KR20010112258A

KR20010112258A - 슈도몬산 복합물을 함유하는 배양 브로쓰로부터 슈도몬산ａ를 분리하는 방법

Info

Publication number: KR20010112258A
Application number: KR1020017009823A
Authority: KR
Inventors: 바르타이스트반; 테그데스아니코; 스젤발레리아; 스자보크사바; 나기니아르바이에디트; 케리빌모스; 레오노브데이비드; 랑일디코; 비들로니이글로이마지트; 저코비쉬기울라; 살라트자노스
Original assignee: 자노스 바르가, 테레지아 밀레; 비오갈 기오기스제르갸르 알티.
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2001-12-20
Also published as: BR0009178A; MXPA01007805A; ZA200106057B; US6245921B1; AU771214B2; EP1147210A1; IS6034A; HRP20010570A2; NO20013790D0; CN1345377A; BG105775A; HK1041294A1; IL144678A0; EP1147210A4; JP2002535996A; AU2980200A; CA2360840A1; CZ20012725A3; WO2000046388A1; SK10902001A3

Abstract

본 발명은 슈도모나스 박테리아 속의 슈도몬산 A-생산 종 중의 하나의 배양 브로쓰로부터 약제 등급의 슈도모나스 A 항생제를 분리하는 방법으로서 염소화 지방족 탄화수소 또는 이소부틸 아세테이트로 산성 pH에서 배양 브로쓰로부터 생합성된 슈도몬산 A를 추출하는 단계 및 정제 단계를 포함한다. 본 발명은 분리된 슈도몬산 A를 정제하는 단계로서 (a) 수성-알코올과 일분 지방족 또는 방향족 탄화수소 사이에 증발된 추출 잔류물을 분배하는 단계; (b) 수성 탄산수소암모늄, 수산화알칼리금속 또는 수산화암모늄 용액으로 추출물을 추출하는 단계 및 생성된 알칼리 수성 추출물을 산성화하는 단계, 이어서 염소화 지방족 탄화수소 또는 이소부틸 아세테이트로 다시 재추출하는 단계; 및 (c) 추출물의 농축 및 이소부틸 아세테이트 및 석유 에테르 또는 에세토니트릴 또는 수성 아세토니트릴의 혼합물에서 결정 슈도몬산 A의 재결정을 포함한다.

Description

슈도몬산 복합물을 함유하는 배양 브로쓰로부터 슈도몬산 Ａ를 분리하는 방법{PROCESS FOR THE ISOLATION OF PSEUDOMONIC ACID A FROM PSEUDOMONIC ACID COMPLEX-CONTAINING CULTURE BROTH }

뮤피로신으로 알려진 슈도몬산 A는 화학식(1)의 항생제이다.

슈도모나스 플루오로센스 균주(Pseudomonas fluorescens)는 슈도몬산 A뿐아니라 소량으로 화학식 (2)-(4)로 각각 나타낸, 문자 B-D에 의하여 지정된 기타 관련된 항생제를 생합성할 수 있는 것으로 알려졌다[E.B. Chain, G. Mellows, J. Chem. Soc. Perkin Trnas I. 318 (1977); J. P. Clayton et al., Tetrahedron Lett., 21, 881 (1980); P. J. O. Hanlon, N. H. Rogers, J. Chem. Soc. Perkin Trans 1. 2665 (1983)].

슈도몬산 항생제 중에서 치료적 관점에서 가장 가치있는 것은 슈도몬산 A이다. 이것은 그램 양성 박테리아(예, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 피오제네스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 클렙시엘라 뉴모니아) 및 일부 그램 음성 박테리아(예, 헤모필러스 인플루엔자, 네이세리아 고노르호에)에 대하여 주로 성장 저해 효과를 갖고, 이것의 최소 저해 농도는 0.02-0.5 mg/dm³의 범위이다. 슈도몬산 A는 이소류신-tRNA 신타아제 효소를 저해함으로써 병원성 박테리아의 펩티드 합성에 영향을 준다[문헌: J. Hughes and G. Mellows, Biochem. J. 191, 209-219 (1980)]. 이 항생제의 장점은 인간 및 동물 모두에 매우 낮은 독성을 갖고 에임스 테스트(Ames test)에서 음성을 나타낸다는 점이다. 현재 슈도몬산 A는 피부 감염(예, 농가진, 농피증), 비강 및 외이 감염, 여드름, 화상, 습진, 건선의 치료를 위하여 궤양의 경우에는 2차 감염의 치료 및 병원 감염의 예방을 위한 다양한 제형으로 인간 치료에 사용된다.

