KR100962843B1

KR100962843B1 - 신규 소란지아데노신 화합물을 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR100962843B1
Application number: KR1020070127723A
Authority: KR
Inventors: 신종헌; 오기봉; 안종웅
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-12-10
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2010-06-10
Also published as: KR20090060787A

Abstract

본 발명은 점액세균(Sorangium cellulosum)으로부터 분리한 항균 활성을 갖는 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균조성물에 관한 것으로, 상세하게는 점액세균(Sorangium cellulosum)의 배양액에서 세스퀴테르펜 아데노사이드계 화합물인 신규 소란지아데노신 화합물을 분리하여 다양한 그램양성 및 그램음성 박테리아에 대한 강한 저해활성을 확인함으로써, 이를 포함하는 조성물은 세균 감염성 질병의 치료를 위한 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

소란지아데노신, 세스퀴테르펜 아데노사이드, 점액세균, 항균조성물

Description

신규 소란지아데노신 화합물을 포함하는 항균 조성물 {A antimicrobial composition comprising novel sorangiadenosine compound}

본 발명의 목적은 점액세균으로부터 분리되는 항균 활성을 갖는 세스퀴테르펜 아데노사이드계 화합물인 신규 소란지아데노신 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 세균 감염성 질병의 치료를 위한 항균 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Strohl W. R. Biotechnology of Antibiotics. Marcel Dekker Inc ., New York, 1997

[문헌 2] Riguera R., J. Mar . Biotechnol ., 5, pp.187-193, 1997

[문헌 3] Hiramatsu, K., Aritaka, N., Hanaki, H., Kawasaki, S., Hosoda, Y., Hori, S., Fukuchi, Y., Kobayashi, I., Lancet , 350, pp.1670-1673, 1997

[문헌 4] Gold, H. S. & R. C. Moellering. N. Engl . J. Med . 335, pp.1445-1453, 1996

[문헌 5] Sieradzki, K., Roberts, R. B., Harber, S. W., Tomasz, A., N. Engl . J. Med . 340, pp.517-523, 1999

[문헌 6] Borris, B. P., J. Ethnopharmacol ., 51, pp.29-38, 1996

[문헌 7] Cowan, M. M., Clin . Microbiol . Rev ., 12, pp.564-582, 1999

[문헌 8] Koch and White, BioEssays , 20, pp.1030-1038, 1998

[문헌 9] Yamanaka, S. Chem . Biol ., 27, pp.656-662, 1989

[문헌 10] Shimekets L., Woese, R., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 89, pp.9459-9463, 1992

[문헌 11] Reichenbach, H. et al., TIBTECH , 6, pp.115-121, 1988

[문헌 12] Tang, L. et al., Science, 287, pp.640-642, 2000

[문헌 13] Reichenbach, H., Hoefle, G., Drug Discovery from Nature, Springer - Verlag , Berlin, 1999

[문헌 14] Reichenbach and Dworkin, 1992; Halt, et al, 1994

[문헌 15] Wu, M., Hancocks, R. E. W., J. Biol . Chem ., 274, pp.29-35, 1999

항생제의 고전적 의미는 미생물에 의해 생산되는 2차 대사 산물로서, 매우 낮은 농도에서 미생물을 죽이거나 성장을 저해하는 물질을 말한다. 항생제라는 용어는 1940년대 왁스만(Waksman)에 의해 처음 사용되기 시작한 것으로, 초기에는 당시에 주로 사용되던 합성물질 설폰아미드류(sulfonamide)와 페니실린 곰팡이 (Penicillium sp.)에 의해 생산되는 페니실린(Penicillin)을 구별하기 위해 사용되었다. 그 후 항균활성(antimicrobial activity)을 나타내는 많은 물질들이 발견되고 합성됨에 따라 항생제의 의미를 일의적으로 정의하는 것이 어려워지고 있는데, 현재는 일반적으로 항생제가 낮은 농도에서 효과적으로 항생활성을 갖는 천연, 반합성 또는 합성의 화합물을 의미하는 것으로 받아들여지고 있다. 이처럼 초기에는 항생활성물질이 주로 미생물에 의해 생산되는 것으로 알려져 있었으나, 이후 다양한 고등동물 또는 식물이 생산하는 여러 종류의 항생활성 물질들이 보고되고 있다. 천연물의 탐색과 이용에 관한 연구는 바로 유기체의 생합성 능력을 탐색하고 이용하는 것으로서, 지금까지 주로 식물과 미생물이 그 대상의 주종을 이루어 왔다. 특히 미생물은 종의 다양성과 함께 독특하고 흥미로운 생리활성 물질을 생산하는 예가 많고 세대기간이 짧으며 대량생산이 용이하고 산업적 이용 가능성이 높아서 매력 있는 생리활성물질의 탐색원이 되어왔다.

