KR19980017911A - 신규한 스트렙토마이세스 속 미생물, 이로부터 제조되는 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규한 14환 마크로라이드(macrolide) 아글리콘 화합물인 8-디옥시랑코라이드(8-deoxylankolide)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주 및 그의 배양액으로부터 화학식 1로 표시되는 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물인 8-디옥시 랑코라이드를 제조하는 방법 및 본 발명의 화합물을 항생물질인 랑카마이신을 생합성하는데 중간물질로 사용하는 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 8-디옥시 랑코라이드를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)미생물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 8-디옥시 랑코라이드를 유효성분으로 하는 항생제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 스트렙토마이세스 속 미생물, 이로부터 제조되는 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘 및 이의 제조방법

항생물질은 병원균은 죽이면서 인체 또는 동물에서는 독성이 낮고 체내의 효소 등에 의해 비활성화되지 않는 선택적 독성작용(selective toxicity)을 갖는 물질로서, 이의 작용기전은 주로 DNA의 복제, 유전정보의 전사 및 해독, 전자에너지의 수송, 세포벽의 생합성 등에 관여하여 미생물의 증식을 억제하는 것이다.

항생물질은 플레밍(Sir Alexandor Fleming)이 1929년에 페니실린을 처음 발견하고, 플로리(Flory) 등이 1939년에 페니실리움 크리소제니움(Penicillium chrysogenum)의 배양액에서 페니실린을 분리·정제한 이후 1959년까지 본격적으로 생산되면서 현재까지 치료제로 유용하게 사용되고 있는 벤질페니실린, 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 마크로라이드계의 에리트로마이신 등이 개발되었다.

이후 페니실린류가 1965년에 처음 합성 방법에 의해 개발되었고, 합성에 의해 테트라사이클린류, 리파마이신류, 리노코마이신류 등이 반합성 제제로 실용화되기 시작하였다. 또한 최근에는 세균, 진균 및 방선균 등을 배양하여 분류하고 그의 대사산물을 분리·정제하는 방법, 항생물질의 치료효과에 대한 검색방법, 그의 안전성에 대한 평가방법 및 항생물질의 심부배양방법 등의 기술이 확립되었다.

지금까지 많은 항생제가 개발되고 사용되어 왔으나, 항생제는 사용에 의해 미생물에서 내성이 생기게 되므로 계속적인 새로운 항생제의 개발이 이루어져야 한다. 또한 대부분의 항생제는 여러 개의 카이랄 센터를 가지고 있을 뿐만 아니라 마크로라이드 또는 펩타이드와 같이 복잡한 구조를 가지고 있으므로, 그 합성이 어렵고 합성방법은 발효방법과 비교하여 그 경제성이 매우 낮다. 따라서 새로운 항생제는 천연물로부터 새로운 물질 또는 그 중간산물을 발견하거나 그의 치환기를 변화시킴으로써 얻는 것이 유용하다.

브로크만(Brockmann)과 헨켈(Henkel)은 1950년에 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.) 균주로부터 최초로 마크로라이드(macrolides) 항생물질을 분리하였다. 이 항생물질들은 처음에 그 특유의 쓴 맛 때문에 피크로마이신이라고 불렸으나, 이들 항생물질이 일반적으로 마크로사이클릭 락톤의 구조를 나타내므로 우드워드 등이 이들 화합물에 대해 '마크로라이드'라는 용어를 사용하였다.

마크로라이드 항생물질은 그의 항균작용 중 특히 혐기성균을 포함한 그람 양성균에 그 효과가 매우 탁월한 것으로 보고되었고, 그외에도 그람 음성균 및 마이코플라즈마에 대해서 제한적으로 그 효과가 좋은 것으로 보고되었다. 구체적으로 이들 항생물질은 그람 양성균 중에서 스태필로코커스(Staphilococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 디플로코커스(Diplococcus) 등에 대해 그 효능이 크고, 그람 음성균 중에서 나이세리아 고노로히아(Neisseria gonorroheae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 보르드텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 등에 대해 그 효능이 좋다. 특히 마크로라이드는 레지오넬라병 및 다른 레지오넬라에 의한 감염증에도 큰 효과를 나타내는데, 베타-락탐과 같은 세포막을 표적으로 하는 항생제와 함께 사용하는 경우 마크로라이드가 상승 작용(synergistic effect)을 나타낸다고 보고되어 있다.

