tartrato de sódio 1 ^ 5¾ i V t; v água destilada 10@Θ;ίΘ PfaRll . ?'H n àl V 1,0 água d sst i1ad a 1000,0 ff; 1 3 (sem ajustamento pH) adicionam-se 1Ό50 usls H_,0 destilada/f raseo su.toc 1 ave 1 minutos C12í °C, autoc tave 2Θ minutes í 5 psi 3 -f õ. \J to ."L / adicionam- 15,0 mls é.QU.B. dssti1ada/ f Γί autoe1ave 20 minutos í ιΖ 1 -u·». •f sr psi 3

í °C EXEMPLO 1

Preparação do Composto,, & A. Cultura MF5447

Cultura HF5447, inoculada a partir de um tubo com solo usando uma pá funda de vidro com solo, foi feita crescer em maio de sementeira KF durante 72 horas a 25°C? 22Θ rpm, 85¾ de humidade» Mo final deste período de incuhaçlcs, porçSes sliquotas de 25Θ mis foram transferidas sssepiieamente para cada um dos 45 frascos de produção de Erlenmsyer de 25® ml F2€>4» Os frascos de produção foram incubados a 25°C estaticamente durante 21 dias sendo entao recolhidos» Na recolha foram adielanados 4Θ mis de cetona metil etílica a cada frasco e o crescimento sólido foi partida e separado em porçSes menores» Os frascos foram então colocados num agitador rotativo e agitados a 22® rpm durante 3® minutos a fim de posteriormente quebrar a massa micelial assim como para melhorar o contacto do solvente com as células» Após agitação, os conteúdos dos frascos individuais foram reunidos vertendo a totalidade dos conteúdos nos frascos (sólidos e tudo) numa proveta de 4 litros»

B. Isolamento do Composto A A cetona metil etílica líquida a partir de aproximada-mente 2 litros de extracto de fermentação em cultura durante 21 dias tal como foi descrito no Exemplo AA foi separado por filtração,, Uma mistura de acetato de etilo e de metanol (isl, 2 L) foi então adicionada ao resíduo sólido» Este foi agitado durante 18 horas usando um agitador mecânico. A mistura foi filtrada e o filtrado foi concentrada CEotovap§ 46°C) até aproximadamsnte 7ΘΘ mL. Adicionou-se acetato de etilo (766 mL) seguindo—se 56® mL de 5% de cloreto de sèdio/água » Após agitação durante 15 minutos, a camada aquosa foi removida e eliminada» A camada de acetato de etilo foi concentrada (Rotovapg 40°C> até aproximadamente 15Θ ml. Foram adicionados hexano (50© ml) e metanol (5Θ0 ml) e a mistura foi agitada durante 15 minutos» A camada de hexano foi removida e eliminada» A camada de metanol foi seca (Rotovaps 4ô,:!C> para proporcionar um extracto crú» 0 extracto crú Cl?4 g) foi dissolvido em 25 ml de hexano/ tolueno/metanol 3s 1 s í e aplicado a uma coluna para croma-toqrafia de Sephadex LH-2® (1 L resina) facendo-se a eluiçlo com a mesma mistura solvente e com uma taxa de fluxo de aproximada-flients 3 ml/minuto» Os primeitros 1.60Θ ml de eluente foram elimihados» Os seguintes 3.6ΘΘ ml de eluente foram concentrados até à secura para proporcionar produto eluido LH-20. Aprcximada-mente 31© .mg do produto eluido LH-2© foram dissolvidos em 5 ml de 5% metanol/clorofórmio. Este foi aplicado a uma coluna para cromatografia de gel de sílica (5© ml de E« Merck Kieselgel 4© 63 um)» A coluna foi eluida passo a passo tal como á indicado no Quadro ía mais abaixo» As fracçSes 4-6 foram combinadas e secas para proporcionar um resíduo oleoso» 0 resíduo (115 mg) foi dissolvido em 4 ml de tetrahidrofuranc? e adicionaram-se 5 ml de ácido clorídrico ©5©05 Μ» A suspensão resultante foi centriíugada (1©»0@@ rpm^ 2© minutos)» 0 produto flutuante foi removido s eliminado para proporcionar um precipitado»

