KR19980017913A - 신규한 바실러스 속 미생물 및 이로부터 마크로락틴 a를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 24환을 갖는 마크로락틴 A와 그의 유도체를 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주와 그의 배양액을 이용하여 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 화합물 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 항균제, 항진균제, 항바이러스제 및 항암제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 마크로락틴 A를 생산하는 우리나라 토양에서 분리한 신규한 바실러스 속 미생물에 관한 것이다.

Description

신규한 바실러스 속 미생물 및 이로부터 마크로락틴 A를 제조하는 방법.

항생물질은 병원균은 죽이면서 인체 또는 동물에서는 독성이 낮고 체내의 효소 등에 의해 비활성화되지 않는 선택적 독성작용(selective toxicity)을 갖는 물질로서, 이의 작용기전은 주로 DNA의 복제, 유전정보의 전사 및 해독, 전자에너지의 수송, 세포벽의 생합성 등에 관여하여 미생물의 증식을 억제하는 것이다.

항생물질은 플레밍(Sir Alexandor Fleming)이 1929년에 페니실린을 처음 발견하고, 플로리(Flory) 등이 1939년에 페니실리움 크리소제니움(Penicillium chrysogenum)의 배양액에서 페니실린을 분리·정제한 이후 1959년까지 본격적으로 생산되면서 현재까지 치료제로 유용하게 사용되고 있는 벤질페니실린, 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 마크로라이드계의 에리트로마이신 등이 개발되었다.

이후 페니실린류가 1965년에 처음 합성 방법에 의해 개발되었고, 합성에 의해 테트라사이클린류, 리파마이신류, 리노코마이신류 등이 반합성 제제로 실용화되기 시작하였다. 또한 최근에는 세균, 진균 및 방선균 등을 배양하여 분류하고 그의 대사산물을 분리·정제하는 방법, 항생물질의 치료효과에 대한 검색방법, 그의 안전성에 대한 평가방법 및 항생물질의 심부배양방법 등의 기술이 확립되었다.

지금까지 많은 항생제가 개발되고 사용되어 왔으나, 항생제는 사용에 의해 미생물에서 내성이 생기게 되므로 계속적인 새로운 항생제의 개발이 이루어져야 한다. 또한 대부분의 항생제는 여러 개의 카이랄 중심를 가지고 있을 뿐만 아니라 마크로라이드 또는 펩타이드와 같이 복잡한 구조를 가지고 있으므로, 그 합성이 어렵고 합성방법은 발효방법과 비교하여 그 경제성이 매우 낮다. 따라서 새로운 항생제는 천연물로부터 새로운 물질 또는 그 중간산물을 발견하거나 그의 치환기를 변화시킴으로써 얻는 것이 유용하다.

브로크만(Brockmann)과 헨켈(Henkel)은 1950년에 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.)균주로부터 최초로 마크로라이드(macrolides) 항생물질을 분리하였다. 이 항생물질들은 처음에 그 특유의 쓴 맛 때문에 피크로마이신이라고 불렸으나, 이들 항생물질이 일반적으로 마크로사이클릭 락톤의 구조를 나타내므로 우드워드 등이 이들 화합물에 대해 '마크로라이드'라는 용어를 사용하였다.

마크로라이드 항생물질은 그의 항균작용 중 특히 혐기성균을 포함한 그람 양성균에 그 효과가 매우 탁월한 것으로 보고되었고, 그외에도 그람 음성균 및 마이코플라즈마에 대해서 제한적으로 그 효과가 좋은 것으로 보고되었다. 구체적으로 이들 항생물질은 그람 양성균 중에서 스태필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 디플로코커스(Diplococcus) 등에 대해 그 효능이 크고, 그람 음성균 중에서 나이세리아 고노로히아(Neisseria gonorroheae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 보르드텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 등에 대해 그 효능이 좋다. 특히 마크로라이드는 레지오넬라병 및 다른 레지오넬라에 의한 감염증에도 큰 효과를 나타내는데, 베타-락탐과 같은 세포막을 표적으로 하는 항생제와 함께 사용하는 경우 마크로라이드가 상승 작용(synergistic effect)을 나타낸다고 보고되어 있다.