항생제 복합물-함유 배양 브로쓰로부터 슈도몬산 A을 분리하는 한 방법은 액체-액체 추출이다. 독일 특허 제2,227,739호 및 미국 특허 제4,289,703호에 따르면, 가용성 바륨염을 발효 브로쓰에 첨가한 후 불용성 불활성 제제를 갖는 미생물 세포를 원심분리에 의하여 분리한 후 마지막으로 항생제를 메틸 이소부틸 케톤에 의하여 추출하였다. 이어서 항생제는 메틸 이소부틸 케톤 추출물로부터 알칼리수에 의하여 제거되고 생성된 알칼리수 추출물은 메틸 이소부틸 케톤으로 재추출함으로써 세척한다. 생성된 조생성물은 크로마토그래피하고 에스테르 유도체는 슈도몬산 항생제 복합물로부터 제조하여, 준비한 얇은 층 크로마토그래피로 정제하였다. 가수분해에 의하여 순수한 항생제로부터 산을 얻는다.

벨기에 특허 번호 제870,855호는 배양 브로쓰를 메틸 이오부틸 케톤으로 추출하고 이 추출물로부터 활성 성분을 탄산수소나트륨 용액에 의하여 추출하는 방법에 관한 것이다. 알칼리수내 불용성 물질을 여과에 의하여 분리한 후 여과액의 pH를 산성화하여 메틸 이소부틸 케톤에 의하여 추출한다. 끝으로 추출물을 농축하고 메틸 이소부틸 케톤-n-헵탄 혼합물로부터 결정화시켜 슈도몬산 A를 얻는다.

일본 특허 제52-70083호는 배양 브로쓰로부터 슈도몬산 A를 회수하는 2가지 방법에 관한 것이다. 이 방법중 하나에 따르면, 박테리아 세포를 원심분리에 의하여 배양 브로쓰로부터 분리하고, 이어서 활성 성분을 에틸 아세테이트에 의하여 상청액으로부터 추출한다. 이어서 슈도몬산 복합물을 탄산수소나트륨 용액에 의하여 에틸 아세테이트 상으로부터 재추출하고, 산성화후 에틸 아세테이트로 다시 추출한다. 증발후 잔류물을 클로로포름-메탄올 용출액을 적용함으로써 실리카겔 컬럼에서 정제하고, 마침내 순수한 슈도몬산 A를 디이소프로필 에테르로부터 결정화시켜 획득한다. 이와는 다른 방법에서 상기 방법에 의하여 얻어진 조생성물을 메탄올-암모니아 용출액의 적용에 의하여 DEAE-세파덱스 음이온 이온 교환 컬럼에서 크로마토그래피하고, 슈도몬산 A를 함유하는 분획물을 분리한다.

A.D. Curzons는 리튬염 형성에 의하여 배양 브로쓰로부터 슈도몬산 A의 회수를 설명한다(유럽 특허 제0 005 614호). pH 4.5에서 획득한 활성 성분을 함유하는 메틸 이소부틸 케톤 추출물은 메탄올중에 용해된 리튬 2-에틸-헥사노에이트와 반응한다. 침전된 슈도몬산 A 리튬염은 분리되어, 물에 용해되며, pH 4.5에서 방출된 슈도몬산 A는 메틸 이소부틸 케톤에서 추출되어, n-헵탄의 존재하에서 침전된다.

상술된 방법에서는, 극성 및 비수혼화성 용매(메틸 이소부틸 케톤, 에틸 아세테이트, n-부탄올)를 배양 브로쓰로부터 슈도몬산 복합물의 회수를 위하여 사용한다. 본 발명자들의 경험에 따르면, 선택적 추출은 이러한 방법을 사용하여 만족할 정도로 실행될 수 없다. 이는 슈도몬산 복합물외에 기타 극성 및 비극성 불순물이 또한 다량으로 추출되기 때문이다. 슈도몬산 A는 다량으로 불순물을 함유하는 유기 용매의 알칼리 추출과 이에 따르는 산성 pH에서의 유기 용매 재추출 및 이에 따르는 조생성물의 결정화에 의하여 단지 저수율(17-34%)로 순수한 형태로 회수될 수 있다. 높은 노동 비용 및 용매 요구때문에 정제를 위하여 크로마토그래프 과정을 이용하는 것은 생산 규모에서 유리하지 않다. 또한, 크로마토그래프 흡착물의 존재하에서 크로마토그래프 공정 동안 분자내 변형을 활성 성분내에서 일어나고, 이것은 생물학적으로 비활성인 이환형 화합물 9-{4-[1S,6R-8R(1S,3S-디히드록시-2S-메틸-부틸)-5S-히드록시-3,7-디옥사비시클로[4.3.0]노네인-4S-일]-3-메틸-부-2(E)-테노일옥시}노나노산 (화학식5) 및 화합물 9-{4-[1R,6S-4S,10S-디히드록시-3R-(2S-히드록시-1S-메틸-프로일)-2,8-디옥사비시클로[4.4.0]데케인-9S-일]-3-메틸부-2(E)-테노일옥시}노나노산 (화학식6)의 형성을 유도한다.