Vinte e quatro miligramas deste precipitado foram dissolvidos em 052 ml de tetrahidrofurano e adicionou-se ©,2 ml de dimetilsulféxido» Isto foi então adsorvido numa camada de resina de uma coluna de cromatografia aberta RP-18 (30 ml de Bakerbond 4®pm RP— íS)., equilibrada com 10% de tetrahidrofura— no/água» A sluiçao feita passo a passo (Quadro 1h mais abaixo) foi seguido por análise HPLC e bioensaio das fracçSes» As <9 —

fracçSes 2-7 forsis combinadas e concentradas até aproximadamente 5Θ ml« A solução aquosa foi extraída com 5® ml de acetato de stilo» 0 sxirscto de acetato ds etiie foi seco e dissolvido em 0,3 ml de metanolç seguindo-se a adição de 0,4 ml de dimetilsul-féxitío, ®?í ml de áqua, s ©=@5 ml de 43% de acetanitrilo/tampão fosfato de potássio 1Θ mlv! CpH 7>» Esta solução foi injectada numa coluns de HPLC (Amicon Matrex Silica MC-100A 08 15 um, 4,6 mm 1D x 25 cm) facsndo-se a sluição com 43% de acetonitrilo/tampão fosfato de potássio 10 mil (pH 7) a 1 ml/minuto» As fraeções 7-12 foram combinadas s adicionou-se Θ,Θ5 ml de ácido cloridrico ®,5 N, seguindo-se 10 ml de acetato de etilo» A camada de acetato de etilo foi seca para proporcionar o Composto A»

Quadro la

Composição solvente para cromatografia em gel de sílica do Produto de tluiçSo LH-20»

Fracção Solvente Volume %<metanol/água/ácido acético íθϊ i s1) em clorofórmio i 5 5© ml/frscção 2-3 10 50 ml/fracção 4-5 20 50 ml/fracção 6-7 30 5€í ml/fracção 8-9 50 50 ml/fracção 10-1 í 75 50 m 1 / f r a c ç ã o 12 10© 50 m 1 /fracç'áa

Quadro ib

Campos xçao sulvente para crGmatoçjraf xa cfr? π ; r sc x ρ x t a d 0 em Baker bontí RP— 18- FracçSo Solvente Volume % tetrahidrofurano em água 1 10 Vfn ail/f racçSo 2-3 -"'iifT ml/fracçSo 5Θ --jcr .ml/f racçSo yi~ •pjrr ml/fracçSo 1 00 ·—or ml/fracçSo EXEMPLO 2

Preparação do Composto A A. Cu.ltura_efli, HF5447

Os processos de fermentação foram idênticos aos do Exemplo ÍA exceptuando o facto de 23 frascos F2Ô4 serem inoculados e do tempo de fermentação ser de i4 dias» Adicionaram-se 5® ml de metanol a cada. frasco, sendo em seguida o produto que cresceu quebrado e sendo os frascos agitados tal como foi indicado no Exemplo IA. Os conteúdos dos frascos foram reunidos vertendo os conteúdos totais numa proveta de 3 L»

B. Isolamento do Composto A

Aproximadamenfe 2 litros de um extrasto de fermentação cultivado durante 14 dias tal como foi descrito no Exempla 2A e contendo um litro adicional de metanol foram agitados vigorosa-mente durante Í6 horas e filtrados. A segunda porção de 1 L de metanol foi adicionada aos sólidos utilizados =, agitando-se durante 4 horas e filtrando-se. Os extractos de metanol foram combinadas e concentradas (rotovap, 47 °C) até aproximad-amente 2ΘΘ ml» Adicionou-se água <3Θβ ml) ao concentrado e o pH foi ajustado para 3 com ácido clorídrico. Adicionou-se n-butanol (5®® ml) e agitou-se durante 2® minutos» A camada orgânica foi removida e evaporada até à secura para dar origem a um alcatrão preto. Este foi cromatografada <239 g) sobre gel de sílica de um modo semelhante ao descrito nos Exemplos í e 3= As fracçSes contendo o Composto A ia partir dos resultados da análise por HPLC) foram combinadas e evaporadas até à secura íEotovap, 4®°C) 0 resíduo oleoso <23® mg) foi dissolvido em 1 ml de dimetil sulfóxido e injectstio numa coluna de HPLC íDYHAMAX ó®A B microns CSρ 21,4 mm ID κ 25 cm com módulo do pratecç^o) fazendo-se a eluição com um gradiente de solventes indicado no Quadro 2a com uma taxa de fluxo de í© ml/minuto> Colhendo fracçSes de 5 ml, as fracçSes 37~42 foram combinadas» Foram adicionados acetato de etilo (50 ml) e água (5Θ ml). Após sxtracção, a camada de acetato de etilo foi separada e seca (Rotovap5 40°C) para proporcionar o Composto A. fedrg......2a