마크로락틴은 거대환의 락톤의 구조는 갖으면서 특이한 활성을 나타내는 마크로라이드 화합물의 일종으로, 1989년에 미국 캘리포니아 대학에서 페니칼(Fenical) 등에 의해 처음 해양의 토양에서 얻은 균주로부터 분리하여 보고하였다. 당시 마크로락틴 화합물들이 발견된 균주는 그람 양성균인 것으로 확인되었으나 분류에 관한 다른 자료는 얻지 못하였다. 또한 본 균주는 불안정하여 보존되지 못하고 아쉽게도 소실되었다.

마크로락틴 화합물은 24개의 탄소원자를 가진 불포화지방산 락톤으로 이루어져 있으며, 지금까지 이에 속하는 6가지의 마크로락틴이 각각 마크로락틴 A, B, C, D, E, F 로 알려져 있다. 이 중 마크로락틴 A는 아글리콘(aglycon) 형태로 당류가 부착되지 않은 형태의 구조를 나타내며, 마크로락틴 B 에서 마크로락틴 F 마크로락틴 A에 치환기가 붙은 형태의 구조를 나타낸다.

마크로락틴 A는 4개의 히드록시기를 가지고 있는 불포화 지방산 락톤으로 마크로라이드계 항생물질이 가지고 있는 생리 활성, 즉 항균 효력, 항진균 효력, 항이스트 효력 등을 가질 뿐만 아니라 일반적인 불포화 지방산 들의 유도체들이 보이는 생리활성을 나타낸다. 특히 마크로락틴 A는 아라키도닉산 유도체, 프로스타글란딘 또는 류코트리엔과 유사하게 히드록시 불포화 지방산으로 흥미로운 생물학적인 특징을 나타내어, 헤르페스 심플렉스(Herpes simplex) 바이러스(제 Ⅰ형 및 제 Ⅱ형) 및 에이즈 질환과 관련된 HIV(Human Immunosuppressive Virus) 바이러스의 증식을 억제하는 작용을 가지므로 항바이러스제로서도 중요하고 면역조절 물질로 효능이 있어 그의 유도체가 신의약품으로 개발될 가능성이 매우 크다.

그러나 페니칼 등이 분리한 마크로락틴 A를 생산하는 균주가 소실된 이후, 마크로락틴 A의 복잡한 24환의 구조로 인하여 그의 화학적 합성이 어려워서 그의 약학적 및 생물학적 중요성에도 불구하고 마크로락틴에 대한 활발한 연구가 이루어지지 못하였다. 또한, 페니칼 등의 제조방법은 본 해양 미생물 배양액 16L 에서 마크로락틴 A 이 6-9mg만 분리되므로 그 수율이 매우 낮았다 (K. Gustafson, M. Roman and W. Fenical, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 7519-7524).

한편 1991년 미국 미네소타 대학의 스코트 D. 리크노브스키(Scott D. Rychnovsky)가 마크로락틴의 4부분의 화학적 입체구조를 알기 위하여 수행하였던 13C-아세토나이드 분석 방법(13C-acetonide analysis) 등에서도 마크로락틴 A는 얻지 못하고 마크로락틴 B와 마크로락틴 F를 이용하여 연구를 수행하였다 (S. D. Rychnovsky, D. J. Skalitzky, C. Pathirana, P. R. Jensen and W. Fenical, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 671-677).

이에 본 발명자들은 신규한 항생물질을 개발하기 위하여 우리나라 토양에서 다양한 균주를 수집하여 검색한 결과, 다양한 활성을 나타내는 항생물질인 마크로락틴 A를 생산하는 바실러스 속(Bacillus sp.) SNUS 9101-142 균주를 분리하고 이의 배양액으로부터 마크로락틴 A를 분리·정제함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 마크로락틴 A 및 이의 유도체를 바실러스 속 균주로부터 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

구체적으로 본 발명은 마크로락틴 A를 바실러스 속 균주의 배양 상등액을 중성수지 컬럼에 흡착시킨 다음, 다양한 농도의 알코올로 추출하여 분획을 얻고, 이를 감압 농축하여 프렙 TLC 크로마토그래피를 수행함으로써 제조한다. 또한 본 발명은 상기 과정에 더하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 다양한 비율의 클로로포름-메탄올 혼합용매로 용출시킴으로써 마크로락틴 A를 정제한다.