피크로마이신이 처음 발견된 이후, 1982년까지 90종 이상의 마크로라이드 항생물질이 토양 방선균(Actinomycetes)으로부터 분리되어 그들의 화학구조가 규명되었다. 실제로 현재까지 생산된 전 마크로라이드 항생물질 중 절반 이상이 방선균인 스트렙토마이세타시아(Streptomycetaceae)에서 생산된다. 또한 마크로라이드 화합물은 다양한 균주에서 생산된 대사산물 또는 중간산물로부터 생합성이 가능할 뿐만 아니라 화학적 구조변화에 의해서 그의 다양한 유도체도 얻을 수 있다.

화학적으로 마크로라이드 화합물은 아글리콘(aglycon)의 락톤 고리의 크기에 따라 12환, 14환, 16환 및 그 이상 크기의 마크로라이드로 분류되는데, 이들 마크로라이드에는 대부분 아미노 당 및/또는 중성 당이 함유된다. 토양에서 분리한 대표적인 마크로라이드 항생물질에 대해 살펴보면 다음과 같다.

스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) M-2140 균주에서 생산된 메티마이신이 12환 마크로라이드로서 최초로 구조가 결정된 이후, 지금까지 12환 마크로라이드로는 몇몇의 화합물이 보고되었다. 14환 마크로라이드는 지금까지 20여개의 화합물이 보고되어 있으며, 실제로 14환 마크로라이드 중 에리트로마이신(erythromycin)과 오랜도마이신(oleandomycin) 등이 현재 의학과 수의학 분야에서 널리 사용되고 있다. 특히 에리트로마이신은 마크로라이드 항생제 중에서 가장 많이 연구된 물질로서, 에리트로마이신 F 등이 에리트로마이신 A, B, C, D 와 함께 스트렙토마이세스 에리트라우스(Streptomyces erythraeus) 균주로부터 생산된다. 또한 방선균이외의 아트로박터 속(Arthrobacter sp.) 균주에서도 에리트로마이신 A가 제조되어 특허를 받았다. 마이크로모노스포라 속 (Micromonospora sp.) 균주에서도 메가로미신(megalomicins) A, B, C1, C2 등이 제조되었다.

16환 마크로라이드 중에서 카르보마이신 A가 최초로 분리된 이후, 1982년까지 16환 마크로라이드에 속하는 71개의 화합물이 분리되고 그의 구조가 결정되었다. 오무라 등이 카르보마이신 A 와 스피라마이신(spiramycin) Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 구조를 각각 제안한 이후 그 구조가 수정되어 결정되었다. 또한 오무라 등이 류코마이신 복합체를 각각의 구성성분(A1, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, U 및 V)으로 분리하고 그들의 구조를 결정하였다. 이러한 마크로라이드에 관한 화학적 연구를 통해 일본등에서 새로운 마크로라이드 항생물질의 개발이 활발히 이루어졌다. 그 결과, 1970년부터 1980년까지 미데카마이신, 플라테노마이신, 마리도마이신, 쥬베니미신(juvenimicin), M-4365 시리즈, 델타마이신 및 마이시나미신(mycinamicin) 등을 포함한 다양한 화합물들이 발견되어 분리되었다.

실질적으로 마크로라이드 화합물은 생체 독성이 매우 낮으면서 상기에서 언급한 다양한 활성을 나타내므로 유용하게 사용되고 있다. 그 예로 에리트로마이신, 올랜도마이신, 류코마이신(키타사마이신), 스피라마이신, 요사마이신(류코마이신 A3) 및 미데카마이신 등은 인체 및 가축에 의학적으로 사용되고 있으며 틸로신(tylosin)은 가축 및 식품의 보존에 사용되고 있다. 또한 최근에 개발된 로사미신, 주베니미신, 마이시나미신 및 M-4365 시리즈 등은 현재 사용되고 있는 마크로라이드보다 항생제로서의 효과가 좋은데, 특히 로사미신은 에리트로마이신, 메갈로미신 이상으로 그람 양성균에 좋은 효과를 나타내고 그 외에 마이코플라즈마 및 다른 혐기성균 등에서도 효과가 좋은 것으로 보고되어 있다.