Gradiente de solventes para Purificação Preparativa por HPLC em Silica Gel Rich Cut»

Tempo ímin) Solvente VÁ acetonítrilo em 0, í % H^PO^/águs 0“10 1Θ-2Φ 20-3Θ

70%« XSQCrátiCD

70-9@%;I gradiente linear ?Θ%5 isocráticD

Sistema HPLC analíticos colunas Dynamax--fc®A S mícrons C8S 4«ò mm ID κ 25 cm com vigia Cl. ,5 cm L) elusntes 80s20 acetonitrilo/©5 í% ácido fosfórico ens taxa de fluxos 19Φ ml/minutos detecçãos UV a 25® nm tempo de retenção do Composto As 5,52 minutos

EXEMPLO 5

Preparação de Composto A A. Cultura em HF5466 A cultura em MF5466 cresceu num plano inclinado YME a 25°C durante pelo menos duas semanas» Um quinto do crescimento no plano inclinado foi transferido para um frasco de sementeira contendo 54 ml de meio KF num bailo Erlenmeyer sem separador de 250 ml» 0 frasco de sementeira foi então incubado durante 72 horas a 24':‘C, 22® rpm» No final desta incubação, 2 porçSes aliquotas de 2 ml foram transferidas para múltiplos frascos de produção de Erlenmeyer de 25® ml contendo meio F2®4» Os frascos de produção foram então incubados estacionáriaments a 24°C durante 21 dias» Na colheita,, 5® ml de 70% de metanol foram adicionados aos frascos de produção e o crescimento micelial foi quebrado e separado manualmente com tuna pipeta» Os frascos foram agitados a 22® rpm durante 3® minutos» Os extractos de metanol foram reunidos, filtrados e os resíduos foram combinados,

B» Isolamento do Composto A

Os sólidos combinados formados tal como foi descrito no Exemplo 3A, foram extraídos vigorosamente com 1 L de metanol durante 15 horas» 0 exiracto de 1 L foi concentrado até 25® ml, diluido com um volume igual de água;, ajustado até pH 8,5 e extraído com 5®® ml de acetato de isopropilo» A solução aquosa foi então acidificada até pH 4,® e foi sucessivamente extraída duas veres com acetato de etilo e uma ver com 1—butanol. Cada extraeto foi concentrado individualmente até 4® ml (Extraeto Acetato Etilo 1, Extraeto Acetato Etilo 2, Extraeto Butanol D»

Uma porção aliquota de 2Q ml de EKtracto de Acetato de Etilo 1 (25Θ mg de sólidos totais) foi concentrada atè à secura e reconstituída em 5 ml de clorofórmio-metanol-água-ácido acético 93/4/1/2. A amostra foi carregada numa coluna de 10 ml de gel de sílica 60 que tinha sido equilibrada no mesmo solvente. A coluna. foi então eluida passo a passo (ver Quadro 3a) - Uuadro 3a Composição de So 1 v en t bs í em volume) pa ra Cromatog ra fia em Gel de Sílica ds EKtracto de EtlíAc Crú. Fraccâo CHC1? ÇH30H H^O CH^COOH 1-B 93 4 1 2 9-16 89 8 2 17-24 85 12 1 2 25-32 “jfq 18 <c. 2 33-38 tsjCj 33 4 4 0 volume de todas as fracçSes foi de 5 ml cada» As fracçSes 18-28 foram combinadas e concentradas até á secura. 0 resíduo (40 mg de sólidos totais) foi dissolvida em 4 ml de tstrahidrofurano? ao qual foram adicionados com agitação 5 ml de água. A mistura turva resultante foi centrifugada durante 2Θ minutos a 15.©Θβ rpm. Foi formado e recolhido um precipitado oleoso Cppt 1). EKtracto Acetato Etilo 2 C40 ml) e o restante EKtracto Acetato Etilo 1 í2© ml) foram processados de um modo semelhante através de gel de sílica e com passos de precipitação para dar origem a um precipitado oleoso (ppt 2). Os dois precipitados foram combinados (43 mg) e dissolvidas em Θ.5 ml de dimetil