화학식 1

또한, 본 발명은 상기 마크로락틴 A를 생산하는 새로운 바실러스 속 균주를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명의 균주를 바실러스 속 SNUS 9101-142로 명명하고, 이를 1996년 8월 30일에 한국종균협회에 기탁하였다 (수탁번호: KFCC 10910).

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 얻은 마크로락틴 A 및 그 유도체를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 항균제, 항진균제, 항바이러스제 및 항암제 등으로 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.

구체적으로 본 발명에서 제조한 상기 마크로락틴 A는 항바이러스제로서 헤르페스 심플렉스 바이러스에 의한 질환 및 HIV에 의한 에이즈(AIDS) 질환 등의 치료제로 사용될 수 있고 항진균제로서 칸디다 감염증에 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 신규한 바실러스 속 SNUS 9101-142 균주의 주사 전자현미경 사 진을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 마크로락틴 A를 적외선 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것 이다.

도 3은 본 발명의 마크로락틴 A를 자외선 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것 이다.

도 4는 본 발명의 마크로락틴 A를 EI 질량 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것 이다.

도 5는 본 발명의 마크로락틴 A를 FAB 질량 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 마크로락틴 A를 수소 핵자기공명 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 마크로락틴 A를 탄소 핵자기공명 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 24개의 탄소원자를 갖는 마크로라이드 항생물질의 일종인 마크로락틴 화합물을 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물로부터 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 우리나라의 토양에서 탁월한 항생 효과를 나타내는 마크로락틴 A를 생산하는 바실러스 속 균주를 분리한다 (도 1참조). 본 발명의 균주를 바실러스 속 SNUS 9101-142 균주로 명명하고 이를 1996년 8월 30일에 한국종균협회에 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC 10910).

본 발명의 바실러스 속 균주로부터 본 발명의 24환 마크로락틴 화합물을 생산하기 위하여, 본 발명의 균주의 생합성 과정 및 조절 과정을 적절히 고려한 발효공정을 수행한다. 토양에서 분리한 균주가 생산하는 항생물질의 양은 균주의 배양조건과 배지의 종류에 따라 크게 달라질 수 있다. 마크로락틴 화합물은 이를 생산하는 균주를 배양한 배양액으로부터 생산되는데, 보통 밀접히 관련있는 성분들이 복합적으로 혼합된 형태로 생산된다.

본 발명은 마크로락틴 A를 생산하는데 적합한 배지인 브레인 하트 인퓨전 배지 등을 이용하여 이의 분리에 필요한 본 발명의 균주 배양액을 대량으로 얻는다. 브레인 하트 인퓨전 배지는 항균 효과 측정에 매우 적합하여 본 배지에 본 발명의 바실러스 균주를 접종한 다음 48시간이 경과한 후 항균 효과를 효과적으로 검사할 수 있다.

상기의 과정으로 얻은 균주 및 그의 배양액으로부터 본 발명의 24환 마크로락틴 A를 그의 물리화학적 성질에 의해 분리·정제할 수 있다. 상기 균주 배양액으로부터 본 발명의 마크로락틴 화합물을 먼저 HP-20 과 같은 중성 수지를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리시킨다. 이 때 물과 알코올이 다양한 비율로 섞인 혼합용매를 사용하는데 특히 물과 메탄올이 유용하다. 그 결과 얻은 마크로락틴이 포함된 분획은 여과하여 휘발시킴으로 마크로락틴 조물질(crude materials)을 제조한다.

