CZ20012725A3 - Způsob izolace kyseliny pseudomonové z kultivačního bujonu obsahujícího komplex kyseliny pseudomonové - Google Patents
Způsob izolace kyseliny pseudomonové z kultivačního bujonu obsahujícího komplex kyseliny pseudomonové Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20012725A3 CZ20012725A3 CZ20012725A CZ20012725A CZ20012725A3 CZ 20012725 A3 CZ20012725 A3 CZ 20012725A3 CZ 20012725 A CZ20012725 A CZ 20012725A CZ 20012725 A CZ20012725 A CZ 20012725A CZ 20012725 A3 CZ20012725 A3 CZ 20012725A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pseudomonic acid
- extract
- solution
- isobutyl acetate
- acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
- C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Předložený vynález se týká způsobu izolace pseudomonové kyseliny A (mupirocin) z kultivačního bujónu obsahujícího komplex pseudomonové kyseliny.
Dosavadní stav techniky:
Pseudomonová kyselina A, také známá jako mupirocin, je antibiotikem majícím vzorec (I):
Je známo, že řetězce Pseudomonas fluorescens jsou schopně biosyntézy, mimo pseudomonové kyseliny A další příbuzná antibiotika označená písmeny B-D v malých množstvích [E. B. Chain, G. Mellows, J. Chem. Soc. Perkin Trans I. 318 (1977); J. P. Clayton a kol., Tetrahedron Lett., 21, 881 (1980); P. J. O. Hanlon, N. H.Rogers, J. Chem. Soc. Perkin Trans 1.2665 (1983)], reprezentované vzorci (TI) (IV), konkrétně:
•··· ·· •· ♦· ·· • · · · · ·· · · · ·· · · · · · · ·· ·
(III)
Mezi antibiotiky pseudomonové kyseliny je z terapeutického hlediska nejhodnotnější pseudomonová kyselina A, která má velký inhibiční účinek zejména proti grampozitivním bakteriím (jako je Slaphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Klebsiellapneumononiae) a některým gramnegativním bakteriím (jako Haemophilus infuenzae, Neisseria gonorrhoae) a její minimální inhibující koncentrace je v rozmezí 0,02-0,5 mg/dm3. Pseudomonová kyselina A má inhibicí isoleucin-tRNA synthasového enzymu vliv na syntézu peptidů patogenních bakterii [J. Hughes a G. Mellows, Biochem. J. 191^ 209-219, (1980)]. Výhodným znakem tohoto antibiotika je to, že je méně toxické jak pro lidi tak zvířata a je negativní v Ames testu. Pseudomonová kyselina A je v současnosti užívána při léčbě lidí, v různých prostředcích, pro léčení kožních infekcí (jako je impetigo, pyoderma), nosních infekcí a infekcí zevního ucha, akné, popálenin, ekzémů, psoriasy, v případě ulcerace pro léčení sekundárních infekcí, a pro prevenci nemocničních infekcí.
Jednou z metod izolace pseudomonové kyseliny A z kultivačního bujónu obsahujícího antibiotický komplex je kapalino-kapalinová extrakce. Podle německého patentu DE 2 227 739 a amerického patentu •· ·· ·· ·· • · · ···· · * · · ······
US 4 289 703 jsou rozpustné soli baria přidávány do fermentačního bujónu, potom jsou buňky mikroorganismu s nerozpustným inaktivačním činidlem separovány odstředěním a nakonec jsou antibiotika extrahována methylisobutylketonem. Potom jsou antibiotika odebrána z methyiisobutylketonového extraktu alkalickou vodou a získaný alkalický vodný extrakt je čištěn reextrakcí s methylisobutylketonem. Získaný surový produkt je podroben chromatografii, a z komplexu antibiotik pseudomonové kyseliny je připraven esterový derivát, a je purifikován preparativni tenkovrstvou chromatografii. Kyselinová forma čistého antibiotika je získána hydrolýzou.
Belgický patent č. 870 855 se týká způsobu, v němž je kultivační bujón extrahován methylisobutylketonem a z extraktu je účinná látka extrahována roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Materiály nerozpustné v alkalické vodě jsou separovány filtrací, potom je pH filtrátu okyseleno a filtrát je extrahován methylisobutylketonem. Nakonec je pseudomonová kyselina A získána koncentrováním extraktu a krystalizací ze směsi methyl isobutyl keton-n-heptanu.
Japonský patent 52-70083 se týká dvou metod získání pseudomonové kyseliny z kultivačního bujónu. Podle jedné z těchto metod jsou buňky bakterií separovány z kultivačního bujónu odstředěním, potom je účinná látka extrahována ze supernatantu ethylacetátem. Potom je komplex pseudomonové kyseliny reextrahován z ethylacetátové fáze roztokem hydrogenuhličitanu sodného a po okyselení je opět extrahován ethylacetátem. Po odpaření je zbytek purifikován na síííkageíové koloně použitím eluens chloroformmethanol, a nakonec je čistá pseudomonová kyselina A získána krystalizací z diisopropyletheru. V jiném postupu surový produkt získaný uvedeným postupem je podroben chromatografii na DEAESephadex aniontové výměnné koloně použitím eluens methanolamonium a frakce obsahující pseudomonovou kyselinu A jsou odděleny.
···· ·· ·· «··· · • · · · · · · · ·· · · ·· · · · · · ·· • · ··· · · · · · ·· « · · · · · · · · ·· ·· · · ·® · · ·· · · ·
A.D.Curzons popisuje odebrání kyseliny pseudomonové A z kultivačního bujónu vytvořením lithné soli (Evropský patent č.