이러한 화합물의 형성 및 재결정을 통한 이들의 제거는 슈도몬산 A의 회수율을 상당히 감소시킨다.

슈도몬산 A 리튬염의 중간체를 통한 분리 공정이 임의의 크로마토그래피 단계를 포함하지 않지만, 공정에 사용되는 리튬염이 공정을 복잡하게 하고 생산 규모에 사용하기에는 비용이 높기 때문에 생산 규모 공정에 용이하게 사용하지 못한다.

따라서, 공지 방법의 단점을 제거하면서 생산 규모에 적용하면 상술된 항생제를 고수율로 회수하게 만들 수 있는 항생제 슈도몬산 A를 분리하기 위한 신규한 공정에 대한 요구가 여전히 남아있다.

본 발명은 슈도몬산 복합물을 함유하는 배양 브로쓰로부터 슈도몬산 A(뮤피로신)를 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 요약

본 발명은 염소화 지방족 탄화수소 또는 이소부틸 아세테이트를 사용하여 슈도모나스 박테리아 속의 슈도몬산 A-생산하는 종의 배양물로부터 슈도몬산 A를 추출하여 슈도몬산 A-함유 추출물을 얻는 단계 및 상기 추출물로부터 슈도몬산 A를 정제하는 단계를 포함하는 화학식(1)의 슈도몬산 A 항생제를 분리하는 공정에 관한 것이다. 정제된 슈도몬산 A는 임의적으로 결정화된다.

화학식 1

본 발명의 구체예에서 정제 단계는 수성-알코올과 덜 극성인 용매 사이에 추출의 증발 잔류물을 분배시켜 불순물을 제거하는 단계; 물로 수성 알코올 상을 희석시키는 단계 및 더 극성인 용매로 추출하여 정제된 슈도몬산 A를 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예로, 정제 단계는 탄산수소암모늄, 수산화알칼리금속 또는 수산화암모늄의 수용액으로 추출물로부터 슈도몬산 A를 회수하여 알칼리 용액을 형성하는 단계; 알칼리 용액을 산성화하여 산성 용액을 형성하는 단계; 및 염소화 지방족 탄화수소 또는 이소부틸 아세테이트로 산성 용액을 추출하는 단계를 포함한다.

발명의 상세한 설명

슈도몬산 A는 산성화한 후 미생물 세포를 함유하는 전체 브로쓰로부터 또한 세포의 분리후 얻어진 상청액으로부터 모두 염소화 지방족 탄화수소에 의하여 선택적이고 효과적으로 추출될 수 있으며, 또한 슈도몬산 A에 수반되는 불활성 불순물의 대부분이 상기 추출물을 증발시킨 후 수성-알코올 용액과 지방족 탄화수소 사이의 증발 잔류물의 분배, 이에 따르는 수성 알코올과 방향족 탄화수소 사이의 증발 잔류물의 분배에 의하여 조생성물로부터 제거할 수 있다는 놀라운 사실을 발견하였다. 바람직한 알코올은 메탄올이다. 이 메탄올을 사용하여 조생성물로부터 슈도몬산 A는 이소부틸 아세테이트, 아세토니트릴 또는 수-아세토니트릴 혼합물로부터 재결정한 후 약제 등급으로 획득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 방법에 따르면, 슈도몬산 A 항생제를 분리하는 동안 미생물 세포를 원심분리에 의하여 거의 중성 pH에서 분리한다. 거의 중성 pH에서 배양 브로쓰를 원심분리한 후, 슈도몬산 A의 주요 부분이 상청액에 있고 이것은 상청액으로부터 바람직한 pH4.5에서 추출에 의하여 회수할 수 있다. 바람직하게는, 항생제의 추출은 염소화 지방족 탄화수소에 의하여, 가장 바람직하게는 염화메틸렌에 의하여 수행된다.

