CS68891A2 - Antihypercholesterolaemia - Google Patents

Description

?i/c ee -ť/H

Antihypercholesterolemika

Oblast tochnikv

Vynález se týká antihypercholestsrolsmik, zejména no-vých inhibitorů skvalen syntetazy.

Dosavadní stav techniky

Hypercholesterolemie je známá jako jeden z hlavníchrizikových faktorů pro ischemickou kardiovaskulární chorobu,jako je arteriosklerosa, Aby se tato choroba vyléčila, použí- valy se maskovací činidla kyseliny žlučové. Ty jsou, zdá se,mírně účinné, ale musí se užívat ve velkých množstvích, t.j. v ·'ířdnot}ivé dávce několik aramů a nejsou příliš chutné, MEVACOR^\(lovastatin), nyní komerčně dostupný, je jed-ním ze skupiny velmi aktivních hypercholesterolemických čini-del, jejichž funkce spočívá v omezení biosyntézy cholesteroluinlúbicí enzymu HMG - CoA reduktasy.

Skvalen syntetasa je enzym, působící v prvním kroku nově ·probíhájící biosyntetické dráhy cholesterolu. Tento enzym ka-talyzuje rěduktivni dimerizaci dvou molekul farnesyL/c?6^fos-fatu za vzniku skvalenu.Inhibice tohoto kroku směrem k cholesterolu by měla opustit nebráněné biosyntetickó dráhysměřující k ubichinonu, dolicholu a isopentenyl t-f?NA. V předešlých pokusech o inhibici skvalen syntetazy sevyužívalo difcsforečnanu nebo analogu difosforečnanu, kterýobsahoval sloučeniny jako jsou ty, popsané v P. Ortiz deMcntellano a další Med Chem. 20, 243 (1977) a E.O. Corsya P. Volante, □. Am. Chem. Soc,, 98, 1291 (1976). S. 3iller(U.S. Patent 4, 871 721) popisuje isoprenoidní fosfinyl-methyl) fosforitany jako inhibitory skvalen syntetasy.

Tento vynález poskytuje inhibitory skvalen syntetasy neobsahující fosfor. - 2 - je zaměřen na nové sloučeniny strukturni- jsou inhibitory skvalen synťetasy

Podstata vynálezu " Tento vynálezho vzorce I, které

nezávisle na sobě vybrány ze skupiny kde Z^, ~2 a zahrnující jsou a) vodík, b) alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, c) alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku substituovanoučlenem skupiny, která se skládá z i) fenylu ii) fenylu, kterýje substituovaný / methylem, methoxyskupinou, haloge-nem (Cl, Br, I, F) nebo hydroxyskupi nou; nebo farmaceuticky vhodné soli sloučenin obecného vzorce Σ,v nichž alespoň jeden ze symbolů Z^, Z9 a Z^ představuje vo-dík. □ednou částí tohoto vynálezu jsou sloučeniny vzorce I,v nichž je relativní stereocheraická konfigurace 2,8-dio;;alri.-cykio £3.2.1) oktanového kruhu taková, jak je ukázáno níže

V tomto popisu a nárocích, kdo je stereochemie popsanápro dioxabicyklo /5.2.1./-oktanový kruh, se samozřejměvždy jedná o konfiguraci relativní. Skutečná konfiguracemůže být taková, jako je ukázáno, nebo může jít o jejíenantiomer.

Další ilustrací této části vynálezu jsou sloučeninystrukturního vzorce I, v nichž relativní konfigurace namístech 3,6 a 7 jo taková, jak je ukázáno níže o

Do jedné třídy táto části vynálezu spadají slou-čeniny vzorce I, v nichž relativní konfigurace v místě 4je taková, jako je ukázáno níže - 4 -

, Z2 a 23 představuji vodík nebo farmaceuticky vhodná Příkladem této třídy je sloučenina, ve které symboly sůl této sloučeniny. Sloučenina, v níž symboly 2^, 29 a 2-,představují vodík je dále v textu označována jako slouče-nina A.

Dalším příkladem z této třídy jsou sloučeniny, ve kte-rých jeden nebo více symbolů 2^, 22 nebo 23 jsou alky- ly nebO’C|-5 alkyly, substituované fenylem, nebo fenylemsubstituovaným metoxyskupinou, halogenem nebo hydroxyskupi-nou. Specifickým příkladem je případ, kdy 2^, 22 a 23 před-stavují methyly. Tato sloučenina je dále v textu označovánajako sloučenina 3.

Dvojné vazby v C14 d ienovém postranním řetězci mohoubýt obě v tránsfkonfiguraci, nebo je,dna z nich může být vcis konfiguraci', nebo mohou být obě v cis konfiguraci.

Sloučeniny vzorce I jsóu připravovány aerobním for-mentačnim postupem s použitím nové kultury MF 5447. Tatokultura byla identifikována jako Sporormialla, intermedia.Sloučeniny vzorce I se také dají získat fermentačnim postu-pem s použitím nové kultury MF 5466, která byla identifiko-vána jako "hitunicate ascomycate". Ačkoliv v tomto vynálezuje specificky popsáno použiti těchto organismů, i jiné orga-nismy rodu Sporormiella a Preussia, včetně mutantů výše uve-dených organismů, jsou také schopny produkovat sloučeninypodle tohoto vynálezu. Všechny tyto organismy spadají dorozsahu tohoto vynálezu.

Kultura MF 5447 je koprofilni houba Sporormiella inter-media, isolovaná z tru3u amerického králíka druh "cottontail"(Arizona). Tato kultura byla uložena v Americké sbírce typůkultur, American Typs Culture Coiloction v 12301 ParklawinDrive, Rockville, MD 20852 pod číslem ATCC 20985. KulturaMF 5466 je koprofilni houba"bitunicate ascomycete"izolovanáz trusu ovce druhu "big horh” (Tucson, Arizona). Tato kulturabyla uložena pod číslem ATCC 20 989.

Kultura MF 5447, určená jako Sporormialla intermedia mánásledující morfologické znaky.

Pseudothecia dozrávají za 4-5 týdnů bu3 na inokulovanémjelením trusu nebo na ovesném "oatmeal” agaru (Difco) při le. Pseudothecia na povrchujednotlivě až ve skupinách, % horní části vyčnívá nad povrch. Maji 200 - 300 yUm v průměru, jsou kulovitého nebo té-měř kulovitého tvaru, neostiální, hladká, matná, stejnoměrněčerně zbarvená, Peridium je tenké, jeho tlouštka činí 1 - 2buňky, jeho textura je angulárni. Peridiální buňky jsou iso-diamétrické, mají 4-8 yura v průměru, v KOH jsou zbarveny šedě až tmavě olivově šedě. z • · ' /

Asky jsou hojné, vyrůstají ze společné bazálni oblasti,mají dva obaly, obsahují 8 spor. Osou válcovité, rovné ažmírně zakřivené s širokým svinutým vrcholem, o velikosti 120 -180 x 20 - 35 yUm. Mají zřetelný bazálni stonek, dlouhý 7 -11 yum. Parafýzy jsou hojné, smíšené s asky, vláknité, septované,seřazeny v10 - 12 /Um,buňky majíobdélníkové- až doliformní. Každá buňka, má laterálni tmavou zárodečnou štěr- binu a je obklopena tenkou, světlolomnou hyalinovou pochvou. v Γ i O { C t JL 4. G· úi Zcí I 'i*. íA. L* G V < inokulovaného jeleního trusu rostoujsou zapuštěná a jen jejich 10-50 přibližné stejne dlouhé jako asky. Askospory jsouasku ve dvou řadách, jejich velikost je 43 - 53 xOsou čtyřbuněčné, hluboce zúžené v septu. Koncovésvinuté nebo zkosená ascicos, středové buňky isou

ó 3uňky jsou často snadno separovatelné, v KOH tmavě olivověšedě zbarvené.