005 614). Methylisobutylketonový extrakt obsahující účinnou látku získaný při pH 4,5 reaguje s lithium-2-ethyl-hexanoátem rozpuštěným v methanolu. Vysrážená lithná sůl pseudomonové kyseliny A je oddělena, rozpuštěna ve vodě a pseudomonová kyselina A uvolněná při pH 4,5 je extrahována v methylisobutylketonu a vysrážená za přítomnosti n-heptanu.
V postupech diskutovaných výše jsou polární a s vodou nemísiteiná rozpouštědla (methylísobutylketon, ethyíacetát, n-butanof) použita pro odebrání komplexu pseudomonové kyseliny z kultivačního bujónu. Podle naší zkušenosti nemůže být při použití těchto postupů úspěšně realizována selektivní extrakce, jelikož kromě komplexu pseudomonové kyseliny jsou také ve větších množstvích extrahovány jiné polární a nepolární nečistoty. Pseudomonová kyselina A může být získána v Čisté formě pouze s nízkým výtěžkem (17-34 %) alkalickou extrakcí organických rozpouštědel obsahujících nečistoty ve větších množstvích, potom reextrakci organickým rozpouštědlem při kyselém pH, a potom krystalizaci surového produktu. Použití chromatografických postupů pro purifikaci neni výhodné ve výrobním měřítku, pro jejich vysoké pracovní náklady a požadavky na rozpouštědlo. Navíc za přítomnosti chromatografických adsorbentů a během chromatografických postupů dochází v účinné látce k intramolekulárním transformacím, což vede k vytvoření biologicky neaktivní bicyklické sloučeniny 9-{4-[ 1 S,6R-8R(lS, 3S-dihydroxy-2S-methyl-butyl)-5S-hydroxy-3,7-dioxabicyklo[4.3.0]nonan-4S’yl]-3methyí-but-2(E)-enoyloxy}nonanová kyselina (vzorec V)
(V)
99 · · ·· • · · ······· • · · ······ • · ·· e · ·· ··· a sloučeniny 9 - [4-[ 1 S,6S-4S, I 0S-dihydroxy-3R-(2S-hydroxy- 1 S-methy l-propyl)-2,8-di oxabicyklo[4.4.0] dekan-9S-yl] -3 -methyl but-2(E)-enoyloxy}nonanová kyselina (vzorec VI).
(VI)
Vznik těchto sloučeniny a jejich eliminace prostřednictvím rekrystalizace značně redukuje získaný výtěžek pseudomonové kyseliny A.
Ačkoliv postup izolace přes meziprodukt lithné soli pseudomonové kyseliny A neobsahuje žádný chromatografický stupeň, není běžným pro výrobu v rozsáhlém měřítku, neboť lithná sůl použitá v postupu činí tento postup komplikovaným a drahým pro použití ve výrobním rozsahu.
Proto je tedy potřeba ve stavu techniky nalézt nový postup izolace antibiotika pseudomonové kyseliny A, který by byl prost nevýhod známých postupů a jehož aplikace ve výrobním měřítku by přinesla velký výtěžek získaného výše uvedeného antibiotika.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká způsobu izolace antibiotika pseudomonové kyseliny A vzorce (I)
(I) ••toto ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · · · • ♦ · · · ·· zahrnujícího krok extrakce pseudomonové kyseliny A z kultury druhů rodu bakterií Pseudomonas, produkující pseudomonovou kyselinu A, při kyselém pH, použitím chlorovaného alifatického uhlovodíku nebo isobutylacetátu, tak, že se získá extrakt obsahující pseudomonovou kyselinu A; a purifikací pseudomonové kyseliny A z uvedeného extraktu. Výhodně je purífikovaná pseudomonová kyselina A krystalizována.
V jednom provedení předloženého vynálezu zahrnuje purifikační stupeň distribuci odpařeného zbytku extraktu mezi vodný alkohol a méně polární rozpouštědla, aby se odstranily nečistoty; zředění vodněalkoholové fáze vodou; a extrakci s více polárním rozpouštědlem pro získání purifikované pseudomonové kyseliny A.
V jiném provedení předloženého vynálezu zahrnuje purifikační stupeň odebrání pseudomonové kyseliny z extraktu vodným roztokem hydrogenuhličitanu amonného, hydroxidu alkalického kovu nebo hydroxidu amonného, takže se vytvoří alkalický roztok; okyselení alkalického roztoku tak, že se vytvoří kyselý roztok; a extrakci kyselého roztoku s chlorovaným alifatickým uhlovodíkem nebo isobutylacetátem.
Podrobný popis vynálezu:
Překvapivě bylo zjištěno, že pseudomonová kyselina A může být účinně a selektivně extrahována po okyselení jak z celého bujónu obsahujícího mikrobiální buňky, tak i ze supernatantu získaného po separaci buněk, prostřednictvím chlorovaných alifatických uhlovodíků, potom může být většina ínaktivních nečistot doprovázejících pseudomonovou kyselinu A eliminována ze surového produktu po odpaření uvedeného extraktu rozdělením odpařeného zbytku mezi vodně-alkoholový roztok a alifatický uhlovodík, potom mezi vodný alkohol a aromatický uhlovodík. Výhodným alkoholem je methanol. Použitím tohoto postupu může být ze surového produktu získána • · · · · · · · · · ·· • · · · · · * · » · • · · ···· · · pseudomonová kyselina A v medicinální kvalitě po rekrystalizaci z izobutylacetátu, acetonitrilu nebo směsi voda-acetonitril.