랑카마이신은 14환의 마크로라이드로서 1960년에 스트렙토마이세스 비오라세오니저( Streptomyces violaceoniger )로부터 처음 분리되고, 1970년에 핵자기공명( NMR )스펙트럼 분석을 통해 그 구조가 밝혀진 항생물질이다. NMR 분석결과를 통해 볼 때 랑카마이신은 에리트로마이신과 동일한 구조(conformation)를 지니며 이를 생산하는 미생물의 배양액에서 이와 함께 i)3'-디-Ο-메틸-2',3'-언하이드로 랑카마이신, ⅱ)15-디옥시-15-옥소 랑카마이신, ⅲ)15-Ο-(α-L-4-Ο-아세틸라카노실)랑카마이신이 확인된 것을 마틴(Martin) 등이 보고한 바 있다.

랑카마이신은 에리트로마이신과 유사하게 탄소 14개로 이루어진 락톤 고리를 가지며 그의 아글리콘 구조가 특히 에리트로마이신과 유사하다. 구체적으로 랑카마이신과 에리트로마이신은 아글리콘 구조에서는 유사하나 당이 랑카마이신은 중성이고 에리트로마이신은 염기성이다. 따라서 랑카마이신의 생합성 과정이 상세히 알려지지는 않았으나 에리트로마이신의 생합성 과정과 거의 동일하게 합성될 것으로 보인다.

에리트로마이신의 경우 하이드록시기가 많은 아글리콘 사슬이 6개의 2-메틸말로닐 CoAs 와 1개의 프로피오닐 CoA 로부터 만들어지고, 9번 탄소의 케토기는 히드록시기로 전환되지 않지만 7번 탄소의 하이드록시기는 물이 빠지고 포화된다. 에리트로놀리드 B에서의 6번 탄소의 히드록시기는 직접 산소로부터 형성되는 것으로 알려져 있다. 실제로 6-디옥시에리트로놀리드 B가 스트렙토마이세스 에리트레우스( Streptomyces erythreus )의 돌연변이 균주의 배양액에서 분리되고 정상적인 에리트로마이신을 생산하는 균주를 스테롤의 생합성시 NADPH 특이 리덕타제 억제자인 3β-[2-(디메틸아미노)에톡시]안드로스트-5-엔-17-온과 함께 배양할 때 본 균주는 배양액으로 6-디옥시에리트로놀리드 B를 배출한다.

상기 결과 및 몇몇 연구 결과를 통해 S. 에리트레우스 안의 C6-에리트로놀리드 하이드록시라제 시스템이 시토크롬 P450 및 NADPH-의존성 효소임을 결론지을 수 있다. 따라서 랑카마이신이 합성되기 위해서는 8-디옥시랑코라이드가 처음에 형성되어 산소에 의해 랑코라이드로 산화된 다음 랑카마이신으로 전환된다는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 새로운 생화학 물질을 스크리닝하는 중에, 토양 샘플로부터 14환 마크로라이드인 랑카마이신과 랑카시딘 C를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) SNUS 9011-300 균주를 분리하고, 발효액의 추출물을 실험하면서 신규의 14환 마크로라이드 아글리콘인 8-디옥시 랑코라이드를 분리·정제하여 그의 구조를 밝히고 이 물질이 랑카마이신을 생합성하는데 중간물질로 사용되는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 화학식 1의 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘인 8-디옥시 랑코라이드를 제공함에 그 목적이 있다.

화학식 1

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속 균주를 이용하여 화학식 1로 표시되는 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘을 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기 14환 마크로라이드 아글리콘을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 균주를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명의 균주를 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-300으로 명명하고, 이를 1996년 8월 30일에 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호:KFCC 10912).

또한, 본 발명은 상기 14환 마크로라이드 아글리콘이 14환 마크로라이드 항생물질인 랑카마이신의 생합성을 위한 중간물질로 사용되는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 14환 마크로라이드 아글리콘을 유효성분으로 하는 항생제용 약학적 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명의 8-디옥시 랑코라이드를 수소 핵자기공명 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 8-디옥시 랑코라이드를 탄소 핵자기공명 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 8-디옥시 랑코라이드를 FAB 질량 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 화학식 1의 새로운 14환의 마크로라이드 항생물질의 아글리콘을 우리나라 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 속 균주로부터 분리한다.