Kolonie, narostlá Z3 7 dni při laboratorní teplotěna bramboro-dextrosovém agaru (potato-dextrose agar, Difco),mají v průměru 10- 12 mm, jsou mírně zvýšené, s hloubkouasi 0,5 - 1mm.Majíponořený okraj, jejich povrch je plsto-vitý až aksamitový. V mládí jsou zbarveny smetanově, dálese barva mění od světle šedé přes tmavě šedou až k tmavěolivově šedé a nakonec k téměř černé, Cartridgo Buff (názvybarev velkými písmeny, Ridgway, R. Color Standards andNomenclatura, (3arevné standardy a názvosloví), (Washington, D.C. 1912), Marguerite Yellov/, (žluť' ), Olivě Surf, (oli-vová barva), Light Gravish Olivě, (světle šedá olivová bar-va), Grayish Olivě (šedavě olivová barva). Deep GrayishOlivě, (tmavě šedavě olivová barva), Iron Gray, (sec!),Olivaceous Slack, (olivová čerň). Ze zpodu jscu kolonietmavě žlutavě olivové až olivově šedé až tmavě olivově še-dé. Zápach ani exudát nevydávají. V koloniích, starších než2 - 3 týdny, se často rozvíjejí rozsáhlé černé stromatickéoblasti. Stromatické oblasti mohou obsahovat mnoho zapuš-těných slévajících se, společně rostoucích pseudothecií.

Kultura MF 5466, neidentifikovaná "bitunicate' ascc-mycete" vykazuje následující mcrfologická znaky:

Kolonie, narostlé na bramboro-dextrosovém agaru(potato-dextrose agar, Difco) při laboratorní teplotě, mají10 - 12 mm v průměru, jsou plstovitá, aksamitové, hladkéaž mírně nepravidelné při pohledu z boku, vyšší než 1 mm.Mají ponořený okraj a často jsou rozdělené na oblasti orůzných barvách. Kolonie mají tuhou až gumovitou strukturu.Zbarvení hyalinových okrajů kolonie so mění od bledé barvyk bledě šedé, olivově šedé, tmavě šedé až olivoyě šedé,Cream Color, (smetanová barva),Pale Smoke Gray, (šed),

Smoko Gray (šed), Light Grayish Olivě, (olivová barva),

Deep Olivě Gray (olivová barva), Iron Gray, (šed), Oliva-ceous Black (olivová čerň).

V některých oblastech starších kultur se tvoří černé sto-matícké tkáně s rudimentárními pseudothecii nebo se struktu-rami, které jsou pseudotheci/m podobné. Pigmentace spodníčásti kolonii je podobná. Zápach a exudát chybí. Pigmentacea diferenciace kolonií je snížena na mediích chudých na ži-viny napr. na obilném agaru(cornmeal), sladinovém agaru(malt extract), agaru s výtažkem trusu (dung extract) nebona.agaru s výtažkem sena (hay extract).

Mycelium je septované, velmi rozvětvené, vlnité, častozkroucené, s elementy většími než 8 ^um v průměru. Hyalinje v KOH olivový nebo olivově šedý. Ve starších oblastechkolonií se rozvijí bazální stromatická zóna isodiametrickýchbuněk. : podobné pssudother.lím jsou v průměru větší než 400 /Um, jsou matné, černé. Skládají se z isodiametric-kých buněk s tenkou stěnou a z vláknitých hyf. Oejich struk-tura je angulárni nebo je kombinací angulárni a spletitástruktury. Isodiametrické buňky jsou větší než 8 ^,um v prů-měru. V některých z těchto rudimentárních pseudothecii bylypo 4 - 6 týdnech na ovesném agaru (oatraeal) pozorovány ne-zralé asky s dvojitým obalem, ale kultury odumřely předuzrátímasků. ,

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou získat kulti-vací výše zmíněných mikroorganismů ve vodném živném mediu,které obsahuje zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku. Nej-lépe je kultivaci provádět za. aerobních podmínek. Živná me-dia mohou také obsahovat minerální soli a odpěňovaci činidla.

Nejlepš^mi zdroji uhlíku v živném mediu jsou sacharidy,jako např. glukosa, glycerol, škrob, dextrin a podobně. Oiný-mi použitelnými zdroji jsou maltosa,' manosa, aacharosu a po-dobně» Kromě toho může být využitelný uhlík dodán v komplex-ních živných zdrojích jako je ovesná mouka, pšeničné vločky,proso, kukuřice a podobně. Přesné množství zdroje uhlíku, 8 které se použije v mediu, závisí částečné na ostatních slož-kách media. Ais obvykle ss toto množství pohybuje v rozme-zí od 0,5 do 5 hmotnostních procent. Tyto zdroje uhlíku semohou používat v daném mediu samostatně, nebo se může pou-žívat kombinace několika zdrojů v jednom mediu.

Nejlepšimi zdroji dusíku jsou aminokyseliny jako jeglycin, raethionin, prolin, threonin a podobně, stejně jakokomplexní zdroje např. kvasničné extrakty (hydrolyzáty, au-tolyzáty), sušené kvasinky, rajský protlak, sojová mouka,peptěn, corn steep litpuor, lihovarské výpalky, sladinovéextrakty a podobně. Anogranické zdroje dusíku jako např.amonné soli (např. dusičnan amonný, síran amonný, fosforeč-nan amonný atd.) se mohou také používat. Různé zdroje dusí-ku se mohou používat samotné nebo v kombinaci s jinými vmnožstvích, která se pohybuji v rozmezí 0,2 až 90 procenthmotnostních v mediu.

Zdroje uhlíku a dusíku se obvykle používají v kombina-ci, ale nemusí být čisté. Mohou se použit méně čisté materiá-ly, které obsahuji stopy růstových faktorů, vitaminů a mine-rálních živin. Do media se také mohou přidat anorganickésoli jako jsou uhličitan vápenatý, fosforečnan sodný nebodraselný, chlorid sodný nebo draselný, soli hořčíku, mědi,kobaltu a podobně. Na ppužiti těchto soli se vynález neomezu-je. Také se mohou použit stopové kovy jako např. mangan,železo, molybden, zinek a podobně. Kromě toho se, jestližeje to nutné, mohou přidat odpěňovaci činidla, jako polyethy-lenglykol nebo silikon, zejména když kultivační medium sil-ně pěni.

Nej lepším způsobem přípravy sloučenin podle tohoto vy-nálezu je zaočkováni spor nebo mycelia produkčního organis-mu do vhodného media- a potom kultivace za aerobních podmí-nek.

Ferraentačni proces se obecně skládá za prvé z inokulace - 9 - konzervovaného zdroje kultury do živného zákvaeného médiaa získáni, někdy pomoci dvoustupňového procesu, rostoucíchorganismů, které se použiji jako zákvasy při přípravě účin-ných sloučenin. Po naočkováni se baňky inkubuji za třepánipři teplotě v rozmezí od 20 do 30 °C, nejlépe při teplotě . , od 25 do 28 °C. Intenzita třepání může dosáhnout až 400min*"\ nejlepěl je však intenzita třepáni od 200 do 220min“^. Zákvasné baňky se inkubuji po dobu 2 až 10 dní, nej-lépe 2 až 4 dny. Když je v médiu mnoho rostoucích buněk,obvykle za 2 až 4 dny, může se kultura použít pro inokulacibaněk s produkčním médiem. Může se vytvořit i druhý stupeňzákvasu, zejména při převodu do větších nádob. K tomuto úče-lu se část rostoucí kultury použije pro naočkování druhézákvasné baňky a ta se inkubuje za stejných podmínek, ale "·:ζ kratší dobu.