sul fé xido 0 0 ?5 ml de me tanol ai A soluç Çjp* ^ càU f oi injat : tad a c ί Lima colun HPLC ( D YNAMfíX 60A y mie r on — Ç* C5 « 2í n ? Ή mm com íãcsdul o de vigi. — \ aX i fazendo a 01 LI 3_ çS o com um g rad i ©n te de sA,j 1 v‘ ©n **" tes i p H i r* ado n o Q uadro 3 & com Lima Γ axa de jZ ' 1 lu KO de i 0 ml /mini. jto. L-u I he ndo f racç P0 '£ de 5 1 líU. ? fo ram C ombina da O as fraeçc 3©S 21- "“•3Í3 » 1 Adicionou :-ss acetato de etiio (1®0 ml > e o n’H da fase aquosa ajustada para 3 com ácido clorídrico. HpÓS e>; trace; lo ? a camas acetato de etiio foi sec-a íRotov-ap9 4Θ°C) para proporcionar -,-í ff; f-J Oi~! A »

Quadro 5b

Composição Solventes em Gradiente para Purificação HPLC do Prsci oi tado

Solvente (Tempo (min) % aoetonitrilo em tampão fosfato de Potássio 1® ιΤ’Μ (pH 7 ) ®— 1.5 42%, , isocrático 15-2® 40—" 70%« o r adi επ te 2=/5-3¾ 7Θ% , isocrático EXEMPLO 4

Como usTia apresentação esq; de um composto deste invento, 2'® mq fογπμ.1 j.edos com suficiente lactose proporcionar uma quantidade total introduzida numa cápsula de gelatin fc't.i j íca de uma composição c do composto do Exemplo 1 finamente dividida ri© S.RÇi = 5Pf

Ara tamanho r* de mq para EXEMPLO 5

Prepar ação de uin Sal de Amón íq Li ima <: imostra de ' @5Í iTuTiOl do ácido li V Γ Irf de u iis compus sto fóríílU Ia (I) é d i. ssol V ÍÕ& ξ£*Τ* 1 *3 ml de SC et a to d e etilo. A , . „5 . Lu„ rss •ultante é satu. : sí ss f \nl ’.^S COíll amón ia q aso S3 prec i pitando·· ESQUI d-a O Sí li de a ιϊιόπ i c a partir QS. so 1 u Cão i a EXEMPLO 6

Preparação de um Sal de Potássio

Um a SO *s . . — À *~"*W ãO de U r. 1 ΙϊϋΤίΟ 1 du ál— xdu 1 ivr ί~~· H s—* u.m c ompast :o da tõrm ula { T ; Biíi 10 ml de meta nol é t r" s ta ]Tjf 2JÍ com uma soluçS .o aquosa ou ma ano 11 c a c ont endo 0,3 ffiilto 1 de h id róK ido de pc itássic i» A e vspo raç So do SCí : 1vente proporc iona o se. 1 de tri -poiás sio * A adi çSo de an t tr& 1 O {3 5 3 ffliua 1 d e n x d rÓH id Q de po tá ssio porpor c x on a íí; J. 3 t Lí j'~ S. “· SD á 1 oQsis· oe ssx5· oe iTíon D— pQ t-é.SS Í O , d X - - po t é.ss i o tri~pa tássic cuja c ο οι pôs x ç -so d e pen d e da quantidade exacta .j LiU hidróK ido de potá· ssio adicionsdo* De um m odo ssíní51. hsn ir.e ooderíi ser tofiTiSdcs os saio U ·;·,* # ! · SCO XLi e de 11tio»

ο

EXEMPLO 7

Preparação de um Sal de Cálcio

Uma solução de Θ,Ι mmol do ácido 1 i vrs de um compo st. o (I) em 2<? m 1 de metanol/água è *4 é tratada . com uma UDS-S de Θ, 1 minol t :!e hidróxido de C-á leio. Os 501vsn tes oriqfefffi cálcio, são evaporados para oaf EXEMPLO 8