Podle výhodného postupu předloženého vynálezu jsou během izolace antibiotické pseudomonové kyseliny A buňky mikroorganismu separovány při téměř neutrálním pH odstředěním. Po odstřední kultivačního bujónu při skoro neutrálním pH je větší podíl pseudomonové kyseliny A v supernatantu a může být odebrán extrakcí ze supernatantu, přednostně při pH 4,5. Přednostně je extrakce antibiotika uskutečněna chlorovaným alifatckým uhlovodíkem, nejvýhodněji methyíenchloridem.
Primární purífikace pseudomonové kyseliny A v methylenchloridovém extraktu se může provádět použitím distribuční separace. Možné pigmenty a kapalné nečistoty surového produktu mohou být odděleny ditribucí mezi 10 % vody obsahující směs voda-alkohol a alifatický uhlovodík, jako je n-hexan nebo n-heptan. Větší podíl nepolárních inaktivních nečistot lípidového typuje převeden do nhexanové nebo n-heptanové fáze. Zvýšením obsahu vody vodněinethanolové fáze na 25 % a její extrakcí použitím aromatického uhlovodíku, přednostně použitím toluenu, mohou být více polární neaktivní nečistoty eliminovány ze surového produktu.
Zvýšením obsahu vody ve vodně-methanolové fázi na 50 % a její extrakcí rozpouštědlem nemísitelným s vodou, přednostně methyíenchloridem, ethylacetátem, methylísobutylketonem, n-butylacetátem nebo isobutylacetátem, a odpařením organického rozpouštědla, je získán surový produkt obsahující pseudomonovou kyselinu A. Pseudomonová kyselina A může být oddělena od dalších složek komplexu pseudomonové kyseliny, vytvořeného během biosyntézy krystalizací, přednostně použitím rozpouštědlové směsi methylisobutyl keton - n-heptan.
Φ φ Φ φ Φ Φ *· ·· ·· * • · φ · · · · · φφφ φ φ · φ φ ·Φ φ φ φ • φφφ ΦΦΦ · φφ φ
Φ· ·· φφ «φ φφ φφφ
V jiném provedení předloženého vynálezu se může provádět extrakce celého bujónu za přítomnosti buněk mikroorganimu pří pH 4,5 chlorovaným alifatickým uhlovodíkem, přednostně methylenchloridem. Komplex pseudomonové kyseliny je extrahován z methylenchloridového extraktu 2% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a komplex pseudomonové kyseliny je získán v kyselé formě z vodné fáze, přednostně při pH 4,5, methylenchloridem.
Dále bylo také zjištěno, že po okyselení může být pseudomonová kyselina A, rozpuštěná v bujónu a vázaná na buňky biomasy, extrahována účinně a selektivně použitím isobutylacetátu pro extrakci. Rovněž bylo zjištěno, že po extrakci kultivačního bujónu může být pseudomonová kyselina získána z isobutylacetátového extraktu výhodněji hydrogenuhličitanem amonným, hydroxidem amonným nebo hydroxidem alkalického kovu. Preferovaným hydroxidem alkalického kovu je hydroxid sodný. Po okyselení uvedených extraktů a jejich extrahování isobutylacetátem, může být získán koncentrovaný extrakt organického rozpouštědla, z něhož lze připravit krystalický surový produkt odpařením. Po rekrystalizaci z isobutylacetátu, acetonitrilu a/nebo směsi voda-acetonitril může být pseudomonová kyselina A získána v medicinální kvalitě.
Podle výhodného provedení předloženého vynálezu je extrakce antibiotika z celého bujónu prováděna isobutylacetátem, přednostně při pH kolem 4,5. Aby se eliminoval vznik emulze, může se použít deemulgátor, přednostně Armogad D5397 (AKZO Chemicals Ltd., Lancashire, Velká Británie). Přednostně obsahuje deemulgátor asi 0,1 % v 10 % obj. roztoku isobutylacetátu. Z isobutylacetátového extraktu separovaného na separátoru typu Westfalia je komplex pseudomonové kyseliny odebrán vodným roztokem hydroxidu sodného, a surový produkt získaný po extrakci při kyselém pH krystalizuje ze směsi petroletheru (bod varu v rozmezí: 60-95 °C) a isobutylacetátu. Získaný produkt je rekrystalizován, přednostně z acetonitrilu; postupně je vodný roztok uchováván jako zbytek, potom znovuzískán po filtraci.
·· ···· ·
• 4 ·· ··
Pro použití jako výchozí materiál pro postup podie předloženého vynálezu je vhodný jakýkoliv kultivační bujón kmene mikroorganismů rodu bakterií Pseudomonas, schopných biosyntetizovat pseudomonovou kyselinu A.
Pro kyselé zpracování buněk mikroorganismů mohou být použity minerální kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina sírová a kyselina fosforečná, a organické kyseliny, jako je kyselina octová a kyselina oxalová. Oxalová kyselina a kyselina sírová jsou pro daný účel zejména výhodné.
Na konci fermentace je stanoven přesný obsah pseudomonové kyseliny A a příbuzných sloučenin vysokotlakou kapalinovou chromatografii. Kultivační bujón je zředěn na dvojnásobek ethanolem, je aplikován ultrazvuk, odstředěn, a supernatan je použit pro analýzu. Pseudomonová kyselina A a příbuzné sloučeniny připravené použitím postupu podle předloženého vynálezu byly definovány následujícími dobami retence: pseudomonová kyselina A vzorce (I) 8,34 min; pseudomonová kyselina B vzorce (II) 6,83 min; pseudomonová kyselina C vzorce (III) 16,8 min; pseudomonová kyselina D vzorce (IV) 6,8 min; menši složka vzorce (V) 6,55 min; menši složka vzorce (VI) 6,9 min [přístroj LKB 2248 čerpadlo, LKB 2157 auto-vzorkovač, LKB2155 kolona, LKB 2141 UV detektor, analýzy při 222 nm, kolona: Nucleosii Či» 10 mikrometrů (BST), eluens: směs (35:65) acetonitrilu a vodného roztoku 0,1 M NaLUPCh (pH = 4,2), průtoková rychlost 1,0 ml/mín].