Po naočkováni se produkční fermentačni medium inkubuje3 až 30 dní, nejlépe 4 až 14 dní za třepání nebo bez třepá-ni (v závislosti na tom, zda se provádí fermentace v kapal-ném nebo tuhém mediu). Fermentace se provádí aerobně při tep-lotách v rozmezí od 20 do 40 °C. Oe-li to potřeba, intenzitatřepáni může být 200 až 400 min”\ Pro získání optimálníchvýsledků leží teploty v rozmezí od 22 do 28 °C, nejlépe od24 do 26 °C, pH živného media, vhodné pro produkci účinnýchsloučenin, se pohybuje v rozmezí od 3,5 do 8,5, nejlépe všakod 5,0 do 7,5. Po vhodné době produkce žádané sloučeniny sefermentačni baňky sklidí a účinná sloučenina se izoluje. K extrakci sloučeniny podle tohoto vynálezu z tuhéhofermentačniho media se používá směs alkoholického rozpouštěd-la a kyslikatého rozpouštědla jako je ester nebo keton. ; Směs se intenzivně-míchá, přefiltruje se a filtrát se ..zkoncoutruje za sníženého tlaku. Ke koncentrátu se přidávoda a pH se upraví minerální kyselinou asi na hodnotu 3.Vodný koncentrát se potom opakovaně extrahuje kyslíkatýmrozpouštědlem nemisitelným s vodou. Organická vrstva němí-

10 - sitelná 9 vodou se oddělí a odpaří do sucha. Zbytek se potomobvykle podrobí několika separačnim krokům, jako Je adsorpčnía rozdělovači chromatografie a precipitace. V každém separač-nim stupni se získané frakce spoji podle výsledků stanovenia/nebo podle HPLC/TLC analýzy. Přednostním rozpouštědlem pro extrakci z tuhého mediaje směs 1 : 1 methanolu a 2-butanonu. Po zkoncentrováni první-ho extraktu a zředěni vodou je přednostním rozdělovacim roz-pouštědlem diehlormethan.

Chromatografické separace se mohou provádět za použitíobvyklých způsobů kolonové chromatografie s iontovou neboneiontovou pryskyřici. Přednostním adsorbentem je silikagel,jnko je například výrobek firmy E, Merck, 3e-li adsorbentemsilikagel, je vhodným eluantera smŠ9 alkohol/chlorovaný uhlo-vodik/organická kyselina jako směs methanol/chloroform/kyse-lina octová/voda. Pro chromatografii na reverzní fázi jepřednostním adsorbentem silikagel vázaný na C8 fázi. Před-nostním eluantem pro chromatografii na reverzní fázi je směsacetonitrilu a vody, která je udržována při nízkém pH na-příklad 0,1 %-ni kyselinou fosforečnou nebo kyselinou tri -fluoroctovou. Při purifikaci lze použít i iontové pryskyřice,jako je Dowex-1 nebo Dowex-50 (úa++). Účinná slouče- nina se může vys rážet z nepolárního rozpouštědla jako je sůlchininia. Přednostním rozpouštědlem pro precipitaci je dietfyl- eter.

Sloučenin podle vynálezu je možno použít pro inhibicibiosyntézy cholesterolu. Netoxické terapeuticky účinnémnožství sloučeniny strukturního vzorce I, nebo její farma-ceuticky vhodné soli se může podávat pacientovi za účelemdosažení léčebného účinku. Sloučeniny podle tohoto vynálezujsou specificky účinné jako antihypercholesteroleraická či-nidla pro .léčeni arteriosklerózy, hyperlipidemie, dědičnéhypercholesterolemie a podobných humánních nemoci. Mohouse podávat orálně nebo parentálně ve formě kapsli, tablet,injekčních přípravků a podobně. Obvykle je vhodné orální

- 11 - podáváni. Dávky mohou být různé, závisí na věku, vážnos-ti choroby, tělesné hmotnosti a jiných aspsktsch, lidskýchpacientů. Denní dávka pro dospělé je však v rozmezí od 20do 2 000 mg (nejlépe 20 až 100 mg) a může se podávat vedvou až čtyřech dílčích dávkách. Je-li to zapotřebí, mohouse úspěšně použit i vyšší dávky.

Farmaceuticky vhodné soli sloučenin podle tohoto vy-nálezu jsou soli utvořené od kationtů sodíku, draslíku, hli-níku, vápníku, lithia, hořčíku, zinku a od bázi jako je amo-niak, etřiylendiamin, N-methyl-glukamin, lysin, arginin,ornithin, cholin, N,N'- dibenzylethylen diamin, chlorprokain,diethanolamin, prokain, N-benzylfenethylamin, diethylamin,piperazin, tris (hydroxymethyl)aminomethan, a tetramethyl-ai»onA.' Hydroxid. Do'toho.v.· výčtu ^padají soli, v nichž jedna,dvě nebo všechny tři karboxylové skupiny jsou převedeny nasůl.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou také podá-vat společně s farmaceuticky vhodnými netoxickými kationto-vými polymery, schopnými vázat žlučové kyseliny na formu,která není v gastrointestinálnim traktu vstřebatelná. Příkla-dy takových polymerů jsou cholestyramin, kolestipol á poly-/methyl-(3-trimethylaminopropyl)iminotrimethylendihalogeni(y.Vzájemný poměr sloučenin podle tohoto vynálezu a těchto po-lymerů leží mezi 1:100 a 1:15000.

Skutečná inhibični aktivita reprezentativních slouče-nin podle tohoto vynálezu vzhledem k skvalen syntetase bylamě rena standardním postupem, prováděným in vitro, jak je po-psáno níže. Pří·* ava tnikrosomů:'

Krysí samci (Charles River CD) o hmotnosti 120 až 150 gbyli 4 dny krmeni stravou, která obsahovala 0,1 % lovasta-tinu. Játra z těchto krys byla homogenizována v 5 objemech 12 - (ml/g) ledově chladného pufru o složeni 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazin-ethansulfonovó kyseliny), 5 mMEDTA (ethylendiamintet^raoctové kyseliny), pH 7,5 pomocítkáňového mlýnku, typu Potter-Elvehjem. Homogehát byl dva-krát 15 min centrifugován při 20 000 g, při teplotě 4 °C,při čemž pokaždé byla peleta odstraněna. Supernatant bylpotom centrifugován při 100 000 g, 1 hodinu, při 4 °C.Výsledná mikrosomálni peleta byla resuspftndována v homoge-nizačnim pufru, jehož složeni je uvedeno výše. Objem homo-genizačniho pufru se rovná jedné pětině objemu původního ho-mogenátu. Koncentrace proteinu v tomto mikrosomálnim prepa-rátu činí asi 7 mg/ml. Mikrosomálni suspenze byly skladová-ny v alikvotnich podílech při -70 °C. Skvalen syntetásováaktivita v těchto alikvotnich podílech je stabilní alespoňněkolik měsíců. Částečná purifikace prenyljtransferasy

Prenyl transferasa byla vyčištěna pro použiti v enzy-mové syntéze radiologicky značeného farnesyldifosfátu. Prenyltransferasa byla stanovena metodou podle Rillinga (Methodsin Enzymology 110, 125-129 /1985)). Oednotka aktivity prenyltransfesy je definována jako množství enzymu, které poskytne1 /Umol farnesyldifosfátu za minutu při 30 °C při standardnímstanoveni. Oátra z 23 krysích samců, 40 dnů starých, jejichž stravaobsahovala 5 % cholesty^aminu plus 0,1 % lovastatinu, bylahomogenizována v mixéru Waring v 1 litru pufru o složeni 10mM merkaptoethanolu, 2 mM EDTA, 25 ^uM leupeptinu, 0,005 %fsnylmethylsulfonyl fluoridu pH 7,0, který také obsahoval0,1 jednotek,inhibujicich trypsin, aprotinu na ml. Homogenátbyl 20 min centrifugován při 20 000 g. pH supernatantu byloupraveno na 5,5 pomoci 6N kvselinypctové (HOAc) a 1 hodinuodstfedováno při 100 000 g,pHYsfípernatantu bylo upraveno 3 NKOH na 7, O a byla odebrána frakce 35-60 % síranu amonného. 60 % pelet bylo znovu rozpuštěno v 60 ml pufru o složeni

- 13

> 10 mM fosforečnanu draselného, 10 mM merkaptoethanolu, 1 mM EDJTA, pH 7,0 (pufr A) a dialyzováno proti dvakrát jednomu » litru pufru A. Tato dialyzovaná frakce byla nanesena na kolo- nu (12,5 x 5 cm) DEAE-sepharosy 4B, která byla stabilizovánapufrera A. Kolona byla promyta 700 ml pufru A a 1 litrem puf-ru s pH gradientem, který se měnil od pufru A k pufru o slo-ženi 100 mM fosforečnanu draselného, 10 mM merkaptoethanolu, 1 mM EDTA, pH 7,0. Frakce o specifické aktivitě větší než0,20 jednotek/mg byly spojeny a byl k nim přidán pevný sí-ran amonný tak, aby se dosáhlo 60 % nasyceni. Ve frakci seutvořila peLeta. Peleta byla rozpuštěna v 8 ml pufru o slo-ženi 10 mM Tris, 10 mM /3 -merkaptoethanol, pH 7,0 (pufr B).Rozpouštěná peleta byla zkoncentrována na 60 % pomoci síra-nu amonného přídavkem 1,5 objemu nasyceného roztoku síranuamonného v pufru B. Tato. suspenze síranu amonného obso;.la 3,5 jednotky/ml se specifickou aktivitou 0,23 jednotky/ml a neměla aktivitu isopentenyldifosfát isomerasy. Tatosuspenze síranu amonného byla použita pro syntézu /4 - ^C/farnesyldifosfátu a její aktivita byla stabilní alespoň 6měsícá při skladováni při 4 °C.