구체적으로 본 발명은 우리나라의 토양에서 다양한 균주를 분리한 다음 그 중에서 항균 효과가 탁월한 신규 마크로라이드 화합물을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주를 분리한다. 본 발명의 새로운 14환의 마크로라이드 항생물질의 아글리콘을 생산하는 균주를 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-300 균주로 명명하고 이를 1996년 8월 30일에 한국종균협회에 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC 10912).

본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주는 본 발명의 신규한 14환의 마크로라이드 항생물질의 아글리콘인 8-디옥시랑코라이드(8-deoxylankolide)와 더불어 14환의 마크로라이드 항생물질인 랑카마이신(lankamycin) 및 이의 아글리콘인 랑카시딘 C를 생산한다.

상기에서 분리한 균주로부터 본 발명의 새로운 14환의 마크로라이드 항생물질의 아글리콘을 생산하기 위하여, 본 발명의 균주의 생합성 과정 및 조절 과정을 적절히 고려한 발효공정을 수행한다. 마크로라이드 항생물질 및 이의 아글리콘은 이를 생산하는 균주를 배양한 배양액으로부터 얻을 수 있는데, 보통 밀접히 관련있는 성분들이 복합적으로 혼합된 형태로 생산된다.

본 발명의 균주를 V-8 배지 또는 트립틱 소이 액체 배지(tryptic soy broth) 등에 배양한 다음, 마크로라이드 생산에 적합한 배지 등으로 옮겨 계속 배양한다. 마크로라이드 생산에 적합한 배지에는 탄수화물 및 질소의 공급원으로 천천히 사용될 수 있는 녹말, 덱스트린, 소이빈 밀, 옥수수액, 파마메디아 등이 포함되면 바람직하다.

본 발명의 균주를 배양할 때 질소 대사 및 탄수화물 대사를 조절하는 것이 발효 효율에 중요한데, 실제로 오무라(Omura) 등이 질소를 억제한 발효(nitrogen depressed fermentation)에 의해 마크로라이드 생산에 효율적임을 보고하였다. 또한 류코마이신은 질소를 제거하는 인산 마그네슘 또는 제오라이트(zeolite)를 가함에 의해 그의 생산이 증진되는 것으로 알려져 있다. 또한, 칼슘 이온은 델타마이신 (deltamycin)생산에 필수적이며, 소량의 Co(NO3)2, ZnCl2, (NH4)2Mo7O24 및 MnCl2 등도 스피라마이신의 수율을 증진시킨다고 보고되었다.

상기의 과정으로 생산된 마크로라이드 항생물질의 14환 아글리콘은 그의 물리화학적 성질에 의해 분리·정제할 수 있다. 본 발명의 균주가 생산하는 마크로라이드 항생물질의 아글리콘이 분비되는 균주 배양액은 적절한 pH로 맞추어져야 하고, 이 때 pH 9.0 이하가 바람직하다.

상기 균주 배양액으로부터 본 발명의 마크로라이드 아글리콘을 적절한 유기용매를 사용하여 추출할 수 있다. 이 때 유기 용매로는 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 메틸렌 아세테이트, 클로로포름 등을 사용할 수 있다. 그 결과 얻은 추출물은 조물질(crude materials)을 제조하기 위해 휘발시킨다.

상기에서 얻은 조물질로부터 각 성분을 분리하기 위하여 역 전류 분배(counter-current distribution), 알루미나 칼럼 크로마토그래피, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및/또는 이온교환 칼럼 크로마토그래피 또는 HPLC (high-performance liquid chromatography) 등을 수행할 수 있다. 또한 각 성분을 페이퍼 크로마토그래피, TLC(thin-layer chromatography) 또는 HPLC를 사용하여 분석할 수 있다.

스트렙토마이세스 속 균주의 배양액 및 분리 과정 중의 각 분획의 항균 효과를 검색하기 위하여, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) ATCC 6633 등을 사용한 아가 확산 방법 등을 수행하여 성장 억제영역의 직경을 측정한다.

상기의 과정을 통해 분리·정제한 신규한 14환의 마크로라이드 항생물질의 아글리콘의 물리화학적 특성은 실시예 4에 나타난 바와 같다.

