HRP20010570A2 - Process for the isolation of pseudomonic acid a from pseudomonic acid complex-containing culture broth - Google Patents
Process for the isolation of pseudomonic acid a from pseudomonic acid complex-containing culture broth Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20010570A2 HRP20010570A2 HR20010570A HRP20010570A HRP20010570A2 HR P20010570 A2 HRP20010570 A2 HR P20010570A2 HR 20010570 A HR20010570 A HR 20010570A HR P20010570 A HRP20010570 A HR P20010570A HR P20010570 A2 HRP20010570 A2 HR P20010570A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- pseudomonic acid
- extract
- solution
- acid
- isobutyl acetate
- Prior art date
Links
- MINDHVHHQZYEEK-UHFFFAOYSA-N (E)-(2S,3R,4R,5S)-5-[(2S,3S,4S,5S)-2,3-epoxy-5-hydroxy-4-methylhexyl]tetrahydro-3,4-dihydroxy-(beta)-methyl-2H-pyran-2-crotonic acid ester with 9-hydroxynonanoic acid Natural products CC(O)C(C)C1OC1CC1C(O)C(O)C(CC(C)=CC(=O)OCCCCCCCCC(O)=O)OC1 MINDHVHHQZYEEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 85
- MINDHVHHQZYEEK-HBBNESRFSA-N mupirocin Chemical compound C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1O[C@H]1C[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C\C(C)=C\C(=O)OCCCCCCCCC(O)=O)OC1 MINDHVHHQZYEEK-HBBNESRFSA-N 0.000 title claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 44
- 229960003128 mupirocin Drugs 0.000 title claims description 31
- 229930194369 pseudomonic acid Natural products 0.000 title claims description 15
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 5
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical group ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 49
- GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N iso-butyl acetate Chemical class CC(C)COC(C)=O GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M isocaproate Chemical class CC(C)CCC([O-])=O FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 43
- OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid methyl ester Chemical class COC(=O)CC(C)C OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 29
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 18
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 11
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 11
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 11
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 5
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims description 5
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 claims description 5
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 4
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 4
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 4
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N butyl acetate Chemical compound CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 1
- 229930187697 mupirocin Natural products 0.000 description 16
- DDHVILIIHBIMQU-YJGQQKNPSA-L mupirocin calcium hydrate Chemical compound O.O.[Ca+2].C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1O[C@H]1C[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C\C(C)=C\C(=O)OCCCCCCCCC([O-])=O)OC1.C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1O[C@H]1C[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C\C(C)=C\C(=O)OCCCCCCCCC([O-])=O)OC1 DDHVILIIHBIMQU-YJGQQKNPSA-L 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 14
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 14
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 229940043265 methyl isobutyl ketone Drugs 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- -1 methylisobutyl Chemical group 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- MPKNPWYCNYLGSC-UHFFFAOYSA-N heptane;4-methylpentan-2-one Chemical compound CCCCCCC.CC(C)CC(C)=O MPKNPWYCNYLGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KKMHFUKZHJOMJL-ZDACLCLWSA-N (+)-Pseudomonic acid C Natural products O=C(OCCCCCCCCC(=O)O)/C=C(\C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C/C=C/[C@H]([C@@H](O)C)C)CO1)/C KKMHFUKZHJOMJL-ZDACLCLWSA-N 0.000 description 1
- RJGJFSVDQPCELW-VCXQKUNESA-N (e)-9-[(e)-4-[(2s,3r,4r,5s)-3,4-dihydroxy-5-[[(2s,3s)-3-[(2s,3s)-3-hydroxybutan-2-yl]oxiran-2-yl]methyl]oxan-2-yl]-3-methylbut-2-enoyl]oxynon-4-enoic acid Chemical compound C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1O[C@H]1C[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C\C(C)=C\C(=O)OCCCC\C=C\CCC(O)=O)OC1 RJGJFSVDQPCELW-VCXQKUNESA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- JGKQAKOVZJHZTF-LHSFDMIQSA-N 9-[(e)-3-methyl-4-[(2s,3r,4s,5r)-3,4,5-trihydroxy-5-[[(2s,3s)-3-[(2s,3s)-3-hydroxybutan-2-yl]oxiran-2-yl]methyl]oxan-2-yl]but-2-enoyl]oxynonanoic acid Chemical compound C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1O[C@H]1C[C@]1(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C\C(C)=C\C(=O)OCCCCCCCCC(O)=O)OC1 JGKQAKOVZJHZTF-LHSFDMIQSA-N 0.000 description 1
- KKMHFUKZHJOMJL-WZLBZGCNSA-N 9-[(e)-4-[(2s,3r,4r,5s)-3,4-dihydroxy-5-[(e,4r,5s)-5-hydroxy-4-methylhex-2-enyl]oxan-2-yl]-3-methylbut-2-enoyl]oxynonanoic acid Chemical compound C[C@H](O)[C@H](C)\C=C\C[C@H]1CO[C@@H](C\C(C)=C\C(=O)OCCCCCCCCC(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O KKMHFUKZHJOMJL-WZLBZGCNSA-N 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 238000010953 Ames test Methods 0.000 description 1
- 231100000039 Ames test Toxicity 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010021531 Impetigo Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- RJGJFSVDQPCELW-IZCYIFJBSA-N Pseudomonic D Natural products O=C(OCCCC/C=C/CCC(=O)O)/C=C(\C[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C[C@H]2[C@@H]([C@H]([C@@H](O)C)C)O2)CO1)/C RJGJFSVDQPCELW-IZCYIFJBSA-N 0.000 description 1
- JGKQAKOVZJHZTF-LMLZBOKOSA-N Pseudomonic acid B Natural products O=C(OCCCCCCCCC(=O)O)/C=C(\C[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](O)(C[C@H]2[C@@H]([C@H]([C@@H](O)C)C)O2)CO1)/C JGKQAKOVZJHZTF-LMLZBOKOSA-N 0.000 description 1
- KKMHFUKZHJOMJL-UHFFFAOYSA-N Pseudomonic acid C Natural products CC(O)C(C)C=CCC1COC(CC(C)=CC(=O)OCCCCCCCCC(O)=O)C(O)C1O KKMHFUKZHJOMJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 208000006311 Pyoderma Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N azane;methanol Chemical compound N.OC CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 159000000009 barium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000006364 carbonyl oxy methylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])OC([*:1])=O 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000000883 ear external Anatomy 0.000 description 1
- 230000002774 effect on peptide Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- MAZKNBXUMANNDL-UHFFFAOYSA-M lithium;2-ethylhexanoate Chemical compound [Li+].CCCCC(CC)C([O-])=O MAZKNBXUMANNDL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N noncarboxylic acid Natural products CCCCCCCCC(O)=O FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- RJGJFSVDQPCELW-UHFFFAOYSA-N pseudomonic acid D Natural products CC(O)C(C)C1OC1CC1C(O)C(O)C(CC(C)=CC(=O)OCCCCC=CCCC(O)=O)OC1 RJGJFSVDQPCELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
- C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Područje izuma
Prikazani izum odnosi se na izolaciju pseudomonske kiseline A (mupirocin) iz podloge za uzgoj koja sadrži kompleks pseudomonske kiseline.