Enzymatická syntéza /4 - ^C/ farnesyldif átu / V rotačním odpařováku se z 55 jjCí /4-^0/ isopent^nyl-difosfátu (47,9 pCi/pmole) odstraní rozpouštědlo (ethanol: 0,15 N NH^OH, 1:1). K odparku bylo přidáno 600 mikrolitrůroztoku o složeni 100 mM Tris, 10 mM MgCl2, 4 mM dithiothrei-tol pH 7,5. Výsledný roztok byl převeden do 1,5 ml Eppendor-foyy centrifugačni zkumavky. Pro zahájeni reakce bylo při-dáno 250 /Ul geranyldifosfátu (koncentrace 20 mM) a 50 ^ulsuspenze síranu amonného s prenyljtransferasou. Tento inku-bo ný roztok obsahoval 5 ^urnol geranyldifosfátu, 1,15 /Umol.tr ->.ntenyidifosťátu, 6 yumol mgCl2 θ 0,18 jednotkami pre-nyljtransferasy v objemu 900 ^ul. Inkubace se prováděla při37 °C. Během inkubace se směs bíle zakalila, jak nově vznik-lý komplex hořčíku s farnesyldifosfátem vypadával z roztoku./4 - farnesyldifosfát byl získán po 3 min odstřelováni při 14 000 min“\v Eppendorfově centrif ugačni zkumavce.

- 14 -

Supernatant byl odstraněn a palata byla rozpuštěna v 1,0 mlroztoku o složeni 50 mM HEPES, 5 mM EDTA, pH 7,5. Výtěžekčinil 50,7 yUCi (92 %) /4-14C/ farnesyldifosfátu. /4 - 14C/farnesyldifosfát byl skladován v alikvotních podílech při- 70 °C.

Stanovení skvalen syntetasy

Reakce se prováděly ve zkumavkách o rozměrech 16 x mm se šroubovým uzávěrem . Dávka směsi pro stanovení byla pravena z následujících roztoků: objem pro Ul na stanovení 50 stanoveni 1. 250 mM Hepes pH 7,5 20 1000 2.· NaF 110 raM 10 500 3. MgCl2 55 mM 10 500 4. Dithiothreitol 30 mM 10 500 5. NADPH 10 mM (čerstvě připra- vený) 10 500 6. /4-i4C/farnesyldifosfát 47,9 pčl/pmol , a 3,0 150 0,025 pCi/3,0 pl / 7. h2o 24 1200

Tato směs pro stanoveni se odplyni pomoci vakua a pro-plachovánim dusíkem. Roztoky inhibitorů skvalen syntetasyse připraví bu3 v DMSO nebo v MeOH. Mikrosomálni proteinse zředí 1 : 120 původním homogenizačním pufrem. Pro kaž-dou reakci se odebere 87 μΐ směsi pro stanovení a 3 plroztoku inhibitoru (DMSO nebo MeOH pro kontrolu). Roztokse na vodní lázni zahřeje na 30 °C. Potom se zahájí reakcepřídavkem 10 jul mikrosomálniho proteinu zředěného 1 : 120(při stanoveni se použije celkem 0,6 pg proteinu). Reakcese po 20 min zastaví přídavkem 100 pl směsi (1:1) 40 % KOH a 95 % EtOH. Směs se 30 min zahřívá na 65 °C a potom

- 15 ochladl* Potom se přidá 10 ml heptanu a směs se zamíchá. Dále se přidají 2 g aktivovaného oxidu hlinitého a směsse opět zamíchá. Oxid hlinitý se nechá usadit a odstraníse 5 ml heptanové vrstvy. K heptanovému roztoku' se přidá10 ml scintilační kapaliny. Radioaktivita se stanoví spočí-táním scxntilaci v kapalině. « Inhibice (%) se vypočítá podle vzorce: zkoušený vzorek-slepý pokus (kontrolní vzorek-slepý pokus)

Hodnoty ICgQ se urči vynesením logaritmu koncentracezkoušené sloučeniny proti inhibici v %. ΙΟ^θ je koncentra-ce inhibitoru, při niž dochází k 50 % inhibici, která seodečte se shora uvedeného grafu.

Data, ICjjq uvedená níže, jsou reprezentativní pro inhi-bičnl aktivity sloučenin podle tohoto vynálezu vůči skvalensyntetase::

Sloučenina

A 5

Sloučeniny podle vynálezu vykazuji také širokéspektrum antifungální aktivity, což bylo stanoveno zředo-va ími metodami v mediu a agaru. Tyto sloučeniny jsou zvláš-tě účinné proti vláknitým houbám a kvasinkám včetně Candi-da albicans a Crypt. neoformans. Citlivost vláknitých huba kvasinek byla stanovena pomoci zradováni inhibitoru naraikrotitrových plotnách. Sloučeniny podle tohoto vynálezu

skvalen syntetasaICSO-z: 5 pM 16 byly rozpuštěny v DMSO (2 mg/ml) a na mikrotitrové plotněsériově zředěny 0,1 M fosfátovým pufrera o pH 7,0 na končen -iraci od;lOO do 0,006 pg/ml. Byla připravena standardní suspenze spor·pro; testování vláknitých hub naočkováním antibioti-kového media' č. 3. Toto medium obsahuje 1,5 % agaru s tako-vým množstvím spor/ že na jednu jamku připadá 1,5 x ΙΟ3 jed-notek tvořících kolonie. Mikrotitrové jamky se naplní 50 plpufru, který obsahuje zkoušenou sloučeninu a 50 μΐ naočko-vaného media. Citlivost kvasinek se stanoví naočkováním kva-sinkové dusíkaté baze, která obsahuje 1 % dextrosy (YNB/G),alikvotnimi podíly 24 h staré kultury kvasinek, pěstované v"Yeast Morphology" (YM) mediu a zředěné v YNB/G na koncentra-ci, která odpovídá konečné koncentraci 1,5 - 7,5 x 10“3 jed-notek tvořících kolonie na jamku. Na jednu jamku se dává150 μΐ naočkovaného media. Pro zkoušení citlivosti kvasinekse zkoumaná sloučenina; rozpustí v 10 %-nira vodném roztokuDMSO v množství 2,56 mg/ml. Zkoumaná sloučenina se seríávězředí v YNB/G na koncentraci od 128 do 0,06 jjg/ml. Oamky senaplní 150 μΐ media, které obsahuje účinnou sloučeninu. Mi-nimální inhibični koncentrace (MIC) je definována jako nej-nižši koncentrace, která zabráni růstu po 42 hodinové inku-baci, při 28 °C pro vláknitá houby a po inkubaci, trvající24 až 48 hodin, při 35 °C pro kvasinky. Minimální fungicidníkoncentrace v pg/ml se definuje jakoznejnižši koncentraceúčinné sloučeniny, která úplně zabráni růstu nebo dovolírůst nevíce než tři kolonii. Oako reprezentativní hodnotyantifungálni aktivity je možno uvést následující minimálníinhibični koncentrace a minimální fungicidní koncentrace.