1950년 중반에 항생물질 시대가 개막된 이후 지금까지 알려진 17,000여종의 미생물 기원의 생리활성물질은 약 70%가 방선균에서 분리되었고 20%가 진균류에서, 나머지 10% 정도가 바실러스(Bacillus) 및 슈도모나스(Pseudomonas)를 주축으로 한 세균에서 분리되었다(Strohl W. R. Biotechnology of Antibiotics. Marcel Dekker Inc ., New York, 1997). 이들을 대상으로 한 신물질 탐색연구는 화학적 다양성의 한계로 인하여 점차 기지물질의 재분리로 그치는 경우가 많았고, 시간과 비용의 증가로 인해 신물질 탐색을 위한 새로운 자원의 필요성이 대두됨에 따라 곤충, 해수, 식물 등에서 균을 분리하고자 시도하고 있다(Riguera R., J. Mar . Biotechnol ., 5, pp.187-193, 1997). 생물학적으로나 화학적 표현형으로나 다양한 미생물 자원을 획득하는 것은 앞으로 생물산업과 인류보건의 장래를 위하여 매우 긴요한 일이다.

현재까지 수많은 항생물질이 천연물로부터 분리되거나 유기합성 됨으로써 많은 질병이나 감염증이 치료 가능해졌으나, 전 세계적으로 과도한 항생제 오남용으로 인해 기존 항생물질에 대한 내성균의 출현 및 내성률이 증가하고 있는 추세이며 (Hiramatsu, K., Aritaka, N., Hanaki, H., Kawasaki, S., Hosoda, Y., Hori, S., Fukuchi, Y., Kobayashi, I., Lancet , 350, pp.1670-1673, 1997), 이에 더하여 다양해지고 있는 감염경로는 내성균의 확산을 가속화 시켜 심각한 사회문제로 대두되고 있다 (Gold, H. S. & R. C. Moellering. N. Engl . J. Med . 335, pp.1445-1453, 1996). 특히, 현재 임상에서는 기존 항생제에 대한 내성균이 증가하면서 항생제 내성균의 마지막 무기인 반코마이신(vancomycin)을 대체할 수 있는 새로운 약제의 개발의 필요성이 강조되고 있는 실정이다 (Sieradzki, K., Roberts, R. B., Harber, S. W., Tomasz, A., N. Engl . J. Med . 340, pp.517-523, 1999).

이에 따라 최근에는 기존 항생제를 대체할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가진 약제의 개발에 관심이 집중되고 있다. 그러나 기존의 연구방법으로는 기지물질의 재발견이라는 한계에 직면하고 있는 실정이다. 현재 새로운 항생제 개발에 있어서 큰 흐름은 기존 항생제의 기본구조에 대한 화학적 수식 방법으로 약효나 독성, 약동력학 등이 개선된 유도체를 개발하는 것이며 이들 모방화합물도 궁극적인 해결책이 될 수 없다. 또한 국내에서는 새로운 생리활성물질의 개발이 극히 어렵다는 점 때문에 특허기간이 만료된 외국의 항생물질을 균주개량이나 생산조건의 최적화를 통하여 기득권을 가진 생산업체와 경쟁을 시도하고 있으며, 투자에 있어서 큰 위험부담을 감수해야하는 것이 현실이다. 따라서 새로운 활성물질의 개발을 위해서는 표적 특이적인 탐색방법 및 새로운 자원의 확보가 요구되고 있다 (Borris, B. P., J. Ethnopharmacol ., 51, pp.29-38, 1996; Cowan, M. M., Clin . Microbiol . Rev ., 12, pp.564-582, 1999).