Osnova izuma
Pseudomonska kiselina A, također poznata kao mupirocin, je antibiotik čija je formula (I):
[image]
Poznato je da su sojevi Pseudomonas fluorescens u mogućnosti biosintetizirati, pored pseudomonske kiseline A, i druge slične antibiotike označene slovima B-D u malim količinama [R B. Chain, G. Mellows, J. Chem. Soc. Perkin Trans L 318 (1977); J. P. Clayton et al., Tetrahedron Lett, 21, 881 (1980); P. J. O. Hanlon, N. H. Rogers, J. Chem. Soc. Perkin Trans Ir2665 (1983)], prikazane odgovarajućim formulama (II) do (IV):
[image]
[image]
Među antibioticima pseudomonske kiseline, sa terapijskog stajališta najvrijednija je pseudomonska kiselina A, koja ima učinak inhibitora rasta uglavnom na Gram pozitivne bakterije (npr. Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae) i neke Gram negativne bakterije (npr. Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae) i njezina minimalna inhibicijska koncentracija je u rasponu od 0.02 - 0.5 mg/dm3. Pseudomonska kiselina A, inhibirajući izoleucin-tRNA sintetazu, ima učinak na sintezu peptida patogenih bakterija [J. Hughes and G. mellows, Biochem. J. 191, 209-219, (1980)]. Povoljno svojstvo ovog antibiotika jest da je manje toksičan i za ljude i za životinje i da je negativan u Amesovom testu. Pseudomonska kiselina A trenutno se koristi u humanoj terapiji, u različitim pripravcima, za, liječenje kožnih infekcija (npr. impetigo, pioderma), infekcija nosa i vanjskog uha, akni, opekotina, ekcema, psorijaze, u slučajevima ulceracija za liječenje sekundarnih infekcija, i za prevenciju bolničkih infekcija.
Jedna od metoda za izolaciju pseudomonske kiseline A iz podloge za uzgoj koja sadrži kompleks pseudomonske kiseline jest ekstrakcija tekuće-tekuće. Prema njemačkom patentu No. 2,227.739 i U. S. patentu No. 4,289.703, topljive barijeve soli se dodaju u fermentacijsku podlogu, nakon čega se stanice mikroorganizama zajedno sa netopljivim maktivnim tvarima uklanjaju centrifugiranjem i na kraju se antibiotik ekstrahira pomoću metilizobutilketona. Antibiotici se tada uklanjaju iz metilizobutilnog ekstrakta pomoću alkalne vode i dobiveni lužnati vodeni ekstrakt se pročišćava reekstrakcijom pomoću metilizobutilketona. Dobiveni sirovi proizvod se kromatografira i priprema se esterski derivat antibiotskog kompleksa pseudomonske kiseline koji se zatim pročišćava preparativnom tankoslojnom kromatografijom. Kiseli oblik čistog antibiotika dobiva se hidrolizom.
Belgijski patent No. 870,855 odnosi se na postupak u kojem se podloga za uzgoj ekstrahira metilizobutilketonom i aktivna supstancija ekstrahira se iz ekstrakta pomoću otopine natrijevog hidrogenkarbonata. Tvari netopljive u alkalnoj vodi uklanjaju se filtracijom, tada se pH filtrata zakiseli i vrši se ekstrakcija metilizobutilketonom. Na kraju se pseudomonska kiselina A dobiva koncentriranjem ekstrakta i kristalizacijom iz smjese metilizobutilketon - n-heptan.
Japanski patent No. 52-70083 odnosi se na dvije metode za regeneraciju pseudomonske kiseline A iz podloge za uzgoj. Prema jednoj od ovih metoda bakterijske stanice odvajaju se od podloge centrifugiranjem, nakon čega se aktivna supstancija ekstrahira iz supernatanta etilacetatom. Tada se kompleks pseudomonske kiseline reekstrahira iz etilacetatne faze otopinom natrijevog hidrogenkarbonata i nakon zakiseljavanja ponovo se ekstrahira etilacetatom. Nakon uparavanja ostatak se pročišćava na koloni silikagela uz primjenu kloroform-metanola kao eluenta i na kraju se čista pseudomonska kiselina A dobiva kristalizacijom iz diizopropiletera. U drugom postupku sirovi proizvod dobiven opisanom metodom se kromatografira na koloni sa DEAE-Sephadex anionskim izmjenjivačem uz primjenu metanol-amonijaka kao eluenta i odvajaju se frakcije koje sadrže pseudomonsku kiselinu A.
A. D. Curzons opisao je regeneraciju pseudomonske kiseline A iz podloge za uzgoj formiranjem litijevih soli (Europski patent No. O 005 614). Metilizobmilketonski ekstrakt koji sadrži aktivni sastojak, dobiven pri pH 4.5, reagira sa litijevim 2-etilheksanoatom otopljenim u metanolu. Istaložena litijeva sol pseudomonske kiselice A se odvaja, otapa u vodi i pseudomonska kiselina A oslobođena pri pH 4.5 se ekstrahira u metilizobutilketon i taloži u prisutnosti n-heptana.