Minimální inhibični koncentrace Qjg/ml)

Organismus.vláknité houby A. fumigatus MF4839A, flavus MF383A. niger MF442 0,098 0,098 >· 128> 128

sloučenina A

sloučenina B 100 17

- Minimální inhibičnl

Organismus vláknité houby

Fus. oxyaporuro MF4O14Pen. italicum MF2819Coch. roiyabeanus MF4626T, Mentagrophytes MF4864 kvasinky C;. alblcans MY1O55 C. tropicalis MY1012C. parapsilosis MY1010Cryrrí. neoformans MY.W51C. alblcans MY 1055C. tropialis MY1012C. parasilosis MY1010Crypt. neoformans MY1051 koncentrace (pg/ml)

Sloučenina A sloučenina B Z 100 0,025 1/6 —-- > 128 Sloučenina A Sloučenina B 8 7128 4 7128 4 7128 Λ 7128 4 XL28 1 7128 1 7128 2 7128

Sloučeniny podle tohoto vynálezu je možno použit taképro léčeni fUngálních infekci. Pacientovi se může za účelemdosaženi léčebného účinku podávat netoxické terapeutickyúčinné množství sloučeniny strukturního vzorce I nebo jejifarmaceuticky vhodné soli. Na základě výše uvedených MICúdajů se zjistilo, že obvykle by mělo být užito při anti-fungálním léčeni v jedné dávce množství látky od 2 do 5 mg/kg.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se dají přizpůsobit propoužiti v různých formách antifungáinich přípravků, Při ta-kovém použiti se sloučeniny podle tohoto vynálezu mohousmísit 3 biologicky inertním nosičem, obvykle s pomocí po-vrchové aktivního disperzního činidla. Povaha tohoto čini - dla se bude měnit v závislosti na tom, zda se zmíněný pří- pravek má použít pro potlačení patogenů, způsobujících in- esse®» ,ιί· .isseesisagsiaaeeiesa^e - 18 - fekce u savců, například u člověka, nebo u ptáků nebo uplazů, anebo pro potlačeni hub v zemědělství například půd-ních nebo rostlinných mikroorganismů, nebo pro potlačeni hubv neživých objektech. V přípravcích pro lékařské , použiti se mohou sloučeni-ny podle tohoto vynálezu smísit s farmaceuticky vhodným no-sičem, jehož povaha se bude měnit v závislosti na tom, zdaje přípravek určen k zevnímu použiti nebo k parentálnimu ne-bo orálnímu podáváni. □estliže je přípravek určen k zevnímu použiti, může seléčivo zpracovat do podoby obvyklého krému nebo masti, jakonapříklad za použiti bílé vazelíny, bezvodého lanolinu, ce-tylalkoholu, základu pro platový krém, glycerylraonostearátu,růžové vody a podobně.

Pro parentálni použiti se sloučeniny podle tohoto vy»nálezu mohou zpracovávat na obvyklé parentálni roztoky, jakonppřiklad na roztoky v 0,85% roztoku chloridu sodného nebo5% roztoku dextrosy ve vodě nebo v jiných farmaceuticky vhod-ných nosičích. Přípravky pro orální podáváni se mohou připravit doko-nalým smísením léčivých složek s jakýmkoliv obvyklým farma-ceutickým nosičem. Pro kapalné přípravky se používá kapalnýchnosičů, jako je například voda, glykoly, oloje, alkoholya podobně. Pro tuhé přípravky, jako jsou kapsle, tablety,se používá tuhých nosičů, jako jsou škroby, cukry, kaolin,ethylcelulosa, povrchově aktivní dispergačni činidla, obvyk-le a mazadlem, jako je stearát vápenatý, společně s pojivý,dezintegračnimi činidly a podobně.

Tyto přípravky se potom podávají v množstvích, kterájsou dostatečná pro dosaženi žádaného antifungálniho efektu.Při lékařském použiti se může pacientovi podat za účelemdosaženi léčebného účinku terapeuticky antifungálně účinné - 19 - množství sloučeniny vzorce I. Vhodné dávky se budou měnitv závislosti na veku, vážnosti choroby, tělesné hmotnostia jiných aspektech. Při zevním použití se přípravky apliku-ji přímo na místo léčeni. Při vnitřním podáváni se přípravekmůže podávat injekčně nebo orálně.

Pro nelékařské použiti se produktu podle tohoto vyná-lezu může užívat bu3 samostatně nebo ve směsi ve formě pří-pravku obsahujícího také inertní nosič. Tento nosič můžezahrnovat jemně rozdělená pevná nebo kapalná ředidla, plni-va, nastavovadla, upravovači přísady a excipienty, jakojsou různé jíly rozsivková zemina, mastek a podobně, nebovoda a různé organické kapaliny, jako například alkanoly,například ethanol a isopropylalkohol nebo petrolej, benzen,toluen a jiné destilačni' frakce ropy nebo jejich směs-.

Tyto přípravky se mohou použít nanesením na povrch ne-bo přidáním do prostředí, které má být chráněno. Pro potla-čeni Pyricularia oryzae u rýže, septoridzy a jiných fungál-ních onemocnění rajčat, jako je fusarióza apod, rez pšenič-ných listů, padli ^fazoli se uvedené přípravky mohou apli-kovat přímo na rostlinu při zevním použiti nebo se mohoupřidávat do půdy při systemické aplikaci. Sloučenin podlevynálezu se přitom používá v antifugálně účinném množství. Následující příklady ukazují přípravu sloučenin vzorceI a jejich zpracováni do podoby farmaceutických přípravků.Tyto příklady se nemohou brát jako omezení patentových ná-roků, které jsou uvedeny dále. Přednostní cesta pro získá-ni sloučen? y A je popsána v přikladu 2.

Složeni medii, kterých bylo použito v následujícíchpříkladech, j-uoc uvedena níže:

- 20 ΥΜΕ Plating Medium složka kvasničný extrakt sladinový extrakt glukóza destilovaná H20 agar

KF zákvasné MEDIUM na litr

Corn Steep Liquor 5 grajčatový protlak 40 govesná mouka 10 g glukóza 10 g roztok stopových prvků 10 ml upraveno na 6,8(před sterilizaci50 ml media v 250 ml

Erlenmeyerovč baňce bezmíchacích narážek aterilizováno v autoklávu20 minut (121°C, 103 kPa)

Produkční média F204 proso 15,0 g/baňka základní kapa-lina č. 1 10,0 ml/baňka množství 4,0 g10,0 g 4,0 g1000 ml 25,0 g roztok stopových prvků FeS04.7H90 q/1 1,0 MnS04.4H?0 1,0 CuCl9.2H90 0,025 CaCl^u,'2HpO 0,1 ^3 0,056 (NH4)6Mo7024.4H2 0 0,019 2nS04.7H20 . 0,2 rozpuštěno v 1 0,6 N HC1 · BRF neloupaná rýže 5,0 g/baňka základní kapali- na č. 2 20,0 ml/baňka základní kapalina č. 1 základní kapalina č. 2 kvasničný extrakt aZi 50,0 kvasničný extrakt ,2/1 1,0 olutamát sodný 10,0 síran sodný 0,5 kukuřičný olej 10,0 ml KH2P04 0,5 síran sodný 10,0 destilovaná voda 1000,0 ml

- 21 - základní kapalina č. 1

g/T základní kapalina ?.č,2

FeS04.7H20 1,0 destilovaná voda 1000,0 ml (pH neupravováno) g/i (pH neupravováno)

sterilizováno v auto-klávu 15 minut (121 °C 15 psi) sterilizováno v autoklá- vu 15 minpt (121 °C,103 kPa) přidáno 15,0 ml destilova-né H^O/baňka no π2υ/ «'Ο»ιιχα sterilizováno v autoklá-vu 20 minut (121 °C, 103 kPa) 15,0 ml destilovanéHgO/baňka sterilizováno v autoklávu20 minut /121 C, 103 kPa/ Příklady provedeni vynálezu Přiklad

Příprava sloučeniny A A. Kultivace MF5447

Kultura MF 5447, naočkovaná ze zkumavky s půdou jednou lžičkou půdy (použije se skleněné lžičky) se pěstuje v KFzákvasném mediu 72 hodin při 25 °C, při intenzitě třepáni220 min""1, při 85% vlhkosti. Na konci tohoto inkubačniho období se asepticky převedou 2 ml alikvotního podílu dokaždé ze 45 Erlenmeyerových produkčních baněk o objemu 250ml a mediem F 204. Produkční baňky se inkubuji staticky21 dni při 25 °C a potom se sklidí. Při sklizení se do kaž- dé baňky přidá 40 ml methylethylketonu aně rozbije'na menši.kousky, Baňky.se pot tuhý nárůst se ruč-m dají na otáči- vou třepačku a třepou se 30 min při intenzitě 220 min ,aby se dále rozbila mycelární hmota a aby se zlepšil kon-takt rozpouštědla s bionikami. Po skončeni třepáni se obsahyjednotlivých baněk spoji nalitím celého obsahu baněk (pev-

22 - ného i tekutého) do kádinky o objemu 4 1.