다음 상기에서 얻은 조물질을 각 성분으로 분리하기 위하여 이를 유기용매에 녹여 페이퍼 크로마토그래피, TLC(thin-layer chromatography) 또는 HPLC 등을 사용하여 분석할 수 있다. 이 때 다양한 비율의 혼합용매를 사용하여 각 성분을 용출할 수 있는데, 바람직하게는 클로로포름-메탄올 등의 혼합용매를 사용할 수 있다.

또한 상기 과정에 더하여 각 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 역 전류 분배(counter-current distribution), 알루미나 컬럼 크로마토그래피, 이온교환 컬럼 크로마토그래피 또는 HPLC (high-performance liquid chromatography) 등을 수행하여 분석할 수 있다.

바실러스 속 균주의 배양액 및 분리과정 주의 각 분획의 항균 효과를 검색하기 위하여, 마이코박테리움 스매그마티스(Mycobacterium smaegmatis) ATCC 29213 등을 사용한 아가 확산 방법 등을 수행하여 성장 억제 영역의 직경을 측정한다.

본 발명의 바실러스 속 균주로부터 상기의 과정으로 분리·정제한 24환의 마크로락틴 A 의 물리화학적 특성은 실시예 7에 기술한 바와 같다 (표 1 및 표 2 참조).

또한 본 발명에서 제조한 마크로락틴 A의 항생물질로의 활성을 확인하기 위하여, 표 3에 나타난 바와 같이 스트렙토코커스 파이오젠스 ATCC 8668, 스트렙토코커스 파이오젠스 C 4003, 스태필로코커스 아우레우스 Smith, 스태필로코커스 아우레우스 ATCC 29213, 대장균 ATCC 10536, 대장균 ATCC 25922, 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 10031, 슈도모나스 에루기노사 GN 11189, 슈도모나스 에루기노사 ATCC 10145, 슈도모나스 에루기노사 ATCC 27853, 스트렙토코커스 페칼리스 ATCC 29212, 칸디다 알비칸스 IFM 40001, 살모네라 티피무리움 C 4045 등을 사용하여 아가 희석 방법을 수행하여 최소 생육억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정한다. 그 결과 본 발명의 마크로락틴 A는 스태필로코커스 아우레우스, 마이코박테리움 스매그마티스, 대장균 및 칸디다 알비칸스 등에 대해 탁월한 항생 효과가 있음을 확인한다.

구체적으로 본 발명에서 제조한 상기 화합물의 구조는 적외선 스펙트럼 및 수소 핵자기공명 스펙트럼을 통해 이중결합이 상당히 많고 에스터기와 하이드록시기를 가진 항생물질임을 확인할 수 있다. 또한 본 발명의 화합물의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 조사하여 본 화합물의 탄소의 수가 24개, C-O에서 연유한 탄소가 4개, 메틸기가 1개, 메틸렌기가 6개, 카르보닐기 중 에스터에서 연유한 탄소가 1개, 이중결합 탄소가 12개임을 확인할 수 있다 (도 2, 도 3, 도 6 및 도 7 참조).

또한 FAB 질량 스펙트럼을 조사하여 본 발명의 화합물이 m/z(M+H)403에서 관찰되므로 분자량이 402이고, 물 한분자가 떨어진 m/z 385, 367, 349의 신호로 인해 하이드록시기가 분자내에 3개 존재함을 확인한다. 이 모든 결과를 문헌에서 나타난 유사한 항생물질에서의 결과와 비교할 때 마크로락틴 A와 정확하게 일치함을 확인한다 (도 4 및 도 5 참조).

상기의 과정을 통해 얻은 정제물의 약제학적인 이용에서는 약제학적인 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 적절한 부형제를 사용하여 정제, 캡슐제, 산제, 액제, 현탁제, 주사제 등의 제형으로 이용될 수 있다.