U gore spomenutim metodama koriste se polarna otapala koja se ne miješaju s vodom (metilizobutilketon, etilacetat, n-butanol) za regeneraciju kompleksa pseudomonske kiseline iz podloge za uzgoj. Prema našem iskustvu, selektivna ekstrakcija ne može biti zadovoljavajuća primjenom ovih postupaka, budući se pored kompleksa pseudomonske kiseline ostale polarne i nepolarne nečistoće ekstrahiraju u velikim količinama. Pseudomonska kiselina može se regenerirati u čistom obliku samo sa malim prinosom (17-34 %) alkalnom ekstrakcijom organskih otapala koja sadrže nečistoće u velikoj količini, zatim reekstrakcijom organskim otapalom u kiselom pH i tada kristalizacijom sirovog proizvoda. Primjena postupka kromatografije za pročišćavanje nije prikladna za proizvodne razmjere zbog visokih laboratorijskih troškova i potrebama za otapalima. Pored toga, u prisustvu adsorbensa za kromatografiju i tijekom procesa kromatografije dešavaju se intramolekulske transformacije u aktivnoj supstanciji, koje dovode do nastajanja biološki inaktivnog bicikličkog spoja 9-{4-[1S,6R-8R(1S,3S-dihidroksi-2S-metilbutil)-5S-hidroksi-3,7-dioksabiciklo[4.3.0]nonan-4S-il]-3-metil-but-2(E)-enoiloksi}noanska kiselina (formula V):
[image]
i spoja 9-{4-[1R,6S-4S,10S-dihidroksi-3R-(2S-hidroksi-IS-metil-propil)-2,8-dioksabiciklo[4.4.0]dekan-9S-il]-3-metilbut-2(E)-enoiloksi}nonanska kiselina (formula VI):
[image]
Nastajanje ovih spojeva i njihovo uklanjanje putem rekristalizacije značajno umanjuje stupanj iskorištenja pseudomonske kiseline A.
Iako postupak izolacije preko intermedijera litijeve soli pseudomonske kiseline A ne uključuje postupak kromatografije, nije prikladan za proces proizvodnih razmjera, jer litijeve soli koje se koriste u postupku čine postupak kompliciranim i skupim za proizvodne razmjere.
Ostaje dakle potreba struke za novim postupkom izolacije antibiotika pseudomonske kiseline A, koji je oslobođen nedostataka poznatih postupaka i čija primjena u proizvodnim razmjerima rezultira visokim iskorištenjem gore spomenutog antibiotika.
Sažetak izuma
Prikazani izum se odnosi na postupak izolacije antibiotika pseudomonske kiseline A formule (I):
[image]
koji uključuje stupnjeve ekstrakcije pseudomonske kiseline A iz kulture sojeva iz roda bakterija Pseudomonas, koji proizvode pseudomonsku kiselinu A, pri kiselom pH, korištenjem kloriranih alifatskih ugljikovodika ili izobutilacetat, tako da se dobije ekstrakt koji sadrži pseudomonsku kiselinu A; kao i pročišćavanje pseudomonske kiseline A iz spomenutog ekstrakta. Ovisno o uvjetima, pročišćena pseudomonska kiselina A je kristalizirana.
U jednom uobličenju prikazanog izuma, stupanj pročišćavanja uključuje razdjeljivanje uparenog ostatka ekstrakta između vodeno-alkoholne faze i manje polarnog otapala, kako bi se uklonile nečistoće; razrjeđivanje vodeno-alkoholne faze vodom i ekstrakciju sa polarnijim otapalom da bi se odvojila pročišćena pseudomonska kiselina A.
U drugom uobličenju prikazanog izuma, stupanj pročišćavanja uključuje regeneraciju pseudomonske kiseline A iz ekstrakta vodenom otopinom amonijevog hidrogenkarbonata, hidroksidom alkalnog metala ili amonijevim hidroksidom, tako da nastane lužnata otopina; zakiseljavanje alkalne otopine tako da nastane kisela otopina; ekstrakciju kisele otopine kloriranim alifatskim ugljikovodikom ili izobutilacetatom.
Detaljan opis izuma
Neočekivano je nađeno da pseudomonska kiselina A može biti učinkovito i selektivno ekstrahirana nakon zakiseljavanja, kako iz podloge za uzgoj koja sadrži mikrobne stanice, tako i iz supernatanta dobivenog nakon odvajanja stanica, pomoću kloriranih alifatskih ugljikovodika; zatim se većina nečistoća koje prate pseudomonsku kiselinu A može iz sirovog ekstrakta ukloniti nakon uparavanja ekstrakta razdjeljivanjem uparenog ostatka između vodeno-alkoholne otopine i alifatskog ugljikovodika i zatim između vodene otopine alkohola i aromatskog ugljikovodika. Preferirano alkohol je metanol. Primjenom ove metode, iz sirovog ekstrakta pseudomonska kiselina A može se dobiti u kvaliteti lijeka nakon prekristalizacije iz izobutilacetata, acetonitrila ili smjese voda-acetonitril.
Prema preferiranoj metodi ovog izuma, tijekom izolacije antibiotika pseudomonske kiseline A, stanice mikroorganizama se odvoje centrifugiranjem kod približno neutralnog pH. Nakon centrifugiranja podloge za uzgoj kod približno neutralnog pH veći dio pseudomonske kiseline A je u supernatantu i može se regenerirati iz supernatanta ekstrakcijom, poželjno na pH 4.5. Poželjno je da se ekstrakcija antibiotika provede kloriranim alifatskim ugljikovodikom, po mogućnosti metilenkloridom.
Primarno pročišćavanje pseudomonske kiseline A u ekstraktu metilenklorida može se provesti primjenom razdjelne separacije. Moguće pigmentne i lipidne nečistoće sirovog ekstrakta mogu se ukloniti razdjeljivanjem između vodeno-metanolne smjese sa 10 % vode i alifatskog ugljikovodika, kao što je n-heksan ili n-heptan. Veći dio nepolarnih inaktivnih nečistoća lipidnog tipa prenosi se u fazu n-heksana ili n-heptana. Povećanjem; sadržaja vode u vodeno-metanolnoj fazi do 25 % uz ekstrakciju primjenom aromatskog ugljikovodika, preporuča se korištenje toluena, moguće je iz sirovog produkta ukloniti polarnije nečistoće.