B. Izolace sloučeniny A

Methylethylketonová kapalina z přibližně 2 litrů fer-mentačniho extraktu, který se kultivuje 21 dni, jak je popsá-no v přikladu 1A, se přefiltruje. K tuhému zbytku se přidají2 1 směsi sthylacetát: methanol (1:1). Výsledná směs se 18hodin michá mechanickým michadlem. Směs se přefiltruje a filt-rát se zkoncentruje na přibližně 700 ml v rotačnim odpařová-ku Rotavap při 40 °C. Přidá se 700 ml ethylacetátu a potom500 ml 5%-niho roztoku chloridu sodného ve vodě. Směs se15 min michá a potom·se odstrani vodná vrstva a ta dále^senezpracovává. Ethylacetátová vrstva se zahusti na přibližně150 ml na Rotovapu při 40 °C. Přidá se 500 ml hexanu a 500ml methanolu a směs se 15 min michá. Hexanová vrstva seodstrani a dále se nezpracovává. Nethanolová vrstva se od-paři do eacha na Rotoyapu při 40 °C, čiraž se získá surovýextrakt. 1,4 g surového extraktu se rozpustí, ve 25 ml směsi he-xan/toluen/methanol (3:1:1) a ňastřikne se na chroraatogra-fickou kolonu se Sephddexem LH-20 o objemu 1 1. Kolona seeluuje stejnou směsi rozpouštědel jako je ta, ve které jerozpuštěn surový extrakt. Průtoková rychlost je přibližně3 ml/min. Prvních 1600 ml elUantu se odstrani. Následují-cích 3600 ml eluantu se odpaři do sucha, aby se získal LH-20 eluát. Přibližně 310 mg LH-20 eluátu 3e rozpust! v 5 ml5%-niho roztoku methanolu v chloroformu. Výsledný roztokse nastřikne na silikagelovou chromatografickou kolonu oobjemu 50 ml s náplni silikagelu od firmy E. Merck Kiesel-gel 40-63 jum. Kolona se eluuje postupně, jak je ukázáno vtabulce x a níže. Frakce 4-5 se spoji a vysusí a tim se ziská olejovitý zbytek. 115 mg zbytku se rozpust! ve 4 ml

23 tetrahydrofuranu a přidá se 5 ml 0,005 molárni kyseliny chlo-rovodíkové. Výsledná suspenze se odstřeluje 20 min při 10 000min"’’*·, Supernatant se odstraní a dále se nezpracovává a získáse sraženina. 24 miligramů této sraženiny se rozpustí v 0,2 ml tetra-hydrofuranu a přidá se 0,2 ml dimethylsulf oxidu. Tento roztokse naadsorbuje na pryskyřici v otevřené chromatografickó ko-loně RP-18 (30 ml pryskyřice Bakerbo^nd 40 pm RP-18), kteráje udržována v rovnováze 10%-nira roztokem hydrofuranu ve vo-dě. Po postupné eluci, jak ukazuje tabulka I b níže, následu-je HPLC analýza a biologické stanoveni frakci. Frakce 2-7se spoji a zahustí na přibližně 50 ml. Vodný roztok se extra-huje 50 ml ethylacetátu. Ethylacetátový extrakt se odpařído '-'^cha a rozpustí v 0,3 ml meťr. ;^oluDále se přidá 0,4ml dimethylsuifoxidu, 0,1 ml vody a 0,05 ml 43%-niho roz-toku acetonitrilu v roztoku fosforečnanu draselného o kon-centraci 10 mM a pH 7,0. Tento roztok se nastřikne na HPLCkolonu (Amicon Matrex Silica MC-100A C8 15 yum, 4,6 mm ID x25 cm) a eluuje se 43%-nim roztokem acetonitrilu v roztokufosforečnanu draselného o koncentraci 10 mM a pH 7. Průto-ková rychlost je 1 ml/ min. Frakce 9-12 se spoji a přidáse k nim 0,05 ml 0,5 molárni kyseliny chlorovodíkové a po-tom 10 ml ethylacetátu. Ethylacetátová vrstva se odpaří dosucha a tím se získá sloučenina A.

Tabulka Ia

Složeni rozpouštědla pro chromatografii na silikage-lu pro získání LH-eluátu

SiiSSiSSi

24

Frakce Rozpouštědlo % (mathanol/voda/kyselina10:1:1) v chloroformu Objem octová (ml/frakce) ' 5 50 · 2 ««3 10 50 4-5 20 50 6-7 30 50 8-9 50 50 10-11 75 50 12 100 50

Tabulka I b Složeni rozpouštědla pro chromatografii na Bakerbond RP-18 pro získáni sraženiny - Frakce Rozpouštědlo Objem % tetrahydrofuranu ve vodě (ml/frakce) 1 10 25 2-3 25 25 4-5 50 25 6-7 75 25 8 100 25 Přiklad 2

Příprava sloučeniny A A. Kultivace MF 5447

Fermentačni postupy jsou stejné jako v příkladu 1A

25 s výjimkou toho, že se naočkuje 23 baněk s mediem F 204a fermentace trvá 14 dni. Potom se do každá baňky přidá50 ml methanolu a tuhý nárůst se ručně rozbije. Dále sebaňky třepou, jak je uvedeno v příkladu 1A. Obsahy baněkse spoji nalitím celých obsahů do kádinky o objemu 31.

B. Izolace sloučeniny A Přibližně 2 litry fermentačniho extraktu, který sekultivoval 14 dní, jak je popsáno v přikladu 2A a který obsa-huje navíc 1 litr methanolu, se 16 hodin silně míchá a po-tom se přefiltruje. K použitým tuhým částicím se přidá dru-hý díl methanolu o objemu 1 1. Směs se 4 hodiny míchá apotom se přefiltruje. Methanolové extrakty se spoji a naRotovapu při 47 °C zahusti na asi 20C· ml. Ke koncentrátuse přidá 300 ml vody a pH směsi se upt©ví kyselinou chloro-vodíkovou na hodnotu 3. Dále se přidá 500 ml n-butanolu asměs se 20 min míchá. Organická vrstva se odtáhne a odpaříse do sucha, čímž se získá černý dehet. 49 g tohoto dehtuse nanese na chroraatografickou kolonu se silikagelem. Chro-matografické podmínky jsou podobné jako v příkladech 1 a 3.Frakce, které obsahuji sloučeninu A (podle výsledků HPLCanalýzy), se spoji a odpaří na Rotovapu při 40 °C do sucha.230 mg olejovítého zbytku se rozpustí v 1 ml dimethyls foxi-du a nastřikne se na HPLC kolonu (DYNAMAX 60A 8 mikron C8; 21,4 mm ID x 25 cm s předkolonou), Eluce se provádí gradien-tem rozpouštědla, jak je ukázáno v tabulce II a, při průtoko-vé rychlosti 10 ml/min. Sbírají se .frakce po 5 ml. Frakce. .37-42 se spoji a k nim se přidá 50 ml ethylacetátu a 50 mlvody. Po extrakci se ethylacetátová vrstva oddělí a odpařína Rot·. vapu při 40 °C, čímž se získá sloučenina A.