염화메틸렌 추출물중 슈도몬산 A의 일차적 정제는 분배 분리를 적용함으로써 수행할 수 있다. 조생성물의 가능한 색소 및 지질 불순물이 10% 수함유 수용성 메탄올 혼합물 및 지방족 탄화수소, 예를 들면 n-헥산 또는 n-헵탄사이에서의 분배에 의해 분리될 수 있다. 지질 유형의 비극성 불활성 불순물의 대부분은 n-헥산 또는 n-헵탄 상으로 이동한다. 수-메탄올 상의 수분 함량을 25%까지 증가시키고 방향족 탄화수소, 바람직하게는 톨루엔을 사용하여 이를 추출함으로써 더 극성인 불활성 불순물을 조생성물로부터 제거할 수 있다.

수-메탄올 상의 수분 함량을 50% 까지 증가시키고 수-비혼화성 용매, 바람직하게는 염화메틸렌, 에틸아세테이트, 메틸 이소부틸 케톤, n-부틸-아세테이트 또는 이소부틸 아세테이트에 의하여 이것을 추출하고, 유기 용매를 증발시킴으로써 슈도몬산 A-함유 조생성물을 획득한다. 슈도몬산 A는 생합성 동안 형성될 수 있는 슈도몬산 복합물의 기타 성분으로부터 바람직하게는 메틸 이소부틸 케톤-n-헵탄 용매 혼합물을 사용하여 결정화에 의해 분리할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예로 전체 브로쓰 추출은 염소화 지방족 탄화수소, 바람직하게는 염화메틸렌에 의하여 pH4.5에서 미생물 세포의 존재하에 수행될 수 있다. 슈도몬산 복합물을 2% 탄산수소나트륨 용액에 의하여 염화메틸렌 추출물로부터 추출하고 슈도몬산 복합물을 수상으로부터 산형태로 바람직하게는 pH4.5에서 염화메틸렌에 의하여 획득한다.

나아가, 산성화한 후, 브로쓰에 용해되고 생물질의 세포에 결합된 슈도몬산 A는 추출을 위하여 이소부틸 아세테이트를 사용함으로써 효과적이고 선택적으로 추출할 수 있음을 알게되었다. 또한 배양 브로쓰 추출후 슈도몬산 A를 이소부틸 아세테이트 추출물로부터 더욱 바람직하게는 탄산수소암모늄, 수산화암모늄 또는 수산화알칼리금속에 의하여 회수할 수 있음을 발견하였다. 바람직한 수산화 알칼리금속은 수산화나트륨이다. 상기 추출물을 산성화하고 이소부틸 아세테이트에 의해 이것을 추출한 후, 농축된 유기 용매 추출물을 얻을 수 있으며, 이로부터 증발에 의하여 결정 조생성물을 제조할 수 있다. 이소부틸 아세테이트, 아세토니트릴 및/또는 수-아세토니트릴 혼합물로부터 상기 생성물을 재결정한 후, 슈도몬산 A를 약제 등급으로 획득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 전체 브로쓰로부터 항생제를 추출하는 것은 이소부틸 아세테이트에 의하여 바람직하게는 약 4.5의 pH에서 수행된다. 현탁액의 형성을 제거하기 위하여, 해유화제, 바람직하게는 Armogard D5397(악조 케미탈스 엘티디., 영국의 란카쉬어에 소재)를 사용할 수 있다. 바람직하게는 해유화제가 10 부피% 이소부틸 아세테이트 용액내 약 0.1 %를 구성한다. 웨스트팔리아 (Westfalia) 타입 분리기상에서 분리된 이소부틸 아세테이트 추출물로부터 슈도몬산 복합물을 수산화나트륨 수용액으로 회수하고 산성 pH에서 추출한 후 생성된 조생성물을 석유에테르(비점 범위:60-95℃) 및 이소부틸 아세테이트 용매 혼합물로부터 결정화한다. 획득한 생성물을 바람직하게는 아세토니트릴로부터 재결정화하고, 이어서 그 수용액을 움직이지 않게 보관하고, 이어서 여과후 회수한다.