한편 점액세균은 그램음성의 활주세균(gliding bacteria)에 속하면서 포자와 자실체를 형성하는 등 세균과 진균의 특징을 모두 지닌 미생물로서 원핵생물 중에서 가장 복잡한 life cycle을 갖고 있다 (Koch and White, BioEssays , 20, pp.1030-1038, 1998). 즉 이들은 영양세포가 모여들어 집합체를 이루며 점차 성숙함에 따라 육안으로도 확인할 수 있을 정도의 자실체로 발달하고, 그 내부에 모여 든 세포들은 점액성 포자(myxospore)로 변환하는 특이한 life cycle을 이루고 있다. 이들은 영양원에 따라 타 미생물을 용해하는 용균성 점액세균 (bacteriolytic myxobacteria; Bmyxo)과 셀루로오스를 용해하는 셀루로오스 용해성 점액세균 (cellulolytic myxobacteria; Cmyxo)으로 대별된다.

점액세균은 타 세균에 사용하는 통상의 기술이나 방법으로는 자연계로부터 분리되지 않고 저영양균이며 성장속도가 느리고 배양조건이 까다롭다(Yamanaka, S. Chem. Biol ., 27, pp.656-662, 1989). 이로 인해 점액세균은 생물학적 선행연구가 미비할 뿐 아니라 미생물 보존기구에서 보존되고 있는 이들의 수도 매우 적은 실정이다. 점액세균은 현재 12속 35종이 인정되어있으며, Proteobacteria의 δ group에 위치한다 (Shimekets L., Woese, R., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 89, pp.9459-9463, 1992). 최근 독일, 일본, 미국을 비롯한 발효선진국들에 의해 이들의 분리법과 배양기술이 개발되면서 점액세균에 대한 관심은 매우 고조되었고 이어 계속되는 새로운 종의 점액세균의 발견과 함께 방선균에 필적하는 다양한 물질생합성 능력이 밝혀져 현재 점액세균은 신물질 탐색의 주요 대상으로 급부상하고 있다(Reichenbach, H. et al., TIBTECH , 6, pp.115-121, 1988). 점액세균은 택솔(taxol)을 능가하는 항암물질 에포틸론(epothilone) 등 생리활성 물질의 새로운 source로서 최근 그 위상을 더욱 확고히 하였으며, 이와 관련된 에포틸론의 유전체 연구를 통하여 유기합성적으로는 얻을 수 없는 다양한 유도체의 생합성을 유도하는 이른바 조합생성(combinatorial biosynthesis)의 첫 성공적 사례가 되기도 하였다 (Tang, L. et al., Science, 287, pp.640-642, 2000).

이와 같이 자연계로부터 분리가 어렵고 난배양성의 특이미생물이라는 이유로 그동안 학문적으로나 산업적으로 활발한 연구가 어려웠던 점액세균은 현재는 오히려 바로 그 이유로 신물질분야의 미개척자원으로서 집중적인 관심과 연구대상이 되고 있어서 산업적 이용연구가 매우 활발하다 (Reichenbach, H., Hoefle, G., Drug Discovery from Nature, Springer - Verlag , Berlin, 1999).

이에 따라, 본 발명인들은 점액세균으로부터 새로운 항박테리아 제제를 개발하던 중에 우리나라의 토양에서 채집된 Sorangium cellulosum의 배양액으로부터 기존의 공지물질들과는 판이한 골격 구조를 갖는 신규한 세스퀴테르펜 아데노사이드계 화합물을 분리 정제하였으며, 이 화합물의 항세균 활성을 측정한 결과, 우수한 항균 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 점액세균으로부터 분리되는 신규한 구조를 갖는 하기 일반식 (Ⅰ) 의 신규 세스퀴테르펜 아데노사이드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:

(Ⅰ)

상기 식에서,

R1 내지 R11은 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐기, 니트로기, 아민기, 히드록시기, C1-C5 저급 알콕시기, 설프하이드릴기, 설포닐기, 카르복실기, C1-C5 저급알킬 에스테르기, C1 내지 C20 알킬기, C2 내지 C20 알켄일기, 및 C2 내지 C20 알키닐기로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다.