Tabulka IIa

Gradient rozpouštědla pro HPLC preparativní vyčištění boha-tých frakcí, získaných z rozděleni na silikagelu Čas (min) 0-10 10-20 20-30

Rozpouštědlo % acetonitrilu v 0,1% roztoku H^PO./vevodě * 70%,isokratická eluce 70-90%,lineární gradient90% , iaokratická eluce

feí - 26 -

Analytický HPLC systém: kolona: Dynamax-60A 8 mikron C8, 4,6 mm ID x 25 cm s předkolonou (1,5 cm/1) eluant: 80:20 acatonitril/O,1% roztok kyseliny fosforečné ve vodě průtoková rychlost: 1,0 ml/min. datakca: UV při 250 nm retenční čas sloučeniny A: 5,52 min Přiklad 3

Příprava sloučeniny A A. Kultivace MF 5466

Kultura MF 5466 se pěstuje na šikmém agaru s YME me-diem, při 25 °C alespoň 2 týdny. Oedna pětina nárůstu naagaru se převede do zákvasné Erlenmeyerovy baňky bez mícha-cích narážek o óbjemu 250 ml, která obsahuje 54 ml KF media.Zákvasná baňka se potom 72 hodin inkubuje při 24 °C a přiintenzitě třepáni 220 min“\ Na konci této inkubace se 2 mlalikvotniho podílu převedou do mnoha Erlenmeyerových pro-dukčních baněk o objemu 250 ml s F 204 mediem. Produkčníbaňky se inkubuji stacionárně, při 24 °C, 21 dni. Při skli-zeni se do produkčních baněk přidá 50 ml 70% roztoku raet-hanolu a mycelárni nárůst se ručně pipetou rozbije. Potom

M -I sé banky 30 min. třepou při intenzitě 220 min . Methano-lové extrakty se spoji, přefiltruji a zbytky se spoji.

B. Izolace sloučeniny A

Spojené tuhé částice, získané tak, jak je popsáno vpřikladu 3A, se 15 hodin intenzívně extrahuji 1 1 methano-lu. 1 1 extraktu se zahustí n(a 250 ml, zředí se stejnýmobjemem vody, pH se upraví na 8,5 a potom se extrahuje 500ml isopropylacetátu. Vodný roztok se potom okyselí na pH4,0, a dále se extrahuje dvakrát ethylacetátem a jednou 27 -

l-butanolem. Každý extrakt aa samostatně zahustí na 40 ml(Ethylacetátový extrakt 1, Ethylacetátový extrakt 2, Bu-tanolový extrakt 1). 20 ml alikvotniho podílu ethylacetátového extraktu 1(s celkovým obsahem 250 mg tuhých částic) se odpaří do suchaa znovu rozmíchá v 5 ml směsi chloroform - methanol-voda-kyselina octová (93:4:1:2). ' Tento vzorek se dávkuje na ko-lonu se silikagelem 60, o objemu 10 ml, která se udržuje vrovnováze stejnou směsi rozpouštědel jako je ta, v níž bylrozpuštěn vzorek. Kolona se potom postupně eluuje (viz Ta-bulka lila).

Tabulka III a

Složení rozpouštědla (v objemech) pro chromatografické děle-ní surového ethylacetátového extraktu na koloně se silikage-lem. frakce CHCI, CH,OH Ho0 CH,CG0H ——o —2— —3" - 1-8 93 4 1 2 9-16 89 8 1 2 17-24 85 12 1 2 ' 25-32 78 18 2 2 33-38 59 33 4 4 Objem všech jednotlivých frakci činí 5 ml. Frakce 18 28 se spoji a odpaří do sucha. Zbytek (40 mg tuhých části se rozpustí ve 4 ml tetrahydrofuranu. Za míchání se k to- muto roztoku i přidá 5 ml vody. Výsledná kalná směs se 20 min. odstředuje při 15 i 000 min 4. Utvořená o lejovitá sra- ženina (ppt 1) se sebere. 40 ml ethylacetátového extraktu 2 a zbývájícícu 20 mlethylacetátového extraktu 1 se obdobně rozdělí na silika-

28 gelové koloně a vysráží, čímž vznikne olejovitá sraženina(ppt 2). Tyto dvě sraženiny se spoji (společně váži 43 mg)a rozpustí se v 0,5 ml dimethylsulfoxidu a 0,5 ml methano-lu. Vzniklý roztok se nastřikne na HPLC kolonu (DYNAMAX60A 8 mikron C8; 21,4 mm ID x 25 cm, s předkolonou). Elu-ce se provádí gradientem rozpouštědla., viz tabulka III b,při průtokové rychlosti 10 ml/min. Sbiraji se frakce po5 ml. Frakce 21-36 se spoji a k nim se přidá 100 ml ethyla-cetátu, pH vodné fáze se upraví kyselinou chlorovodíkovouna 3. Po extrakci se ethylacetátová vrstva vysuší na Roto-vapu při 40 °C a tak se získá sloučenina A.

Tabulka Illb

Složeni gradientu rozpouštědla pro čištěni sraženiny pomociHPLC čas (min) Rozpouštědlo % acetonitrilu v 10 mM roztoku fosforečnanu 0-15 15-20 20-30 draselného (pH 7) 42%, isokratická eluce42-70%, lineární gradient70%,isokratická sluce Přiklad 4

Specifickým příkladem orálního přípravku se sloučeni-nou podle tohoto vynálezu je tvrdá želatinová kapsle veli-kosti 0. 20 mg sloučeniny podle příkladu 1 se smísi s ta-kovým množstvím jemně rozemleté laktosy, aby se získalocelkem 580 až 590 mg směsi. Touto směsi se naplní kapslez tvrdé želatiny velikosti 0.

‘-Í 'V·

- 29 - X» Přiklad 5 Příprava amonné soli 0,1 mmol vzorku volné kyseliny sloučeniny vzorce Ise rozpustí v 10 ml ethylacetátu. Výsledný roztok se nasy-tí plynným amoniakem, při čemž se v roztoku vysráží amon-ná sůl. Přiklad 6 Příprava draselné soli

Rn mztok 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce Iv 10 ml sjothanolu se nechá působit vodný nebo roethanolovýroztok, obsahující 0,3 mmol hydroxidu draselného. Odpaře-ním rozpouštědla vznikne tri-draselná sůl. Analogicky vznik-ne směs mono-draselných, di-draselných a tri-draselných so-li při přídavku 0,1 až 0,3 mmol hydroxidu draselného. Slo-ženi směsi závisí na přesném množství přidaného hydroxidudraselného. Podobně se dají vytvořit sodné a litKne soli. Přiklad 7 Příprava vápenaté soli

Na roztok 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce I,ve 20 ml směsi methanol/voda (6:4)se působí vodným roztokem0,1 mmol hydroxidu vápenatého. Rozpouštědla se odpaří a timse získá vápenatá sůl. Přiklad 8 Příprava soli ethylendiaminu ''Viň· - 30 -

Na roztok 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce Iv 10 ml methanolu se nechá působit 0,1 mmol ethylendiarainu.Odpařením rozpouštědla se získá sůl ethylendiaminu. Tentopostup se může také použit při přípravě soli N ,N *'~dibenzyl- ethylendiaminu. P ř 1 k 1 a d 9 Příprava soli tris(hydroxymethyl)aminomethanu K roztoku 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce Iv 10 ml methanolu se přidá 0,1 až 0,3 mmol tris(hydroxymethyl)arainomethanu rozpuštěného v 10 ml methanolu. Odpařením roz-pouštědla se získá odpovídající solná forma, jejíž přesnésloženi je určeno molárnim poměrem sloučeniny vzorce I apřidaného aminu. Podobně- se připraví soli L-ornithinu, L~lysinu, a N-methylglujkaminu. Přikladlo Příprava soli L-argininu

Na roztok 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce Iv 10 ml směsi methanol/voda (6:4) se působ! vodným rozto-kem, který obsahuje 0,1 až 0,3 mmol L-argininui Odpařenímrozpouštědla se získá přláluěné sůl, jejíž přesné složenije určeno molárnim poměrem aminokyseliny a použité volnékyseliny vzorce I. Podobně se připrav! soli L-ornithinu,L-lysinu a N-methylglukaminu. P ř i k la d 11 Příprava sloučeniny B (způsob 1)

Na roztok 2 mg sloučeniny A v 5 ml směsi methanol/ether (1:1) se působ! mírným přebytkem diazoraethanu v etheru. - 31 -

Po 5 min. se přebytek diazomethanu odstraní a rozpouštědlose odpaří, aby se získala sloučenina B. Příklad 12 Příprava sloučeniny B (způsob 2)