슈도몬산 A를 생합성할 수 있는 슈도모나스 박테리아 속의 임의의 미생물 균주의 임의의 배양 브로쓰가 본 발명의 방법을 위한 출발 물질로서 사용하기에 적절하다.

미생물 세포의 산성 처리를 위하여, 염산, 황산 및 인산과 같은 광산(mineral acid) 및 아세트산 및 옥살산과 같은 유기산 모두를 사용할 수 있다. 옥살산 및 황산은 이러한 목적에 특히 유익하다.

발효의 말기에 슈도몬산 A 및 관련된 화합물의 정확한 함량은 고압 액체 크로마토그래피에 의하여 결정된다. 배양 브로쓰는 에탄올에 의하여 2회 희석하고, 초음파 처리 및 원심분리하고, 상청액을 분석하였다. 본 발명의 방법을 사용하여 제조한 슈도몬산 A 및 관련된 화합물은 다음과 같은 보유시간을 갖는 것으로 밝혀졌다: 화학식(1)의 슈도몬산 A 8.34분, 화학식(2)의 슈도몬산 B 6.83분, 화학식(3)의 슈도몬산 C 16.8분, 화학식(4)의 슈도몬산 D 6.8분, 화학식(5)의 부성분 6.55분, 화학식(6)의 부성분 6.9분[기계 LKB 2248 펌프, LKB2157 자동샘플기, LKB2155 컬럼 오븐, LKB2141 UV 검출기, 222nm에서 분석, 컬럼: 뉴클레오실 C₁₈10um(BST), 용출물: 아세토니트릴 및 0.1M NaH₂PO₄수용액(pH=4.2)의 혼합물(35:65), 유속 1.0 ml/분].

분리된 슈도몬산 A의 구조를 UV, IR,¹H-NMR,¹³C-NMR 및 질량분광 조사에 의하여 결정하였다. 본 발명에 따라 제조된 슈도몬산 A는 국제특허 제 WO 92/10493호에 개시된 다중형 I과 동일하였다.

본 발명의 방법은 다음 실시예에 의하여 예시된다. 그러나, 본 발명은 이로 인하여 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

1200 ug/ml 뮤피로신을 갖는 5리터 배양 브로쓰의 pH는 20% 황산(60 ml)에 의하여 연속 교반하면서 4.5로 조정되었다. 산성화된 액체는 2.5리터 염화메틸렌에 의하여 추출하였다. 이어서 이 상을 분리하여 현탁화된 유기 상으로부터 원심분리에 의하여 뚜렷한 상을 제조하였다. 이전의 단계에 따라 배양 브로쓰는 염화메틸렌 1.25리터로 다시 2회 추출하였다. 혼합된 염화메틸렌 추출물을 1.25리터 탈이온수로 세척하였다. 상을 분리하고 20℃이하에서 염화메틸렌 추출물을 처음에 0.5리터 다음에 0.25 리터 2% 탄산수소나트륨 용액으로 추출하였다. 상을 분리하고 추출물을 혼합하였다. 혼합된 추출물을 20℃ 이하까지 냉각하고 추출물의 pH를 계속 교반하면서 20% 황산에 의하여 4.5로 조정하였다. 생성된 산성 용액을 0.38 리터 염화메틸렌으로 한번, 0.19 리터 염화메틸렌으로 한번 추출하였다. 혼합된 염화메틸렌 추출물을 0.19 리터 탈이온수로 세척한 후 염화메틸렌 추출물을 실온에서 숯(0.42g)으로 정화하였다. 정화한후 염화메틸렌 추출물을 증발시켰다. 증발 잔류물(약 8g)을 실온에서 이소부틸 아세테이트 16 ml에 용해하였다. 용액을 교반하면서 0 내지 5℃로 냉각시키고 결정화가 일어날때까지 계속하여 교반하였다. 이후 결정화는 밤새 상기 온도에서 수행하였다. 침전된 뮤피로신을 여과한후 2×4 ml 냉(5℃이하) 이소부틸 아세테이트 및 이소부틸 아세테이트-석유 에테르의 혼합물(1:2) 6ml에 의하여 표면 세척을 실시하였다. 이후 항생제를 2×25 ml 석유에테르(비점: 60-95℃)중 현탁액으로 세척하고 50℃ 진공에서 건조시켰다. 획득한 뮤피로신은 40-45℃에서 이소부틸 아세테이트 60 ml중에 용해시켰다. 이 용액을 실온으로 냉각하고 석유에테르(비점: 60-95℃) 60 ml를 용액중에 적가 도입하였다. 이어서 0-5℃에서 밤새 결정화시켰다. 침전된 결정을 여과하고 2×4 ml 냉(5 ℃이하) 이소부틸 아세테이트-석유 에테르의 혼합물(1:2) 6ml에 의하여 표면 세척을 수행하였다. 이어서 생성물을 3×20 ml 석유 에테르내에 현탁시킴으로써 세척하였다. 뮤피로신은 중량이 일정할때까지 50℃ 온도에서 진공하에 건조하였다. 이런 방식으로 다음 성질을 갖는 순수한 뮤피로신 3.3 g을 획득하였다.