물에 대한 용해도를 높이기 위하여 약학적으로 허용되는 에틸 석시네이트, 에틸 카보네이트, 글루코헵토네이트, 스테아레이트, 프로피오네이트, 에스토레이트, 락토비오네이트 등의 염을 사용하여 본 발명의 마크로락틴을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 250mg/ml의 농도로 매 6시간마다 경구로 또는 정맥 주사로 투여하여 이의 혈중 농도가 1.5μg/ml로 유지되도록 한다. 또한 본 발명의 마크로라이드 화합물의 세포 독성을 50% 치사량 (LD50)으로 나타내면 그의 값이 정맥주사의 경우 425mg/kg, 피하주사의 경우 1,849mg/kg 그리고 경구 투여의 경우 2,927mg/ml 정도로 나타난다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 토양에서 분리한 바실러스 속 균주의 배양

우리나라에서 수집한 토양으로부터 마크로락틴 A를 생산하는 신규한 바실러스 속 균주를 분리하였다. 본 발명의 균주를 바실러스 속 SNUS 9101-142 균주로 명명하고 이를 1996년 8월 30일에 한국종균협회에 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC 10910).

본 발명의 바실러스 속 미생물에서 생산된 마크로락틴 A를 얻기 위하여, 본 발명의 균주를 V8 아가 배지(V-8 쥬스 200ml, CaCO3 3.0g, 아가 20.0g, 증류수 800ml)에 배양하였다. 배양한 바실러스 속 균주의 균사체를 멸균한 산적꽂이로 취하여 50ml의 브레인 하트 인퓨전(brain heart infusion) 배지에 접종한 다음, 28℃에서 180rpm 으로 2일 동안 종균 배양하였다. 2L의 삼각 플라스크에 브레인 하트 인퓨전 배지(37g/L, 디프코)를 500ml을 넣어 멸균시킨 다음 상기 종균 배양액을 50ml 넣어 28℃에서 180rpm 으로 5일간 배양하였다. 이와 같은 방법으로 총 5L의 배양액을 얻어 그 배양액을 J-2 원심분리기를 이용하여 균사체를 걸러내고 그의 상층액만을 분리하였다.

실시예 2 항균 효과의 검색

본 발명의 바실러스 속 균주 및 그의 배양액의 항균 효과를 검색하기 위하여, 마이코박테리움 스매그마티스 (Mycobacterium smaegmatis) ATCC 29213을 사용하였다. 항균 효과를 조사하기 위한 아가판을 마이코박테리움 스매그마티스 ATCC 29213 균주의 현탁액을 영양 아가 배지에 가한 다음, 이를 20ml씩 취하여 일회용 페트리 디쉬에 부어 판을 굳혀 사용하였다.

다음 항균 효과를 조사하기 위한 6.3mm 직경의 종이 디스크에 30μl씩 시료를 적신 다음, 완전히 말리고 마이코박테리움 스매그마티스가 함유된 플레이트의 위에 이를 얹었다. 이를 4℃에서 30분간 방치하여 확산시킨 다음 28℃에서 16시간 이상 배양하여 성장 억제 영역의 직경을 측정하였다.

실시예 3 HP-20을 통한 화학식 1 화합물의 분리

상기 실시예 1에서 얻은 배양 상등액으로부터 마크로락틴 A를 분리하기 위하여, 상기 5L의 배양 상등액을 Diaion HP-20 수지를 1L 채운 유기관(직경 10cm)에 통과시켜 흡착시켰다. 상기 용액을 모두 받아낸 다음 증류수 1L로 컬럼을 씻고, 물에 대한 메탄올의 비율을 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% 로 바꾸어가며 혼합용매를 각각 1L 씩 흘려주었다. 다음 아세톤을 2L를 더 흘려준 후 각 분획을 30 μl 씩을 취하여 마이코박테리움 스매그마티스에 대한 항균 효과를 조사하였다.

그 결과, 80, 90, 100% 의 메탄올에서 항균 활성이 나타남을 확인하고 그 분획을 분리하였다. 이 중 100% 메탄올의 분획은 전부 감압 증발시켜 시료를 500mg 얻었고, 이를 사용하여 TLC 크로마토그래피를 수행한 결과 3개의 스폿(spot)을 확인할 수 있었다.