Struktura izolované pseudomonové kyseliny byla stanovena metodami UV, IR, ]H-NMR, bC-NMR a hmotové spektroskopie. Pseudomonová kyselina A, připravená podle předloženého vynálezu, byla identická s polymorfní formou I publikovanou v mezinárodním patentu WO92/10493.
Postup podle předloženého vynálezu je doložen následujícími příklady. Nicméně, předložený vynález by tím neměl být omezen.
··· ··»· *·· • · · 9 9·· 9 ·
Příklady provedení vynálezu:
Příklad 1
Hodnota pH pěti litrů kultivačního bujónu se 1200 pg/ml mupirocinu byla upravena za kontinuálního mícháni na 4,5 prostřednictvím 20% kyseliny sírové (60 ml). Okyselená tekutina byla extrahována 2,5 litru methylenchloridu. Potom byly fáze separovány a ostrá fáze byla připravena z emulgované organické fáze odstředěním. Podle předchozího kroku byl kultivační bujón extrahován dvakrát opět 1,25 litru methylenchloridu. Spojené methylenchloridové extrakty byly promyty s 1,25 litru deionizované vody. Fáze byly odděleny a, při teplotě pod 20 °C, byl extrahován methyienchloridový extrakt nejprve 0,5 Jitru a potom 0,25 litru 2% roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Fáze byly odděleny a extrakty byly spojeny, Spojené extrakty byly ochlazeny pod 20 °C a pH extraktu bylo upraveno za kontinuálního míchání na 4,5 20% kyselinou sírovou. Získaný kyselý roztok byl extrahován jedenkrát s 0,38 litru a jedenkrát s 0,19 litru methylenchloridu. Spojené methylenchloridové extrakty byly promyty s 0,19 litru deionizované vody, a potom byl methyienchloridový extrakt čištěn při teplotě místnosti dřevěným uhlím (0,42 g). Po vyčištěni byl methyienchloridový extrakt odpařen. Zbytek po odpaření (kolem 8 g) byl rozpuštěn při teplotě místnosti v 16 ml isobutylacetátu. Za mícháni byl roztok ochlazen na 0-5 °C a mícháni pokračovalo, dokud nebyla zahájena krystalizace. Potom krystalizace probíhala při této teplotě přes noc. Vysrážený mupirocin byl odfiltrován, promývání bylo provedeno 2x4 ml studeného (pod 5 °C) isobutylacetátu a 6 ml směsi (2:1) ísobutylacetát-petrolether. Potom byla tato antibiotika promyta suspenzí ve 2 x 25 ml petroletheru (rozmezí varu: 60-95 °C) a sušena za vakua při 50 °C. Získaný mupirocin byl rozpuštěn při 40-45 °C v 60 ml isobutylacetátu. Roztok byl ochlazen na teplotu místnosti a 60 ml petroletheru (rozmezí varu: 60-95 °C) bylo zaváděno po kapkách do roztoku. Potom probíhala krystalizace při 0-5 °C přes noc. Vysrážené krystaly byly filtrovány a promývání bylo provedeno 2x4 mi studené (pod 5 °C) směsi ···« * · ·· ·· ·· · · · ♦ » ·*·· • ♦ · · · ·· 99 ···· ···♦ 9 9· ·· ·· · · · · 9 9 9 9 · i sob uty J acetát-pet rol et he r (1:2). Potom byl produkt promyt jeho suspendováním v 3 x 20 mi petroletheru. Mupirocin byi sušen ve vakuu při teplotě 50 °C do konstantní hmotnosti. Tímto způsobem bylo získáno 3,3 g čistého mupirocinu, majícího následující charakteristiky:
Teplota táni: 73-75 °C .
UV spektrum (10pg/ml, v 95% roztoku ethanolu): Xmax=222 nm EAcm - 303,6.
IČ spektrum (MBr): vOH 3483 a 3306, vC = O 1728 (COOCH2), 1720 (COOH) cm’1.