I

Preparação de um Sal Etilenedlamina

Uma solução de Θ,Ι mmol do ácido livre de um compi os to da fórmula (!) em 10 ml de metanol é tratada com 0,1 íThTíqI de I ©n©d i. *ã ffl i. Π 3. A evaporaçã o do solvente proporc iona o sal eti1enediamina* n =-5U UUQfe também ser aplicado à preparação do sal N . M!! -d i ben z i 1 s t i I sned i am i n a, EXEMPLO 9

Preparação de um Sal Tris(hidroximetil)aminometano A uma solução de Θ51 mmol do ácido livre de um composto da j órmula (I) em 1Φ m1 de me tano1 de trisíhid ΓΟΚ imetil! ) aminometa.no di A evaporação do solvente dá origem adicionam-se de <3,1 ssolvido em 10 ml d a uma forma salina a 0,3 minai metanol, correspon dente cuja composição eracta. é determinada pela ralaça amina adicionada. São preparados de um modo semelhante L-ornitine. , L~ 1 isina e N-meti 1 gluacamina. . 3 molar os sa .i s da EXEMPLO 10

Preparação de um Sai L-arqinina

Uns a s o 1 u.ç: So de 0tí mnsol do ácido livr e úb um ccmpa sto da fórmula (I) em 1 u ml de metanol/água 6x4 é Cf ci Ldod L.Wni uma solução aquosa de 0 5i a ©53 1 de L-sruinina, A evaporação d cs solvente proporciona ti do titulo, .-.J tá fôKÃC i*tâ CLiCnp0S3.Ç-^0 determinada pela relação molar do amirio ácido do ácido livre da ror situa \ I} usaoOn

Bao preparados de um modo semelhante os sais L—orniti” na5 L~lisina e N-metilglucafnina* EXEMPLO lí

Preparação de um Composto B (Método 1)

Uma solução de 2 mg do C 1x1) foi tratada * com um 1 i josto A em 5 ml de meta·" Iro excesso de d ia. z orne t ano etéreo * Após 5 minutos o excesso de diszometano foi removido e o solvente foi evaporado para dar origem ao Composta B, EXEMPLO í2

Preparação de Composto B (Método 2)

Uma solução de 2 mg de Composto A em ©„5 ml de acetoni-trilo é tratada à temperatura ambiente com 1& equivalentes de DBU e 1Θ equivalentes de Mel, Apés 2 horas a rsacção é diluida com 1-Θ ml de diclorometano e lavada sucessivamente com 10 ml de ácido fosfórico ft, 1 Mj 10 ml de água10 ml de bicarbonato de sódio saturado e 1Φ ml de -água» Após secagem sobre sulfato de sódio, a camada orgânica é concentrada e o resíduo é cromatografado sobre gel de sílica usando misturas de heKsno e de acetato de ©tilo para dar origem ao Composto B» D método do Εκemolo 12 é também apropriado para a preparação de outros derivados éster tais como 1) ésteres etílicos e outros alquílicos inferiores s 2) ésteres benzilicos e benzilicos substituídos,

Dados da Massa Espectral

Os espectros de massa foram registados num modelo Finnigan-Mat MAT212 (impacto de electrões, EI, 9Θ ev), ΜΑΤ 90 (Bombardeamento Atómico Rápido, FAB), e espectrómetros de massa TSQ70B (FAB, EI), Medições de massa eMactas foram realizadas com elevada separação (HR-EI) usando perfluoroqueroseno (PFK) ou óxido de perfluoropolipropileno (Ultramark Uíó0®F> como j:>adrão irtterno* Os derivados de trimetilsililo foram preparados com uma mistura Isl de BSTFA-piridina à temperatura ambiente.

Dados 15C RMN 0 espectro 13c RMN do Composto A foi registado em CD^OD a 1ΦΘ MHz num espectrémetro Variari Χί„.4θβ, Os desvios químicos são indicados em ppm em relação a tetrametilsilano (TMS) a zero ppm usando o pica de solvente a 49,® ppm como padrão interno* Λ

Es pec t ros a H RMN

Os espectros Ή-! RMN foram registados a 4Θ© MHz em CD^OD e num espsctrómetro XL4®®= Os desvios químicos são indicados em ppm em relação a TMS a zero ppm usando os picos de solvente a 3,30 ppm CCD.J3D) s 7,15 ppm <C,D,> coma oadrSes internos, ·-* Cí o

Propriedades Físicas dos compostos da Estrutura I;

Composto η- o composto da estrutura <I) em que Z^ , Z„ e são cada um deles hidrogénio.