특히 상기의 과정을 통해 분리상기 과정을 통해 분리·정제한 신규한 14환의 마크로라이드 항생물질의 아글리콘의 화학적 구조를 분석하기 위하여 여러 가지 분광학적인 자료를 얻는다. 우선 FAB 질량 스펙트럼을 분석하여 본 화합물이 m/z (M+H)+431.5919에서 관측되므로 분자량이 431인 것을 알 수 있다. 적외선 스펙트럼에서는 3400cm-1 에서 하이드록실기에서 연유한 -OH 스트레칭 흡수띠가 관찰되고 1740cm-1 에서 케톤에서 유래되는 -C=O 스트레칭 흡수띠가 관찰된다. 1H-NMR 스펙트럼과 13C-NMR 스펙트럼을 통하여 화합물의 특징적인 구조를 추정할 수 있다. 이러한 자료들은 실시예 4에 나타내었다.

또한 본 발명의 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물의 항생물질로의 활성을 확인하기 위하여, 표 2에 나타난 바와 같이 바실러스 섭틸리스 ATCC 6633, 스트렙토코커스 파이오젠스 C 4003, 스태필로코커스 아우레우스 Smith, 마이코박테리움 스매그마티스 ATCC 29213, 대장균 ATCC 10536, 대장균 ATCC 25922, 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 10031, 슈도모나스 에루기노사 GN 11189, 슈도모나스 에루기노사 ATCC 10145, 슈도모나스 에루기노사 ATCC 27853, 스트렙토코커스 페칼리스 ATCC 29212, 살모네라 티피무리움 C 4045 등을 사용하여 아가 희석 방법을 수행하여 최소 생육억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정한다. 그 결과 본 발명의 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물은 대체로 항균효과가 크지만, 특히 바실러스 섭틸리스, 스트렙토코커스 파이오젠스, 마이코박테리움 스매그마티스 균주에 대해 우수한 항균 효과가 있음을 확인한다.

상기의 과정을 통해 얻은 정제물의 약제학적인 이용에서는 약제학적인 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 적절한 부형제를 사용하여 정제, 캡슐제, 산제, 액제, 현탁제, 주사제 등의 제형으로 이용될 수 있다.

물에 대한 용해도를 높이기 위하여 약학적으로 허용되는 에틸 석시네이트, 에틸 카보네이트, 글루코헵토네이트, 스테아레이트, 프로피오네이트, 에스토레이트, 락토비오네이트 등의 염을 사용하여 본 발명의 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 250mg/ml의 농도로 매 6시간마다 경구로 또는 정맥 주사로 투여하여 이의 혈중 농도가 1.5μg/ml로 유지되도록 한다. 또한 본 발명의 마크로라이드 화합물의 세포 독성을 50% 치사량 (LD50)으로 나타내면 정맥주사의 경우 425mg/kg, 피하주사의 경우 1849mg/kg 그리고 경구 투여의 경우 2927mg/ml 정도로 나타난다.

또한 본 발명의 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물의 항생물질로의 항균효과를 랑카마이신의 항균효과와 비교하여 랑카마이신에 비하여 3/4 정도의 항균효력을 가지고 있음을 확인한다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 토양균에서 분리한 스트렙토마이세스 속 균주의 배양

우리나라에서 수집한 토양으로부터 새로운 14환 마크로라이드 아글리콘을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주를 분리한다. 이를 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-300 균주로 명명하고, 한국종균협회에 1996년 8월 30일에 기탁하였다(수탁번호: KFCC 10912).

본 발명의 스트렙토마이세스 속 미생물에서 생산된 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘을 얻기 위하여 본 균주를 V-8 아가배지(V-8 쥬스 200ml, 탄산칼슘(CaCO3) 3.0g, 아가 20.0g, 증류수 800ml)에 배양하였다. 배양한 스트렙토마이세스 속 균주의 균사체를 백금니로 취해 50ml의 배지(글리세롤 2.0%, 소이빈 밀 2.0%, 염화나트륨 0.3% )가 들어 있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하여 28℃, 180 rpm에서 2일간 진탕배양하였다. 다시 균주 배양액을 13L의 배지(글리세롤 2.0%, 소이빈 밀 2.0%, 염화나트륨 0.3% )가 담긴 발효조에 옮기고 28℃, 200 rpm에서 10L/분의 속도로 공기를 공급하면서 4일간 배양하여 배양액 13L를 얻었다.