• to·· ♦· ·· ·· ·« ♦ · · φ · to · to * · • · ♦ ·*·· · · • *· · · ·· · · · ·· »· · · ·» ·· * ‘H-NMR spektrum (CDCI3, Ótms = 0,00 ppm):
| 5 (ppm) | Přiřazení | Interakční konstanta (Hz) |
| 5.75 (lH)q | 2-H | 472,i5= 1-1 |
| 4.08 (2H)t | 9’-H2 | Vgg—6.4 |
| 3.93-3.72 (4H)m | 5,7,13-H; 16-He | |
| 3.55(lH)dd | 16-Hp | 2Á6a.l60= 1 1.8; ύήόβ.8 = 2.6 |
| 3.48(lH)dd | 6-H | U215= 8.4; V67 = 3.2 |
| 2.82(lH)td | 10-H | io= 6.3; Vio.ii = 2.? |
| 2.74(lH)dd | 11-H | V,0„=2.3;V„.,2 = 7.8 |
| 2.60(lH)dd | 4-Ha | 3·Αα.4β= 14.5; V4tt 5 = 2.7 |
| 2.36-2.28 (3H)m | 4-Hp; 2'-H, | |
| 2.20 (3H)d | 15-H3 | V>.15= 1-1 |
| 2.02-1.92 (lH)m | 8-H | |
| 1.76-1.61 (6H)m | 9-H2; 3'-H2. 8',-H2 | |
| 1.43-1.33 (9H)m | 12-H;4'-H2; 5'-H2; 6’-H2; 7'- | |
| h2 | ||
| 1.22 (3H)d | 14-Hj | 3.14 — 6.4 |
| 0.94 (3H)d | 17-H3 | 3Á?.i7 = 7.0 |
·♦·· 99 99 9999
9 9 9 9 9 9 9 99
999 9 9 9999 • 9 9 9 9 9 · 999
9· ·· 9 9 9 9 9 99 hC-NMR spektrum (CDCh roztok, STMS = 0,00 ppm):
| δ ÍDpm) | Přiřazení | δ (ppm)..... | Přiřazení |
| 177.8s | C-l' | 42.7t,d | C-9, C-l2 |
| 166.9s | C-l | 39.4d | C-8 |
| 156.Os | C-3 | 33.9t,t | C-9, C-2’ |
| 117.7d | C-2 | 31.6t | C-4'* |
| 74.9d | C-5 | 28.9t | C-5'* |
| 71.4d | C-13 | 28.8t | C-6’* |
| 70.4d | C-7 | 28.5t | C-8'* |
| 69.0d | C-6 | 25.9t | C-7’ |
| 65.31 | C-16 | 24.6t | C-3' |
| 63.91 | C-9’ | 20.8q | C-14 |
| 61.3d | C-l 1 | I9.1q | C-15 |
| 55.6d | C-10 | 12.7g | C-17 |
* zaměnitelná přiřazeni
Hmotové spektrum
Charakteristická spektrální data:
| M/z | RI(%) | Přiřazení |
| 501 | 100 | (M + H)+ |
| 327 | 45 | (M + H-HO/CH2/8COOH)+ |
| 309 | 16 | (M/z 327-H2O)+ |
| 227 | n J 3 | (C i 2Mi 9Ο4) + |
• ♦· · ·· · · ·· ·· • · · · * · · » • · · ··♦· · · Η···· ···· · · ♦ · ·· ·♦ 99 99
Příklad 2
Hodnota pH pěti litrů kultivačního bujónu se 1500 pg/ml mupirocinu byla upravena za kontinuálního míchání na 4,5 prostřednictvím 20% kyseliny sírové. Okyselená tekutina byla extrahována 2,5 litru isobutylacetátu. Fáze separovány a ostrá fáze byla připravena z emulgované organické fáze odstředěním. Podle předchozího kroku byl kultivační bujón extrahován opět 1,25 litru isobutylacetátu. Spojené isobutylacetátové extrakty byly promyty s 1,25 litru deionizované vody. Fáze byly odděleny a do isobutylacetátového extraktu bylo přidáno 0,5 litru deionizované vody. PH směsné fáze bylo upraveno na 8,0±0,2 5% hydroxidem amonným. Fáze byly odděleny a isobutylacetátový extrakt byl opět extrahován s 0,5 litru deionizované vody při pH 8,0±0,2 . Spojené alkalické extrakty byly ochlazeny pod 20 °C a pH extraktu bylo upraveno za kontinuálního míchání na 4,5 20% kyselinou sírovou. Získaný kyselý roztok byl extrahován jedenkrát s 0,5 litru a potom jedenkrát s 0,25 litru isobutylacetátu. Spojené isobutylacetátové extrakty byly promyty s 0,25 litru deionizované vody, potom byl isobutylacetátový extrakt čištěn při teplotě místnosti dřevěným uhlím (0,52 g). Po vyčištění byl isobutylacetátový extrakt koncentrován ve vakuu na finální objem 13 ml. Potom krystalizace a rekrystalizace mupirocinu probíhala jako v příkladu 1. Tímto způsobem bylo získáno 3,75 g mupirocinu, majícího stejné fyzikální vlastnosti, jako je popsáno v příkladu 1.
Příklad 3 litrů kultivačního bujónu s koncentrací mupirocinu 1000 gg/ml bylo odstředěno na super odstředivce typu F-100 (výrobce: Budapešti Vegyipari Gépgyár), potom bylo pH supernatantu upraveno na 4,5 prostřednictvím kyseliny oxalové (kolem 0,69 litru). Okyselený roztok byl extrahován dvakrát 24 litry methylenchloridu, a spojené extrakty byly odpařeny ve vakuu. Olejový zbytek (asi 0,14 kg) byl rozpuštěn v 0,56 litru methanolu obsahujícího 10 % vody a potom byl roztok • ♦ ·· ·« ·· ·· ·· • · · · · · · ·
9· · · ·· i < ····#»···>>
99 99 99 99 99 999 extrahován dvakrát 0,56 litru n-hexanu, Methanolový roztok byl zředěn deionizovanou vodou na obsah 25 % vody a roztok byl extrahován dvakrát 0,56 litru toluenu. Následně byl methanolový roztok zředěn deionizovanou vodou na obsah vody 50 % a roztok byl extrahován jednou 0,56 litru methylenchloridu, potom jednou 0,28 litru methylenchloridu. Spojené methylenchloridové extrakty byly odpařeny ve vakuu. Po odpaření získaný zbytek (asi 0,11 kg) byl zpracován podle postupu v příkladu 1, za získání 44 g mupirocinu, majícího stejné fyzikální vlastnosti, jako v příkladu 1.