상기 일반식 (I)의 바람직한 화합물군으로는 R1 내지 R11은 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐기, 히드록시기, C1-C5 저급 알콕시기, 카르복실기, C1-C3 저급알킬 에스테르기, C1 내지 C10 알킬기, C2 내지 C10 알켄일기, 또는 C2 내지 C10 알키닐기인 화합물군이며; 보다 바람직하게는 R1 내지 R11은 각각 독립적으로 수소원 자, 히드록시기, 메톡시기, 메틸에스테르기, C1 내지 C5 저급알킬기, C2 내지 C5 저급 알켄일기, 또는 C2 내지 C5 저급 알키닐기인 화합물군들이다. 가장 바람직하게는 R1 내지 R11은 수소원자인 화합물 10'N- (4-eudesm-11-enyl) adenosine이다.

상기 일반식 (Ⅰ)의 본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염으로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산 (maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산 (citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산 (glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산 (glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼 리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 일반식 (Ⅰ) 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 일반식 (Ⅰ) 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트 (메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트 (토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일반식 (Ⅰ) 화합물은 하기와 같은 공정을 통하여 분리 또는 당업계에 잘 알려진 간단한 제조공정으로서 제조될 수 있다.

본 발명은 밭에서 채취한 토양을 고체배지에 있는 여과지위에 토양시료를 처리한 다음 균주를 배양, 순화하는 1단계; 상기 1단계의 균주를 균체증식을 위해 액체배지에서 배양하는 2단계; 배양액을 흡착수지에 흡착시켜 이를 모아 아세톤으로 추출, 농축하는 3단계; 상기 3단계의 추출물을 증류수로 현탁시킨 후, 에틸아세테 이트로 재추출하는 4단계; 상기 4단계의 추출물을 메탄올 및 n-헵탄(n-heptane)으로 분획하여 메탄올층을 회수하는 5단계; 상기 5단계의 분획물을 액체크로마토그래피를 수행하여 소란지아데노신을 분리, 정제하는 제 6단계를 포함하는 공정으로 구성되는 신규 소란지아데노신을 제조하는 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법으로 얻어진 일반식 (I)을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항균 활성 효과를 확인함으로써, 세균 감염성 질병의 치료에 효과적인 항균조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 일반식 (I) 로 표기되는 신규 구조 소란지아데노신 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 세균 감염성 질병의 치료를 위한 항균조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

상기 조성물은 바실러스 서틸리스, 스타필로코크스 오레우스, 마이크로코크스 루테우스, 프로테우스 불가리스, 살모넬라 티피무리움 또는 에쉐리키아 콜리의 세균 감염성 질병의 치료에 효과적이다.

상기 세균 감염성 질병은 포도상구균 식중독, 봉와직염, 노로감염증 수막염, 복막염, 방광염, 림프관염, 표저, 중이염, 호흡기 질환, 폐렴, 화농성 염증 또는 패혈증 등을 포함한다.

본 발명의 상기 일반식 (I) 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글 리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 항균 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 세스퀴테르펜 아데노사이드계 화합물인 신규 소란지아데노신 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 그램양성균 및 그램음성균에 대한 강한 저해활성을 나타내어 세균 감염성 질병의 치료를 위한 항균 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 실험 준비 및 기기

1-1. 분석기기

본 실험에 사용된 기기로 핵자기 공명 스펙트럼 (¹H NMR, ¹³C NMR) 은 브루커(Bruker)사의 AMX-500을, 용매는 DMSO-d6를 사용하였다. 짝지음(Coupling) 상수 ( J )는 Hz 로 표시하였다. 질량(Mass) 스펙트럼은 지올(Jeol)사의 JMS-700 고해상 질량분석기를 사용하였으며 m/z 형태로 표시하였다. 적외선(IR) 분광은 맷슨(Mattson)사의 GALAXY 분광기를 사용하였으며 염화나트륨(NaCl) 판에 흡착하여 사용하였다. 자외선(UV) 분광은 히타치(Hitachi) 사의 U-3210 분광기에서, 용매는 메탄올(methanol)을 사용하였다. 기체 크로마토그래피 분석은 휴렛페커드(Hewlett-Packard) 사의 HP 5890 II 기기에서 AP-I 컬럼으로 분석하였다.