실시예 4 프렙 TLC 크로마토그래피를 통한 화학식 1 화합물의 분리

상기 실시예 3에서 얻은 시료를 정제하기 위하여, 다시 프렙 TLC 크로마토그래피를 수행하였다. 시료 500mg을 이용하여 머크사의 F254 실리카젤 TLC 플레이트에 각 플레이트 당 30mg 씩 로딩하고 이를 전개시켰다. 이 때 전개용매로는 클로로포름-메탄올(250 : 25)을 올리고 전개된 각 부분은 칼로 긁어 클로로포름에 녹였다. 그 결과 항균 활성을 나타내는 부분인 2번째 스폿을 얻었다. 이 때 얻은 항균물질의 양은 72.3mg 이었다.

실시예 5 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통한 화학식 1 화합물의 분리· 정제

본 발명의 마크로락틴 A을 순수하게 분리·정제하기 위하여, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 클로로포름을 용매로 사용하여 실리카겔을 5×10cm 컬럼에 충전시킨 다음, 상기에서 얻은 본 발명의 항생물질 30mg을 같은 용매를 사용하여 현탁시키고 이를 컬럼에 흡착시켰다. 여기에 클로로포름-메탄올 1%, 2%, 4%, 8% (메탄올의 양)인 혼합용매를 각각 50ml 씩 흘려주어 시험관에 각 분획을 받았고 각 분획은 TLC로 확인하였다. 또한 각 분획으로 활성화 시험을 수행하였다. 그 결과 항생물질을 10, 11, 13번 분획에서 15mg 및 12번 분획에서 12mg을 얻었고, 12번 분획은 본 발명의 마크로락틴 A임을 확인되었다.

실시예 6 화학식 1 화합물을 생산하는 바실러스 속 균주의 전자현미경 관찰

본 발명의 마크로락틴 A를 생산하는 토양에서 분리한 균주를 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM)으로 관찰하였다. 그 결과 본 발명의 균주는 바실러스 속(Bacillus spp.)의 한 균주임을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

실시예 7 화학식 1 화합물의 물리화학적 구조 분석

우리나라 토양에서 분리한 바실러스 속 균주 배양액에서 정제한 화학식 1로 표시되는 본 발명의 마크로락틴 A의 물리화학적 구조를 분석한 결과를 표 1 및 표 2에 나타냈다.

구체적으로 본 발명의 화합물의 구조를 적외선 스펙트럼으로 살펴보면 3400-3200 cm-1 에서 하이드록실기에서 유래한 O-H 스트레칭 흡수띠가 관찰되고, 1695, 1680, 1650 cm-1 에서는 각각 에스터기와 올레핀의 작용기가 관찰되었다. 또한 이의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 살펴보면 5.4-7.7 ppm 에서 이중결합에 의한 양성자 신호가 나타나며, 탄소와 산소 같은 헤테로 원자와의 결합에서 나타나는 특징적인 화학적 이동값 및 메틸기에서 유래한 신호 등을 관찰할 수 있었다. 그리고 각각의 피크 적분값을 통해 수소의 수가 최대 40개를 넘지 못하고 알데히드나 아로마틱에서 연유한 양성자 신호는 없음을 알 수 있다. 그 결과, 본 발명의 화합물은 이중결합이 상당히 많고 에스터기와 하이드록시기를 가진 항생물질임을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명의 화합물의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 조사하여, 29,899 ppm에서의 신호가 불순물이고 탄소의 수가 24개임을 확인하였다. 그 결과 본 발명의 화합물은 탄소의 수가 24개, C-O에서 연유한 탄소가 4개, 메틸기가 1개, 메틸렌기가 6개, 카르보닐기 중 에스터에서 연유한 탄소가 1개, 이중결합 탄소가 12개임을 확인할 수 있었다.

또한 FAB 질량 스펙트럼을 조사하여 본 발명의 화합물이 m/z(M+H)403 에서 관찰되므로 분자량이 402인 것을 확인하고, 물 한분자가 떨어진 m/z 385, 367, 349의 신호로 인해 하이드록시기가 분자내에 3개 존재함을 알 수 있었다. 그 결과를 문헌에서 나타난 유사한 항생물질에서의 결과와 비교할 때 마크로락틴 A와 정확하게 일치함을 알 수 있었다.