Příklad 4
Hodnota pH 160 litrů kultivačního bujónu obsahujícího mupirocin v koncentraci 1200 pg/ml byla upravena za kontinuálního míchání na
4,5 ± 0,2 prostřednictvím 20% kyseliny sirové (asi 2,7 litru). Potom byla okyselená tekutina extrahována 80 litry isobutylacetátu. Po 30 min mícháni byl přidán 0,1% deemulgátor (1 g Armogard D5397/litr bujónu v roztoku isobutylacetátu). Fáze byly separovány separátorem typu Westfalia SA1-01-175 (Westfalia Separator A.G., Oelde, Německo). Kultivační bujón byl opět extrahován 40 litry isobutylacetátu a separován podle předchozích kroků. Isobutylacetátové extrakty byly promyty 40 litry deionizované vody. Promytý isobutylacetátový extrakt byl smísen s 20 litry deionizované vody, a potom bylo přidáno do směsi 400 ml roztoku 10% hmotn. roztoku síranu hořečnatého jako deemulgátoru. Následně bylo pH vodné směsi isobutylacetátu upraveno hydroxidem sodným na 8,0±0,2. Po 20 minutách míchání byly fáze odděleny a isobutylacetátový extrakt byl opět extrahován při pH 8,0±0,2. Spojený vodný alkalický roztok byl extrahovánl2 litry isobutylacetátu za přítomnosti 800 ml 10% hmotn. síranu hořečnatého. Po oddělení fází bylo do vodné fáze přidáno 8 litrů isobutylacetátu, potom bylo pH vodné isobutylacetátové směsi upraveno na 4,5±0,2 20% roztokem kyseliny sírové. Po 20 min míchání byly fáze separovány a okyselený roztok byl opět extrahován, jak bylo popsáno výše. Spojené isobutylacetátové extrakty byly promyty 5 litry deionizované vody za ······ ·· ·· ··
ΦΦΦ φ · φ · ΦΦΦ • · · φ φ ·φ · · ♦ · · · · φ · ΦΦΦ φ φ ΦΦ Φ ΦΦΦ · 0 · φφ φφ φφ φφ φφ φ přítomnosti 100 ml 10% hmoln. roztoku síranu sodného. Fáze byly odděleny a isobutylacetátový extrakt byl odpařen ve vakuu na finální objem 1,1 litru. Isobutylacetátový koncentrát byl smísen se 110 ml petroletheru (rozmezí varu: 60-95 °C ), a krystalizace probíhala při 0-5 °C po 24 hodiny. Vysrážené krystaly byly odfiltrovány a promyty chladným (pod 5 °C ) isobutylacetátem. Potom byl vlhký surový produkt suspendován v 600 ml petroletheru, filtrován a sušen ve vakuu při 40 °C . Získaný mupirocin byl rozpuštěn v 550 ml acetonitrilu při 40-50 °C, a Čištěn při předchozí teplotě s dřevěným uhlím (5,5 g). Po vyčištěni byl roztok ochlazen na teplotu místnosti, potom udržován při 0-5 °C po 24 hodiny. Vysrážený mupirocin byl odfiltrován, potom bylo provedeno promývání 50 ml chladného (pod 5 °C) acetonitrilu. Vlhké krystaly byly suspendovány ve 200 ml deionizované vody, potom bylo do suspenze přidáno další množství 200 ml deionizované vody. Potom probíhala krystalizace při 0-5 °C po 24 hodiny. Krystaly byly odfiltrovány, potom bylo provedeno promývání 2 x 50 ml deionizované vody. Produkt byl sušen pod vakuem při 40 °C po 72 hodiny. Tímto způsobem bylo získáno 80,6 g mupirocinu, majícího stejné fyzikální vlastnosti jako v přikladu 1.
Ačkoliv zde byla popsána některá výhodná provedeni vynálezu, je odborníkovi znalému stavu techniky zřejmé, že mohou být provedeny různé obměny a variace popsaného provedení, bez toho, že by bylo opuštěn duch a rozsah vynálezu. Proto se předpokládá, že vynález je omezen pouze rozsahem daným připojenými nároky a aplikovatelnými právními pravidly.
Claims (17)
- PATENTOVÉ NÁROKYT\|1. Způsob izolace antibiotické pseudomonové kyseliny A vzorce (I) (I) vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:extrakci pseudomonové kyseliny A z kultury druhů rodu bakterií Pseudomonas, produkujících pseudomonovou kyselinu A, při kyselém pH, použitím chlorovaného alifatického uhlovodíku nebo isobutylacetátu, tak, že se získá extrakt obsahující pseudomonovou kyselinu A; a purifikaci pseudomonové kyseliny A z uvedeného extraktu.
- 2 Způsob podle nároku 1 vyznačující s tím, že purifikačni krok zahrnuje rozdělení extraktu mezi vodně-alkoholovou fázi a organickou fázi obsahující alespoň jedno organické rozpouštědlo; a odpařeni organického rozpouštědla.
- 3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že uvedeným alkoholem je methanoi.
- 4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že extrakt se rozdělí mezi roztok 10 % vody-methanolu a alifatický uhlovodík.
- 5. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že alifatickým uhlovodíkem je hexan nebo heptan.
- 6. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že alifatický uhlovodík je n-hexan.···· 4* ·Φ *· φ • · · · 9 · · · ♦ · · • · · ···· *·· ·· ··· ·· ··· · « • ♦ · · ·«·· 9 9 9 ·· 99 99 99 99 999
- 7. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že extrakt se rozdělí mezi roztok 25 % vody-methanolu a aromatický uhlovodík.
- 8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že aromatický uhlovodík je toluen.
- 9. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že extrakt se rozdělí mezi roztok 50 % vody-methanolu a rozpouštědlo nemísitelné s vodou.
- 10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že rozpouštědlo nemísitelné s vodou je vybráno ze skupiny sestávající z methylenchloridu, ethylacetátu, methylisobutylketonu, n-butylacetátu a isobutylacetátu.
- 1 1. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok purifikace zahrnuje získání pseudomonové kyseliny A z extraktu vodným roztokem hydrogenuhličitanu amonného, hydroxidu alkalického kovu nebo hydroxidu amonného, tak, že se vytvoří alkalický roztok; okyselení alkalického roztoku, takže se vytvoří kyselinový roztok; a extrakci kyselého roztoku isobutylacetátem.