실시예 2 항균 효과의 검색

스트렙토 마이세스 속 균주 배양액의 항균 효과를 검색하기 위하여, 바실러스 섭틸리스( Bacillus subtilis ) ATCC 6633 균주를 사용하였다. 바실러스 섭틸리스에 대한 항균 효과를 조사하기 위한 아가판은 다음과 같이 제조하였다. 바실러스 섭틸리스 ATCC 6633 균주의 포자 현탁액을 영양 아가 배지( 펩톤 5.0g, 비프 추출액 3.0g, 증류수 1.0L, 아가 15.0g )에 0.2% (v/v) 부피가 되도록 가한 다음, 20ml 씩 취하여 일회용 페트리 접시( petri dish )에 판을 굳혀 사용하였다. B. 섭틸리스의 포자 현탁액은 영양 배지( 펩톤 5.0g, 비프 추출액 3.0g, 증류수 1.0L )에 B. 섭틸리스를 접종하여 포자가 충분히 형성되도록 배양한 다음, 멸균 증류수에 현탁시키고 밀봉하였다. 여기에 질소를 주입하여 냉장고에 보관하였다.

항균 효과를 조사하기 위한 직경 6.3mm의 종이 디스크에 30㎕ 씩 시료를 적신 다음 완전히 말리고 B. 섭틸리스가 함유된 플레이트 위에 이를 얹었다. 이를 4℃에서 30분간 방치하여 확산시킨 다음 28℃에서 16시간 이상 배양하여 성장 억제영역의 직경을 측정하였다.

실시예 3 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 이용한 8-디옥시랑코라이드의 분리 ·정제

우리나라의 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-300 배양액을 12,000rpm 에서 10분간 원심분리하여 균사체를 제거하고 배양 상등액을 13L 얻었다. 배양상등액 13L에 약 8L의 에틸 아세테이트를 가하여 격렬히 흔들어 주고 분액 깔대기를 사용하여 수층과 에틸 아세테이트층을 분리하였다. 에틸 아세테이트층을 여과하고 감압증발하여 시료 1을 1.49g 얻었다.

상기의 시료 1(1.49g)을 소량의 메탄올에 녹인 다음 약 5g의 실리카겔을 가하고 감압증발하여 시료를 실리카겔에 흡착하였다. 이것을 100g의 실리카겔이 충진되어 있는 직경 2.5cm의 관에 부어주고 여기에 계속하여 클로로포름-메탄올(20:1), 클로로포름-에탄올(10:1) 용액을 부어주어 분획을 수집하였다. 각 분획을 30㎕ 씩 취하여 1/4인치 직경의 항생물질 조사용 종이 디스크를 적셔 B. 섭틸리스 함유 플레이트에 얹어 28℃에서 하룻밤 동안 배양해 항균효력을 측정하였다. 항균효력 조사 결과 활성을 보인 분획들을 함께 모아 감압증발하여 분획 1(0.66g), 분획 2(0.37g), 분획 3(0.21g), 분획 4(0.19g)를 얻었다.

상기의 분획 1(0.66g)과 분획 3(0.21g)을 합쳐서 소량의 클로로포름에 녹인 다음 30g의 실리카겔이 충진되어 있는 직경 2.5cm의 관에 부어 로딩하고 계속해서 클로로포름-메탄올(10:1)을 부어주고 분획을 수집하였다. 각 분획을 30㎕ 씩 취하여 1/4인치 직경의 항생물질 조사용 종이 디스크를 적셔 B. 섭틸리스 함유 플레이트에 얹어 28℃에서 하룻밤 동안 배양해 항균효력을 측정하였다. 항균효력 조사 결과 활성을 보인 분획들을 함께 모아 감압증발하여 시료 2(0.76g)을 얻었다.