Dados de Massa Espectral;

Este composto tem peso molecular 73© por FAB-ffS (observado Π*Ή·Η3 + a m/z 731 ? e com adição de -acetato de lítio EM-Li^-t-LiD"1 (isto éf o adueto de lítio do sal trilítio a m/z. /oo>, H Tormula molecular ϋ39Η54° , foi determinada por medição HR-EI do derivada hena-trimelilsililo Ccaic, para C^^H^u-,01^-s-(SiC-,Hg) 1147»5701, encontrados 1147.5751) „

Espectro 1H RMN (40© MHz) (CD^OD, 22*0 s ver figura 1.

Desvios Químicos ^ RMN i CD-,OD» ’7i“T tr aUj 33 5 i 5 3Θn3 (2k) í "?£? *r? ;í £? t| / w{ J / 5 /tí <2 V > f 7?*7 α *| ',,‘D 2·.’ f ' Λ f r. - **" *’ V ** f» a. J~ - q -? ; , 13! » *T ·· n *-· 1 *7f?< “< q λ .· *..· q ·-· ir .- JÍ. !í W , vv or* '*« « 1 xi o i =·; i o i iwJ- u.* .* s Á T i| ‘.~i ij λ w ς λ. q X U tj X q ΪΓ (’Λ,Λ *Τ·9· *·“> T ί| Λ tP/ “7 •J ^ \JLAí9 .-í-J·,·/, --=Η· , d· J -J-O J J , v ía «31 1 1ÍV7 7 1 7 O 1 77 i 27«0 UV C MeQH) i ÀfnaK é 25*3 nm (€ 23 «ΦΘΘ) IV (como ácido livre; película em ZnSe? | 2849 hf s-*i £ 1741, 1436, 1417, 1266, 1152, 1122« 1¾ 4 J04, 967, 95©, 834, "7 « Λ / ΛΤ"Ϊ ? / r-iír· 07J c«T\ éster trimelí1 2CD do UOffip osto A, xstu é I) em que Z1? 7.„ s Z-, sSo cada. um deles

Dados de liassa Espectral; P" ste c U mpo s to tem 0 psso mo I ecul a. r 77^- ΓτΓ-ιτΤ' j-fW J FAB-HS (obss v-V .. *1 ->· r-·- |Ti f g 77Ç T\ 0 ssp sc i tí-i-% *| it iado) 11 Λ ri fórmula mQ 1 ργ ul ar C η .-/H 0 •f T f oi dca i π ada. po r m 7 r- •m t«S «X mj· Ko HR-E ϊ do derivada •^£•2. £j V'i irís™ tr 3, ϊ nt5 *t ilsil \ lo f ca J Lc. para C42H6 T + {B ί03Η8ί. v "7 '88 „ 5229, encon -j- i·"” ados PRR 5 •í -7.-¾ x í xl ) 3

Espectro XH RÍ1N (4ΘΘ HHz) (C,0e, 22°C)s Ver fiqura

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES composto de íã» - Processo para a preparação de um fórmula estrutural Is O II

   Ω- C- ( CH2) 4-CH= CH- C CH2) 4-CH= CH- CH3 (I)

   e 2..^ slo cada um deles independantemente se 1 scc:tonados de H; b) Calquilo? c) '-"i-s alquilo substituído com um membro do grupo consistindo em 1) f afi 11G » ii> fenilo substituído com metilo, metoKi, halogénio ÍC1, Br 5 I, F) ou. hidrojíi? ou V da uai sal farroaceuticaroente Cl) sro que pelo menos um de entre 7 ^ aceitável de um composto da fórmula , e Z-, é hidroqènioq- caracterizado por compreender s