1-2. 사용 시약

본 실험에서 사용된 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 디프코 (DIFCO) 제품을 구입하여 사용하였으며, 분리용매인 메탄올, 아세톤, 디클로로메탄, 에틸아세테이트와 헥산은 아르곤 기류에서 가열환류하여 재정제하여 사용하였다.

실시예 1. 점액세균으로부터 균주 배양 및 동정

A. 점액세균으로부터 균주의 배양

경기도 안산시 외곽에 위치한 밭의 토양을 채취하여 하기의 시료로 사용하였다. WCX 고체배지 (CaCl₂2H₂O 0.1%, cycloheximide 50μg/ml, agar 1.5%, pH 7.2)를 담은 패트리-디쉬(petri-dish)에 미리 멸균한 여과지(filter paper)를 깔고 그 위에 토양 시료를 처리한 다음, 30℃에 2~3주일 배양했을 때 여과지의 주변이 용해되면서 나타나는 주황색의 자실체가 생성되었다. 이 자실체를 KAN-4 고체배지 (CaCl₂2H₂O 0.1%, cycloheximide 50μg/ml, kanamycin sulfate 0.025%, agar 1.5%, pH 7.2)로 옮겨 순화하였으며, 이러한 과정을 3~5회 반복하여 최종 순화된 균주는 VY/2 고체배지 (Bakers' yeast 0.5%, CaCl₂2H₂O 0.1%, cyanocobalamin 0.50μg/ml, agar 1.5%, pH 7.2)를 이용하여 계대하였다.

순화된 균주 KM1003의 균체증식을 위한 예비배양과 물질생산을 위한 본 배양 에는 모두 동일한 조성의 액체배지 (Potato starch 0.8%, glucose 0.2%, soyameal 0.1%, MgSO₄7H₂O 0.1%, CaCl₂2H₂O 0.1%, EDTA Fe(III)-Na⁺salt 0.0008%, pH 7.2)를 사용하였다. 또한 본 배양에서는 물질생산량을 높이기 위해 2L 용량의 배양플라스크에 흡착수지인 XAD-16을 1.5% (w/v) 첨가하여 400 ml의 액체배지와 함께 넣은 후 멸균한 다음 예비배양 한 균액을 5% (v/v) 접종하여 30℃에서 10일간 진탕배양(160 rpm) 하였다.

B. 균주의 동정

점액세균은 타 세균과는 달리 계통발생학적 유연관계에 근거하여 분류하기 보다는 아직 자실체와 swarm의 형태적 특징에 의한 표형적 특성을 기준으로 하여 분류하고 있다(Reichenbach and Dworkin, 1992; Halt, et al, 1994). 그러나 셀룰로오스(cellulose)를 용해하는 점액세균은 예외적으로 모두 Sorangium 속에 속하며, 최근의 분류체계에서는 S. cellulosum 1종만 인정되고 있다. 균주 KM1003은 그람음성의 셀룰로오스 용해성 점액세균으로서 WCX 고체배지 상의 여과지(Whatman No.2)에 접종했을 때 10~14일이 경과한 후 여과지가 용해되기 시작하였고, 여과지의 이면에 주황색의 자실체가 관찰되었다. 이들의 영양세포는 광학현미경(x1500)으로 형태를 관찰한 결과 끝이 무딘 짧은 간상으로 나타났으며, 이들을 KAN-4 고체배지에서 30℃, 2주간 배양했을 때 특유의 덩어리 형태가 관찰되었다. 또한 액체배양에서 균체가 다양한 크기의 덩어리를 이루며 생장하였으며, 배양플라스크의 유리벽 면에 둥근 띠를 형성하였다. 상기와 같은 균주의 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 바탕으로 본 균주를 Sorangium cellulosum으로 동정하고, S. cellulosum KM1003으로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 11228BP).