성질:

융점: 73-75℃

자외선 스펙트럼(10 ug/ml, 95% 에탄올 용액): λ_최대= 222 nm

E^1% _icm= 303.6

적외선 스펙트럼(KBr): νOH 3483 및 3306, νC=O 1728(COOCH₃), 1720(COOH)cm^-1

'H-NMR 스펙트럼 (CDCl₃, δ_TMS= 0.00 ppm):
δ(ppm)	지정	커플링 상수(Hz)
5.75(1H)q	2-H	⁴J_2.15=1.1
4.08(2H)t	9'-H₂	³J_8.9=6.4
3.93-3.72(4H)m	5,7,13-H; 16-H_α
3.55(1H)dd	16-H_β	²J_16α.16β=11.8;³J_16β.8=2.6
3.48(1H)dd	6-H	³J_2.15=8.4;³J_6.7=3.2
2.82(1H)td	10-H	³J_9.10=6.3;³J_10.11=2.3
2.74(1H)dd	11-H	³J_10.11=2.3;³J_11.12=7.8
2.60(1H)dd	4-H_α	³J_4α.4β=14.5;³J_4α.5=2.7
2.36-2.28(3H)m	4-H_β; 2'-H₂
2.20(3H)d	15-H₃	⁴J_2.15=1.1
2.02-1.92(1H)m	8-H
1.76-1.61(6H)m	9-H₂; 3'-H₂; 8'-H₂
1.43-1.33(9H)m	12-H; 4'-H₂; 5'-H₂; 6'-H₂; 7'-H₂
1.22(3H)d	14-H₃	³J_13.14=6.4
0.94(3H)d	17-H₃	³J_12.17=7.0

¹³C-NMR 스펙트럼 (CDCl₃용액, δ_TMS= 0.00 ppm):
δ(ppm)	지정	δ(ppm)	지정
177.8s	C-1'	42.7t,d	C-9, C-12
166.9s	C-1	39.4d	C-8
156.0s	C-3	33.9t,t	C-9, C-2'
117.7d	C-2	31.6t	C-4'^*
74.9d	C-5	28.9t	C-5'^*
71.4d	C-13	28.8t	C-6'^*
70.4d	C-7	28.5t	C-8'^*
69.0d	C-6	25.9t	C-7'
65.3t	C-16	24.6t	C-3'
63.9t	C-9'	20.8q	C-14
61.3d	C-11	19.1q	C-15
55.6d	C-10	12.7g	C-17
^*상호대체가능한 지정

질량 분광:
스펙트럼 데이터 성질:
m/z	RI(%)	지정
501	100	(M+H)⁺
327	45	(M+H-HO/CH₂/₈COOH)⁺
309	16	(m/z 327-H₂O)⁺
227	33	(C₁₂H₁₃O₄)⁺