상기의 분획 2(0.37g)를 소량의 클로로포름에 녹인 다음 30g의 실리카겔이 충진되어 있는 직경 2.5cm의 관에 부어 로딩하고 계속해서 클로로포름-메탄올(10:1)을 부어주고 분획을 수집하였다. 각 분획을 30㎕ 씩 취하여 1/4인치 직경의 항생물질 조사용 종이 디스크를 적셔 B. 섭틸리스 함유 플레이트에 얹어 28℃에서 하룻밤 동안 배양해 항균효력을 측정하였다. 항균효력 조사 결과 활성을 보인 분획들을 함께 모아 감압증발시켜 시료 3(0.37g)을 얻었다.

시료 2(0.76g)를 실리카겔 액체 컬럼( YMC-Pack SIL, 내부 직경 10mm, 길이 250mm, YMC사 제품 )과 전개용매로 에틸아세테이트-헥산(1:1)을 사용한 관 크로마토그라피를 수행하여 분획 5(100.1mg), 분획 6(30.2mg), 분획 7(24.1mg)을 얻었다.

시료 3(0.37g)를 실리카겔 액체 컬럼( YMC-Pack SIL, 내부 직경 10mm, 길이 250mm, YMC사 제품 )과 전개용매로 에틸아세테이트-헥산(1:1)을 사용한 관 크로마토그라피를 수행하여 분획 8(93.4mg), 분획 9(55.5mg), 분획 10(46.0mg), 분획 11(12.3mg)을 얻었다.

실리카겔 관크로마토그라피를 수행하여 얻은 시료들을 실리카겔 판과 전개 용매로 크로로포름-메탄올(10:1)을 사용한 프렙 TLC를 수행하고 분리하여 랑카마이신 41.7mg, 8-디옥시 랑코라이드 8.0mg, 랑카시딘 C( Lankacidin C ) 9.3mg, 그 밖의 미지의 시료 7.1mg 을 얻었다.

실시예 4 8-디옥시 랑코라이드의 물리화학적 성질

우리나라 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-300 균주로부터 생산되는 새로운 14환의 마크로라이드 항생물질의 아글리콘은 물리 화학적인 특성이 다음과 같다.

1) 물질의 성상 : 옅은 황색의 오일

2) 분자량 : 431

3) 분자식 : C23H43O7

4) 고분해능 질량분석치(m/z) : 실측치(M+) 431.5919

계산치(M+) 431.5927

5) 고유 광회전도 (메탄올에서 [α]25D) : -10.42 (C=0.25, 메탄올)

6) 자외선 흡수 스펙트럼 (UV max MeOH nm(ε)) : 285(1.50)

7) 적외선 흡수 스펙트럼 (IR νmax KBR cm-1) : 3400, 1740, 1460

8) 핵자기 공명 (NMR) 스펙트럼

클로로포름 (CDCl3)을 용매로 하고 테트라 메틸 실란 (TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H NMR) 스펙트럼, 탄소핵자기 공명(13C NMR) 스펙트럼은 각각 다음 표 1과 같다.

화학식 1로 표시되는 화합물의 핵자기 공명 스펙트럼

위치	δ 13C	δ 1H
1	176.4
2	44.0	2.81(dq: 10.4, 6.8)
3	79.3	3.94(d: 10.4, 0)
4	37.6	1.87(dq: 0, 6.3, 7.0)
5	76.4	4.01(dd: 6.3, 2.0)
6	35.5	2.03(m: 2.0, 3.5, 6.6)
7	37.5	1.71(ddd: 14.0, 3.5, 9.1)
		1.23(dd: 14.0, 6.6, 0)
8	39.5	2.66(dq: 9.1, 0, 6.8)
9	213.7
10	43.3	2.82(brq: -, 6.8)
11	71.1	3.75(dd: -, 11.2)
12	37.7	2.10(dq: 11.2, 0, 7.0)
13	76.8	5.24(d: 0, 9.7)
14	40.0	1.93-1.89(m: 9.7, -, 6.8)
15	66.7	4.01(dq: -, 6.8)
2-Me	14.7	1.33(d: 6.8)
4-Me	6.9	1.10(d: 7.0)
6-Me	16.6	1.08(d: 6.6)
8-Me	13.4	1.09(d: 6.8)
10-Me	6.5	1.07(d: 6.8)
12-Me	9.5	0.90(d: 7.0)
14-Me	9.6	0.93(d: 6.8)
15-Me	21.1	1.25(d: 6.8)

생합성의 관점에서 볼 때 8-디옥시랑코라이드는 당 성분이 없는 것을 제외하고는 랑카마이신과 입체구조가 같다고 추정된다.