실시예 2. 소란지아데노신의 분리 및 정제

배양액(10 L)을 원심분리하여 균체와 흡착수지(XAD-16)를 모은 다음 이들을 아세톤으로 추출 및 농축하였다. 이 농축물을 증류수에 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 재추출하여 얻은 에틸아세테이트 추출물을 다시 메탄올과 n-헵탄으로 분획하여 무극성의 세포성분을 포함하는 n-헵탄층을 제거한 다음 메탄올층을 회수한 결과 510 mg의 분획물을 얻었다. 메탄올 층은 반분취 C₁₈ 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (semi-preparative C₁₈ reversed-phase HPLC)에서 ODS-A 컬럼(YMC ; 250 x 10 mm, 20 % aqueous MeOH, 용출속도 1.3 mL/min) 으로 분리한 결과 머무름시간 39분에서 무색의 반고형 성분으로 28.4 mg의 소란지아데노신을 획득하였다.

실시예 3. 소란지아데노신의 화학구조 결정

순수 분리된 소란지아데노신의 화학구조 분석을 위하여 Bruker AMX NMR 스펙트럼을 이용하여 NMR 스펙트럼 항균활성 물질을 DMSO-d6에 녹여 ¹H NMR 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 조사하였고, JMS-700 고해상 질량분석기를 사용하여 소란지아데노신의 분자량과 탄소, 질소, 산소원자의 구성비율을 확인하였다. 또한 적외선 분광기 및 자외선 분광기를 이용하여 각종 원자단에 의한 흡수를 통해서 특수 관능기를 확인하여 하기의 표에 나타내었다(표 1 및 2 참조).

소란지아데노신의 분석결과

성질	소란지아데노신
분자식	C₂₅H₃₇N₅O₄
분자량	471
색	무색
녹는점	상온에서 반고형 액체
적외선 흡수대 (NaCl)	3400(br), 2920, 1610, 1530, 1475 cm-1
자외선 흡수대 (MeOH)	213(64,000), 265(9350)nm

핵자기공명 분석에 의한 소란지아데노신의 수소 및 탄소 지정

위치	1H	13C
1	1.40 (1 H, m), 1.28 (1 H, m)	40.3 t
2	1.59 (1 H, br d, 13.8 Hz), 1.51 (1 H, m)	18.8 t
3	2.36 (1 H, ddd, 13.4, 13.1, 4.1 Hz), 2.05 (1 H, br d, 13.1 Hz)	36.7 t
4		57.8 s
5	2.48 (1 H, dd, 12.4, 2.0 Hz)	47.7 d
6	1.57 (1 H, m), 1.33 (1 H, m)	26.0 t
7	1.89 (1 H, br dd, 11.9, 11.9 Hz)	45.5 d
8	1.54 (1 H, m), 1.33 (1 H, m)	26.7 t
9	1.40 (1 H, m), 1.31 (1 H, m)	44.8 t
10		34.2 s
11		149.9 s
12	1.64 (3 H, s)	20.6 q
13	4.66 (1 H, br s), 4.61 (1 H, br s)	108.5 t
14	0.96 (3 H, s)	19.2 q
15	1.39 (3 H, s)	20.5 q
2‘	8.21 (1 H, s)	151.5 d
4‘		148.0 s
5‘		120.3 s
6‘		154.3 s
8‘	8.33 (1 H, s)	139.6 d
1“	5.86 (1 H, d, 6.3)	88.0 d
2“	5.34 (1 H, dd, 6.3, 5.3 Hz)	73.4 d
3“	4.15 (1 H, dd, 5.3, 2.4 Hz)	70.6 d
4“	3.95 (1 H, dt, 2.4, 2.4 Hz)	85.8 d
5“	3.67 (1 H, dd, 12.6, 2.4 Hz), 3.54 (1 H, dd, 12.6, 2.4 Hz)	61.6 t
NH	6.28 (1 H, br s)

실험예 1. 항세균 활성 검정

상기 실시예 2에서 제조한 소란지아데노신 화합물의 항균 활성을 측정하기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다 (Wu, M., Hancocks, R. E. W., J. Biol . Chem ., 274, pp.29-35, 1999).