실시예 2

1500 ug/ml 뮤피로신을 보유한 5리터 배양 브로쓰의 pH를 계속 교반하면서 20% 황산에 의하여 4.5까지 조정하였다. 산성화된 액체는 2.5리터 이소부틸 아세테이트에 의하여 추출하였다. 이 상을 분리하여 현탁화된 유기 상으로부터 원심분리에 의하여 뚜렷한 상을 제조하였다. 이전의 단계에 따라 배양 브로쓰는 이소부틸 아세테이트 1.25리터로 다시 추출하였다. 혼합된 이소부틸 아세테이트 추출물을 1.25리터 탈이온수로 세척하였다. 상을 분리하고 0.5리터 탈이온수를 이소부틸 아세테이트 추출물에 첨가하였다. 혼합된 상의 pH는 5% 수산화암모늄에 의하여 8.0±0.2로 조정하였다. 상을 분리하고 pH 8.0±0.2에서 0.5리터 탈이온수로 이소부틸 아세테이트 추출물을 다시 추출하였다. 혼합된 알칼리 추출물을 20℃이하에서 냉각하고 추출물의 pH를 계속 교반하면서 20% 황산에 의하여 4.5로 조정하였다. 생성된 산성 용액을 0.5리터 이소부틸 아세테이트로 한번, 0.25리터 이소부틸 아세테이트로 한번 추출하였다. 혼합된 이소부틸 아세테이트 추출물을 0.25리터 탈이온수로 세척한 후 이소부틸 아세테이트 추출물을 실온에서 숯 0.52g으로 정화하였다.정화한후 이소부틸 아세테이트 추출물을 13ml 최종 부피로 진공하에서 농축시켰다. 뮤피로신의 결정화 및 개결정화를 실시예1에서와 같이 수행하였다. 이런 방식으로 실시예 1에 나타난 바와 동일한 물리적 성질을 갖는 순수한 뮤피로신 3.75 g을 획득하였다.

실시예 3

1000 ug/ml 뮤피로신을 보유한 80 리터 배양 브로쓰를 F-100 유형 수퍼 원심분리기(제조자: Budapesti Vegyipari Gepgyar)로 원심분리한후, 상청액의 pH를 옥살산(약 0.69리터)으로 4.5까지 조정하였다. 산성화된 액체는 24 리터 염화메틸렌에 의하여 2회 추출한 후 혼합된 추출물을 진공하에서 증류하였다. 유성 잔류물(약 0.14kg)은 10% 수-함유 메탄올 0.56리터에 용해한 후 이 용액을 0.56리터 n-헥산으로 2회 추출하였다. 메탄올 용액을 25% 수함량까지 탈이온수로 희석하고 이 용액을 0.56 리터 톨루엔으로 2회 추출하였다. 이어서 메탄올 용액을 탈이온수로 50% 수함량까지 희석하고 이 용액을 0.56 리터 염화메틸렌으로 한번, 0.28 리터 염화메틸렌으로 한번 추출하였다. 혼합된 염화메틸렌 추출물을 진공하에서 증발시켰다. 생성된 증발 잔류물(약 0.11kg)을 실시예1에 따라 진행시켜, 실시예1과 동일한 물리적 성질을 갖는 뮤피로신 44g을 획득하였다.

실시예 4

1200 ug/ml 뮤피로신을 보유한 160 리터 배양 브로쓰의 pH를 계속 교반하면서 20% 황산(약 2.7 리터)에 의하여 4.5±0.2까지 조정하였다. 이후 산성화된 액체는 80 리터 이소부틸 아세테이트에 의하여 추출하였다. 30분간 교반한 후 0.1 % 해유화제를 여기에 첨가하였다(이소부틸 아세테이트의 용액중 1g Armogard D5397/리터 브로쓰). 이 상을 SA1-01-175 유형 웨스트팔리아(Westfalia) 분리기에 의하여 분리하였다(Westfalia separator A.G., Oelde, Germany). 배양 브로쓰는 이소부틸 아세테이트 40 리터로 다시 추출하고 이전 단계에 따라 분리하였다. 이소부틸 아세테이트 추출물을 40 리터 탈이온수로 세척하였다. 세척된 이소부틸 아세테이트 추출물을 20 리터 탈이온수로 혼합하고 이어서 400 ml의 10 질량% 황산마그네슘 용액을 해유화제로서 혼합물에 첨가하였다. 이어서 수성 이소부틸 아세테이트 혼합물의 pH는 수산화나트륨에 의하여 8.0±0.2로 조정하였다. 20분 동안 교반후 상을 분리하고, pH 8.2±0.2에서 이소부틸 아세테이트 추출물을 다시 추출하였다. 혼합된 알칼리 수용액을 800 ml의 10 질량% 황산마그네슘의 존재하에 12 리터의 이소부틸 아세테이트로 추출하였다. 상을 분리한 후, 이소부틸 아세테이트 8리터를 수성 상에 첨가한 후 이소부틸 아세테이트 혼합물의 pH를 20% 황산 용액에 의하여 4.5±0.2로 조정하였다. 20분 동안 교반후, 상을 분리하고 산성 용액을 상술된 바와 같이 재추출하였다. 혼합된 이소부틸 아세테이트 추출물을 100 ml 10 중량% 황산마그네슘 용액의 존재하에서 5 리터 탈이온수로 세척하였다. 상을 분리하고, 이소부틸 아세테이트 추출액을 진공하에서 증류하여 최종 부피 1.1 리터로 만들었다. 이소부틸 아세테이트 농축물을 석유 에테르(비점: 60-95℃) 110 ml와 혼합하고 24시간동안 0-5℃에서 결정화하였다. 침전된 결정을 여과하고 냉(5℃ 이하) 이소부틸 아세테이트로 세척하였다. 이어서 습윤 조생성물을 600 ml 석유 에테르에 현탁하고 여과하여 40℃에서 진공하에 건조하였다. 생성된 뮤피로신을 40-50℃에서 550 ml의 아세토니트릴에서 용해한 후 이전 온도에서 숯(5.5g)으로 정화하였다. 정화한 후 상기 용액을 실온에서 냉각한 후, 24시간동안 0-5℃에서 방치하였다. 침전된 뮤피로신을 여과한 후 표면을 50 ml 냉(5℃ 이하) 아세토니트릴에 의하여 세척하였다. 습윤 결정을 200 ml 탈이온수에 현탁한 후 탈이온수의 또다른 200 ml 부피를 현탁액에 첨가하였다. 이어서 24시간동안 0-5℃에서 결정화시켰다. 결정을 여과하고 표면을 2×50 ml 탈이온수로 세척하였다. 생성물을 72시간동안 40℃에서 진공하 건조시켰다. 이런 방식으로 실시예1에서와 동일한 물리적 성질을 갖는 뮤피로신 80.6g을 획득하였다.