13C NMR 결과의 비교

위치△δ	마크로락틴, δ(ppm)	본 발명의 시료, δ(ppm)
	A(pyr d5)	F(CDCl3)	CDCl3
1	166.3	166.3	166.308	-0.008
2	117.8	117.8	118.308	-0.257
3	143.7	143.2	142.749	0.451
4	129.4	128.7	129.800	-1.1
5	142.4	139.4	139.439	-0.039
6	43.8	41.2	40.820	0.38
7	71.2	71.3	70.931	0.369
8	138.3	136.2	136.003	0.197
9	124.9	125.3	124.921	0.379
10	130.6	130.8	130.356	0.444
11	128.6	127.3	127.551	-0.251
12	36.7	35.1	35.437	-0.337
13	68.8	67.9	69.602	-1.702
14	43.9	43.8	41.523	2.277
15	69.2		70.381	-1.181
16	136.6		135.013	0.518
17	131.2		130.682	1.587
18	129.6		129.916	-0.316
19	133.7	131.0	132.821	-1.821
20	32.3	31.9	32.030	-0.13
21	25.0	24.9	24.412	0.488
22	35.3	34.7	35.029	-0.329
23	70.8	70.8	71.265	-0.465
24	19.9	20.0	19.922	0.078
* △δ는 마크로락틴 A의 화학적 이동에서 본 발명의 시료의 화학적 이동을 뺀 값임.* 15, 16, 17, 18번은 pyr d5의 값을 취했음.

1H NMR 결과의 비교

위치△δ	마크로락틴, δ(ppm)	본 발명의 시료, δ(ppm)
	A(C6D6)	F(CDCl3)	CDCl3
2	5.68(d, 11.2)	5.59(d, 11.5)	5.5899(d, 11.34)	0.0001
3	6.29(dd, 11.2, 11.5)	6.54(dd, 11.2, 11.5)	6.5308	0.0092
4	7.48(dd, 11.5, 14.9)	7.29(dd, 11.2, 15.1)	7.2138(dd, 11.94, 17.88)	0.0717
5	5.85(ddd, 7.2, 7.2, 14.9)	6.06(dt, 7.6, 15.1)	6.0407	0.0193
6	2.30(m), 2.35(m)	2.48(m)	2.7417	-0.2627
7	4.14(m)	4.34(dt, 5.8, 6.1)	4.5114(dt, 5.281)	-0.1714
8	5.58(dd, 4.7, 15.0)	5.77(dd, 6.1, 15.1)	5.6169(dd, 6.54, 14.34)	0.1531
9	6.73(dd, 11.2, 15.0)	6.49(dd, 11.2, 15.1)	6.5406(dd, 11.7)	-0.0506
10	6.04(dd, 11.2, 15.0)	6.14(dd, 11.2, 15.1)	6.1026(dd, 11.28)	0.0374
11	5.42(m)	5.51(dt, 8.3, 10.8)	5.5144(dt, 9.54, 8.7)	-0.0044
12	2.43(m), 2.70(m)	2.46(m)	2.4218(dd, 7.08, 15.31)	0.0384
13	4.03(m)	4.06(m)	3.9796	0.0804
14	1.74(m), 1.83(m)	2.53(dd, 7.6, 17.0)	2.4719(dd, 7.26, 15.48)	0.0981
15	4.62(m)		4.3328	0.2872
16	5.70	2.43(m)	5.9244(dd, 8.64, 14.22)	-0.2244
17	6.35(dd, 10.6, 15.3)	2.26(m)	6.1748(dd, 10.44, 15.06)	0.1752
18	6.08(dd, 10.6, 14.8)	5.39	6.0180(dd, 10.56, 14.82)	0.062
19	5.70	5.41	5.7673	-0.0673
20	1.91(m), 2.06(m)	1.93(m), 2.01(m)	2.0971, 2.1641	-0.1541,-0.1671
21	1.32(m)	1.45(m)	1.4912	-0.0412
22	1.32(m), 1.49(m)	1.40(m), 1.63(m)	1.5638, 1.6387	-0.1638, -0.0087
23	5.10(m)	5.00(m)	5.0340	-0.034
24	1.09(d, 6.5)	1.25(d, 6.1)	1.268(d, 6.36)	-0.018
* △δ는 마크로락틴 A의 화학적 이동에서 본 발명의 시료의 화학적 이동을 뺀 값임.