- 12. Způsob podle nároku 1 1 vyznačující se tím, že pseudomonová kyselina A se získá z extraktu vodným roztokem hydroxidu sodného.
- 13. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že pseudomonová kyselina se získá z extraktu vodným roztokem hydroxidu amonného.
- 14. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že pseudomonová kyselina se získá z extraktu vodným roztokem hydrogenuhličitanu amonného.
- 15. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok odpaření a krystalizace purifikované pseudomonové kyseliny A.
- 16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že surová pseudomonová kyselina A krystalizuje z isobutylacetátu nebo směsi isobutylacetátpetrolether.
- 17. Způsob podle nároku 15 vyznačujíci se tím, že surová pseudomonová kyselina A krystalizuje z acetonitrilu, vody nebo směsi acetonitrilu a vody.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11844799P | 1999-02-03 | 1999-02-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20012725A3 true CZ20012725A3 (cs) | 2002-03-13 |
Family
ID=22378653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20012725A CZ20012725A3 (cs) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | Způsob izolace kyseliny pseudomonové z kultivačního bujonu obsahujícího komplex kyseliny pseudomonové |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6245921B1 (cs) |
| EP (1) | EP1147210A4 (cs) |
| JP (1) | JP2002535996A (cs) |
| KR (1) | KR20010112258A (cs) |
| CN (1) | CN1345377A (cs) |
| AU (1) | AU771214B2 (cs) |
| BG (1) | BG105775A (cs) |
| BR (1) | BR0009178A (cs) |
| CA (1) | CA2360840A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20012725A3 (cs) |
| HK (1) | HK1041294A1 (cs) |
| HR (1) | HRP20010570A2 (cs) |
| HU (1) | HUP0105286A3 (cs) |
| IL (1) | IL144678A0 (cs) |
| IS (1) | IS6034A (cs) |
| MX (1) | MXPA01007805A (cs) |
| NO (1) | NO20013790L (cs) |
| PL (1) | PL349153A1 (cs) |
| SK (1) | SK10902001A3 (cs) |
| TR (1) | TR200102232T2 (cs) |
| WO (1) | WO2000046388A1 (cs) |
| YU (1) | YU55501A (cs) |
| ZA (1) | ZA200106057B (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000046389A1 (en) * | 1999-02-03 | 2000-08-10 | Biogal Gyogyszergyar Rt | Process for the preparation of pseudomonic acid a antibiotic by microbiological method |
| AU2002345856A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-08 | Biogal Gyogyszergyar Rt | Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production |
| DE20220885U1 (de) * | 2001-12-28 | 2004-06-24 | BIOGAL Gyógyszergyár Rt. | Kristallines und amorphes Mupirocin-Calcium |
| IL150907A (en) * | 2002-07-25 | 2007-07-04 | Stephan Cherkez | Process for the preparation of stable amorphous calcium pseudomonate |
| WO2005117837A1 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Teva Gyógyszergyár Zàrtköruen Muködo Rèszvènytàrsasàg | Process for preparation of amorphous form of a drug |
| US7619102B2 (en) | 2005-02-21 | 2009-11-17 | Axellia Pharmaceuticals Aps | Purification of mupirocin |
| GB2441328A (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-05 | Alpharma Aps | A method for obtaining mupirocin calcium |
| US8268975B2 (en) * | 2009-04-03 | 2012-09-18 | Dow Agrosciences Llc | Demulsification compositions, systems and methods for demulsifying and separating aqueous emulsions |
| CN104370896A (zh) * | 2013-11-29 | 2015-02-25 | 江苏汉邦科技有限公司 | 一种纯化假单孢菌素的方法 |
| CN103820369B (zh) * | 2014-03-07 | 2015-11-18 | 浙江瑞邦药业有限公司 | 一种萤光假单胞菌及其应用 |
| CN109053707B (zh) * | 2018-09-19 | 2021-08-17 | 福建康鸿生物科技有限公司 | 一种莫匹罗星的提纯方法 |
| CN110823649A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-02-21 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种卷烟主流烟气中有机酸的收集方法和检测方法 |
| US20230312540A1 (en) * | 2020-08-25 | 2023-10-05 | Hangzhou Zhongmeihuadong Pharmaceutical Co., Ltd | Method for extracting mupirocin |
| CN116867905A (zh) * | 2021-02-07 | 2023-10-10 | 杭州中美华东制药有限公司 | 一种莫匹罗星的发酵方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1395907A (en) | 1971-06-12 | 1975-05-29 | Beecham Group Ltd | Antibiotics |
| JPS5270083A (en) | 1975-12-04 | 1977-06-10 | Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd | Manufacture of an antibiotics, trans-pseudomonic acid |
| CA1103264A (en) * | 1977-09-30 | 1981-06-16 | Norman H. Rogers | Purification of pseudomonic acid |
| CA1115699A (en) | 1978-05-20 | 1982-01-05 | Alan D. Curzons | Lithium pseudomonate and its preparation |
| IS1606B (is) * | 1991-05-07 | 1996-10-18 | Sankyo Company Limited | Aðferð til framleiðslu nýs sýkladrepandi efnasambands Thiomarinol, fengið með ræktun Alteromanas rava SANK 73390 |