항균력 시험은 엠플레이트 카운트 액체배지(m-plate count broth, Difco사 제품)를 사용하여 액체배지희석방법으로 측정하였다. 상기 실시예 2의 소란지아데노신을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여서 상기의 액체배지로 2배 희석계열을 만든 후 96-웰 플레이트(96-well-plate)에 분배하고, 여기에 시험균액 (약 10⁴ CFU/ml)을 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 항균력은 2배 희석계열에서 균 성장을 완전히 저해하는 농도를 최소 생육저지농도 (MIC, minimum inhibitory concentration)로 판정하였으며, 이때 사용한 검정균주로는 스타필로코크스 오레우스(ATCC 6538p), 바실러스 서브틸리스(ATCC 6633), 마이크로코크스 루테우스(IFO 12708), 프로테우스 불가리스(ATCC 3851), 살모넬라 티피무리움(ATCC 14028), 에쉐리키아 콜리(ATCC 25922)를 사용하였다. 소란지아데노신의 최소 생육 저지 농도(MIC, ㎍/㎖)를 측정하여 하기 표 3에 나타내었다. 대조 항생물질로서는 겐타마이신(Gentamycin)을 사용하였다(표 3 참조).

세균	항균 최소 생육저지농도(MIC, ㎍/㎖)
세균	소란지아데노신 (GB03-A)	겐타마이신
스타필로코크스 오레우스	25	3.12
바실러스 스브틸리스	12.5	3.12
마이크로코크스 루테우스	6.25	6.25
프로테우스 불가리스	6.25	12.5
살모넬라 티피무리움	12.5	3.12
에쉐리키아 콜리	>100	1.56

실험결과, 소란지아데노신은 에쉐리키아 콜리를 제외한 상기의 검정균주에 대해 향균 최소 생육저지농도 6.25 내지 25 ㎍/㎖ 범위를 나타내는바, 적은 농도에서도 탁월한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

하기에 본 발명의 소란지아데노신을 함유하는 항균조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

소란지아데노신 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

소란지아데노신 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

소란지아데노신 300 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

소란지아데노신 300 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

소란지아데노신 300 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims

점액세균으로부터 분리되는 신규한 구조를 갖는 하기 일반식 (Ⅰ) 의 신규 세스퀴테르펜 아데노사이드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:

(Ⅰ)

상기 식에서,

R1 내지 R11은 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐기, 니트로기, 아민기, 히드록시기, C1-C5 저급 알콕시기, 설프하이드릴기, 설포닐기, 카르복실기, C1-C5 저급알킬 에스테르기, C1 내지 C20 알킬기, C2 내지 C20 알켄일기, 및 C2 내지 C20 알키닐기로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다.
제 1항에 있어서, 상기 일반식 (I) 화합물은 R1 내지 R11은 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐기, 히드록시기, C1-C5 저급 알콕시기, 카르복실기, C1-C3 저급알킬 에스테르기, C1 내지 C10 알킬기, C2 내지 C10 알켄일기, 또는 C2 내지 C10 알키닐기인 화합물 및 그 염.
제 1항에 있어서, 상기 일반식 (I) 화합물은 R1 내지 R11은 수소원자인 10'N- (4-eudesm-11-enyl) adenosine인 화합물 및 그 염.
제 1항의 일반식 (I) 로 표기되는 신규 구조 세스퀴테르펜 아데노사이드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 세균 감염성 질병의 치료를 위한 항균조성물.
제 4항에 있어서, 상기의 세균은 바실러스 서틸리스, 스타필로코크스 오레우스, 마이크로코크스 루테우스, 프로테우스 불가리스, 살모넬라 티피무리움 또는 에 쉐리키아 콜리인 항균조성물.
제 4항에 있어서, 상기 세균 감염성 질병은 포도상구균 식중독, 봉와직염, 노로감염증 수막염, 복막염, 방광염, 림프관염, 표저, 중이염, 호흡기 질환, 폐렴, 화농성 염증 또는 패혈증인 항균조성물.