실시예 8 화학식 1 화합물의 항균 효과

본 발명의 화학식 1로 표시되는 24환 마크로라이드 화합물의 항균효과를 아가 희석 방법(agar dilution method)으로 최소 생육억제 농도를 측정함으로써 조사하여 표 3에 나타내었다.

화학식 1로 표시되는 24환 마크로라이드 화합물의 항균 효과

시험 균주	최소 생육억제 농도(MIC, μg/ml)
Streptococcus pyogenes ATCC 8668	2.5
Streptococcus pyogenes C 4003	2.5
Staphylococcus aureus Smith	12.5
Mycobacterium smaegmatis ATCC 29213	2.5
Escherichia coli ATCC 10536	2.5
Escherichia coli ATCC 25922	2.5
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031	100
Pseudomonas aeruginosa GN 11189	100
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145	100
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	100
Streptococcus faecalis ATCC 29212	100
Candida albicans IFM 40001	10.0
Salmonella typhimurium C 4045	100
* 최소 생육억제 농도는 Mueller-Hinton 아가(디프코사 제품)를 이용한 아가희석 방법에 의해 측정하였다.

본 발명의 제조방법은 마크로락틴 A를 바실러스 속 KSM 9101-113 균주로부터 용이하게 얻을 수 있으므로, 기존의 해양미생물이 소실되고 24환의 특성상 화학적 합성이 어려운 본 마크로락틴 A를 다량으로 생산하기에 매우 유용하다.

본 발명에서 제조한 마크로락틴 A는 기존의 마크로라이드 화합물과 동일한 항균 효과에 더불어 칸디다 알비칸스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 에이즈 질환과 관련있는 HIV 바이러스 등에 대해서 탁월한 효과가 있으므로, 대량 생산되면 항균제 뿐만 아니라 항진균제, 항바이러스제 및 항암제 등으로 널리 이용될 수 있다. 또한 마크로락틴 A는 24개의 탄소원자를 갖는 아글리콘으로 이를 이용하면 다양한 유도체를 합성할 수 있슴으로써 더욱 우수한 항생물질의 개발을 기대할 수 있다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 마크로락틴 A 및 이의 유도체를 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주로부터 제조하는 방법에 관한 것이다.

화학식 1

또한, 본 발명은 상기 마크로락틴 A를 생산하는 우리나라 토양에서 분리한 신규한 바실러스 속 미생물에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 24환의 락톤 구조를 갖는 마크로락틴 A를 토양에서 분리한 바실러스 속 균주로부터 용이하게 분리·정제하는 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 마크로락틴 A는 항생물질로서의 그 효능이 탁월하므로 항균제, 헝진균제, 항바이러스제 및 항암제 등으로 널리 사용될 수 있다.

Claims (6)

1. 토양에서 분리한 바실러스 속 미생물의 배양 상등액을 중성수지 컬럼에 흡착시킨 다음, 다양한 농도의 알코올로 추출하여 분획을 얻고, 이를 감압 농축하여 프렙 TLC 크로마토그래피를 수행하는 마크로락틴 A의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 과정에 더하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 다양한 비율의 클로로포름-메탄올 혼합용매로 용출시킴으로써 정제하는 마크로락틴 A의 제조방법.
3. 마크로락틴 A를 생산하는 신규한 바실러스 속 SNUS 9101-142 균주 (수탁번호 : KFCC 10910).
4. 제 1항 또는 제 2항에서 제조한 마크로락틴 A 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 항균제용 약학적 조성물.
5. 제 1항 또는 제 2항에서 제조한 마크로락틴 A 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 항생제용 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 항생제는 항균제, 항진균제, 항바이러스제 및 항암제인 것을 특징으로 하는 항생제용 약학적 조성물.