실시예 5 화학식 1로 표시되는 마크로라이드 아글리콘 화합물의 항균 효과

본 발명의 화학식 1로 표시되는 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물의 항균효과를 아가 희석 방법(agar dilution method)으로 최소 생육억제 농도를 측정함으로써 조사하여 표 2에 나타내었다.

화학식 1로 표시되는 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물의 항균 효과

시험 균주	최소 생육억제 농도(MIC, μg/ml)
Bacillus subtilis ATCC 6633	25.0
Streptococcus pyogenes C 4003	25.0
Staphylococcus aureus Smith	50.0
Mycobacterium smaegmatis ATCC 29213	25.0
Escherichia coli ATCC 10536	100
Escherichia coli ATCC 25922	100
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031	100
Pseudomonas aeruginosa GN 11189	100
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145	100
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	100
Streptococcus faecalis ATCC 29212	100
Salmonella typhimurium C 4045	100
* 최소 생육억제 농도는 Mueller-Hinton 아가(디프코사 제품)를 이용한 아가희석 방법에 의해 측정하였다.

실시예 6 8-디옥시 랑코라이드와 랑카마이신의 항균효력 비교

8-디옥시 랑코라이드와 랑카마이신 동일량을 취해 1/4인치 직경의 항생물질 조사용 종이 디스크를 적셔 B. 섭틸리스 ATCC 6633이 이식되어 있는 아가판에 얹어 28℃에서 16시간 동안 배양해 성장억제영역의 직경을 측정한 결과, 8-디옥시 랑코라이드의 성장억제영역의 직경은 13mm 였고 랑카마이신의 성장억제영역의 직경은 17mm 였다.

즉 8-디옥시 랑코라이드는 랑카마이신에 비하여 약 3/4 정도의 항균 효력을 가지고 있음을 알 수 있다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 14환 마크로라이드의 아글리콘인 8-디옥시 랑코라이드는 그 자체로도 다양한 균주에 대하여 항균효과를 가지므로 항생물질로서 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 8-디옥시랑코라이드는 보다 뛰어난 항균효과를 갖는 항생물질인 랑카마이신을 합성하는데 중간물질로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규한 14환 마크로라이드(macrolide) 아글리콘 화합물인 8-디옥시랑코라이드(8-deoxylankolide)에 관한 것이다.

화학식 1

또한, 본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주 및 그의 배양액으로부터 화학식 1로 표시되는 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물인 8-디옥시 랑코라이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘 화합물인 8-디옥시 랑코라이드를 항생물질인 랑카마이신을 생합성하는데 중간물질로 사용하는 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 8-디옥시 랑코라이드 화합물을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)미생물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 8-디옥시 랑코라이드를 유효성분으로 하는 항생제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Claims (7)

1. 화학식 1로 표시되는 신규한 14환 마크로라이드의 아글리콘인 8-디옥시 랑코라이드(8-deoxylankolide).

   화학식 1
2. 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 속 미생물의 배양 상등액을 유기용매로 추출하여 감압증발시키고, 다양한 비율의 혼합용매를 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 반복적으로 수행하여 여러 분획으로 분리하는 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘인 8-디옥시 랑코라이드의 제조방법.
3. 제 2항에 있어서, 혼합용매는 클로로포름-메탄올, 클로로포름-에탄올 또는 헥산-에틸아세테이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 8-디옥시랑코라이드의 제조방법.
4. 제 2항에 있어서, 상기 과정에 더하여 프렙 TLC를 수행하여 분리·정제하는 신규한 14환 마크로라이드 아글리콘인 8-디옥시 랑코라이드의 제조방법.
5. 제 1항의 8-디옥시랑코라이드를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 SNUS 9011-300 균주 (수탁번호:KFCC 10912).
6. 제 1항의 8-디옥시 랑코라이드를 14환 마크로라이드 항생물질인 랑카마이신(lankamycin) 생합성의 중간물질로 사용하는 용도.
7. 제 1항의 8-디옥시 랑코라이드 화합물을 유효성분으로 하는 항생제용 약학적 조성물.