Na roztok 2 mg sloučeniny A v 0,5 ml acetonitrilu sepůsobí při laboratorní teplotě 10 ekvivalenty DBU a 10ekvivalenty Me^T. Po 2 hodinách se reakčni směs zředí 10ml di chlormethanu a promývá se postupně 10 ml 0,1 M roz-toku kyseliny fosforečné, 10 ml vody, 10 ml nasyceného roz-toku hydrogenuhličitanu sodného a 10 ml vody. Po vysušenísíranem sodným se organická vrstva zkoncentruje. Zbytek sechromá negraficky děli na silikagelu. Oako elučni činidlese použiji směsi hexanu a ethylacetátu. Tímto způsobem sezíská sloučenina B, Způsob podle přikladu 12 je také vhodnýpro přípravu jiných esterových derivátů, jako 1) ethyles-terů a jiných nižších alkylesterů a 2) benzylesterů a subs-tituovaných benzylesterů. Údaje z hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektra se proměřují na hmotnostních spektro-metrech Finnigan-MAT model MAT212 (ráz elektronů (electron impact)El, 90 eV), MAT 90 bombardováni rychlými a torny(rast AtomBombardment}), FAB), a TS070B (FAB, El). Přesná hmotnostníspektrometrická měření se provádí při vysokém rozlišení(high resolution) (HR-EI) s použitím perfluorovanóho petro-leje <PFK) nebo perfluorovaného propylenoxidu (UltramarkU 1600 F) jeko vnitřního standardu. Triraethylsilyl derivátyse připraví se směsí BSTFA-pyridin (1:1) při laboratorníteplo'ě. Údaje z C ΝΜΡΐ C NMR spektrum sloučeniny seměří v CD^OD při 100 MHz na Varian XL400 spektrometru.

Chemické posuny ee udávají v ppm. Oedná se o hodnoty rela-tivní, vztažené k tetramethylsilanu (TMS). (TMS - O ppm). - 32 -

Pik rozpouštědla je při 49,0 ppm, rozpouštědlo je vnitřnímstandardem. 1H NMR Spektra

Hl NMR spektra se měří při 400 MHz v CD^OD a CgDg naVarian XL400 spektrometru. Chemické posuny se udávají v ppm.Oedná se o hodnoty relativní, vztažené k tetramethylsilanu(TMS). (IMS - Oppm). Piky rozpouštědel jsou při 3,30 ppmpro CDgQD a při 7,15 ppm pro ΟθΟθ. Rozpouštědla jsou vnitř-ními standardy.

Fyzikální vlastnosti sloučenin strukturního vzorce I:

Sloučenina A je sloučenina strukturního vzorce I, kde všech-ny symboly Z^, Z2 a Zg představují vodíkové atomy. Údaje z hmotnostní spektrometrie

Tato sloučenina má molekulovou hmotnost 730, zjištěnoupomoci FAB-MS (pozorováno /M+H/+ při m/z 731, a s přídavkemacetátu lithného /M.Lig + Li/+ (t.j, adukt lithia, tri-lithnásůl) při m/z 755). Sumární vzorec C 39^54^3,3 θθ stanoví mě-řením hexa-trimethylsilyl derivátu na HR-EI (vypočteno proC39H54°13+^SiC3H8^6“CH3 1147· 5701 ’ nalezeno 1147, 5751). 1H NMR spektrum (400 MHz) /CDgOD, 22 °C): viz obr. 1. 13C NMR chemické posuny (CDgOD, 22 °C): 14,8^ 15,2, 18,1,25,3, 27,5, 30,1, 30,3, (2x), 33,2, 33,5, (2x), 33,9, 34,8, 36.7, 36,9, 38,6, 75,7, 76,7, 78,4, 81,0, 82,0, 91,1, 107,5, 125.7, 127,0 (2x), 127,9, 129,5 (2x), 130,2, 131,0, 131,9,132,57, 132,63, 139,3, 168,6, 170,3, 172,6, 173,6 ppm. UV (methanol): maximální vlnová délka je 250 nm (e 23,000) IR (pro volnou kyselinu: film na ZnSe): 522Q br, 2924, 2855,2489 br, 1741, 1436, 1417, 1266, 1152, 1122, 1004, 967, 950,804, 744, 695 cm“1.

Sloučenina B je trimethylester sloučeniny A, t.j. sloučeni-na strukturního vzorce I, kde všechny symboly Z^, Z2 a Zg

'«Vijlíí - 33 představuji methylskupiny. Údaje z hmotnostní spektrometrie

Tato sloučenina má molekulovou hmotnost 772. zjištěnoupomocí FAB-MS (pozorováno /M+Li/ při m/z 779 v spektru slithiem}* Sumární vzorec ^43^50°13 s® stanov^ měřením tris-trimethylsilyl derivátu na HR-ΞΙ(vypočteno pro θ42*^60°13+(SiCgHg) 988, 5220 nalezeno 988, 5172). NMR Spektrum (400 MHz) ,(0θ0θ,22 °C): vte obr. 2.

Claims (9)

1. - T - PATENTOVÉ NÁROKY

   1, Sloučeniny obecného vzorce I,

   (I) V" -*-----A· ‘Λ3Γ80V TiVNAA OHdσν^η l 5 .111 S t <&amp;oa ^6110 •f'5 II aC-CCH2)4-CH=CH-(CH2)4-CH=CH-CH3 kde Z^t Z2 a Z3 jsou nezávislezahrnující na sobě vybrány ze skupiny a) vodík, b) alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, c) alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku substituovanoučlenem skupiny, která se skládá z i) fenylu ii) fenylu, který je substitu-ovaný methylem, methoxyskupinou,halogenem (Cl, 3r, I, r) nebohydroxyskupinou; nabo farmaceuticky vhodné soli sv nichž alespoň jeden ze symbolůvodík. loučením obecného vzorcea představuje
2. 2.Sloučeniny podle nároku 1, v nichž rslativní kon- figurace strukturního vzorce I je II.
3. 3, Sloučeniny podlá nároku 2, v nichž symboly Z-j , ZQ a2-, představují atomy vodíku nsbo jejich farmaceuticky vhodnésoli.
4. 4. Sloučeniny podle nároku 2, v nichž symboly Zp Z7 a Z., představují methylskupiny. O
5. 5. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, žeobsahuje netoxické terapeuticky účinné množství sloučeninypodle nároku 1 a farmaceuticky vhodný nosič.
6. 6, Kultura Mr 5447 (STCC 20985) nsbo jojí aktivní mutant,schopný: produkovat sloučeninu vzorce

   V izolovatelných množstvích.
7. 7. Kultura MF 5446 (A7CC 2C989) nebo její aktivní mu III taní, schopný produkovat sloučeninu vzorce

   v izolovatelných množstvích.
8. 8. Způsob ..přípravy sloučeniny vzorce

   vyznačující se tím, že se kultura MF 5447 (ATCC 20985)nebo její aktivní mutant kultivuje za podmínek, vhodnýchpro tvorbu řečené sloučeniny, načež se získaná sloučeninaizoluje. G. Způsob přípravy sloučeniny vzorce

   IV

   vyznačující saaktivní nutantné sloučeniny, :ín, ža ca kultura Mr 5456 2C98S) nebo kultivujnačež se s za podmínek, vhodných pro tvorbuzískaná sloučenina izoluje/’ rsca-
9. 10, Způsob inhibice run gálního růstu, vyznačující se žo na plochu,na které má být růst vkesnjSs nanese anti účinné množství sloučeniny v zorce I tím, W,, > unaina

   coozš (I) kde ΖΊ,jící ^~2 a Z3 j sou nozávi sis na SObě vybrány ze skupiny zahrnu a] vodík, b; alkyls kupinu s 1 2 ií 5 atomy uhlíku, c) alkyls kupínu s 1 až 5 atomy uhlíku substituovanou členen skupiny, která 3 3 S k ládá z ii] renylu, který je substituovaný methylen,□ethoxyskupinou, halogenem (Cl, Sr, I, r) nebo hydronyskupinou; t \1*. Λ η ο b ο Γ’ ο r π ο c ο u ί' i ok y vhod n év nichž alespoň jo don as solí. sloučenin obecného vzorce Iycbclú Z1, Ξ? 3 2_ představuje v ut, J —4S · MP-171-91-HO