Povećanjem sadržaja vode u vodeno-metanolnoj fazi na 50 % i ekstrakcijom pomoću otapala koje se ne miješa sa vodom, preporuča se metilenklorid, etilacetat, metilizobutilketon, n-butilacetat ili izobutilacetat, i uparavanjem organskog otapala, dobiva se sirovi proizvod koji sadrži pseudomonsku kiselinu A. Pseudomonska kiselina A može se odvojiti od ostalih komponenti kompleksa pseudomonske kiselina koje nastaju za vrijeme biosinteze kristalizacijom, preferirano primjenom smjese otapala metilizobutilketon - n-heptan.
U drugom uobličenju prikazanog izuma, ekstrakcija pune podloge može se provesti u prisustvu stanica mikroorganizama pri pH 4.5 pomoću kloriranog alifatskog ugljikovodika, preferirano metilenklorida. Kompleks pseudomonske kiseline ekstrahira se iz ekstrakta metilenklorida pomoću 2 %-tne otopine natrijevog hidrogenkarbonata, pri čemu se kompleks pseudomonske kiseline dobiva u kiselinskom obliku iz vodene faze, preporučljivo pri pH 4.5, pomoću metilenklorida.
Nadalje, također je uočeno da se nakon zakiseljavanja pseudomonska kiselina A, otopljena u podlozi i vezana za stanice biomase, može učinkovito i selektivno ekstrahirati korištenjem izobutilacetata za ekstrakciju. Također je nađeno da se nakon ekstrakcije iz podloge za uzgoj pseudomonska kiselina A može regenerirati iz ekstrakta izobutilacetata još povoljnije pomoću amonijevog hidrogenkarbonata, amonijevog hidroksida ili hidroksida alkalnog metala. Preferirani hidroksid alkalnog metala je natrijev hidroksid. Nakon zakiseljavanja ovog ekstrakta i njegovom ekstrakcijom pomoću izobutilacetata, može se dobiti koncentrirani ekstrakt u organskom otapalu, iz kojeg se kristalinični sirovi produkt može dobiti uparavanjem. Nakon njegove prekristalizacije iz izobutilacetata, acetonitrila i/ili smjese voda acetonitril, može se dobiti pseudomonska kiselina A kvalitete lijeka.
Prema preporučenom uobličenju prikazanog izuma, ekstrakcija antibiotika iz ukupne podloge za uzgoj provodi se izobutilacetatom, preferirano pri pH oko 4.5. Da bi se izbjeglo nastajanje emulzije, može se dodati demulgator, preferirano Armogard D5397 (AKZO Chemicals Ltd., Lancashire, great Britain). Preporučljivo demulgator čini oko 0.1 % u 10%-tnoj (vol.) otopini izobutilacetata. Iz izobutilacetatnog ekstrakta odvojenog na separatom tipa Westfalia, kompleks pseudomonske kiseline se regenerira vodenom otopinom natrijevog hidroksida, i sirovi proizvod dobiven nakon ekstrakcije pri kiselom pH kristalizira iz smjese otapala petroletera (raspon vrelišta 60 - 95°C) i izobutilacetata. Dobiveni produkt se prekristalizira, preferirano iz acetonitrila; nakoti toga vodena faza se ostavi da miruje i zatim regenerira filtracijom.
Bilo koja podloga za uzgoj bilo kojeg soja bakterija iz roda Pseudomonas, koji ima sposobnost proizvodnje pseudomonske kiseline A, prikladna je kao ishodni materijal za metodu prikazanog izuma.
Za kiselinsko tretiranje stanica mikroorganizama mogu se koristiti bilo mineralne kiseline, kao što su klorovodična (solna), sulfatna (sumporna) i fosfatna (fosforna) kiselina, bilo organske kiseline, kao što su octena kiselina i oksalna kiselina. Oksalna kiselina i sulfatna kiselina posebno su pogodne za ovu svrhu.
Na kraju fermentacije, točan sadržaj pseudomonske kiseline A i srodnih spojeva određuje se primjenom visokotlačne tekućinske kromatografije (HPLC). Podloga za uzgoj kulture razrijedi se na dvostruki volumen dodatkom etanola, obradi ultrazvukom i centrifugira, i supernatant se koristi za analizu. Za pseudomonsku kiselinu A i srodne spojeve pripremljene primjenom metode prikazanog izuma nađena su slijedeća vremena retencije: pseudomonska kiselina A formule (I) 8.34 min, pseudomonska kiselina B formule (II) 6.83 min, pseudomonska kiselina C formule (III) 16.8 min, pseudomonska kiselina D formule (IV) 6.8 min, manja komponenta formule (V) 6.55 min, manja komponenta formule (VI) 6.9 min [instrument LKB 2248 pumpa, LKB 2157 automatski dozator uzorka, LKB 2155 pećnica za kolonu, LKB 2141 UV detektor, analiza pri 222 nm; kolona Nucleosil C18 10 μm (BST), eluent: smjesa (35:65) acetonitrila i vodene otopine NaH2PO4 (pH=4.2), protok 1.0 mL/min].
Struktura izolirane pseudomonske kiseline određena je pomoću UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR i masene spektroskopije; Pseudomonska kiselina A priređena u skladu sa prikazanim izumom bila je identična polimorfnom obliku I objavljenom u međunarodnom patentu No. WO92/10493.
Postupak prema prikazanom izumu ilustriran je slijedećim primjerima. Naravno, prikazani izum nije time ograničen.