   p, carac 1 s w } & cul tu r*s de MF5447 CATCC 20985) ou de um seu mu tan te ac tiv O 5 em CD ndiç: 3es apr O 'ΡΓ i-Sd as para a forro ação do pg-fgaj·- ido compos to 5 S -5 recuperaçSo d D C D íli posto; ou h) ·*«. o. cu 1 tu. ra de MF5466 CATCC P0Q0Q} ou de um seu. mutan T ϊχ; ac tiv O 5 em CD ndiç o o o apr r\ priad as para a f orm ação -í uD reter ida comp ;OS to 5 e a recu peração H o com posto» . 2§„ Proce SE- o de acordo c Dm a Reivinriic a í$. o 15 cem "ac- teriz ado por s b prs pa rar um comp O ·*- »«> em que a conf iou.ra.cSo re 1 ai iva de f ór fíiLi i. & $ ..«· 4· ,rutu ral (I) é um deles hidruqénio, ou um seu sal farroaceuticaroente aceitável :aracterizado 4â =. ~ Proces-so para ríexvi.nd icaçao 2 * de um composto de· por se preparar um composto em Z e I-,. são cada um deles meti lo, 44 - -.(

   5-ã. - Processo para a preparação ds uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade terapeuticamente eficaz não tóxica de uns composto da Reivindicação i e um veículo farmaceuticamente aceitável. óâ. - Método para o tratamento da 0ipercα 1 ssisro 1 émia,, csrsctsrisadD por compreender a administração a um indivíduo que necessite desse tratamento de uma quantidade tsrapêuticamanie eficaz não tóKica de um composto da Reivindicação 1, sendo a gama ds dosagem ds ingrediente acti.vo de cerca de 2Θ mg até cerca de 2ΘΘΦ mg por dia. 7ã. - Cultura de MF5447 CATTC 20985) ou de um seu mutante activo, csracterizada por ser capaz de produzir um composto de estruturas 0 II

   4-Cffc CH-( CH2) 4-CH= CH-CH3 em quancidades recuperáveis» Sã. - Cultura ds MF5466 CATCC 29989> du de um seu mutante activo, csracterizada por ser capaz de produzir um composto de estruturas I

   n- c- C CH2) 4- CH- C ch2) 4- ch=ch- ch3 em quantidades recuperáveis» 9ã» — Processo para a produção de um composto de estruturas O II

   - CíiCH-( CH2) 4-CH= CH-CH3 caracteri £âdo por cuiTspreender a cultura de Ms-5447 (AíCC £€í!/fc>5) ou de um seu mu tanta activo, em condições apiropriadas para a formação do referido composto, e & recuperação do composto» 10ã» - Processo para a produção de um composto de estrutura; 'C/*

   /° O W uc-cch2)
2. 4-CIt CH-C cH2) 4-CH= CH“ CH3 OH HO·

   Xj' ^COOH

   "COOH OH COOH caracterizado por conspreendsr a cultura de MFS4Ó6 <ATCC 2Φ989) ou de um ssu mutante activo, em condições apropriadas para a forma-çM.c do referido composto, e a recuperação do composto» ilã.= ~ Método para a inihiçSo do crescimento de fungos, caracterizado por compreender a aplicação è superfície onde o crescimento deve ser controlado ou ao organismo vivo necessitando desse tratamento, particularrnente por via oral, sistémica ou. parentérica, de uma quantidade antifungicamente eficaz de um composto de fórmula Is em que

   CD «

   *r / "** «— λ ^ sn tre s 2.T. são cada um de 1 es indtjDj.r;ndi-‘n tsmsn te ss 1 eu«_ xuí sados de a) H s b) L·j alauilos i — ri 4.. .· W alqui1 txndo em aiquxiQ substituído com um membro do grupo consis- x ) f en .11 o ·. x x) ien xIo ;· s t x t u .i. d o com meti lo, netoid, halDqánio <C1, Br, 1« F) ou hidrox: O Li de um sal farmaceuticamente aceitável (1) em que pelo menos um de entre Z,, fórmulas as gama de dosagem de ingrediente activo de ma de peso corporal» de um l..uiíipC'-= td da 0 e Z_,. é hidrogénio, sendo a -3 mo, por qui logra-· .-1}~ 'índlc a c S" o 12, CSfSC“ entre o «grupo consis- :xndo em 5 ·»**

   & (υ

   p. c- C CHa) 4- CH= CH- C CH2) 4- CH= CH- CH3 Lisboa. 5 i-9 de Março de Ivvi

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.» 1200 LISBOA