-
2000
- 2000-02-03 HU HU0105286A patent/HUP0105286A3/hu unknown
- 2000-02-03 KR KR1020017009823A patent/KR20010112258A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 SK SK1090-2001A patent/SK10902001A3/sk unknown
- 2000-02-03 BR BR0009178-2A patent/BR0009178A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-02-03 YU YU55501A patent/YU55501A/sh unknown
- 2000-02-03 TR TR2001/02232T patent/TR200102232T2/xx unknown
- 2000-02-03 EP EP00908467A patent/EP1147210A4/en not_active Withdrawn
- 2000-02-03 CA CA002360840A patent/CA2360840A1/en not_active Abandoned
- 2000-02-03 CN CN00805537A patent/CN1345377A/zh active Pending
- 2000-02-03 IL IL14467800A patent/IL144678A0/xx unknown
- 2000-02-03 US US09/497,806 patent/US6245921B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-03 WO PCT/US2000/002824 patent/WO2000046388A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 MX MXPA01007805A patent/MXPA01007805A/es unknown
- 2000-02-03 CZ CZ20012725A patent/CZ20012725A3/cs unknown
- 2000-02-03 AU AU29802/00A patent/AU771214B2/en not_active Ceased
- 2000-02-03 PL PL00349153A patent/PL349153A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 JP JP2000597447A patent/JP2002535996A/ja active Pending
-
2001
- 2001-07-24 ZA ZA200106057A patent/ZA200106057B/en unknown
- 2001-07-27 HR HR20010570A patent/HRP20010570A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2001-08-01 IS IS6034A patent/IS6034A/is unknown
- 2001-08-02 NO NO20013790A patent/NO20013790L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-08-03 BG BG105775A patent/BG105775A/xx active Pending
-
2002
- 2002-04-22 HK HK02103004.6A patent/HK1041294A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0009178A (pt) | 2001-11-20 |
| MXPA01007805A (es) | 2003-06-04 |
| ZA200106057B (en) | 2002-07-24 |
| US6245921B1 (en) | 2001-06-12 |
| AU771214B2 (en) | 2004-03-18 |
| EP1147210A1 (en) | 2001-10-24 |
| IS6034A (is) | 2001-08-01 |
| HRP20010570A2 (en) | 2002-08-31 |
| NO20013790D0 (no) | 2001-08-02 |
| CN1345377A (zh) | 2002-04-17 |
| KR20010112258A (ko) | 2001-12-20 |
| BG105775A (en) | 2002-03-29 |
| HK1041294A1 (zh) | 2002-07-05 |
| IL144678A0 (en) | 2002-06-30 |
| EP1147210A4 (en) | 2004-06-02 |
| JP2002535996A (ja) | 2002-10-29 |
| AU2980200A (en) | 2000-08-25 |
| CA2360840A1 (en) | 2000-08-10 |
| WO2000046388A1 (en) | 2000-08-10 |
| SK10902001A3 (sk) | 2002-04-04 |
| YU55501A (sh) | 2003-07-07 |
| NO20013790L (no) | 2001-10-02 |
| TR200102232T2 (tr) | 2002-02-21 |
| PL349153A1 (en) | 2002-07-01 |
| HUP0105286A3 (en) | 2003-03-28 |
| HUP0105286A2 (hu) | 2002-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20012725A3 (cs) | Způsob izolace kyseliny pseudomonové z kultivačního bujonu obsahujícího komplex kyseliny pseudomonové | |
| JP2001504474A (ja) | エポチロンｃ，ｄ，ｅ及びｆ、製造と薬剤 | |
| EP0005614B1 (en) | Lithium pseudomonate, process for its isolation and its hydrolysis | |
| JPH032867B2 (cs) | ||
| US4278665A (en) | Papulacandin derivatives and pharmaceutical compositions containing same | |
| US4863955A (en) | Scytophycins | |
| EP0116150A2 (en) | Pharmaceutically active heterocyclic compounds containing at least four ring-nitrogen atoms, their preparation and fermentation broths of ASPERGILLUS ALLIACEUS ATCC 20655 and 20656 | |
| Taylor et al. | Synthesis and antifungal selectivity of new derivatives of amphotericin B modified at the C-13 position | |
| US20070135629A1 (en) | Isolation of ansamitocins | |
| EP0068680B1 (en) | Antibiotics | |
| EP0395418B1 (en) | A phospholipase A2 inhibitor, method for producing it and pharmaceutical or veterinary formulations comprising said inhibitor | |
| US5281533A (en) | Scytophycins-producing Scytonema pseudohofmanni microorganisms | |
| KR0163660B1 (ko) | 방선균류인 마이크로모노스포라 속 sa-246 균주를 이용한 항균-항암활성을 갖는 saph 유도체의 제조방법 | |
| JPH0365944B2 (cs) | ||
| JP3795604B2 (ja) | Ｇｅｘ１化合物 | |
| KR0130473B1 (ko) | 새로운 항생물질, 베나노마이신 a와 b 및 덱실오실베나노마이신 b와 이들의 제조 방법과 용도 | |
| US4745202A (en) | Aerocyanidin-antibiotic | |
| KR100919368B1 (ko) | 인간의 혈소판 응집 및 대두 리폭시게나제의 저해제제조방법 | |
| JPH0665277A (ja) | 抗生物質ジヒドロアルデカルマイシンおよびその製造法 | |
| JPS6122949B2 (cs) | ||
| JPH05247018A (ja) | 抗生物質１０６−ｂ、その製造方法、抗生物質１０６−ｂを有効成分とする抗菌剤および抗生物質１０６−ｂを有効成分とする抗腫瘍剤 | |
| JPH05222086A (ja) | 抗生物質アルデカルマイシンとその製造法、並びにその誘導体とその製造法 | |
| WO2002027010A1 (fr) | Compose a base de xanthone | |
| CS209196B1 (cs) | Způsob fermentativní výroby derivátů ergolinu | |
| JPS61126092A (ja) | 抗生物質ｔｍ−５９１ |