PRIMJERI
Primjer 1
U 5 litara podloge za uzgoj sa 1200 μg/mL mupirocina podešen je pH na 4.5 dodatkom 20 %-tne sulfatne kiseline (60 mL), uz konstantno miješanje. Zakiseljeni likvor ekstrahiran je sa 2.5 L metilenklorida. Faze su zatim odijeljene i bistra faza priređena iz emulzijske organske faze centrifugiranjem. Prema prethodnom postupku podloga za uzgoj je ekstrahirana još dva puta sa 1.25 L metilenklorida. Spojeni ekstrakti metilenklorida isprani su sa 1.25 L deionizirane vode. Faze su odijeljene i na temperaturi ispod 20°C, ekstrakt metilenklorida je ekstrahiran prvo sa 0.5 L a zatim sa 0.25 L 2 %-tne otopine natrijevog hidrogenkarbonata. faze su odvojene i ekstrakti spojeni. Spojeni ekstrakt je ohlađen na ispod 20°C i pH ekstrakta je uz stalno miješanje podešen na 4.5 dodatkom 20%-tne sulfatne kiseline. Dobivena kisela otopina ekstrahirana je jednom sa 0.38 L ijednom sa 0.19 L metilenklorida. Spojeni ekstrakti metilenklorida su isprani sa 0.19 L deionizirane vode, zatim je ekstrakt metilenklorida izbistren na sobnoj temperaturi dodatkom aktivnog ugljena (0.42 g). Nakon bistrenja metilenkloridni ekstrakt je uparen. Upareni ostatak (oko 8 g) je otopljen na sobnoj temperaturi u 16 mL izobutilacetata. Uz miješanje otopina je ohlađena na 0 - 5 °C i miješanje je nastavljeno dok nije započela kristalizacija. Kristalizacija je provedena na toj temperaturi preko noći. Istaloženi mupirocin je filtriran i provedeno je ispiranje sa 2x4 mL hladnog (ispod 5°C) izobutilacetata i sa 6 mL smjese (1:2) izobutilacetat - petroleter. Nakon ovoga antibiotik je ispran suspendiranjem u 2x25 mL petroletera ( raspon vrelišta 60-95 °C) i osušen u vakuumu pri 50 °C. Dobiveni mupirocin je otopljen pri 40-45°C u 60 mL izobutilacetata. Otopina je ohlađena na sobnu temperaturu i 60 mL petroletera (raspon vrelišta 60-95°C) je dodano u otopinu kap po kap. Tada je provedena kristalizacija preko noći pri 0-5°C. Istaloženi kristali su filtrirani i pranje je provedeno sa 2x4 mL hladne (ispod 5°C) smjese izobutilacetat: petroleter (1:2). Tada je proizvod opran suspendiranjem u 3x20 mL petroletera. Mupirocin je osušen u vakuumu na temperaturi od 50°C do konstantne težine. Na taj način dobiveno je 3.3 g čistog mupirocina sa slijedećim karakteristikama: Točkatališta:73-75°C
Ultraljubičasti spektar (10 μg/mL, u otopini 95 %-tnog etanola): λmax = 222 nm E1%1cm = 303.6 Infracrveni spektar (KBr): υOH 3483 i 3306, υC - O 1728 (COOCH2), 1720 (COOH) cm-1
1H-NMR spektar (CDCl3, δTMS = 0.00 ppm):
[image]
13C-NMR spektar (CDCl3 otopina, δTMS = 0.00 ppm):
δ (ppm) Oznaka 8 (ppm) Oznaka
177.8s C-1’ 42.7t,d C-9, C-12
166.9 C-1 39.4d C-8
156.0s C-3 33.9t,t C-9, C-2'
117.7d C-2 31.6t C-4’*
74.9d C-5 28.9t C-5’*
71.4d C-13 28.8t C-6'*
70.4d C-7 28.5t C-8’*
69.0d C-6 25.9t C-7’
65.3t C-16 24.6t C-3’
63.9t C-9’ 20.8q C-14
61.3d C-11 19.1q C-15
55.6d C-10 12.7g C-17
*zamjenjive oznake
Spektar masa:
Karakteristični spektralni podaci:
m/z RI (%) Oznaka
501 100 (M+H)+
327 45 (M+H-HO/CH2/8COOH)+
309 16 (m/z 327-H2O)+
227 33 (C12H19O4)+
Primjer 2
U 5 litara podloge za uzgoj koja je sadržavala 1500 μg/mL mupirocina pH je podešen na 4.5 sulfatnom kiselinom uz stalno miješanje. Zakiseljeni likvor je ekstrahiran sa 2.5 litre izobutilacetata. Faze su zatim odijeljene i bistra faza priređena iz emulzijske organske faze centrifugiranjem. Prema prethodnom postupku podloga za uzgoj je ekstrahirana ponovo sa 1.25 litre izobutilacetata. Spojeni ekstrakti su isprani sa 1.25 L deionizirane vode. Faze su odvojene i ekstraktu izobutilacetata je dodano 0.5 L deionizirane vode. pH miješane faze je podešen na 8.0±0.2 pomoću amonijevog hidroksida. Faze su odvojene i izobutilacetatni ekstrakt ponovo je ekstrahiran sa 0.5 L deionizirane vode pri pH 8.010.2. Spojeni alkalni ekstrakt je ohlađen ispod 20 °C i pH ekstrakta podešen je uz stalno miješanje na 4.5 pomoću 20 %-tne sulfatne kiseline. Dobivena kisela otopina ekstrahirana je jednom sa 0.5 litara i zatim jednom sa 0.25 litara izobutilacetata. Spojeni izobutilacetatni ekstrakti oprani su sa 0.25 L dcionizirane vode i zatim je izobutilacetatni ekstrakt izbistren na sobnoj temperaturi sa 0.52 g aktivnog ugljena. Nakon bistrenja izobutilacetatni ekstrakt je koncentriran u vakuumu na konačni volumen od 13mL. Tada je kristalizacija i prekristalizacija mupirocina provedena kao u %. Primjeru 1. Na taj način dobiveno je 3.75 g mupirocina, koji je imao ista fizikalna svojstva kako je opisano u Primjeru 1.
Primjer 3
80 litara podloge za uzgoj sa 1000 μg/mL mupirocina centrifogirano je pomoću super centrifuge tipa F-100 (proizvođač: Budapesti Vegyipari Gépgyér) i pH supernatanta je podešen na 4.5 pomoću oksalne kiseline (oko 0.69 L). Zakiseljena otopina ekstrahirana je dva puta sa 24 litre metilenklorida i spojeni ekstrakti su upareni u vakuumu. Uljasti ostatak (oko 0.14 kg) je otopljen u 0.56 L metanola koji je sadržavao 10 % vode, a zatim je otopina dva puta ekstrahirana sa po 0.56 L n-heksana. Metanolna otopina je razrijeđena deioniziranom vodom na sadržaj vode od 25 % i otopina je dva puta ekstrahirana sa po 0.56 L toluena.