본 발명의 바람직한 구체예가 본원에 설명되어 있지만, 상술된 구체예의 변형 및 변이가 본 발명의 본질을 벗어나지 않을 것이라는 점은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 본 발명은 법의 적용가능한 법칙 및 첨가된 청구범위에 의하여 요구되는 정도까지 제한된다.

Claims

염소화 지방족 탄화수소 또는 이소부틸 아세테이트를 사용하여 산성 pH에서 슈도모나스 박테리아 속의 슈도몬산 A를 생산하는 종의 배양물로부터 슈도몬산 A를 추출하여 슈도몬산 A를 함유하는 추출물을 획득하는 단계; 및

상기 추출물로부터 슈도몬산 A를 정제하는 단계

를 포함하는 화학식(1)의 슈도몬산 A 항생제를 분리하는 방법.

화학식(1)
제1항에 있어서, 상기 정제 단계는 하나 이상의 유기 용매를 포함하는 유기상과 수성-알코올 상 사이에 추출물을 분배하는 단계 및 유기 용매를 증발시키는 단계를 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올인 방법.
제3항에 있어서, 상기 추출물은 10% 수-메탄올 용액과 지방족 탄화수소 사이에 분배되는 방법.
제4항에 있어서, 상기 지방족 탄화수소는 헥산 또는 헵탄인 방법.
제5항에 있어서, 상기 지방족 탄화수소는 n-헥산인 방법.
제3항에 있어서, 상기 추출물은 25% 수-메탄올 용액과 방향족 탄화수소 사이에 분배되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 방향족 탄화수소는 톨루엔인 방법.
제3항에 있어서, 상기 추출물은 50% 수-메탄올 용액과 수-비혼화성 용매 사이에 분배되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 수-비혼화성 용매는 염화메틸렌, 에틸 아세테이트, 메틸 이소부틸 케톤, n-부틸 아세테이트 및 이소부틸 아세테이트로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정제 단계는 탄산수소암모늄, 수산화알칼리금속 또는 수산화암모늄의 수용액으로 추출물로부터 슈도몬산 A를 회수하여 알칼리 용액을 형성하는 단계; 알칼리 용액을 산성화하여 산성 용액을 형성하는 단계; 및 이소부틸아세테이트로 산성 용액을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 슈도몬산 A는 수산화나트륨 수용액으로 추출물로부터 회수하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 슈도몬산 A는 수산화암모늄 수용액으로 추출물로부터 회수하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 슈도몬산 A는 탄산수소암모늄 수용액으로 추출물로부터 회수하는 방법.
제1항에 있어서, 증발시켜 정제된 슈도몬산 A를 결정화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 조 슈도몬산 A는 이소부틸 아세테이트 또는 이소부틸 아세테이트-석유 에테르 혼합물로부터 결정화하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 조 슈도몬산 A는 아세토니트릴, 물 또는 아세토니트릴과 물의 혼합물로부터 결정화하는 방법.