Nakon toga metanolna otopina je razrijeđena deioniziranom vodom na 50 %-tni sadržaj vode i otopina je jednom ekstrahirana sa 0.56 L metilenklorida, zatim jednom sa 0.28 L metilenklorida. Spojeni ekstrakti metilenklorida su upareni u vakuumu. Dobiveni upareni ostatak (oko 0.11 kg) obrađen je prema Primjeru 1, rezultirajući sa 44 g mupirocina, fizikalnih svojstava kao u Primjeru 1.
Primjer 4
pH u 160 litara kulture za uzgoj koja je sadržavala 1200 μg/mL mupirocina podešen je na 4.50.2 dodatkom 20 %-tne sulfatne kiseline uz stalno miješanje (oko 2.7 litara). Nakon toga zakiseljeni likvor je ekstrahiran sa 80 litara izobutilacetata. Nakon 30 min miješanja dodan je 0.1 % demulgator (1 g Arinogard D5397/litri podloge u otopini izobutilacetata). Faze su odvojene pomoću Westfalia separatora tip SAl-O l-l 75 (Westfalia Separator A. G., Oelde, Germany). Podloga za uzgoj ponovo je ekstrahirana sa 40 litara izobutilacetata i odvojena prema prethodnom postupku. Izobutilacetatni ekstrakt opran je sa 40 litara deionizirane vode. Oprani izobutilacetatni ekstrakt je pomiješan sa 20 litara deionizirane vode, a zatim je 400 mL otopine magnezijevog sulfata masenog udjela 10% dodano smjesi kao demulgator. pH vodene smjese izobutilacetata podešen je zatim pomoću natrijevog hidroksida na 8.2±0.2. Nakon 20 minuta miješanja faze su odvojene i izobutilacetatni ekstrakt ponovo je ekstraliiran pri pH 8.2±0.2. Spojena alkalna vodena otopina je ekstrahirana sa 12 litara izobutilacetata u prisutnosti 800 mL 10 %-tnog magnezijevog sulfata. Nakon razdvajanja faza, vodenoj fazi dodano je 8 litara izobutilacetata, nakon čega je pH vodene izobutilacetatne smjese podešen na 4.5±0.2 pomoću 20 %-tne otopine sulfatne kiseline. Nakon 20 minuta miješanja faze su razdvojene i kisela otopina je ponovo ekstrahirana kako je ranije opisano. Spojeni izobutilacetatni ekstrakti su isprani sa 5 litara deionizirane vode u prisutnosti 100 mL 10 %-tne otopine magnezijevog sulfata. Faze su odvojene i izobutilacetatni ekstrakt uparen u vakuumu na konačni volumen od 1.1 litre. Izobutilacetatni ekstrakt je pomiješan sa 110 mL petroletera (raspon vrelišta: 60-95 °C) i kristalizacije je provedena na 0-5 °C kroz 24 sata. Istaloženi kristali su filtrirani i oprani hladnim (ispod 5 °C) izobutilacetatom. Vlažni sirovi produkt je suspendiran u 600 mL petroletera, filtriran i osušen u vakuumu na 40 °C. Dobiveni mupirocin je otopljen u 550 mL acetonitrila na 40-50 °C i izbistren na prethodnoj temperaturi pomoću aktivnog ugljena (5.5 g). Nakon bistrenja otopina je ohlađena na sobnu temperaturu i zatim ostavljena na 0-5 °C kroz 24 sata. Istaloženi mupirocin je filtriran, zatim opran sa 50 mL hladnog (ispod 5 °C) acetonitrila. Vlažni kristali su suspendirani u 200 mL deionizirane vode, zatim je dodano još 200 mL deionizirane vode u suspenziju. Provedena je kristalizacija na 0-5 °C kroz 24 sata. Kristali su filtrirani i oprani sa 2 x 50 mL deionizirane vode. Produkt je sušen u vakuumu na 40 °C kroz 24 sata. Na taj način dobiveno je 80.6 g mupirocina čija su fizikalna svojstva bila kao u Primjeru 1.
Iako su ovdje opisane određene preferirane izvedbe izuma, biti će razumljivo upućenima u struku kojima je izum namijenjen, da je moguće načiniti određene promjene i modifikacije opisane primjene bez udaljavanja od biti i djelokruga izuma. Prema tome, namjera je da izum bude ograničen samo do potrebnog stupnja prema postavljenim zahtjevima i važećim zakonskim propisima.
Mi tražimo pravo na:
Claims (17)
1. Postupak izolacije antibiotika pseudomonske kiseline A formule (I)
[image]
naznačen time što uključuje:
- ekstrakciju pseudomonske kiseline A iz kulture sojeva iz roda bakterija Pseudomonas koji proizvode pseudomonsku kiselinu A, pri kiselom pH, korištenjem kloriranog alifatskog ugljikovodika ili izobutilacetata, tako da se dobije ekstrakt koji sadrži pseudomonsku kiselinu A; i
- pročišćavanje pseudomonske kiseline A iz spomenutog ekstrakta.
2. Postupak iz zahtjeva 1. naznačen time što stupanj pročišćavanja uključuje razdjeljivanje ekstrakta između vodeno-alkoholne faze i organske faze uključujući najmanje jedno organsko otapalo; i uparavanje organskog otapala.
3. Postupak iz zahtjeva 2., naznačen time što je spomenuti alkohol metanol.
4. Postupak iz zahtjeva 3., naznačen time što je ekstrakt razdijeljen između 10 %-tne vodeno-metalne otopine i alifatskog ugljikovodika.
5. Postupak iz zahtjeva 4., naznačen time što je alifatski ugljikovodik heksan ili heptan.
6. Postupak iz zahtjeva 5., naznačen time što je alifatski ugljikovodik n-heksan.
7. Postupak iz zahtjeva 3., naznačen time što je ekstrakt razdijeljen između 25 %-tne vodeno-metanolne otopine i aromatskog ugljikovodika.
8. Postupak iz zahtjeva 7. naznačen time što je aromatski ugljikovodik toluen.
9. Postupak iz zahtjeva 3., naznačen time što je ekstrakt razdijeljen između 50 %-tne vodeno-metanolne otopine i otapala koje se ne miješa s vodom.
10. Postupak iz zahtjeva 9., naznačen time što je spomenuto otapalo koje se ne miješa sa vodom odabrano iz grupe koju čine metilenklorid, etilacetat, metilizobutilketon, n-butilacetat i izobutilacetat.
11. Postupak iz zahtjeva 1., naznačen time što stupanj pročišćavanja uključuje regeneraciju pseudomonske kiseline A iz ekstrakta pomoću vodene otopine amonijevog hidrogenkarbonata, hidroksida alkalnog metala ili amonijevog hidroksida, tako da nastaje alkalna otopina; zakiseljavanje alkalne otopine tako da nastaje kisela otopina; i ekstrakciju kisele otopine izobutilacetatom.
12. Postupak iz zahtjeva 11., naznačen time što je pseudomonska kiselina regenerirana iz ekstrakta pomoću vodene otopine natrijevog hidroksida.
13. Postupak iz zahtjeva 11., naznačen time što je pseudomonska kiselina A regenerirana iz ekstrakta pomoću vodene otopine amonijevog hidroksida.
14. Postupak iz zahtjeva 11., naznačen time što je pseudomonska kiselina A regenerirana iz ekstrakta pomoću vodene otopine amonijevog hidrogenkarbonata.
15. Postupak iz zahtjeva 1., naznačen time što nadalje uključuje stupnjeve uparavanja i kristalizacije pročišćene pseudomonske kiseline A.
16. Postupak iz zahtjeva 15., naznačen time što je sirova pseudomonska kiselina A kristalizirana iz izobutilacetata ili iz smjese izobutilacetat-petroleter.
17. Postupak iz zahtjeva 15., naznačen time što je sirova pseudomonska kiselina A kristalizirana iz acetonitrila, vode ili smjese acetonitrila i vode.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11844799P | 1999-02-03 | 1999-02-03 | |
| PCT/US2000/002824 WO2000046388A1 (en) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | Process for the isolation of pseudomonic acid a from pseudomonic acid complex-containing culture broth |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20010570A2 true HRP20010570A2 (en) | 2002-08-31 |
Family
ID=22378653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20010570A HRP20010570A2 (en) | 1999-02-03 | 2001-07-27 | Process for the isolation of pseudomonic acid a from pseudomonic acid complex-containing culture broth |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6245921B1 (hr) |
| EP (1) | EP1147210A4 (hr) |
| JP (1) | JP2002535996A (hr) |
| KR (1) | KR20010112258A (hr) |
| CN (1) | CN1345377A (hr) |
| AU (1) | AU771214B2 (hr) |
| BG (1) | BG105775A (hr) |
| BR (1) | BR0009178A (hr) |
| CA (1) | CA2360840A1 (hr) |
| CZ (1) | CZ20012725A3 (hr) |
| HK (1) | HK1041294A1 (hr) |
| HR (1) | HRP20010570A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0105286A3 (hr) |
| IL (1) | IL144678A0 (hr) |
| IS (1) | IS6034A (hr) |
| MX (1) | MXPA01007805A (hr) |
| NO (1) | NO20013790L (hr) |
| PL (1) | PL349153A1 (hr) |
| SK (1) | SK10902001A3 (hr) |
| TR (1) | TR200102232T2 (hr) |
| WO (1) | WO2000046388A1 (hr) |
| YU (1) | YU55501A (hr) |
| ZA (1) | ZA200106057B (hr) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000046389A1 (en) * | 1999-02-03 | 2000-08-10 | Biogal Gyogyszergyar Rt | Process for the preparation of pseudomonic acid a antibiotic by microbiological method |
| AU2002345856A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-08 | Biogal Gyogyszergyar Rt | Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production |
| DE20220885U1 (de) * | 2001-12-28 | 2004-06-24 | BIOGAL Gyógyszergyár Rt. | Kristallines und amorphes Mupirocin-Calcium |
| IL150907A (en) * | 2002-07-25 | 2007-07-04 | Stephan Cherkez | Process for the preparation of stable amorphous calcium pseudomonate |
| WO2005117837A1 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Teva Gyógyszergyár Zàrtköruen Muködo Rèszvènytàrsasàg | Process for preparation of amorphous form of a drug |
| US7619102B2 (en) | 2005-02-21 | 2009-11-17 | Axellia Pharmaceuticals Aps | Purification of mupirocin |
| GB2441328A (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-05 | Alpharma Aps | A method for obtaining mupirocin calcium |
| US8268975B2 (en) * | 2009-04-03 | 2012-09-18 | Dow Agrosciences Llc | Demulsification compositions, systems and methods for demulsifying and separating aqueous emulsions |
| CN104370896A (zh) * | 2013-11-29 | 2015-02-25 | 江苏汉邦科技有限公司 | 一种纯化假单孢菌素的方法 |
| CN103820369B (zh) * | 2014-03-07 | 2015-11-18 | 浙江瑞邦药业有限公司 | 一种萤光假单胞菌及其应用 |
| CN109053707B (zh) * | 2018-09-19 | 2021-08-17 | 福建康鸿生物科技有限公司 | 一种莫匹罗星的提纯方法 |
| CN110823649A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-02-21 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种卷烟主流烟气中有机酸的收集方法和检测方法 |
| US20230312540A1 (en) * | 2020-08-25 | 2023-10-05 | Hangzhou Zhongmeihuadong Pharmaceutical Co., Ltd | Method for extracting mupirocin |
| CN116867905A (zh) * | 2021-02-07 | 2023-10-10 | 杭州中美华东制药有限公司 | 一种莫匹罗星的发酵方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1395907A (en) | 1971-06-12 | 1975-05-29 | Beecham Group Ltd | Antibiotics |
| JPS5270083A (en) | 1975-12-04 | 1977-06-10 | Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd | Manufacture of an antibiotics, trans-pseudomonic acid |
| CA1103264A (en) * | 1977-09-30 | 1981-06-16 | Norman H. Rogers | Purification of pseudomonic acid |
| CA1115699A (en) | 1978-05-20 | 1982-01-05 | Alan D. Curzons | Lithium pseudomonate and its preparation |
| IS1606B (is) * | 1991-05-07 | 1996-10-18 | Sankyo Company Limited | Aðferð til framleiðslu nýs sýkladrepandi efnasambands Thiomarinol, fengið með ræktun Alteromanas rava SANK 73390 |
-
2000
- 2000-02-03 HU HU0105286A patent/HUP0105286A3/hu unknown
- 2000-02-03 KR KR1020017009823A patent/KR20010112258A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 SK SK1090-2001A patent/SK10902001A3/sk unknown
- 2000-02-03 BR BR0009178-2A patent/BR0009178A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-02-03 YU YU55501A patent/YU55501A/sh unknown
- 2000-02-03 TR TR2001/02232T patent/TR200102232T2/xx unknown
- 2000-02-03 EP EP00908467A patent/EP1147210A4/en not_active Withdrawn
- 2000-02-03 CA CA002360840A patent/CA2360840A1/en not_active Abandoned
- 2000-02-03 CN CN00805537A patent/CN1345377A/zh active Pending
- 2000-02-03 IL IL14467800A patent/IL144678A0/xx unknown
- 2000-02-03 US US09/497,806 patent/US6245921B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-03 WO PCT/US2000/002824 patent/WO2000046388A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 MX MXPA01007805A patent/MXPA01007805A/es unknown
- 2000-02-03 CZ CZ20012725A patent/CZ20012725A3/cs unknown
- 2000-02-03 AU AU29802/00A patent/AU771214B2/en not_active Ceased
- 2000-02-03 PL PL00349153A patent/PL349153A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 JP JP2000597447A patent/JP2002535996A/ja active Pending
-
2001
- 2001-07-24 ZA ZA200106057A patent/ZA200106057B/en unknown
- 2001-07-27 HR HR20010570A patent/HRP20010570A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2001-08-01 IS IS6034A patent/IS6034A/is unknown
- 2001-08-02 NO NO20013790A patent/NO20013790L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-08-03 BG BG105775A patent/BG105775A/xx active Pending
-
2002
- 2002-04-22 HK HK02103004.6A patent/HK1041294A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0009178A (pt) | 2001-11-20 |
| MXPA01007805A (es) | 2003-06-04 |
| ZA200106057B (en) | 2002-07-24 |
| US6245921B1 (en) | 2001-06-12 |
| AU771214B2 (en) | 2004-03-18 |
| EP1147210A1 (en) | 2001-10-24 |
| IS6034A (is) | 2001-08-01 |
| NO20013790D0 (no) | 2001-08-02 |
| CN1345377A (zh) | 2002-04-17 |
| KR20010112258A (ko) | 2001-12-20 |
| BG105775A (en) | 2002-03-29 |
| HK1041294A1 (zh) | 2002-07-05 |
| IL144678A0 (en) | 2002-06-30 |
| EP1147210A4 (en) | 2004-06-02 |
| JP2002535996A (ja) | 2002-10-29 |
| AU2980200A (en) | 2000-08-25 |
| CA2360840A1 (en) | 2000-08-10 |
| CZ20012725A3 (cs) | 2002-03-13 |
| WO2000046388A1 (en) | 2000-08-10 |
| SK10902001A3 (sk) | 2002-04-04 |
| YU55501A (sh) | 2003-07-07 |
| NO20013790L (no) | 2001-10-02 |
| TR200102232T2 (tr) | 2002-02-21 |
| PL349153A1 (en) | 2002-07-01 |
| HUP0105286A3 (en) | 2003-03-28 |
| HUP0105286A2 (hu) | 2002-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HRP20010570A2 (en) | Process for the isolation of pseudomonic acid a from pseudomonic acid complex-containing culture broth | |
| DK141254B (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af clavulansyre eller et salt eller en ester deraf. | |
| DE4320023A1 (de) | Holotyp-Stamm Aspergillus obscurus und Verfahren zur Herstellung von µ,£-Di-(hydroxy)-7-[1,2,6,7,8,8a-hexa-(hydro)-2,6-di-(methyl)-8-(2'-{methyl}-butyryloxy)-naphthalin-1-yl]-heptansäure-£-lacton{Mevinolin} und/oder µ,5-Di-(hydroxy)-7-[1,2,6,7,8,8a-hexa-(hydro)-2,6-di-(methyl)-8-(2'-{mehtyl}-butyryloxy)-naphthalin-1-yl]-heptansäure | |
| CN108084126A (zh) | 化合物FuramycinsⅠ和Ⅱ及其制备方法和应用 | |
| US4639534A (en) | Isolation of pseudomonic acid | |
| DE69633330T3 (de) | Verfahren zur herstellung von pharmazeutisch verträglichen salzen der clavulansäure | |
| EP0196628B1 (de) | Ein neues Ansamycin-Antibiotikum, ein mikrobielles Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneimittel | |
| US7619102B2 (en) | Purification of mupirocin | |
| CZ331897A3 (cs) | Způsob přípravy klavulanátových solí | |
| JPH04352783A (ja) | １２員環マクロライド系化合物 | |
| JPS6012039B2 (ja) | 新規抗生物質その製法および抗菌性および抗カビ性組成物 | |
| US4277478A (en) | Antibiotic and use thereof | |
| DE2813922A1 (de) | Antibiotikum ps-5-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur bekaempfung von bakteriellen infektionen | |
| DE2833689C2 (hr) | ||
| WO1998021212A1 (en) | Process for the preparation of salts and esters of clavulanic acid | |
| CN101031653A (zh) | 大环内酯化合物的分离方法 | |
| EP0068680B1 (en) | Antibiotics | |
| FR1465395A (fr) | Composé nouveau, la décoyinine et son procédé de fabrication | |
| JP2546239B2 (ja) | 新規物質オバリシン | |
| CN117820283A (zh) | 一种球孔海绵来源的过氧环类化合物及其制备方法和用途 | |
| JPS6210640B2 (hr) | ||
| CN110692636A (zh) | 一种3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在抑制细菌群体感应系统活性中的应用 | |
| JPH0665277A (ja) | 抗生物質ジヒドロアルデカルマイシンおよびその製造法 | |
| KR20040007472A (ko) | 인간의 혈소판 응집 및 대두 리폭시게나제의 저해제제조방법 | |
| JPS61126092A (ja) | 抗生物質ｔｍ−５９１ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20050125 Year of fee payment: 6 |
|
| PNAN | Change of the applicant name, address/residence |
Owner name: TEVA GYOGYSZERGYAR RESZVENYTARSASAG, HU |
|
| ODBI | Application refused |